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乳業用乳酸菌DNAの腸管M細胞を合する免疫活性化機構の解明と - J-milk

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乳業用乳酸菌DNA
の腸管M細胞を合する免疫活性化機構の解明と
間接構を~尾した“生体訪御食品腎の開発研究
東北大惨火学続農学研究科教授粛藤窓夫
津
間七大学火学院農学長斉党絞め教授北
春 樹
[要約}
本研究 i
主
事L
際関由来DNA
による腸管免淡紋浴f
t
機織を鯵籾し,機能性 DNA
モチーブを有する乳後予選
を滋いた“生体妨綴食品"の閥多患の基礎を築くととをE!1iきとした。その幸喜多長,以下 i
こ主訴す知晃が得ら
れた。
1.乳業F総統重量的‘ 19歯車悲より染色体 DNAを務裂し,マウスパ 4 ヱ Jレ絞細胞に対するリンパ球綬~'i雪化汚
空会を解析したとごろ,乳費量関 1
9
J
1
毒
事
家2同総事去の DNA
においてその浴伎が認められ, y
議後 DNA
はリン
の多老若詫を誘導した。
パ主義に CD69
2
. y ウスおよびブタ目襲警警経緩主審議による乳酸菌滋体およびDNA
の滋過をフローサイトメト
1
)いおよ
および手L
費義務E
往来 DNAI
ま脇撃を上皮 i
こ付濁し
びレーザー顕微鏡を潟いて解析した。その結果,乳護費言語i
た後,
M線総壱介してパイニJ:.)I.-板 i
こ浸潤し s 免疫担当紙胞と接触することが明らかとなった。
3
. Lb
u
槙r
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c
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sN
I
A
IB6
由来のDNA
モチーフ給付ょにル板綴喜怒からのI
L
7,阪r
l
,
合 I
L
1
2,I
L
1
8,~-r
の重量生を i
勢強したことから,活性DNA
による腸管糸ザイトカインネヅトワークの制御が考えられた。
本研究により,乳酸菌DNAモチーフが勝後においてη11 およびη12~長の免疫応、答を護憲禁事する事が籾
らかとなった。また,乳量菱総および活性DNAI
まM細胞を分してバイエル絞 i
ニ取り込まれ,免疫滋当
溺胞とき費用虫する壌により腸管免霊安を燃?毒化するごとが溺らかとなった。本総3
誌で得られた知見は,
E
暴管系サイトカインネットワークを制御する DNA
モチーフを終つ乳議長官喜一を用い,感染症の予防効果
を宛揮する“然体防御会長義"の隠発の基織を緩くものと長丹後できる。
キーワ…ド;乳業 F
若
手
し
棄
を
簡
, DNA
,I
}ンパ球幼務化,ザイトカイン,パイエル綴, M華語路,機状細胞
[
1]研究の背祭および自的
我が留で隊生議認可の下ヨミまれた「特定事最終用食品 JI
ま
,
r
:J量生滋において特定の係縫目的で務理更を
するものに対し,その摂取により当該保健の図的が期終ゼきる旨の表示告する食品 Jと定義されてお
m,コレステロ
0
0
2
年 5月278;
混
在
, 2
9
6
1
協践に対して認可されている(1),その機能伎は盤競作
り
き 2
ール低減,要注E
E
降下, Ca'Fe
の吸収i
段滋などがあり,食品の糧費援としては発襲撃事L.乳酸菌飲料をベー
0
0
0
年 3J
Hニ籾治乳業(株)から発売されたプロピオヨーグル訂正子2
1は
スとするものが多い.また, 2
…162-
キ寺定保 f
建m
j
をおではないが, t
受性清炎や閣議愛媛
十二 t
憶綴淡蕩さらには符ガンの綴図官官とされる
3
H
e
l
i
c
o
b
a
c
t
e
rp
y
l
o
r
i
の除葱および総事会防御 i
こ寄与し (
2
),生体喜寿番事機能を有する食品開発のう色悪意 I
tとし
て詩号線されている e しかしながら後設の免疫応答金総活化し,
'
i
J
本防5
軍機能を向上させる特定係官霊殿
食品の開発は未だ実現して L冶ない。
発酵乳および手し酸菌はE
きくから健康食品として世界的 i
こ?協議きされてきた選手もあって,その生体裁節
,
機毒患が詳織に解析されつつある也波紋までに発勝手L.乳酸議の 1J
盟活'
1
1として 1)乳酸予霊祭による乳
成分の栄空襲約締穫の向上 (
3
),2) ま護隊作用 (4…6), 3) 血圧降下作周 (7-9),4) 抗服毒事件
m
(
1
0
), ;))主義変異原作F
目 (10-12), 6) 免惑を滋活化作朗 (
1
0
,
1
3,
1
4
) 宅撃が明らかとなっており,今後
さらなる研究の滋爆が媛待されている.やでも,乳駿蓄の発t
草する免疫総滋化作用に関する幸義告は加
v
i
v
o
,i
nぱt
r
oを遜じて多く,マクロブァージ (10,
1
5
ト
1
7
),細胞際努狩E車
部
組 (
1
8
),NK
綴喜告の f
佼↑定化
(
1
9
) やI
F
N
rを始めとする各種サイトカインの重量佼筋線 (
2
0
2
5
) および抗腫疫体総 (
1
0
) や抗アレ
ルギ一作用 (
2
6
) などが知られている c
以上の研究成多震をさ義礎とし,章受汲になって手L
般若蓄を湾いた淡総予防の考えが,より一塁雪主主関される
ようになった n 乳重量関 1
;:1:安全性;ニ後れているたみき食品誌として経口約 i
こ渋取することが可絡であり,資
r
酸耐性,塁塁 霊長耐性に毛{祭れているため,まさ害義的に H
量管まで災遺し ,R
議後免疫の、溶性化告発搾できる
と綴待されている (
2乃。経口投与した乳重量言語が発揮する免淡紙活化作賂としては 7 クロブァージの活
性化 (28-30) やム a
c
i
d
o
p
h
i
1
u
s
およびL c
a
s
e
i
の
,液化後関連リンパ総選議 (
G
A
L
T
) を分する I
g
A
際
空
駐
車
際
空
室
作用などが季設をきされている (
3
1
)。また,ム c
a
s
e
i
が1津細胞の機能を光議するととにより抗日重湯作般を添
すととも殺を告されている (32) 。これら演し義義務による感染妨綴,抗腫曜~M認が直接的な機長支綴留や1重男事
綴総 i
こ対する{墨彩作用ではなく,京芸主の免主主力を増強することにより発事事されるととは,綴内菌緩や
mが限緩となる抗食物質や貌7!ン舟jなどによ乙絞し,より好ましい予防法につなが
免疫糸 i
こ対する副作
るものと茶話線できる。さらに,サルモネ予緩や病原 f
並大綴磁を始めとナる食*簿登首は勝守若松緩を介し
て感染するが, ~F表裏口約抗原投与によっては~,!署殺免淡から機管における独立した粘主翼手立史認システム
を十分に総浴するととが出来ないのに対し,総 o
投与した乳量豊後は綴管免事誌を設支援量産活化することに
より,手ド豪華口投与によ七べ紛果的;こ感染妨害草作用を発郷できるというやj
点がある (
3
3
,
3
4
)。
乳業活乳機関長免疫獄沼化作用を有する食品として事護者義的;こ利用しようとする場合,その活性化閃
予の同定は必喜善不可欠である。撃も繁華麗由来免淡総深化滋子 l
こ隠する研究は,官自体幸運霊き壁成分 (
3
5,
3
6
)
や図体外多糖成分 (37-41) がその鴻1
'
全国子とし℃線告されて Lミる。我々のとれまでの研究により,
筑業湾筑後簡の DNAにおいて碑臓Bリンパ擦を幼若化寸る DNA
モチーフが潟定された (
4
2,
4
3
)
0DNA
の免疫賦鴻化食器については 1
世俗学,大腸菌凶米DNA
中の終9
型的配列 (CpGモチーフ}金!, l
i
ま接B級胞
を?活倣f
とすると貌!1告され, DNA'
の生君主活性がタ oーズアップされた (
4
4
),CpGモチーフは, Bリンパ
E
事の者警護憲誘導 (
4
4,
45
),抗原特異的抗体の産生 (46-48) およびサイトカイン分泌誘導 (
4
喜
一5
2
),
NK
綴胞の機関鴻牲の増大 (
5
3
) や各種疾病 l
こ対する総効薬(アジュパント)的役綴 (
5
1,
5
4
)害
事
,
繍キの免疫義主総化作間を持っととが報告されている。しかしながら CpGモチーブの務管免書誌に対する
噌EA
内
δ
p
o
作f
f
lおよびそのメカニズムについては語学紛な検討が立されていない。 CpGモチ… 7
1
主総主主のような強
A
託宣武穏化作用を有するが,食品成分どして大勝菌由来成分を用いる之とは隊第話可?あり,さらに敗
いi
5
5
) など,創作閣が指摘されている e そこでコド餅究では CpGモチーフ
成後後ショックを引き起こす (
の勝後免疫に対する践活
のこれまでの知見を墓;こ,安全性が機縁在れている乳業用乳酸菌とそのひNA
容を祭暴露;ニ解析することを償金きとした。
化作F
立乳業用享L
重量霊童白米の
本長野究 i
m守A
!
の2
議後免疫 i
二女まする作用を発縦約に発事燃することにより,
2
1世紀
において疾病を予防する機能然 DNA
を手ぎする乳畿濠を用いた未来食品,“全然防御食品"の創製の基
礎を築くものと考えられる。
[
2
] 研究計画および方法
本研究では,疾病予防機総伎の DNA
を有する乳酸菌を周いた“体“体防御食品"の創製の慕礎を築く
重量簡はD長の DNA
の務管免疫に対する作 f
f
lを多話機的に解明する。具体的には
ととを白書きとし,議議期李L
以下の研究を遂行した。
こ対する免疫窓洛1
1:援を有する総書菱重富鼠来DNA
の選抜
1.麗管免疫に重要なパイヱル主要綴ll'&1
L
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商
事
業
安 8
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印 税o
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1
室
稼
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I
u
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グループ 8D
毒事去の計1
宮菌株について γ
ウスパイエル板細胞に対する幼液化添牲を検討した。
によるパイエ!t,.板級胞における務?主化繊総について,綴喜程表i
l
i
i
l
こ発現する務
乳業用乳酸菌凶米DNA
C
D
ω
)をf
詩燃として,解析した。
性化抗原 (
1)供試乳酸菌
実 験i
こ用いた若議事孝の名称および起源をT
a
b
l
e
.
l1
こ治した。
2) 蕊業滋裂選愛媛がもの染色鈴 DNA
の器製
La
c
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;
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也でそれぞれ 3防総代域安委 (
3
7
'
C,2
4
草寺潔}後, 5
0
m
l
めま遊泳 i
こ協接種し, 3
7
'
Cで1
6
時間安藤安委した。
b
r
o
菌体を集菌し,ワゾチーム{主主化学工業,東京}および?もア-l:!チ}t,.ムラミダーゼSG (,生化学工幾〉を
T
a
KaRa,京都}によりタンパクを分鯵した。ぬ号事長ヱタノー J
しでき京畿
加え溶蘭後,プ口ディナーゼK (
を沈殿させ,手伝じた沈殿を滅的‘したガラス棒を附いて縁者絞り
1
7
'
岩手長エタノ-}t,.で苦もき争後, T
E
*
選総液
に溶解した。対~A を分時半後の核般を TE緩衝液に F露骨干した。以上の操作で DNAが続奪還され,主主F詰まで
の
罪
悪4
.
C下でi
柴みした。
針案警養護毒物
S
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協cp
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皿)を胤 L、
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.
:. γ ウスは 5
遜歯告のt
設を総人し, MR
ブザーダー{録主幹線滋ζ
:楽}および水を自由摂取させ, 3
定数 l
こは 6…1
0
l
魁齢
のマウスを闘いた。
…1
6
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NCFB2490
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NIAIyB62
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OLS3002
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OLS3059
y
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OLS3060
y
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g
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OLS3073
y
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PN-Ri-2
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泌総
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母
,
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e,加 m皐n(
皐お1t)
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JC
忌1
201IT
泌総s
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日
L
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JCM113JT
I
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L
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l
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v
o
r
u
s
肇
4
)マウスパイエル板銀総の調製
BALB/cマウスの腸管を搬出し,パイエル板を切りIilした。バイエ Jレ板をガーゼ中で良くほぐし,
B
S
<
!
'I
こ溺坊さ-tr,細胞浮滋託費を自問製した。紛胞は洗浄後,最終的に 10%牛胎児血
パイエル板綴胞をP
液 (
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句
I
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SA) を合主r
R
P
M
I
1
6
4
0潟地 l
こ懸溺し,とれをバイエル板級胞懸濁液
とした。
5
) マウスバイエル緩線路i
こ対する主主務イヒi
議後
事6
1¥マイクロプレート
(SUMITOMOB泌 総UIECO.
,
I
.
:
η).To
勾10,
J
郎副1lの各穴に細胞懸濁液を 1X
10'吋1s/問主になるように分主主し,言緩豪還したひNA~ lO pg/叫になるように添加し,府MI-1640
(
1
0
%
F
C
S
)
で 5%CO
,
,3TC,4
8
B
寺湾総後した。主義型金銭安建設ま草寺としてLi
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4,SIGMA) またはC
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C
∞A:
Tc
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l照 i
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喜
朗
,S
IG
MA)を思い,それぞれ最終濃度が
2
0
μg
J
n
せおよび 2pg!
漁民こなるように滋叙した。また,大綴讃DNA
において j
吾i
定されたマイトジェン活
P
GODN1826(
5
'T
(
にATGACGrro
口'GA
CGTT3
)およびさき研究室主でム
性を有するオリゴヌクレ会チド C
'
出W
を
ふ
b
u
l
g
a
r
i
c
u
sNIAIB6DNA において民主主したマイトジェン r~ 性オリゴヌクレオチド OLLB7 (
5
'
CGGCACGCTCACGAγrCl
寸G3
つも同時に試験した。培養終了泌雲寺跨前に, [
5,6'
H
]U
r
i
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i
n
e
出n
ershamp
h
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) を9
.
2
5
紹 q
/
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e
l
l
添加し,パルス予ベ)L-した。総務終了後,むレハーベスター
(LABOMA8HLM1
0
1
6器5,LABO8CIENCECO,LTD) を続いて細E
告をガラスフィルタ… (LABO
必5
5
,lAB
O8CIENCECO,1:百)ょに I
H
J
I
寂し,放射活性を液体シンチレーションカウンタ
MASHLM1
0
1
ーで測定した。ワンパ稼幼若化波紋 i
ま,以下の式を F
裂いて S
白n
u
l
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語以d
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8.
1
.
)
を
君
事l
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ちして相宣言平奇襲
した。
8.
1
.
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匂r
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)
]I[
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ei
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同r
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u
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d
)
]
i
nc
o
n
t
r
o
l
l… (
6)事L
駿緩ま往来 DNAによるマウスパイコEル絞における治性化姻践の解析
方法 4
) Iこ従 L り f イニI:. JL-~話線胞を鍛裂した e 幼若化浴依然殺において語道い渓性が認められた葱株の
おNA
について,パイエ JL
板綿l
胞における CD69
発現誘導書きを議事柄した。すなわ'02
4
穴マイクロプレー
ト(
S
U
M
I
τひ
主
主oBAKEL
ロE CO.,LTD.Tokyo,Japan) にノ fイエル絞綴胞懸濁液を 4X10'cel
1
s
/
w
e
院
に
なるように分注し, C
hromo
拍 ma
1DNAを1
0戸富1
m!になるように添加し,設5
∞戸i
のF
院
で
, 5%CO"
3
7'
C
, 2
4
時間縞獲した。泌総化された綴喜撃の問A:は技CD6
告主主体を用いた抗争主主義色法により f
fったか
2
. マウス腸管バイエル板およびフタ麗管における富車体およびDNA!
の返還と免疫鍛潟総合性の解析
豪華口投与により勝後 l
ニ到達した乳隊関およびそのひNA
がバイエル微において免疫綴滋細胞と援発生
し 免疫総滋化作用を発事事できる事を謹建設する目的で
B
?ウスパイエ J
L
絞綴ぬおよび騰を野総選議培養に
より解析した。さらに,免淡路武双 陸乳酸菌, DNA
およびそチ…フの綴管における通過解析をたトモデ
i
)L-~患として期待されるブタの勝繁華長織培養により検討した。
1
) 供霊式詰車体
L
.g
a
s
s
e
r
iJ
CM1
1
3
1
T (
LG) およびムぬお制c
u
sN
I
A
IB6(
L
B
) の凍総事霊会議粉末を調製し,多名高実に使
燃した。
2)供試DNA
お
楽 DNAc
I
o
n
e(
L
B
b-40)を合主F
プラスミド p
LBb
4
0より LB
与4
0の級事選を PCR (
p
o
!
y
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e
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a
s
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LBE
話o
n
) 淡により f
fった.時ヨ総DNAIまフェノール抽出,エタノール汰媛を f
fい,最終的 i
こ1mg/
m!1
こ
r
e
a
c
なるようミリ Q;1えに綴濁し,俊子詩までの問 20'Cで事長存した.
3
)F
I
T
Cを湾いた事 L
Il童書留の蛍光標識
凍結絡先撃した LGまたは工殺を 100mg/1容認誌の濃度で、 PB8に潟慾濁した。言語体塁手、潟液 l
こ1m
悲の還元型
FITCを加え, 4'
C, 1時間イン'fュペートした。来反応、の FITCを絵去し a 議室終的 i
ニE
童
話
室
をR
P
M
I
ω
1
6
4
0
縦約 l
こ懸濁し,古車問までの関 20'Cで保谷した。言選手容のF汀 Cラベルは,フローサイトメトリーにより
確認した。
4) DNAc
l
o
r
憾の AτC
蛍光線滋
La
b
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1
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i
t(
T
a
K
a
R
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, kyoto多 jap担)を問いて行った。 FITCl忍:b-4Oは,車審議~t豪
-166-
3 %アガロースグル官尊気泳動 i
こを共し, M
o
l
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c
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紅 F
文 (
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s,CA) によ
ぼ℃養護織を総認し?と金
りF
5)災事貴重書物
S
p
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自cp
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S
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) BALB/c7ウス(Ja
p
鵠 S
LC
,S
h
i
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鵠 k
a
,
]
a
p
a
n
) は 5,緩織のま差を購入し,
M Rブリーダー(日本幾康工業)および水を白幽摂取させ,き建議案;こは 6-10
道重量舎のマウスを用いた。
LWD
綴ブタ(La
n
d
r
a
c
e(
L
),L
a
r
g
ey
o
r
k
s
h
i
r
e (W) の れ に Duroc (D)舎交配させた 35[;交豪華種〉の
Da
yO)は(株)ヒ jレズ(寓城燃}より購入した。
初受{子ブタ (
6) F
I
T
C
標識オリゴヌクリオチドの合成
F
I
T
CまたはBio
出 標 識CpGODN1826,O江 B7
,AT
5
ACL (
4
2
) (5'TATMγITITACCAACTAGC3
':
当
級交宣言でL
.g
a
.
田e
r
iJCM1
1
3
1
τにおいて悶定した幼務化滋燃を手まずる DNAモチーフ)の合成はSawady
玄関:
h
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.L
t
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.(
T
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Y
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)1
こ依頼した。
F
I
T
C
綴設事オリゴヌクレオチドは付属のデータシート l
ご従い,
ミ
ヲ Q本 i
こ1mg/ml
の濃度で溶解した。
7)マウス軍事猿およびバイエル緩ま泊施における滋君主ォ
υごまヌクレオチドの結合特性
1
.
5
m
l
マイクロチュープ;こマウス綴君主滋き毒液 (
5
)
く1
グc
e
l
l
s
/
5
o
of11)を分注した。 100mg/μlになるよ
TC
標 識CpGODN1
8
2
6,OLLB7,AT5ACL
およびH20を加え, 3
7"
C
ま 4時間組転させ
うにそれぞれFl
告は洗浄f
表,各警護主主体処理し,:tリゴヌクレオチドの結合および取り
ながらインキュベートした。綱5
込みをフローサイトメトリーにより解析したか
8)フタ腸管組織培養における FITC
綴 総E
草分子の取り込みの書等級
発く沈主争後,見署管を 6cm
程度;こ切り,一線を滅菌した然糸で絡
初生{子ブタの腸管を摘出し,管殿内を t
口じLG,FITCLB,F
I
T
司
心LB
b
4
0
およひR
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M
I
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1
6
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こ入れ残りの一裁を緩んだ. :
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んだ。 F
i
こjJIl潟しておいた RP
l
¥
位.
1
6
4
0
ゆでサンプノレを入れた勝管断片を 3
7
'
C,0
.
5
-6待関培養した。主義委主終了後,
で良く洗浄し,月善寺野総織を PLP
詩号訴主で悶定した。組織はT
issue.TekO.C.T.Compound
内 総 を PBS
S必G双 AF"
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lC
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.,Ud.
,
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O,
J
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関口) I
こ泌総包捜した。クリオスタットにより作成した燦さ s
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1mの凍結窃廷をP
o
l
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L
L
y
む減措したスライドガラスにのせ,サボニン処理後,四.
t
i
.
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u
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制刷。,k
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恥
1
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b
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y (SIGMA) を 4'
C,14
野
寺
院
号f
送船させた。次いでA
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,田u1arPr
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,
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践で1
時間反応させた。Pr
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)で
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,
A USA) で封入した。綴誘導 l
ま災会長点レ
R
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1
0
2
4
iE1iタイプ;級品必La泌総o
r
i
偽CA,むS
A) を熱海て行った。
ーザー顕微鏡(JI;1
3
. 活性 DNAおよび DNA
モチーフによる務管系サイトカインネットワークの総額
モチーフおよび機体が緩管において誘導するサイトカインをパイヱル者猛毒揺自主主義喜重お
活 性DNA,DNA
I,去により解析し, >>量管における感染務者理系サイトカインネットワー
よび腸管組織培養を行い,庶民PCR
クの制御を考堅持した。
1) DNA
実験 i
こはL b
u
l
g
a
r
i
c
u
sN以 1B6chromosomalDNA (LB-DNA) およびOLLB7を燃いた。対日震として
-167ー
C
p
G
1
8
2
6を用いた。
2
)パイJ:)(...絞車問胞におけるサイトカイン縁者事
4
穴マイクロプレート i
こ4X1
0
'
c
e
l
l
s
/
w
e
l
lになるように分主主した c
マウスのバイエ)!.-緩綴総!懸濁被告 2
サンプルとして L
B
・D
NAまたは O
L
L
B
7をそれぞれ1
0"
g
/
m
lまたは 1
0
0"g/ml になるよう添加し,~霊
5
0
0
μ
1
0)系で, 5
%CO" 3T'
C
,
1
2
時!調主審議‘した。ネガティブコントロールにはミリ Q水,ポジティブ
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こはC
p
GO
D
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1
8
2
6(10
0戸g
/
n
u
) をそれぞれ添加し,まき絡には RPMI
1
6
4
0(10
兎
.
F
C
S合)
コントロ… J
を周いた。
3)袋署警縮胞からのT
o
t
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lRNAの寵製
m
lマイクロチューブに凶 i
侠し,付事ま細胞はプレートの各ウェ )
!
.
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(
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,G
r
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n
di
s
泌総, NY
,USA)
を詮~凶収した e 総務液を浮i務細胞のベレットに加え,完全に
量銀総を溶解させた。言葉話誌で 5分長著書支援した後,クロロホルムを金設え激しく後手事し,遠心分隊
,
0
0
ω
f
,
事
(
15
4'
C
, 1
5
分間)後,水産喜を新しいマイクロチス}ブ i
こ
差
益i
反した。後m
した1
1
沼z
o
lR
回依然の
震で 1
0
分間放室主義,定量心分量産(15
,∞Ox
g
,
さ予分量のイソプロピルアルコールを加えよく繍搾し,室主 j
4'
c,1
5
分閲}し,上洛を除去した。冷7
5
%エタノー)!.- (悶I[a
配 合e
e
)法主争後風車z
(~室温, 1
0
分間)し,
s戸l
のD
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C
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i
Ol
こ溶解し R
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サンプ)q
ごした。
こ
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4
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畠i
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)記長によるサイトカイン誘導撃の解析
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) を周 P"trった。す
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RNA
をテンプレートとし季
なわちマウスパイヱル季語紙約より議事還したτ
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8
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i
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-1
0,mIL-12p40,mIL
-18,mIFN-y,mTNFαprimerを用いて
I
I
T
P
C
Rを行った。用いたサイトカインプライマーの配列はT
a
b
l
e
.
2に示した。 PCR
反応液は"3%アガロ
c
i
o
nimagev
e
r
.1
.6
2
c1こより各レーンのバンドのデンシトグラムを得た。得
ースゲル電気泳動に供し, S
られた数値を β
a
c
t
i
nを用いて補正した後, S
t
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u
l
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S
.1.)を算出した。
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r
o
l
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a
c
t
i
n
)
[3]研究成果
L 腸管免疫に重要なバイエル板細胞に対する免疫賦活化能を有する乳酸菌由来 DNA
本研究では乳酸菌由来 DNAについて,腸管免疫に重要なパイエル板細胞に対する免疫賦活化能を比
較検討した。
1)乳業用乳酸菌DNA
のバイエル板細胞に対する幼若化活性
幼若化活性試験に供試した各種乳酸菌由来 DNA
は電気泳動により RNA
の混入がないことを確認し,
またその純度は O
.
D
.
2
6
0
/
0
.
D
.
2
8
0
=1
.
6
-1
.
8の間であった。バイエル板細胞に対する幼若化活性試験を行
9菌株の内 6菌株 ,L
.b
u
l
g
a
r
i
c
u
sNCFB1979,NIAIyB62,NIAIB6,
ったところ,供試した乳酸菌 1
NCFB2
0
7
4,S
.t
h
e
n
n
o
p
h
i
l
u
sOLS3
0
7
3,L
.g
a
s
s
e
r
iJCM1
1
3
1TのDNAにおいて有意な幼若化活性が認め
られた (
S.
J
.
=
1
.7
2
.
2
)。
2)乳業用乳酸菌DNA
のバイエル板細胞における CD69
発現の増強
CD69はリンパ球の初期活性化マーカーとして報告された細胞表面抗原である。そこで, CD69発現
の誘導を指標として,乳業用乳酸菌由来DNA
によるマウスパイエル板細胞における活性化細胞を解析
した。
幼若化活性が認められた 6
菌株 ,L
.b
u
l
g
a
r
i
c
u
sNCFB1
9
7
9,NCFB2
0
7
4,NIAIyB62, NIAIB6,S
.
t
h
e
r
m
o
p
h
i
l
u
sOLS3
0
7
3,L
.g
a
s
s
e
r
iJCM1
1
3
1TのDNAについてノ t
イエル板細胞における CD69の誘導能
を解析したところ, CD4/8およびTCRα /s陰性(R2)の細胞集団において全ての菌株の DNA
が強い
CD69の発現誘導を示した。また, CD4/8
陽性およびTCRα/β 陰性 (
R
3
) の細胞集団においても,全
ての菌株の DNA
により CD69の発現誘導がされた。 L
.b
u
l
g
a
r
i
c
u
sNIAIB6,NIAIyB62,NCFB1
9
7
9,L
.
T
g
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s
s
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r
iJCM1
1
3
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,S
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n
n
o
p
h
i
l
u
sOLS3
0
7
3はCD4/8
強陽性およびTCRα/β 陽性 (
R
4
) の細胞集団に
対して CD69の発現を誘導した。 CD4/8弱 陽 性 お よ びTCRα /s陽 性 (R5) の 細 胞 集 団 で は L
.
b
u
l
g
a
r
i
・
cusNIAIyB62,NCFB1
9
7
9のDNAにおいて CD69の発現誘導が認められた。 OLLB7およひ1CpG
ODN1826は全ての細胞集団に対して CD69の発現を誘導したが,特に CD4/8およびTCRα/β 陰性
(
R
2
)
, CD4/8陽性およびTCRα /s陰性 (
R
3
) の細胞集団に対して強く CD69の発現在誘導した。各細
胞集団における CD69
の誘導活性を T
a
b
l
e
.
3にまとめた。
-169ー
T
a
b
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e
3 I
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1CD69m
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sshowni
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R2
R3
R4
L
.b
u
l
g
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i
c
u
sNIAIB6DNA
÷
+
+
NIAIyB62DNA
+
÷
÷
+
NCFB1979DNA
ト
ベ
十
+
4
ム
NCFB2074DNA I
+
+
ト
ベ
+
+
S
.
l
h
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r
m
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p
h
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l
u
sOL53060DNA
+
十
ト
ベ
OLLB7
÷
+
+
ト
イ
+
+
÷
÷
+
ト
→
4
い
+
L
.gasseriJCM1131TDNAI
CpGODN1826 I
Co
nA I
R5
ゃ :i
n
d
u
c
t
i
o
n
制:noi
n
d詰c
t
i
o
n
2
. 腸管線総による関体およびひ対Aの通過と免疫総総結合後
毒
装 D投与により腸奇警に到達した事L
l'i菱重喜およびその DNA
がバイエル板において免事託銀当主題ぬと緩触
こより統明した。
し,免疫賦活化作用を発抑マきる惑を務管組車緩ま長餐 i
1)マウス牌臓の告H重暴露主題集問における寸リゴヌクレオチドの結合性
3
種類のオリコ、ヌクレオチド (CpGODN1
8
2
6,OLLB7,AT5ACL) の,マウス線建議各緩車問胸集団
(Ma
ゃ1
,CD45R
,Thy
1
.2
による解析)に対する綴合伎を解析した。全てのオヲゴヌクレオチド会'Ma
c
-1
重量除後 (
R
4
) および絵性(R2)のま援!滋集団に対して主主く総合した。絡に, AT5ACLI
立主主総ω
1陰 性 の 級
) において特 i
こ緩く結合している (
MFl>lO')綴凝集団が総められた(Fig
.1
)
. CD45
廷に
胞築思{廷2
よ る 解 析 で は OLLB7
,CpGODN1826
が 弱 陽 性 お よ び 重 量 陽 性 紛 胞 築 留 保3
) において号室く総合し,
AT5ACL
は陰紋および弱隣子生総飽築関(R2,ま3
)1
ご対して絡会性を主訴した (
F
i
g
.2
)
.T
h
y
1
.
2による紛争苦
こ結合総が認められ,中でも陽性総ぬま薬問(R3) i
こ対してやや高い総合性が認め
では全ての細胞築関 i
られた。その総合後はAT5ACL
で
、
重
量L、傾向マあった (
F
i
g
.
3
)。
2) マウス軍事崩事細胞またはバイエル板綴療における OLLB7
の結合締役
FITC
機 識 OI
よB7幸碑1
蔵糊ぬまたはバイエル綴暴露紹 i
二女すして 3
7
"
C 4時間以Jb.させ, CDl
1c
および
望
NK
l.1により細胞築関を解析したところ警 CD
l
1c
険性綴飽およびNK
l.l除除級殺において重量いき読光強度
I
>1
0
'
) が認められた。バイエJt
-t
経細胞に対して打TC
綴 織OLLB7を3
7
'
C,4
時間反
を夜する縦約 (MF
,CDl
1c
,NK
1.
1,CD4,およびCD8により綴賂築関を解析したところ, CD45R
務綴性,
応さ-lt, CD45R
CDllc
険性, NKl.1~毒性級胸君臨図において強い絡会牲が認められた(Fí時手心。
-170-
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-173-
3)レーザー霊護者数畿による OLLB7Oパイ.:r:JI
宅配綴胞に対する絡会般の解析
3
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C, 4時間反応させた F
I
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C擦言語OILB7
のパイヱ)t.-綴織5
告に文ますムる絡会性をレーザ…綴微鏡により
ITC
際 線O
LLB7はバイニt:)t.-綴総総 i
こ対し務擦に総合することが明らかとなり,またその結
商事析した。 F
合性は細胞によって奥なることが明らかとなった。
4) ブタ揺を警豪華審議主義獲における F
I
T
C
縁談話語分子の取り込みの解析
FITC-LG,FITCLB,2
告倍希釈 F
I
T
じL
B
l
r
4
0,ラテックスピ…ズのブ:;腸努総織機幾何時間)にお
“
B
b
紛いずれも緩宅雪上災者選華道議し,事告E
葉F総選議ま'1'到達していた。
ける通過を解析した。 LG,LB,L
みな総胞が存在したものの,その数は LG,
ラテックスピ…ズは耳鳴管上皮織もにおいて隠所的に取り i
LB,L
B
b
4
0と比較し,非常に少なかった。 LGは上皮への付恋愛および上皮を透過し総長量へ浸潤する委主
G1
まサイトケラチン 1
8険性の細胞から組織に取り込まれ,近傍 i
こ
が LBと比較し紛らかに多かった寺 L
位置する喜怒毛主義援捻もしくはマクロファージ;こ取り込まれ,消化されるととが紛らかとなった。 LG,
LB,L
B
l
r
4
0
の綴織への浸潟 i
主総もおよび主主言語弱方において主主践できたが,終i
こ整案言語の下方における粘
膜下組織で(f;く検出された。これらの高高架から初生仔ブタ耳議後において言書体およひ:n災Aといった高等分
をは分子によって災なることが籾らかとな
子が綴織に絞り込まれることが明らかとなり,またそのねE
った。
3
. )議後ONA
お よ びONA
モチーフによるま署管系サイト 1
1インネットワークのIIil
J
御
活侠 DNA,DNA
モチーフおよび関手本が緩管において益義務するサイトカインについてバイエル総事副総
培養を行い,
Rr
-PCR
法により解析した。
1)パイ.:r:JI
緩細胞にお付るサイトカイン誘導
l
パぜニι
J
レ緩綴絡を L b
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官民1B6
由来DNA(
LBDNA) およびOL
l
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1こより 1
2時間刺激し
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C
設により Z
量管系サイトカインの発漢を解析したところ, LBDN
Ai刺激により I
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L
l
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, I
L
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L
-1
8の然現が誘導され(それぞれ5.
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.
0
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.
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車織により I
F
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L
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L
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2,I
L
1
8の多費税が誘導された(それぞれ S
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.=1
.4
,2
.
2,2
ふ1.3
)。ポジティブコントロールとした CpGODN
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F
N
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L
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0,I
L
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2,I
L
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8を誘惑事した(それぞれS
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.=1
.
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,
2
.
0,
1
.
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,3
.
0,
1
.5
)。
1
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2
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1
2) CD4
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f
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I
絞綴君主集聞こ必けるサイトカイン遺伝子発現の誘導
OLLB7で 1
2
時間刺激したパイヱル緩綴雪量一祭主遣をま完 CD45
ま抗体を殉いた綴気分離法 1
こより分闘した。
CD45RJl鎖性紛胞集団は綴気分露益法により 5
4
.
6
%か ら 鈴5予るまで純化でき,一方ネガテ
fブセレクショ
陰'険制H
視線開は 4
5.4%から 98.2%となった。金級建設悩分, CD45
豆際空主滋分および
ンとなった CD45R
CD45
波長会絵画分におけるサイトカイン遺伝子の手話機を解析したところ, C
D45R
陽性画分において I
L
l
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,
I
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1
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.
お
お2
.
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.
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.
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)。また CD45R
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0,I
F
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,1
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)
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,
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れた RNA
の援が少なかったため, I
L
-1
2,I
F
N
-y ニ隠してのみ解紛することとした。 CDllc
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主総量話集
Dllc
絵倹網野智然関はいずれも OL
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1こより I
L
-1
2お よ びIFN宮の発現が言建議されていたが,
sIIおよびC
CDl
1c
験後綴費量集団における I
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2,I
F
N
-yの発機議導はそれぞれ S
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.
3と,勝↑金納胞集団 (
S
.
層処
A
喧
n,
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A
1~1. 7.1.5) より主義いものであった。
[4]今後の媛議
事L~淡路~I立一般にη11 系の免疫応答を誘導するごとが知られており,その?選後 E喜子埠~*輝君き塁主主主分でみ
る芸評が等製f
きされていたが,本研究により,乳酸菌DNA
モチーフが CpGモチーフと似た浴然を有し,特
i
こ
主
幹
事
若3
認で初めて腸管においてη11および 2系の免疫応答を総務ナる療が明らかとなった。この乙と
成I
話作 f
f
l
lこ事寄与する可能性を示唆する色の
は説話芸議後五充分と相乗的に作用するごとにより乳酸閣の免疫j
f
lし,経口約摂取
三をある。 ηはおよび 2系免疫応答を制御する活性DNAを手まする乳機関を発勝手しに後 f
金大勝目盛といった病原性縦菌やウイルス
により車種施鐙および液性免疫が戴沼化し,サルそ才、うや病以f
にまずして慾染防御作用が発拝される食品の繍発が大いに期待される。…方,乳酸菌に組み替えタンパ
タ後を安芸渓させるごとにより,経口約に祭詩文したタンパク燃の主主滋活性を勝管で効果的に発揮させよ
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rらは火葬器炎の治療究会主裂を手ぎする 1
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0を発現させた工l
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うという試みがまされている。 S
こ豪華口投与するととにより,炎症反応が事p
えられ有意に疲状が改替
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sを,大鰐炎発症モデルマウス i
,
5
6
)。また五十数は書道芸票数主義番号のまえ霊祭を撃し重量E
震に残波させた経口ワクチンの伺J
it
説
される事を報告した (
伎を示唆している (
5
7
)。本研究により,総槻話路,"'<クロファージなどの抗原援示綴胞を活性イじさせ
は,これら繍胞のt
主主謀縫芝公脅撃を光発車することによりま主体重量生を港強することが考え
る乳殴衡由来DNA
級殺の主主体主量生後を増強することにより
られ,また B細胞を直接活性化する作用も手ぎすることから .B
乳厳菌の経口ワクチンとしての効果を地君主主する夜効なアジュパントとしての活性を示すものと考えら
の告を'殺体としてT
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れる。ごく最近になって. CpGDNA
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.DNAワクチンへの 0
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lも員選後
然免疫から獲得免疫系の制御に闘する新しい考え方がt
6
0
)。本研究で繰られた知Ji,は,多色里控目武?首化作悶を有する DNAを持つ乳酸磁を F
習い暑義革
されている (
理作用を有する機能然食品
主
義
務Z
E
あるいは終日ワクチン‘アジュパントとして感染主主の予防効果を事若
モチーフの勝管におけ
手事するさ主体妨害事食品の綴発の議後を築くものであり,今後 g さらに乳酸菌DNA
工R9を分するアジュノ T
ント浴後零を議事車援に検討するごとにより 2
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世紀の未来食品とじて,“主主体防
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[参考文献]
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