骨へのミネラル沈着機構の解明 - J-milk

骨へのミネラル沈着機構の解明
新潟大学歯学部口腔解剖学第一講座小
津
英
浩
要約
骨石灰化の分手機構を解明することを目的に以下の項目を検討した。
(A)
非石灰化部位における宥稽留の橋治閉す
石灰化現象におけるミネラルと有機質の相互関係を解明することを目的として、非石灰化相から石
灰化相へと移行する幼弱な骨の有機基質の微細形態を、形態保持の最も優れている急速凍結法を用い
て観察するとともに、細胞組総化学を用いてプロテオグリカンなどの有機質の組成を同定した。その
結果、プロテオグリカンが石灰化球の結品と連続する像が観察されたことから、プロテオグリカンが
結品成長の足場になっている可能性が示唆された。また、プロテオグリカンの組成に関しては、幼弱
な骨基質に、デコリン、パイグリカン、ベルシカン、コンドロイチン 4ー硫酸、ケラタン硫酸等が観察
さわし、様々なプロテオグリカンが石灰化におけるカルシウムの保持や集積に関与しているものと推測
された。
(B)
石灰イk聞蛤部位におけるミネラル集積機構
骨形成部位の石灰化開始機序を解明するため、生後 8ヵ月一1
8ヵ月のラット膝骨骨梁あるいは頭蓋骨
9
.
5日と比較して観察した。いずれの時期においても、骨芽細胞と石灰化基
内骨膜の微細形態を胎生 1
質の聞に類骨が介在し、そこにはヒドロキシアパタイト結晶と思われる針状結晶を内包する脂質 2重
膜に固まれた基質小胞が観察された。以上の結果より、胎仔における初期石灰化部位のみならず成獣
ラットにおける骨形成の石灰化においても、基質小胞が関与していることが明らかとなった。
(C)
結晶析出制御機構#担う有機雷枠結晶鞘の解析
ヒドロキシアパタイト結晶と有機質との相互関係をさらに詳細に解析するために、石灰化球の結晶
の内部構造、ミ並びに周囲の有機構造を、微細形態学的、細胞組織化学的に解析した。石灰化球の内部
にはヒドロキシアパタイト結晶の集積が観察され、その周回には有機性の結晶鞘が観察された。この
構造は、結晶と密接な関係を保っていることから、石灰化結晶の析出や成長に重要な役割を果たすと
考えられ、骨シアロ蛋白やオステオポンチンなどによって構成さわしていることが明らかとなった。
(0)
コラーゲン細線維に対するヒドロキシアパタイト結晶沈着機構の解明
コラーゲン細線維やその他の基質蛋白等に対するヒドロキシアパタイト結晶沈着機構解明の一助と
することを目的として、ヒト永久臼歯の象牙質を集束イオンビ
ム加工装置で厚さ約 100mm{こ超薄切
加工し、却[j速電圧200KV
のエネルギーフィルター透過型電子顕微鏡(EFTEM) で観察した。象牙質基
質には、幅約 10mm、長さ 50-100mmの針状結晶が集積し、その周囲には結品鞘と忠われる電子透過性
構造が観察さわした。これらの針状結品は 2-3本が s
i
d
e旬 s
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eで集合し、束を作る傾向を IJ¥していた。
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内ぺ
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EITEMによる e
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p
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cimage法を用いて Cおよひ'
C
aの局在を観察すると、 Cは針状結晶
あるいは象牙細管以外の領域に局在が見られ、特に針状結晶の隣接部にはCが多く局在する部位も見
られたのに対し、 Caは、象牙細管を除く広い領域に局在が見られた。 Cは象牙質の有機成分を反映し
ており、結晶鞘等の構成成分となっていると思われた。 Caは結晶の部位以外にも存在し、基質蛋白な
どと結合して石灰化結晶の形成や維持に関与していると推測さわした。
キーワード: 生物学的石灰化、骨、プロテオグリカン、得脇田形態、エネルギーフィルター透過型電
子顕微鏡
本研究課題の呂的と意義
骨の石灰化に関する基礎的知見が蓄積する一方、機序解明に必須な、石灰化に伴う分子レベルでの
構造変化と微小ミネラル環境の定量的評価に関する情報は、依然、不足している。この原因としては、
nv
i
t
r
o
の系がない事、あるいは、 i
nv
i
v
o
の系においても試料作
生理的石灰化現象を忠実に再現できる i
成中に糖鎖などの不安定な構造が変形したり、ミネラルが流出するため正確な評価ができない事、な
どが挙げられる。
一方、近年エネルギーフィルター透過型電子顕微鏡 (EITEM) が開発された。元来、透過型電顕は、
透過する電子と散乱する電子のコントラストによって、像を可視化する。透過する電子の一部には、
元素の外郭電子と衝突してエネルギ
を失う非弾性散乱篭子も含まれており、このような非弾性散乱
電子は従来の透過型電顕ではノイズの原因となっていた。しかし、 EFIEMは、任意の電子エネルギー
損失を有する非弾性散乱電子を可視化する事ができるので、電子エネルギ
損失量を OeV
に設定する
と、ノイズの多くが除去され、従来の電顕と比べて高コントラストの画像が得られる。また、各元素
は、固有の電子エネルギー損失を有するので、この性質を利用して、特定の電子ヱネルギー損失を有
する非弾性散乱電子を可視化すると TEMレベルで元三者をマッピングすることができる。この技術は、
従来の元素分析法である、 e
l
e
c
廿o
np
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b
eXr
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c
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sを空間分解能ではるかに凌駕する o 申請
者の所属機関にも EITEMの一種である C
a
r
lZ
e
i
s
s9
0
2が設置されている。申請者らは、平成 1
1年度の
責研究助成を受け、この電顕を用いて石灰化に伴うカルシウム“リンの共在化現象を発見した。すな
わち、非石灰化部位においては、カルシウムは主にプロテオグリカンの部佼に、リンは主にコラーゲ
ン細線維の領域l
こ局在しており、それぞれが別々の部位に集積しているため石灰化が抑制されている
一方、石灰化開始部位においてはカルシウム・リンの共在化が起こり、石灰化が進行することを明ら
かにした<H
o
s
h
i，
Ozawae
ta
l]BoneMinerR
e
s2
0
0
1>
。
本計画では、このカルシワム・リン共在化機構をさらに詳細に検討するため、ミネラル流出や構造
変形を防止できる凍結技法を用いて、プロテオグリカンやコラーゲンの分子構造の詳細な解析や、微
小ミネラルの詳細な評価を試みる。石灰化に伴うコラーゲンやプロテオグリカンなどの有機成分の分
子形態と微小ミネラル環境の変化を厳密に且つ詳細に評価することにより、骨石灰化の分子機構を包
Aせ
1ょ
に
ひ
括的に解明することが本研究の目的である。
各研究計画の成果及び進行状況
研究計画の成果及び進行状況に関しては、申請時の研究計画に対応させて、現時点での研究成果を
以下に記載した。
(A)
[呂的]
非右j
英作部位における有機管の構活問宏
骨基質はヒドロキシアパタイトと呼ばれるリン酸化カルシウム結晶と様々な有機質によって
構成されている。これらの有機質には、骨基質の基調となる I型コラーゲンの他、多く陰性荷電を有
するプロテオグリカンや、酸性アミノ酸を豊富に含む非コラーゲン性基質蛋白などが含まれる。骨に
おいて石灰化が進行する際には、ミネラルに相互関係を有する有機質が何らかの重要な役割を果たす
ものと推測される。
本研究では、ミネラルと有機質の相互関係を解明することを目的として、これらの有機基質の微細
形態を、形態保持の最も優れている急速凍結法を用いて観察するとともに、細胞組織化学を用いてプ
ロテオグリカンなどの有機質の組成を同定した。
[方法]
すべての実験過程は、新潟大学歯学部動物実験委員会の承認を得て行った。エーテル麻酔の
後、妊娠1
9
.
5日の妊娠ラットから胎仔を摘出し、一部は液体ヘリウムで凍結固定を行い微細形態観察
用の試料とし、また一部は、アルデヒド溶液で化学画定し細胞組織化学用とした o 微細形態用試料は、
オスミウムアセトンで凍結置換を行った後、エポキシ樹脂に包埋し、超薄切の後、透過型電子顕微鏡
で観察した。
組織細胞化学は、プロテオグリカンのコア蛋白であるデコリン、バイグリカン、ベルシカンについ
て、あるいはグリコサミノグリカン鎖 (GAG
鎖)に関しては、コンドロイチン 4ー硫酸、コンドロイチ
ンふ硫酸、ケラタン硫酸について、光顕レベルでは凍結切片を用いた酵素免疫法で、電顕レベルでは
LRGold
樹脂を用いたp
o
s
t
叩 l
b
e
d
d
i
n
g
金粒子法を用いて検出した。
[結果と考察]
胎生期頭蓋骨の骨基質では、非石灰化部位から石灰化部位へと移行するに従い、骨芽
細胞が分泌した基質小胞内に石灰化結晶が析出し、成長して石灰化球となり、さらに石灰化球が拡大
して隣接したコラーゲン細線維を石灰化して最終的には広範な石灰化基質が形成される過程が観察さ
れる。
微細形態用試料を透過型電顕で観察すると、初期石灰化部位においては基質小胞や石灰化球周辺に
は、コラーゲン細線維とプロテオグリカンと思われる細い線維構造のメッシュワークが密に観察され
た。さらにプロテオグリカンと思われるメッシュワークと石灰化球の関係を詳細に観察すると、プロ
テオグリカンの線維構造と石灰化球の結品が連続して観察される部伎が見られることから、石灰化球
の結品成長においてプロテオグリカンがその足場になっている可能性が示唆さわした。
一方、プロテオグリカンの組成に関しては、骨基質、特に石灰化していない類骨に、コア蛋白では
一155ー
デコリン、パイグリカン、ベルシカンのすべてが観察された。 GAG
鎖に関じては、コンドロイチン 4硫酸、ケラタン硫酸が観察されたのに対しコンドロイチンふ硫酸の局在は見られなかった。免疫電顕
鎖の局在を観察したところ、コンドロイチン 4ー硫酸、ケラタン硫酸いずれも石灰化
で骨における GAG
球に局在が観察さわしたが、非石灰化部位のコラーゲン細線維周囲にはコンドロイチン 4-1硫酸のみが観
察された。このように、石灰化進行部位には様キな種類のプロテオグリカンが局在しており、カルシ
ウムの保持や集積に関与しているものと推測された。
(実験終了、 J
oum
a
1o
fE
l
e
c
仕o
nM
i
c
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c
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p
y2
0
0
1，
H
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s
h
i，
，
K uzawaH，e
ta1，印刷中)
(B)
[目的]
石I
引k
隅蛤部位におけるミネラル集積機構
骨組織が軟部組織において新規に形成される機序には、長幹骨における内軟骨骨化と、頭蓋
骨の発生等で見られる膜性骨化の 2種類がある o これらの骨化は骨格の発生過程で観察され、個体の
形態形成に重要な役割を果たす。骨化によって生じた骨は、形成と吸収が異なる場所で生じるモデリ
ングにより発育・成長し、さらに成長が終了した骨においては、恒常的に骨基質の吸収とそれにカッ
プリングした骨形成が起こり、骨のリモデリングがなされるく F
r
o
s
t1
9
7
3
>
。このリモデリング現象は、
ヒトや大動物の皮質骨では、破骨細胞とそれに続く骨芽細胞の細胞列からなる B
a
s
i
cmul
世間 l
l
u
l
a
ru
n
i
t
s
t1
9
7
3
> あるいはBoneRemodelingU
n
i
t (BRU) <P田五社 1
9
7
9
> により営まれ、その結果、
(BMU) <昨o
セメントラインに囲まれた特有の層板構造であるオステオンが新たに形成されるくJ
問
、 1
9
8
3
>。オス
テオン構造を皇さない海綿骨く J
e
e、1
9
8
3
>や小動物の骨く uguro1
9
8
9
> においても、 BMUが観察さ
れ、骨吸収を伴う骨形成と、古い骨基質の新しい骨基質への恒常的な置換が観察される。このような、
BMUにおける骨形成は、既存の石灰化基質に隣接した部位に形成される点で、内軟骨骨化や膜性骨化
と区別される。
内軟骨骨化における軟骨基質あるいは膜性骨化によって作られる骨基質の石灰化機構に関しては、
基質小胞の関与が指摘されているくAn
d
e
r
s
o
n1
9
6
7
，B
o
n
u
c
c
i1
9
6
7，Bemard1
9
6
9
>。元来、基質小胞は、
石灰化軟骨の細胞外基質において発見された脂質 2重膜に囲まれた直径 40-200mm
程度の構造で
くAnd
e
r
s
o
n1
9
6
7，Bon
配 c
i1
9
6
7
>、この小胞構造は頭蓋骨の膜性骨化部位においても観察されく Bemard
1
9
6
9
>、内軟骨骨化においては軟骨細胞が、膜性骨化の場合には骨芽細胞が分泌する事が知られている。
基質小胞内にはしばしばヒドロキシアパタイト (HA) 結晶が観察され、そこには石灰化結晶形成成長
阻害因子であるプロテオグリカンやピロリン酸の除去に関与する MMP-3 <
S
h
m
i
t
z1
9
9
6>やアルカリ
ホスブアターゼ<F
r
e
i
s
c
h1
9
6
1，Matsuzawa
，1
9
71>や、カルシウムの汲み上げに関与するアネキシン
<K
i
r
s
c
h1
9
9
7>等が存在することから、初期石灰化における HA
結晶は最初に基質小胞内に析出すると
考えらていれる。基質小胞内に析出した HA
結晶はその後成長を続け、石灰化球を形成し、個々の石灰
化球が拡大、癒合して、周囲に存在するコラ
ゲン細線維等の有機質に沿って伸展し(コラーゲン性
石灰化)、連続した石灰化慕質の形成に至る。この様な基質小胞は、内軟骨性骨化の軟骨や、頭長骨の
膜性骨化部位以外にも、骨髄移行部 <Y
副n
ada1
9
7
6
>、象牙質形成高官位 <uzawa1
9
7
2、Yamada1
9
7
8
>、
鹿角形成部位。 ayegh1
974> や、骨折部位 <Lowe1983>、骨肉腰 <Muhlarad1978>、動脈硬化
pnu
に
l1u
ー
…叶一一一-~="一一
-一一一町一一一ーャわれ叩山崎…今宅つ.<.~~-~~，， ~-~-γT
一一一一{一一一一て戸〔
<
P
e
a
g
l
e1
9
6
9
>、歯石形成 <Vogell97D などの病変部や、 BMPIこより誘導される骨<H
o
s
h
l1997>等
においても観察され、広義の硬組織が新規に形成される部位に出現し、石灰化結品形成の初期過程を
制御すると考えらている。
内軟骨骨化あるいは膜性骨化以タ iの骨形成における石灰化においては、日吉生期のニワトリ膝の座骨
類骨のように、骨基質形成が旺盛で、急速な石灰化が進行する部位で観察されており、基質小胞性石
灰化が確認されているく B
o
n
u
c
c
i1
9
7
1、Plumbo1
9
8
6
>。しかし、成熟骨に見られる、 BMUの骨形成に
おける石灰化機構に関しては、既存の石灰化領域の拡大による石灰化の可能性や、骨芽細胞が新たに
分泌する基質小胞を介して石灰化する可能性等が推測されているが、詳細は不明である
O
本研究では、
急速な骨形成が終了した骨形成における石灰化開始機構を明らかにする事を目的として、生後 8ヵ月一
1
8ヵ月のラット鹿骨骨梁あるいは頭蓋骨内骨膜の微細形態を、成長期の胎生 1
9
.
5日のものと比較し観
察した。
[材料と方法]
標本作製
D
i
e
血y
le
出回ーによる吸入麻酔とベントパルピタールナトリウム (30mg/kg) の腹腔内投与の後、胎
生1
9日W
i
s
t
e
rr
a
t
胎仔 4匹(約1.9
g
)、および成獣W
i
s
t
e
rr
a
t4匹 (8ヵ月 2匹
、 1
0ヵ月 l匹
、 1
8ヵ月 1
匹
、 6
4
0
7
2
0
g
) を、左心室にカテーテルを刺入し、潅流固定をした o 同定液には、 0
.
0
5
0
.
0
6
7
Mカコジ
ル酸緩衝液で緩衝した 2 %パラフォルムアルデヒド .2.5%グルタールアルデヒド混合溶液 (pH7.
4
)
を、胎仔は 1匹あたり 2m1、成獣は 1
0
0
0
m
l
使用した。 i
雀流固定後、腔骨あるいは頭蓋骨を摘出し、胎
仔骨は用手的に、成獣骨は BandsawBS
3
0
0
0 (Meiwa、Osa
1
也
、 ]
a
p
阻)を用いて厚さ lmmlこ薄切し、
それぞれの固定液に 4"
Cで1
2
時間浸潰した。洗浄後、一部の試料は 4.13%EDTl
生で脱灰した後、さらに
O.IMカコジル酸緩衝液で緩衝した 1% 4酸化オスミウム (pH7.4)で後固定した後、上昇エタノール
系列および酸化プロピレンで脱水、浸透して P
o
l
y/Bed8
1
2r
e
s
i
n(
P
o
l
y
s
c
i
e
n
c
e
s，W
a
r
r
i
n
g
t
o
n，PA) に
包埋した。
組織学的および組織化学的観察
Microtome、Ult
r
a
c
u
tUCT (
L
e
i
k
a、Wien、A
u
s
t
r
i
a
) を用いて、 Poly/bedlこ包埋した試料の厚さ
lmml二準超薄切し、リン酸カルシウムの局在を同定するためにフォンコソサ染色を行った後に、トル
イジンブルー染色を加えるか、もしくはトルイジンブル
染色単独で、光顕で観察した。
微細構造の観察
切片上での脱灰を予防するために、超薄切片の採取の際には、蒸留水の代わりにエチレングリコー
ルを使用して、厚さ 60mm
の超薄切片を得た。超 i
等切片はヒドロキシアパタイト結晶を保持するため
に無染色のまま、あるいは特に脂質二重膜を強調するときには酢酸ウラン、クヱン酸鉛の 2震染色を
行い、カーボンコーデイングを施し、透過型電子顕微鏡 (TEM) (
JEM-100CXI，
]OEL
，
Tokyo，
]
a
p
阻
，
o
rH7100B，H
i
t
a
c
h
i，
Tokyo，
]
a
p
a
n
) で観察した。
[結果]
生後 1
8ヵ月ラット鹿骨の近 j
u
:を観察すると、成長板は閉鎖しており、骨幹端の骨梁には破骨
l
司ム
﹁吋U
ηi
細胞が見られ、近接した骨基質表面には楕円形の骨芽細胞が
つて f
徐余々に骨芽細胞は扇平化していつた。以降、このような骨芽細胞が円形あるいは楕円形を呈する、
基質産生が行われていると思われる部位を観察した。
生後 1
8ヵ月の座骨骨梁の骨形成部位を非脱灰で観察すると、骨芽細胞とフォンコッサ陽性の石灰化
基質の聞に、類骨が存在しており、この部位にはトルイジンブルー好性の、頼粒状構造物が観察され
た。胎生期目霊骨骨梁は類骨が豊富で広範な領域に同様なトルイジンブルー好性頼粒状構造物が存在し
ていた。このような領域を、さらにTEM
観察すると、いずれの時期においても、穎粒状構造物に一致
8ヵ月
して基質小胞あるいは石灰化球が認められた。このような基質小胞あるいは石灰化球は、生後 1
に比べ胎生 1
9
.
5日に密に存在している傾向があった。脂質 2重膜に固まれた基質小胞内には HAと恕わ
れる針状結晶が観察され、基質小胞性石灰化が認められた。
生後 1
8ヵ月齢ラット頭蓋骨の内骨膜においても、骨形成の過程が連続的に観察された。類骨層が豊
富な部位においては、光顕レベルでも石灰化球と思われるトルイジンブルー好性穎粒状構造物は観察
された。一方、類骨層が非薄化する領域でも、電顕レベルでは、まれに結晶を有する基質小胞が観察
され、このような部位でも基質小胞牲石灰化が生じることが示唆された。
生後 8ヵ月あるいは 1
0ヵ月齢ラット以外の成獣の座骨骨梁類骨や頭蓋骨の骨形成部においても同様
に基質小胞性石灰化が観察さわした。
[考察]ラット座骨の骨成長は、 1
9
8
9
年にWronskiらにより評価されており、 S
pragueDawleyラットで
は生後 1
2
0日で成長速度がプラトーに達し、生後 4
5
0日で長軸方向の成長はほぼ停止する事が知られて
いるくWr
o
n
s
k
i1
9
8
9>。本研究で用いた成獣ラットにおいても骨成長が鈍化していたと予想され、特に、
生後 1
8ヵ月のものはすでに成長板が閉鎖しており、骨成長が停止していた。このような成獣ラットの
鹿骨骨梁において、破骨細胞による骨吸収から骨芽細胞による骨形成にいたる一連の細胞配列である
BMUが観察され、最高生後 1
8ヵ月の老齢ラットにおいても BMUによる骨の置換が生じていることが
再確認された。さらに、この時期のラット腔骨骨梁における微細構造学的解析から、骨成長が停止し
た膝骨においても、 BMUの骨形成部位を観察すると、基質小胞性石灰化が存在しており、骨基質の石
灰化には、既存の石灰化領域の拡大とは加に、骨芽細胞が分泌する基質小胞を介した経路が存在する
ことが明らかとなった。
一方、胎生期ラット座骨では成長が著しく、骨は盛んにモデリングされていると思われる。したが
って、胎生期の膝骨骨梁の骨形成は、 BMUにおける骨形成とは異なる機構で誘導され、進行すると予
想される。骨梁には基質小胞や石灰化球が密に且つ広範に局在する類骨が豊富に観察さわした。
しかし、観察された基質小胞は、胎仔、成獣いずれも i
直径 4
0-200mm
程度で、巾約 7且mの脂質 2重
膜に固まれており、個々の形態には特異的な相違はなかった。胎仔、成獣聞の基質小胞あるいは石灰
化球の分布の相違は、石灰化が進行する面積の相違を反映していると推測さわし、 HA
結晶を内包する基
質小胞が石灰化球に成長し、いずれは連続した石灰化慕質を形成する事を考えると、細胞が多数の基
質小胞を広範な領域に分泌すれば、より広範に l
iつ急速に石灰化領域を広げる事ができると予怨され
14ム
四川
る。このように、基質小胞は、石灰化の範囲と速度を制御するために骨芽細胞が分泌する機能構造体
であると考えられた。
さらに、成獣ラットの骨形成においては石灰化が進行し、類骨層が非薄化し、石灰化前線様の構造
が形成さわしる部位においてもごくわずかではあるが基質小胞が観察され、基質小胞性石灰化が行われ
ていることが示唆された。ラット切歯の d
e
n
t
i
n
形成においては、石灰化が進行し石灰化前線が観察さ
れるようになると、基質小胞が観察されないと報告されているく E
ismann1972>。骨基質は、象牙質
とは異なり、断続的な添加を繰り返しながら層板構造を形成するため、石灰化過程に対する細胞性制
御がより強く働くものと推測された。
成獣で観察される骨形成は、主に破骨細胞による骨吸収の後に、カップリングしている骨芽細胞に
より行われと思われるが、一部には基質合成を休止し l
i
n
i
n
gc
e
l
l
様となった骨芽細胞が、再度基質合成
を開始した擦に起こる可能性も否定できないく Chow1997>。破骨細胞は骨あるいは石灰化軟骨の吸収
の後、セメントラインを形成するく T
ranVan1982>。また、骨芽細胞が基質合成を休止し l
i
n
i
n
gc
e
l
l
様
細胞となる場合、類骨が消失し石灰化基質との界面にうミナリミタンスを形成するく S
h
e
r
f
t1972>。従
って、既存骨へ沈着される骨形成は原則としてセメントライン様構造か、ある L刈まラミナリミタンス
様構造によって境界されると考えられる。一方、これらの構造は、ともにプロテオグリカンやオステ
オポンチン、オステオカルシン等の非コラーゲン性骨基質の集積を伴う事が知られているく S
c
h
e
r
f
t
1972，S
c
h
a
血e
r1987，McKee1992>。プロテオグリカンやオステオポンチン等の非コラーゲン性骨基質
には石灰化結晶形成成長抑制作用があるためく Chen1985，H
u
n
t
e
r1996>、石灰化領域の拡大において
セメントライン様構造やラミナリミタンス様構造は構造上の障害となる可能性が推測される。今後は、
ヒトや大動物などのオステオンにおける骨形成の観察をし、さらに、種や部位を広げて骨形成におけ
る基質小胞性石灰化の重要性を検証して行く必要がある。
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(C)
[目的]
結晶析出制御機構を担う有機質性結晶鞘の解析
ヒドロキシアパタイト結晶と有機質との相互関係をさらに詳細に解析するために、石灰化球
の結晶の内部構造、並びに周囲の有機構造を、微細形態学的、細胞組織化学的に解析した。
[方法}
9
.
5日の妊娠ラットから胎仔を摘出し、一部は液体ヘリウムで凍結
エーテル麻酔の後、妊娠 1
回定を行い微細形態観察用の試料とし、残りは、アルデヒド溶液で化学固定し細胞組織化学用とした。
凍結固定を行った試料は、オスミウムアセトンで凍結霞換を行った後、エポキシ樹脂に包埋し、超薄
切の後、透過型電子顕微鏡で観察した。
樹脂を用いたp
o
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組織細胞化学は、骨シアロ蛋白およびオステオポンチンについて、 LRGold
金粒子法を用いて電顕レベルで検出した。
embedding
[結果と考察]
非脱灰切片で通常の電顕観察すると、石灰化球の内部には幅 10nm
長さ 100nm
程度の
電子密の結品様構造の集積が観察される。それらの結晶線構造を加速電圧300KV
の高分解能観察する
と、結晶間隔が 8.14Aの六角格子ーが観察され、ヒドロキシアパタイトであることが確認された。この切
片を電子染色し、切片上で脱灰すると、結品に対応、する部位が電子明構造として観察さわし、逆に周聞
の電子密構造は、有機性の結晶鞘と考えられL、結晶と密畿
が電子密として観察される。この幅約 10nm
な関係を保っていることから、石灰化結晶の析出や成長に重要な役割l
を果たすと考えられた。
-161ー
さらに結晶鞘の組成を同定するために、骨シアロ蛋白とオステオポンチンの免疫電顕を行ったとこ
ろ、両者とも結晶鞘の部位と
致した局在性を示したことから、いずれも結晶鞘の構成要素となって
いることが示唆された。
{実験終了、 J
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1，Hoshi，
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l，印刷中)
(D)
コラーゲン細線維に対するヒドロキアパタイト結晶涼落機構の解明
[目的]
ヒト象牙質は無機含有量が 73%を占め、 96%の無機成分を有するエナメル質に比べるとやや
低いものの、エナメル質同様、非脱灰試料のまま超簿切し、透過型電子顕微鏡 (TEM) で微細形態を
観察するのは困難である <
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3>。しかし、近年、ガリウムイオンを照射し、イオンスパッ
タリングの原理で繊細な加工を行うことができる集束イオンビーム加工装置 (
F
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B
) が開発された。
この装置を用いると、ダイアモンドナイフによる超薄切が困難であった硬い試料でも超薄切加工が可
能となるく I
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>
0 FlBは生物材料への応用も試みられており、 FlBで超薄切加工したヒトエナ
メル質を加速電圧 200KV
O)TEM
で観察し、エナメ，レ結晶の結品格子を観察した報告があるく Yaguch
i
>
。
しかし、エナメル質に比べやや有機質や水分含有量が多い象牙質に関しては F
lBを使用した報告はな
L冶。
一方、最近、エネルギ←フィルター透過型電子顕微鏡 (
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を像にすることができる。すなわち、電子エネルギー損失が OeVの電子線を像にすれば、非弾性散乱
電子が除去できるため従来の TEM
像より高分解能の像を得ることがでヰまた元素に固有の電子エネ
ルギ
損失を伴った電子線を像にするとその元素をマッピングするこ lとができる (
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SIは、生物系の研究で、は Ca
やP等の元素のマッピングに応用されて
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>、生物の主要構成元素である C!二関しては、試
きたがくAr
SIが困難であった。近年、二重作らのグ
料を樹脂する樹脂や支持膜に大量の Cが含まれているため、 E
jレ←プが
Si
O2支持膜の作成に成功し、大腸菌の C局在を観察したく Hutaes北 u1999>。一方、象牙質は
結品成分も多く強度があるため、超薄加工が可能であれば無包埋、無支持膜で''T
EM
観察ができ、また
CやCaなどのマッピングができると予怨された。
象牙質の微細構造や有機質・無機質の相互関係が明らかになれば生物学的石灰化、特にコラーゲン
細線維やその他の基質蛋白等に対するヒドロキシアパタイト結晶沈着機構に関する重要な情報が提供
できる。本研究では、石灰化機構解明の一助とすることを目的として、非脱灰、無包埋の象牙質に
FIB
超薄切加工を試み、加速電圧 200KVの EFTEMによる高分解能微細形態の観察を行うとともに、
ESIによりヒドロキシアパタイトの構成元三宮である Caと有機質の主要元素である Cの元素マッピングを
t
rった。
[材料と方法]
標本作製
抜歯後、中性ホルマリンに浸漬し、洗浄後風乾したヒト永久臼閣を用いた。 BandsawBS
-3000
-162
一一一一一…~"-<，，"，，~~--，，.'…押-'-.~:.'川和… -ë.-_，~一一一一司_'''''''~~'''.<''_~:7>'''-~';'''---OC ，-~--，
(Meiwa
，Osaka，
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) を用いて作成した厚さ lmmの象牙質切片を、さらに、周子的に厚さ 100μm
まで研磨した。エナメル象牙質境界付近を巾 lmm、高さ 0.5mm1こトリミングし、 U字型メッシュにマ
程度に pt蒸着
ニキュアで張り付けた。加工あるいは観察時のチャージアソプを予防するため厚さ 20nm
した後、 FIB
加工観察装置FB2000A (Hi
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岳c
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i，To
匂 0，]apan) を用いて、象牙質切片を掘削加工した。
同
加速電圧は 30KV
で、粗加工はピーム電流 12nA、ビーム径 800nm
で行 L¥ 厚さ 1μmの薄切部を作り、
順次ビーム電流、ビーム径を減少させて、仕上げ加工 50pA
、50nmで、薄切部の両端 2カ所に厚さ約
100nmの超薄切部を作った (
F
i
g1B)。加工に要した時聞は、合計 6時間であった。 H
F
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i)を用い、加速電圧200KV
で加工部位を確認した。
TEM (H
微細構造観察およびC、Ca
の元素マッピング
微細構造は、 LE0922 (LEO、S
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町 t
、Germany) を用い、加速電圧 200KV、エネルギーフィルタ
ーOeV
、s
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で、無染色で観察し、撮影にはイメージングプレート (
F
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Tokyo，]
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吏用した。
C、Caの元素マッピングはイメージングプレートを用い、 s
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の 2-window
方式で解析した。
Cはp
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北を 295eV
、Ca
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で撮影し、イメージングプレー
ト上の画像情報は画像解析ソフト ImageGuageおよひ工，p
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F
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) で処理した。 EELSスベク
トルは、イメージングプレート上に撮影し、Im
ageGuageで測定した。
[結果 J FIBで掘削した象牙質超薄切片においては、直径 O
.
l
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m程度の終末象牙細管と思われる電子透
過構造と、針状結晶の集積が観察された。針状結晶を拡大して観察すると、針状結晶の長さはおおよ
そ50nm
から 100nmに達するものもあった。幅は全長にわたりおおよそ 10nmで、一定の幅を保ってい
るが、両端部では幅が減少し鈍角を呈していた。結晶周囲には不定形の電子密領域が観察さわしたが、
不定形の電子密領域と針状結晶の境界部には結品鞘と思われる lnm
程度の電子透過領域が存在してい
た。このような針状結晶は 2-3本が s
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eで、集合し、束として存在する傾向があった。
CとCaのESIを観察すると、 Cは針状結品あるいは象牙細管以外の領域に局在が見られ、特に、針状
結晶の隣接部にはCが多く局在する部位も見られた。 Ca
は、針状結晶の領域のみならず、象牙細管を
除く広い領域に局在が見らわした。この部位の EELSスベクトルでは、 CとC
a1二対応する 295eVおよび
355eV
のピークが観察さわした。
[考察]
本研究では、 FIBで加工した約 100nmの無包埋象牙質超薄切片を用いたが、加工時に生じる
熱による著しい損傷はなく、石灰化結晶が明瞭に観察された。また、加速電圧200KV
のEFTEMを使用
することにより、高分解能の画像所見を得ることができた。
F
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kらはヒト管問象牙質の石灰化結晶は、幅36nm、厚さ 10nm
程度で、板状の形状を呈しているこ
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>
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rらも、ヒト管周象牙質では石灰化結晶が長さ 36nm、幅 25nm、
とを記載したく F
厚さ 10nmであったとし、管問象牙質の結晶よりも小型ではあるが、同様に板状結晶を呈していること
指摘したく S
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>。戸方、本研究では、石灰化結晶は、幅約 10nm、長さ 50-100nmの針状結
晶として観察され、個々の結晶は、 2-3本集合し、平行に走行していた。Arno
l
dらは、象牙質の板が
-163ー
結晶は、初期に形成された針状結品が、 s
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eで癒合してできると考えているくAr
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。
>
集合している針状結晶は、
部で境界不明瞭となる部位はあったが、概 Lて一本一本は明瞭に識別す
ることができ、板状結晶の形成に至る癒合が必ずしも結晶全長で行われる訳ではないと思われた。
歯の無機塩はわずかな混入はあるものの、ほとんどがリン酸カルシウムであるためく W
eatherell
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7
3
>、観察された C元素の局在は、有機成分を反映すると考えられる。結晶の周囲に Cの局在が見ら
れ、象牙基質に存在する I
型コラーゲンやプロテオグリカン、非コラーゲン性基質蛋白<t
e
nC
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8
5>
などに起因すると思われた o また、 Cは結晶にほぼ接した部位より局在している部位もあり、このよ
うな部位は結品鞘と思われる電子透過性構造に相当する。従って結品鞘もなんらかの有機質性物質よ
り構成されていると j
思われる。結品鞘は石灰化結晶に隣接し密接な関係を保つことから、結晶の形
成・成長の制御を担っているものと推測された。
一方、 C
a
!二関しては、針状結晶の領域やその周囲の不定形電子密領域以外にも広く分布していた。
象牙質の基質蛋白には、プロテオグリカンく T
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0>のほかオステオカルシン<deV
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>
やオステオポンチン <McKee1
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>、骨シアロ蛋白 <ChenI993> などの骨と共通のものや、象牙質に
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> などが含まれており、これらの蛋白はCa
結合能を有する
ことが知られている。非結晶性の Ca
の一部はこのような蛋白と結合して保持され、石灰化基質形成に
おける Ca
の集積機構を担うと同時に、石灰化結品成長における抑制的調節にも関与していると推測さ
れた。
[文献]
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{著書]
江尻員
、小津英浩.
煩組織「骨」。
走査電子顕微鏡。日本電子顕微鏡学会関東支部会編
共立出版社、 2
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網塚憲生、佐々木朝代、小津英治:
骨原生細胞
カルシウムと骨、朝倉書庖(印刷中)
網塚憲生、渡漫淳一、佐々木朝代、小津英治:
カルシトニンの標的組織と作用
カルシウムと骨、朝倉書宿(印刷中)
[総説]
網塚憲生、佐々木朝代、小津英治:
副甲状腺ホルモン関連ペプチド遺伝子組み替えマウスの軟骨・骨の異常
医学のあゆみ 1
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日本骨代謝学会雑誌 1
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[訳書]
池亀美華、星和人、西野幾子、柳津宏信、柴崎伸恭、小i
宰英浩:
(文献訳)低骨密度のヒト顎骨における滑面および粗面チタンインプラントの形態計測学的比較
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星和人、池亀美華、西野幾子、柴崎伸恭、柳i
宰宏信、小津英治:
(文献訳)骨欠損部におけるバイオグランとカルシタイトの使用.サルにおける組織学的研究
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2000
[その他]
星和人、小守蕎文、小浮英浩:
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2000
小津英治
30日間世界 1周旅行
素晴らしいノルウヱーの船旅ー
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1、2000
おやしらず第 3
小津英治:
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おやしらず第3
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小津英浩.
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号) :1
1、 2000
新聞クイント 9月号 (
縞塚憲生、佐々木朝代、小湾英治、織田公光、入江真理子:
副甲状腺ホルモン関連ペプチドの核小体移行
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) ・ (グラピア)、 C2000
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{研究会などでの特別講演]
小津英浩:
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1世紀の歯科医療を先取りする
骨の形態科学の最前緩
新潟大学園学部
口腔外科歯科麻酔科同門会公開講演会
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[国際シンポジウムでの発表]
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[圏内シンポジウム]
小津英浩、網塚憲生、伊藤将広、島村拓也:
腫蕩性骨吸収に関する組繊細胞化学的所見
第1
8回日本骨代謝学会、シンポジウム 1、2
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年 7月 1
9日、広島国際会議場、広島プログラム
抄録集
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[圏内学会での一般口演 I
江尻員
、田中みか子、河野正司、小津英治:
マイクロ CT
を用いた卵巣摘出サル顎骨の構造解析
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2
0
0
0年 3月2
9
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3
1日、神奈川
プログラム予稿集
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池亀美華、星和人、川島博行、小i
軍英治.
張力刺激による骨形成促進過程の微細形態学的・組織化学的解析
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2000
年 3月2
9
3
1日、神奈川
p
.
8
0(
14
2
)
プログラム予稿集
星和人、江尻貞
、小津英治:
骨石灰化結品の結晶鞘に関する微細形態学的・細胞化学的解析
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2000
年 3月2
9
3
1日、神奈川
プログラム予稿集
p
.
8
0(
14
3
)
柳津宏信、星和人、江尻貞一、佐藤光三、小津英浩:
関節軟骨の修復機構に関する微細形態学的・細胞化学的解析
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2000
年 3月2
9
3
1日、神奈川
プログラム予稿集
p
.
8
0(
14
4
)
網塚憲生、佐々木朝代、小津英治:
GI
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I
i3遺伝子欠損マウスにおける軟骨内骨化の異常について
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2000年 3月2
9
3
1日、神奈川
プログラム予稿集
p
.
1
4
7(
5
4
1
)
佐々木朝代、網塚憲生、入江一元、江尻貞一、小津英浩:
マウス尾椎における軟骨内骨化の細胞組織化学的観察
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2000
年 3月2
9
3
1日、神奈川
プログラム予稿集
p
.
1
4
7(
5
4
2
)
島村拓也、網塚憲生、中島民雄、小津英浩・
乳癌転移モデルを用いた骨転移巣形成初期の形態学的検索
第1
0
5回日本解剖学会総会・全国学術集会、 2000
年 3月2
9
3
1日、神奈川
プログラム予稿集
p
.
1
4
7(
5
4
5
)
星和人、小津英浩:
初期石灰化機構に関する形態計測学的解析
第 20
同日本骨形態計測学会2
0
0
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年 6月2
3、24日、長崎
[]本骨形態計測学会雑誌1
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師事興平、星和人、川本真一郎、江尻貞一、小津英治:
骨細胞性骨溶解の形態学的検討
0回日本骨形態計測学会2
0
0
0年 6月23、 24日、長崎
第2
0(
I
) :333、2000
日本骨形態計測学会雑誌 1
佐々木朝代、網塚憲生、小津英i
告.
軟骨内骨化の血管侵入における VEGF
の局在と細胞・基質問相互作用
回日本骨形態計測学会
第 20
2000
年 6月23、 2
4日、長崎
0(
1
) :S
34、 2000
日本骨形態計測学会雑誌1
江尻貞一、問中みか子、豊岡英
、角崎英志、福崎好一郎、宮属宏彰、宮林信次、馬場則男、河野
正司、小i
畢英治:
μCTを用いた 2次元的・ 3次元的解析
卵巣摘出によるサル顎骨の構造変化
回日本骨形態計測学会
第 20
2000
年 6月2
3、24日、長崎
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I
) :S
39、 2000
日本骨形態計測学会雑誌 1
田中みか子、江尻貞一、石田陽子、野中希一、角崎英志、福崎好一郎、宮属宏彰、河野正司、小j
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英浩:
第2
0回日本骨形態計測学会 2∞口年 6月2
3、 24日、長崎
0(
1
) :340、2000
日本骨形態計測学会雑誌1
星和人、江尻貞一、小津英治:
EELS
分析の為の試料作製法とデータの読み方
0回懇話会、 2000
年 6月2
4日、東京
日本解剖学会関東地方会第 1
プログラム抄録集
p
.
1
2
佐々木朝代、網塚憲生、入江一元、江尻貞一、小津英浩.
マウス尾椎の軟骨内骨化における石灰化とアルカリ性ホスファターゼ、オステオポンチンの局在
乎成 1
2
年度新潟歯学会第 1回例会
プログラム
2000
年 7月 8日、新潟
p
.
1
7
佐々木朝代、網塚憲生、小津英治:
VEGFの局在と MMP-9の基質分解について
2
年度新潟歯学会第 1回例会
平成 1
2000年 7月 8日、新潟
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フ。ログラム
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島村拓也、網塚憲生、新垣晋、中島民雄、小津英治:
腫療の骨転移初期における組織破壊の組織学的検討
平成1
2
年度新潟歯学会第 1回例会
プログラム
2
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年 7月 8日、新潟
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網塚憲生、佐々木朝代、 J
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i3遺伝子欠損マウスの解析
第1
8
回日本骨代謝学会
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年 7月1
9日-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
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0
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佐々木朝代、網塚憲生、織田公光、小津英浩:
軟骨内骨化はVEGF
集積機構による血管内皮細胞の侵入の誘導と MMP9の基質分解により行われる
】
第四回日本骨代謝学会
2
0
0
0年 7月198-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) :1
1、2
0
0
0
星和人、江尻貞一、小浮英浩:
骨の石灰化結品の析出は、プロテオグリカンやオステオポンチン、骨シアロ蛋白との相互作用によ
り進行する
第四回日本骨代謝学会
2
0
0
0
年 7月1
9日-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) ・1
5、2
0
0
0
池亀美華、星和人、
1
1
1島博行、小津英、冶
張力刺激による頭頂骨縫合部の骨芽細胞分化促進過程の解析
第四回日本骨代謝学会
2
0
0
0
年 7月1
9日-22司、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) :3
2、2
0
0
0
川口実太郎、東由明、星和人、竹下淳、太田知裕、小津英浩、竹市雅俊、千坂修、工藤
OBカドヘリン/カドヘリン
第1
8回日本骨代謝学会
明:
1
1ノックアウトマウスは石灰化基質の形成不全により骨量減少を呈す
2
0
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0年 7月1
9日一 2
2日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
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小谷博子、 1
1
1口
浩、星和人、岩坂正和、小浮英浩、中村耕三、上野照剛
強磁場は同一方向に配向したコラーゲン上の骨芽細胞の分化を誘導して骨形成を促進する
第四国日本骨代謝学会
2
0
0
0年 7月1
9日-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌1
8(
2
) :5
7、2
0
0
0
星和人、川口浩、緒方直史、監物新一、門脇孝、中村耕三、小津英浩:
IR
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-l遺伝子欠損マウスは早期に骨端軟骨が閉鎖し、老化に類似した骨形態を呈する
8回日本骨代謝学会
第1
2
0
0
0年 7月1
9日-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌1
8(
2
) :8
2、2
0
0
0
島村拓也、網塚憲生、中島民雄、小津英浩・
骨転移における腫湯性基質分解と破骨細胞形成のメカニズム
第四回日本骨代謝学会
2
0
0
0年 7月1
9日-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) ・1
5
7、2
0
0
0
小野加津広、赤津拓彦、村上健彦、北村竜
、山本通子、網塚憲生、小津英治、永田直一、久貝信
夫:
マウス乳癌細胞株の骨破壊メカニズムの検討
8
回日本骨代謝学会
第1
2
0
0
0
年 7月1
9日-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌1
8(
2
) :1
5
8、2
0
0
0
坂倉康則、入江一元、小津英浩、矢嶋俊彦・
カルシトニン受容体の局在の変化は破骨細胞の分化と骨吸収活性を反映しているー免疫組織化学的
検討
8
回日本骨代謝学会
第1
2
0
0
0年 7月1
9日一 2
2日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) :1
9
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0
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0
宮琳、星和人、中島氏雄、坂井日出男、監物新一、江尻貞一、小津英浩
BMP-2により誘導される異所性骨に対する b
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7
5の影響
第1
8回日本骨代謝学会
2
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0年 7月198-22日、広島
日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) :2
9
3、2
0
0
0
柳浮宏信、星和人、佐藤光三、江尻貞¥小津英治:
関節軟骨の軟骨細胞は、自ら基質の形成と分解を行いながら軟骨修復を行う
第1
8
回日本骨代謝学会
2
0
0
0
年 7月1
9日一 2
2日、広島
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日本骨代謝学会雑誌 1
8(
2
) :2
9
4、2
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0
0
帯電塚憲生:
軟骨に対する副甲状腺ホルモン艮連ペプチド
(
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) の二極性の作用機序について
第4
2回歯科基礎医学会総会、 2
0
0
0
年 9月30-10月 1日、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) ・5
9、2
0
0
0
佐々木朝代、縞塚憲生、小津英治:
軟骨内骨化の血管侵入の機序における形態学的検索
第4
2回歯科基礎医学会総会、 2
0
0
0
年 9月30-10月 1日、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :6
6、2
0
0
0
網塚憲生、佐々木朝代、小津英浩:
G
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i
遺伝子欠損マウスの軟骨内骨化における形態学的解析
第4
2回歯科基礎医学会総会、 2
0
0
0
年 9月30-10月 l目、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :6
6、2
0
0
0
福士一入江真理子、伊藤将広、天谷吉宏、絹塚憲生、佐々木朝代、小津英浩、織田公光:
低ホスファターゼ症を発症する変異組織非特異型アルカリホスブアタ
ゼのヘテロ接合体の解析
第4
2
回歯科基礎医学会総会、 2
0
0
0年 9月30-10月 1日、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :1
1
0、2
0
0
0
i
度漫淳一、網塚憲生、小津英治.
OCIF
遺伝 f欠損マウスの歯槽骨ならびに菌根膜における組織学的検索
第4
2
回歯科基礎医学会総会、 2
0
0
0年日月 30-10月 1B、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :1
1
2、2
0
0
0
江尻貞一、田中みか子、河野正司、小津英浩:
エストロゲン欠乏によるサル顎骨の構造変化一マイクロ CTを用いた解析ー
第4
2回歯科基礎医学会総会、 2
0
0
0年 9月30-10月 l日、大阪
i
語科基礎誌4
2(
5
)
・1
1
3、2
0
0
0
川i
本真郎、江尻貞
、田中みか子、長岡英一、小浮英治
ITH
持続投与によるラソト下顎骨の組織変化
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第 42回歯科基礎医学会総会、 200C 年 9 月 30~ 1O月 1 目、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :1
1
3、2
0
0
0
池亀美華、星和人、川島博行、小津英治:
張力刺激により形成促進される骨基質の形態学的解析
第42図歯科基礎医学会総会、 2000年 9 月 30~10 月 1 日、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :1
1
7、2
0
0
0
田辺啓太、吉羽邦彦、吉羽永子、岩久正明、小浮英浩:
Er:YAGレーザ
を用いたラット臼歯議洞形成後の歯髄反応に関する免疫組織化学的研究
第 42回歯科基礎医学会総会、 2000年 9 月 30~ 1O月 1 日、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :1
2
0、2
0
0
0
演本宜興、新垣晋、小津英浩・
モルモット臼歯セメント質発生とエナメル上皮細胞のアポトーシス
第 42回歯科基礎医学会総会、 2000年 9 月 30~10 月 l 目、大阪
歯科基礎誌4
2(
5
) :1
6
1、2
0
0
0
国津輿平、星
和人、川本真一郎、田中みか子、江尻貞
、小i
草英治:
骨細胞性骨溶解の形態。学的検討
平成 1
2
年度新潟歯学会第 2回例会、 2
0
0
0
年1
1月1
1日、新潟
プログラム
4P
宮琳、星和人、中島民雄、新垣晋、坂井日出男、監物新一、江尻貞一、小湾英治-
BMP2により誘導される異所性骨に対する b
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eYM175の影響
目
平成 1
2
年度新潟歯学会第 2回例会、 2
0
0
0
年1
1月1
1日、新潟
フ。ログラム
4P
近藤由香里、池亀美華、入江一元、小津英浩.
骨髄組織における間質系細胞ネットワークおよびその破骨細胞形成への関与:組織化学的ー微細構
造学的研究
平成 1
2
年度新潟関学会第 2回例会、 2
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年1
1月1
1日、新潟
ブ。ロク守ラム
4P
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細矢明宏、吉羽邦彦、吉羽永子、星
和人、岩久正明、小津英浩:
ラット臼歯の皮下移植後に形成される歯髄腔内硬組織に関する免疫組織化学的研究
平成 1
2
年度新潟歯学会第 2回例会、 2
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年1
1月1
1日、新潟
プログラム
4P
篠倉恵子、池亀美華、花田晃治、小i
宰英浩.
ラット臼歯の生理的遠心移動における有細胞セメント質のセメント細胞・セメント芽細胞のオステ
オポンチンの局在と発現
平成1
2
年度新潟歯学会第 2回例会、 2
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年1
1月1
1日、新潟
プログラム
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