メーカー名 一覧表
貯蔵
略号
メーカー名
略号
意味
APB
Applied Biological Materials Inc.
室
室温
BCH
BioChain Institute, Inc.
冷
4℃
BIO
Bioo Scientific Corporation
凍
−20℃
BLG
Biological Industries Ltd.
BOT
Biosettia Inc.
CBL
Cell Biolabs, Inc.
CLT
Cellecta, Inc.
EXQ
Exiqon A/S
GCP
GeneCopoeia, Inc.
GNE
株式会社 iGENE（アイジーン）
GNF
ジェノスタッフ株式会社
GSC
Glycosan BioSystems, Inc.
MIR
コスモ・バイオ株式会社
MOR
Molecular Research Center, Inc.
NOG
Norgen Biotek Corp.
NUR
Neuromics Antibodies, Inc.
ORG
Origene Technologies, Inc.
SAB
Synvolux Therapeutics B.V.
SCB
Santa Cruz Biotechnology, Inc.
SIR
SIRION Biotech GmbH
凍
−70℃
液窒
液体窒素
研究用
miRNA
microRNA とは ……………………………………………………………………………………………… p . 4
miRBase ……………………………………………………………………………………………………… p . 6
LNA とは ………………………………………………………………………………………………………… p . 8
抽出 / 精製 …………………………………………………………………………………………………… p . 10
プロファイリング …………………………………………………………………………………………… p . 18
定量 …………………………………………………………………………………………………………… p . 24
検出 …………………………………………………………………………………………………………… p . 41
インヒビター ………………………………………………………………………………………………… p . 46
過剰発現（オリゴ ） ………………………………………………………………………………………… p . 55
過剰発現（ベクタ ー ） ……………………………………………………………………………………… p . 57
機能検証 ……………………………………………………………………………………………………… p . 66
次世代シークエン シ ン グ ………………………………………………………………………………… p . 73
siRNA
RNAi とは …………………………………………………………………………………………………… p . 78
配列解析サービス …………………………………………………………………………………………… p . 82
カスタム合成サー ビ ス ……………………………………………………………………………………… p . 85
コントロール siR N A ……………………………………………………………………………………… p . 86
デザイン済み siR N A ……………………………………………………………………………………… p . 87
shRNA 配列解析 （ カ ス タ ム 解 析 ）……………………………………………………………………… p . 91
shRNA クローン コ レ ク シ ョ ン ………………………………………………………………………… p . 92
si/shRNA 発現 …………………………………………………………………………………………… p . 94
ノックダウン検証 ………………………………………………………………………………………… p . 103
si/shRNA ライブ ラ リ ー ……………………………………………………………………………… p . 104
関連試薬
トランスフェクシ ョ ン 試 薬 …………………………………………………………………………… p . 110
その他 ……………………………………………………………………………………………………… p . 115
技術情報
miRNA プロファ イ リ ン グ ………………………………………………………………………………
miRNA 機能解析 …………………………………………………………………………………………
プール型 shRNA ラ イ ブ ラ リ ー ………………………………………………………………………
遺伝子デリバリー （ ウ イ ル ス ）…………………………………………………………………………
p . 120
p . 131
p . 136
p . 144
microRNA とは
miRNA
ゲノム上にコードされた内在性の
siRNA
䜴䜱䝹䝇 㻾㻺㻭
小分子 non-coding RNA
ᑟධ㑇ఏᏊ
㌿෗≀
䝖䝷䞁䝇䝫䝌䞁
miRNA Gene
Nucleus
R dR P
Primary-miRNA
rt
in
5
標的 mRNA に特異的に結合し、
intermolecular
pairing
Dicer
Ex
po
Precursor-miRNA
*
Dicer
dsRNA
Drosha
mRNA 切断または翻訳抑制を行う
*
Cytoplasm
多くの場合、ミスマッチ配列を含んで
siRNA
duplex
miRNA::miRNA* duplex
*Unwind
Asymmetric RISC assembly
Som
miRN
標的を認識
e
As
mRNA cleavage
Translational repression
microRNA (miRNA) は遺伝子発現の調節に重要な役割を果たしている小分子（∼22塩基前後）の non-coding RNA のひとつです。転写後レベルで作用するこれらの
興味深い分子は、
全哺乳類のタンパク質をコードする遺伝子の約60%程度を発現（微）調節する可能性があると考えられています。
miRNA は発生や生理的過程、
アポトーシス、
細胞周期制御といった多くの生物学的プロセスに広範囲に関与していることが示されています。
これらには、
幹細胞の分化、
造
血、低酸素症、心筋および骨格筋の発達、
ニューロン新生、
インスリン分泌、
コレステロール代謝、老化、免疫応答およびウイルスの複製が含まれます。さらに、組織特異的に発
現することや、
胚発生時に時期特異的に異なる発現パターンを呈すことから、miRNA は分化と組織固有性の維持に重要な役割を果たすことを示唆しています。
健常者における上記の重要な役割に加えて、miRNA は多種の癌、心疾患や神経疾患など多くの疾患に関与することが報告されており、それらの診断および予後のバイオ
マーカーや薬物反応予測の候補因子として注目されています。
miRNA は、
標的 mRNAの3'UTR 内に存在する標的部位に結合することによって、遺伝子サイレンシングを誘導することが知られています。この相互作用により、
タンパク
質の翻訳抑制と mRNA の分解、
またはその何れかが起こり、
タンパク質生成が阻害されます。mRNA 上の miRNA 標的部位のほとんどはその一部のみが miRNA と相補
して作用するため、
個々の miRNA は約100種もの異なる mRNA を標的する可能性がある上に、
個々の mRNA には異なる miRNA に対する結合部位が複数含まれる場
合もあり、
複雑な調節ネットワークを形成しています。加えて、
多くの miRNA は非常に類似した miRNA ファミリーに属します。
miRNA の特長およびその検出実験の問題点
短鎖：mature miRNA は16∼29nt程度
一般にプローブの Tm 値が低い
プローブの Tm 値をそろえにくい
存在量が少ない：miRNA は totla RNA の 0.01％ 程度
配列が類似：種族間や miRNA 間で1塩基違いのものが他数存在
第二に、miRNA ファミリーの配列は非常に類似しており
「わずか1塩基違い」のものも存
在するため、それらの検出には1塩基のミスマッチを識別できる特異性の高さが求められます。
従来の DNA や RNA 技術では克服困難であったこれらの問題を解決するため、
EXIQON
社では LNA 技術により結合親和性と配列特異性を飛躍的に向上させたmiRNA 研究ツー
ル "miRCURYシリーズ" を開発しています。LNA 技術の詳細は p.8 ∼ p.9 の「microRNA
miRNA の研究の課題は2つあります。
プロファイリング・検出に優れた Locked Nucleic Acid (LNATM)」をご参照ください。
第一に、
miRNA は22塩基程度と非常に短鎖であることです。
このような短鎖配列の検出は、DNA を利用した従来の検出方法では感度が不十分であり、
信頼性のある結果を取得することが困難です。
microRNA用語説明
Precursor miRNA (pre-miRNA) とは：
Primary miRNA とは：
核内でゲノムより RNA pol II により転写される1本
鎖 RNA で、キャップ構造やpoly(A) テールをもつ。
m7Gppp
AAAAA
核内で primary miRNA が Drosha に切断され生じる 70 塩基程度の
ステム-ループ構造。Precursor-miRNA は、
Exportin-5 を介して細胞質に移送される。
miRNA の遺伝子制御：
Mature miRNA(miRNA) とは：
主に、遺伝子の 3’ UTR にミスマッチを含んで結合し、翻訳制御または
mRNA 切断を行う。
Pre-miRNA が Dicer により切断され産生する 16∼29 塩基程度の2本鎖
RNA のうち、ターゲット遺伝子を標的する1本鎖 RNA。
mature miRNA は
mature miRNA
pre-miRNA の 5’ 側、
3’ 側または両方に
位置する。
miRBase：
sanger Institute が管理する miRNA 関連データベース。miRNA 配列や
ターゲット遺伝子予測結果の情報が登録されている。詳細は p.6 からの
“miRBase Sequence Database に関して”の頁をご参照ください。
LNA(Locked Nucleic Acid)とは？
LNA とは、
リボ核酸の 2’位の酸素原子と 4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋した 2 つの環状構造を持つ核酸です。EXIQON 社は、LNA に関する特許
の総元です。LNA を用いた独自の配列デザイン技術を保有しており、
各種プローブ設計・作成に秀でています。
HO
B
O
EXIQON 社では、独自の LNA プローブデザイン技術を保有しています
相補 DNA/RNA に対する熱安定性が上昇
高い生体内安定性
• 高い結合親和性を有する
• exo-/endonuclease に対して安定
配列特異的に結合
O
LNA - Locked Nucleic Acid
セルフアニーリングによるプローブ内二次構造形成の回避
天然 RNA に近い構造
• 細胞毒性が低い
LNA プローブは、DNA プローブに比べ構造上の自由度から標的に
対する融解温度が高くなります。表1に示した配列を例にとると、DNA
プローブの場合ではミスマッチとパーフェクトマッチの Tm 値差が
10℃ であるのに対し、LNA プローブではその差が 26℃ となりま
す。つまり、LNA の使用により標的配列とわずか1塩基差のプロー
ブであっても Tm 値に差が生じるため、標的配列の認識が困難となり
識別が可能となります。さらに、
これまで DNA プローブでは検出が
困難であった低発現の miRNA の検出も LNA プローブの利用によ
り可能となりました。時期や部位特異的に発現する miRNA の固定
にも一躍を担っています。
004
高感度かつ特異的検出が可能
• わずか1塩基のミスマッチも検出
Perfect match
3’-acgaccac-5’
probe
HO
target
Single mismatch
3’-acgaccac-5’
DNA 8-mer
5’-tgctggtg-3’
℃
℃
℃
LNA 8-mer
℃
℃
℃
表1. 8mer のターゲット核酸を 8mer の DNA または LNA プローブで検出する場合の Tm 値とその差
miRNA 実験を始めるにあたって
microRNA (miRNA)研究の実験アプローチ方法例を図 1 に示し、
これらを使って実験を進める際のポイントを以下にご紹介します。
なお、
当社ではこれらをサポートする実験ツールを準備ご用意しておりますので、
各製品ページをご参照ください。また、p.120 ∼ の技術情報では各アプリケーション
について詳細に解説しています。
siMature（合成 miRNA）
LNA microRNA Inhibitor
LNA microRNA Family Inhibitor
in vivo LNA microRNA Inhibitor
LNA microRNA Inhibitor Library
microRNA
Knockdown
miNatural（合成 miRNA）
Pre-microRNA 発現ベクター
Knockdown
Overexpression
AAAA
Target Gene
Detection
LNA microRNA array
LNA Detection Probe
- in situ
-Northern
LNA Uni-RT microRNA PCR
図1 miRNA 研究の実験アプローチ方法例
miRNA 発現プロファイリング
miRNA microarray または パネル型 microRNA qPCR プレート --- 目的の細胞・組織における各 miRNA の発現レベルを調べることにより、実際に発現している
miRNA を知る。
3
検出・定量 --- miRNA が実際にどの程度発現しているかどうかを検出する。この時、実験の目的に応じて以下の点を考慮する。
• 定量的または定性的
• どのmiRNA形態（ mature, precursor, primary ）を検出したいか
• 類似 miRNA 識別の必要性
例えば、mature form miR-196a と miR-196b は1塩基のみ異なる。mature miR-196a には2つの precursor mir-196a-1 と mir-196a-2 が存在。
① qPCR, リアルタイム PCR
primary と precursor を同時に増幅する primer をデザインすることは可能である。
それに対して、
mature miRNA のみを定量したい場合、短鎖であることや類似 microRNA 配列の存在などから困難な場合が多い。
② in situ hybridization - Detection probe (DNA/LNA オリゴ)
mature miRNA 配列と相補的な DNA/LNA オリゴを用いて標的 miRNA の発現局在性を確認。同時に、LNA プローブの特異性を利用して、
類似配列をもつ
miRNA との局在性比較が可能。
③ Northern Blotting - Detection probe (DNA/LNA オリゴ)
mature, precursor, primary miRNA のそれぞれの発現を比較することも可能である。発現レベル確認の目安にはなるものの、定量目的の場合にはリアル
タイム PCR を推奨。
機能阻害（インヒビター）--- miRNA に結合してその活性を阻害する。
miRNA Inhibitor を用いて miRNA を阻害し、
ターゲット遺伝子の発現量の変化や表現型への影響をみる。
5
miRNA 過剰発現 --- miRNA を強制発現し、対象遺伝子の発現レベルへの影響、ならびに表現型を確認する。
① 合成 RNA オリゴ
miRNA の precursor (single strand) または mature (double strand) に相当する配列の合成 RNA を細胞に導入する。
② 発現ベクター
primary または precursor miRNA を発現するベクターまたはウイルス粒子を細胞に導入する。
miRNA ターゲット検証
miRNA の機能検証やターゲット遺伝子探索方法として、標的レポーターベクターシステムの利用がある（ページ下部の Technical Note および技術情報 p.134
を参照）
。各 miRNA ターゲットレポータープラスミドも市販されている（p.66 ∼ p.72 参照）
。 microRNA 標準バリデーション
Technical Note
microRNA は、標的 mRNA と結合して mRNA の切断やタンパク質への翻訳抑制を行います。標的 mRNA レベルには影響を与えないことも多く、その
タンパク質レベルでの評価が重要となります。ここでは、microRNA 標的バリデーション方法のひとつをご紹介します。
■ 準備するもの
microRNA：
microRNA インヒビター,
合成 microRNA, microRNA
発現システムなど
■
Pro
■ これら2つ（microRNA およびその
ターゲット・レポーターシステム）を
■ microRNA ターゲット
・レポーターシステム：
標的細胞に導入し、レポーターアッセイ
Luciferase や saturated alkaline
によりタンパク質レベルの低下を確認
phsphate(SAP) など。
レポータータンパク質の UTR 領域
（CDS の下流）に microRNA の標的配列
またはアンチセンス鎖配列を組込んだ
コンストラクト
Pro
Reporter
target
■ コスモ・バイオ miNatural, siMature
を使用した microRNA functional
assay の結果
レポーター活性の低下が確認できた。
120
miRNA
Target
const
Enzymatic Activity (%)
100
80
60
40
20
0
AAAA
Reporter assay
Vector
Precursor miNatural siMature
Vector
synthetic
ctrl
miRNA Functional Assay
005
miRNA miRBase
miRNA
miRBase
miRBase Sequence Database に関して
miRBase
miRBase は Sanger Institute が管理する主要な microRNA オンラインデータベースで，公表済み microRNA（miRNA）配列およびアノテーションが
保管されています。リソースには主に 3 つの目的があります。
LNA
抽出 / 精製
1. 全生物種における全 miRNA 遺伝子に対して，一定の持続的な命名法をコーディネート（miRBase Registry）すること。
プロファイリング
2. 簡便検索と大量情報のダウンロードを目指し，オンラインデータベースで公開済みの全 miRNA 配列およびアノテーションを提供すること
（miRBase Sequence）。
定量
3. 最新の miRNA 標的予測を実行し配布すること（miRBase Targets）
。
本項では，命名法の特徴を協議し，miRBase Registry，miRBase Sequences ならびに miRBase Targets におけるアノテーションの役割を簡単に
紹介します。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
miRBase Registry
miRBase は“microRNA Registry”との名称で 2002 年に設立され，遺伝子名や新発見の miRNA 遺伝子クラスのコーディネートを主な目的として
いました。大規模 miRNA スクリーニングを行う研究室からこのようなサービスの必要性が提起されていました。当時，数々の研究者が新規 miRNA を
発見するであろうことは明らかであり，各 mRNA 配列を迅速かつ正確に既存のものと照会し，同一配列をもつ miRNA には最初に報告された名称を付与し，
かつ名称と配列が一対一の関係であるよう管理することが必須でした。miRNA 研究分野の発展が急速に進んだのは，この統括され一貫した命名法が一翼を
担っているといえます。
遺伝子名の割当
60
5000
50
4000
40
3000
30
2000
20
1000
10
0
0
Date
図 1 miRBase Sequences データベースの登録情報の推移
橙色：precursor miRNA 数，黄色：生物種の数
006
# Species
70
2002-10
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
WEB 上の“miRBase Sequences”サイトでは，公開されている全 miRNA の情報を提
供しています。データベースに登録されている miRNA 数および生物種数は初期の頃の何倍
にもなり，未だ急速に増加しています（図 1 参照）
。現在は，2011 年 11 月にアップデート
された ver 18 が最新版で，21643-mature microRNA, 18226-precursor microRNA,
168 生物種が登録されています。mature miRNA 配列，precursor 配列およびその構造，
主要な文献のリファレンス，および mature miRNA 同定の実験的証拠など広範なデータ
が公開されています。データベースのページの一例を図 2 に示しました。
7000
6000
2007-12
プール型 shRNA
ライブラリー
miRBase Sequences
2007-10
miRNA
機能解析
2007-06
miRNA
プロファイリング
2007-02
技術情報
2006-10
その他
2006-06
トランスフェク
ション試薬
2006-02
関連試薬
2005-10
si/shRNA
ライブラリー
2005-06
ノックダウン検証
現在マンチェスター大学が主催する，miRNA の配列，機能，アノテーションの情報を集めたデータベース ”miRBase”で使用されている大まかなルール
をご紹介します。名称は順次割り当てられ，"rno-mir-331"，"rno-miR-331"，"rno-miR-331*" といった形式をとります。最初の 3 ∼ 4 文字は生物種情
報を示し，"rno" は，"Rattus norvegicus" を省略した表記ですのでラットを示しています。ヒトは hsa-，マウスは mmu- のように表記されます。通常，
mature miRNA 配列の場合は“miR”と表記され，precursor やゲノム上の座位は“mir”と表記されています。このデータベースの慣例として大文字と
小文字の使い分けを行っていますが，このようなわずかな差に意味の違いをもたせることは懸命ではないとの意見もあるでしょう。
1 つ の precursor miRNA（例 え ば "rno-mir-331"）に 2 種 類 の mature miRNA が コ ー ド さ れ て い る 場 合，mature miRNA は "rno-mir-331"
(predominant なもの )，"rno-miR-331*" ( 反対鎖 ) と表記します。ただし，どちらが dominant か不明な場合は，precursor の 5' 末端側から発現す
るものに "-5p"，3' 末端側から発現するものに "-3p" を付加し，”hsa-miR-21-5p”
，”hsa-miR-21-3p”のように表記します。最近の miRBase のアッ
プデートでは，数字および数字 +"*" で表記されていた配列が "-5p" と "-3p" に名称変更するケースが非常に多くなっています。
ゲノム上の異なる座位に precursor がマップされている場合や異なる precursor 配列をもつ場合で，全く同一配列の mature miRNA が発現してい
る場合もあります。
「この場合，予測されたヘアピン状の precursor は“-1, -2”といった数値が付与され，"hsa-mir-218-1"，"hsa-mir-218-2" のように
表記されます。つまり，いずれの precursor からも hsa-miR-218-5p と hsa-miR-218-1-3p という同一配列の mature miRNA が発現します。
ミスマッチが 1 ∼ 2 塩基のみであったり，同一のシード領域をもつなど，非常に類似した mature miRNA をもつ precursor は，"hsa-mir-451a"，
"hsa-mir-451b" のように表記され，mature miRNA はそれぞれ，"hsa-miR-451a"，"hsa-miR-451b" と表記します。
ヒトとマウスの miRNA 名称は，Human Genome Nomenclature Committee（HGNC）および Mouse Genome Informatics（MGI）より認可さ
れた遺伝子命名法のスキームにリンクしています。植物における命名は動物のものと若干異なり，植物の遺伝子名にハイフンをつけて数値を付与したものは，
突然変異体を意味することが通例です。そのため，同一または類似配列をもつ場合は，mature および precursor miRNA 何れにおいても数値ではなく文字
を付加します。また，precursor は "MIR" と表記し mature は "miR" と表記します。Arabidopsis の precursor である ath-MIR172a および athMIR172b からは，mature miRNA の ath-miR172a および ath-miR172b が発現します。ウイルス由来の miRNA の場合，ebv-mir-BART1 などの
ように miRNA の生ずる座位が名称に含まれる場合があります。
miRNA の名称は，あくまでそれらの関連性を示すガイドとして付与されているものです。そのため，複数提示されている情報のひとつが任意に選択され
ている場合もあるので，配列情報の代替として安易に名称のみを使用するべきではありません。
2005-02
si/shRNA 発現
miRNA の名称
2004-10
shRNA クローン
コレクション
類似生物種において既に検証されている miRNA と相同性をもつ場合は，それ自身の実験的検証なくデポジットでき，公称が取得できます。現在，
miRBase では，コンピュータ解析により予測された miRNA のうち他の如何なる生物種においても実験的検証がなされていないものは受理していません。
2004-06
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
・論文誌に受理されず欠番となる miRNA 名称を最小に止める。
2004-02
デザイン済み
siRNA
・査読することで miRNA 同定手法が適切かつ妥当であることを確認し，デポジットされたデータの信頼度を高く保つ。
2003-10
コントロール
siRNA
2003-06
カスタム合成
サービス
2003-02
配列解析
サービス
# Hairpin sequences
siRNA
miRBase では，既報 miRNA とのホモロジー確認により同定された miRNA と，実験的検証により同定された miRNA の 2 種類を扱っています。
新規 miRNA は，クローニングやシークエンシング，または mature miRNA の発現確認による実験的な検証が必要となっており，miRNA 同定の
クライテリアの報告もなされています（Ambros et al ., 2003）。これらのガイドラインは適切なものではありますが，今後も検討を重ねていくべきものと
いえるでしょう。
新規 miRNA の命名は，その発見などを記述した報告が査読付き論文誌へ受理された後に行われます。公式名称は論文報告の最終校正時に追記されます。
が，この方法には 2 つの利点があります。
miRNA miRBase
ヘアピン構造の precursor miRNA と mature miRNA の配列
miRNA の名称の他に，各 mature miRNA（例：MIMAT0000101）お よ び precursor
miRNA（例：MI0000109）にはアクセッション番号が付与されています。公開されている
precursor miRNA は全てコンピューテーショナルな解析およびキュレーションにより
各ファミリーに分類されており，将来的には mature miRNA もファミリーに分類される
予定です。配列同様，ファミリーにも名称およびアクセッション番号が付与され，異なる名称
を も つ 複 数 の miRNA が 混 在 す る 場 合 も あ り ま す。例 え ば，mir-17 フ ァ ミ リ ー
（MIPF0000001）には哺乳類の mir-17, mir-18, mir-20, mir-93 および mir-106 が
含まれています。配列とファミリー何れにおいても名称に意味がありますが，データや知見の
増加にともない変更される可能性もあります。一方，アクセッション番号は一定で，リリース
間で追跡することができます。新規データベースのリリース時には，前回のリリース時と比較
して変更した点に関しての情報提供も行っています。
ゲノムのコーディネーツ（座位）も表記されています。データベースは，コーディネーツを
用いて検索することが可能であり，クラスター化した miRNA の検索にも使用できます。
おおよそ 50% におよぶ脊椎動物の miRNA はアノテートされたタンパク質をコードする
遺伝子のイントロン領域より発現していることが報告されております（Rodriguez et al .,
2004）。イントロンの miRNA は無脊椎動物や植物では比較的少なく，それぞれ 10 ∼
40%（無脊椎動物）または 5 ∼ 10%（植物）であり，これらの遺伝子構成も各登録情報に
表で示されています。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
図 2 “miRNA entry”ページの一例
最初の項目には precursor の構造，ゲノム上の位置および詳細などが記載
されている。中程の項に生ずる mature miRNA 情報が記載され，下段には
主要文献のリファレンスが列記されている。
siRNA
primary miRNA
110888k 110888k 110889k 110889k 110889k 110889k 110889k 110889k 110889k 110889k 110889k 110890k 110890k 110890k 110890k
MiRNA
miRBase database に お い て precursor miRNA 配 列 が 各 登 録 の
主軸となっておりますが，この precursor miRNA はおそらく何 Kb もある
長鎖の転写物の一部であると考えられています。イントロン miRNA の
第一次転写物（primary miRNA, pri-miRNA）はタンパク質をコードする
宿主遺伝子であると考えられています。しかし，イントロン miRNA の
pri-miRNA は，ま だ ほ ん の 一 握 り し か 同 定 さ れ て い ま せ ん。miRBase
ウェブサイトの新規項目では，既知 miRNA 周辺のゲノム特徴に関する
アノテーションも提供されています。ESTs，cDNAs，DITAGS および
5'CAGE からの実験的データとともに，予測される転写開始位置（TSS），
CpG アイランド，転写因子結合部位（TFBS），ポリアデニレーションシグナル
（polyA）も表記されています。これらを組合せることで，pri-miRNA 予測
が改善されるであろうと言われております。これらのデータを包括的に解析
した結果，pri-miRNA の大きさは非常に多様で，数百 bp から何十 Kb に
及ぶものもあるであろう と 推 測 さ れ て い ま す（Saini et al ., 2007）。
各 miRNA の重複および隣接領域情報および図表が提供されるため（図 3 参照），
5' および 3' 末端に関してはユーザー個人が判断することも可能になります。
現在のところ，ヒト，マウス，ラット，ショウジョウバエ，線虫に関してのみ
提供されていますが，将来的には他の生物種に関しても情報提供する予定です。
hsa-mir-34b
hsa-mir-34c
カスタム合成
サービス
TSS
CpG
コントロール
siRNA
EST
BG705262.1
デザイン済み
siRNA
BM969538.1
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
CB243753.1
BX099301.1
CR744362.1
shRNA クローン
コレクション
cDNA
BC021736.1
TFBS
配列解析
サービス
si/shRNA 発現
CMYB_01
CHX10_01
ノックダウン検証
Ditag
polyA
H05BD10H1205
AATAAA
si/shRNA
ライブラリー
図 3
hsa-mir-34b-34c クラスターの隣接領域に関する miRBase genomic view 実証データより，
pri-miRNA は 1.3 ∼ 1.6kb であることが示唆される。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
miRBase Targets
miRBase Targets database は現在 miRanda アルゴリズム（Enright et al ., 2003）とアノテートされた遺伝子の 3' UTR を用いて，多種の生物種
を対象として miRBase 登録済み miRNA の標的部位を予測しています。将来的には，multiple target prediction algorithms の利用，ensemble
genome annotation database（Flicek et al ., 2008）からの UTR 情報の利用，アノテートされた UTR が存在しない場合は遺伝子の下流 2kb の
利用を目指しています。各 miRNA と標的配列との組合せはスコア化し，相同性，単一 UTR 内の複数箇所を標的する可能性，関連生物種における
miRNA/ 標的配列の保存性（ただし，他生物間との保存性は必須項目としていない）を考慮して P-value を算出します。miRBase/miRanda では，
“シード領域”の相補性に重きをおいていますが，既知の miRNA/ 標的配列でみられるようにシード領域の完全相補性にはこだわっていません。実
験的に検証された miRNA 標的部位はハイライトし，他の標的予測や TarBase database（Sethupathy et al ., 2006）の検証済み標的部位情報にリ
ンクしてあります。miRBase Target は microCosm に移行し，現在 EBI に管理されています（http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/
htdocs/targets/v5/）
。
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
情報入手について
プール型 shRNA
ライブラリー
miRBase WEB サイト： http：//www.mirbase.org
FASTA や MySQL な ど，種 々 の フ ォー マ ッ ト で FTP サ イ ト か ら ダ ウ ン ロ ー ド で き ま す。miRBase Registry の 命 名 関 数 お よ び miRBase
Sequences の初期データは Sam Griffiths-Jones（University of Manchester）が所有しています。miRBase Targets のパイプラインは Anton
Enright（Wellcome Trust Sanger Institute）が管理しています。命名法，配列，データベースおよびウェブサイトに関するお問い合わせは mirbase@
manchester.ac.uk へ，miRBase Targets ページおよびそのアルゴリズムや手法に関しては [email protected] までご連絡ください。
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Cosmo Bio would like to acknowledge and thank EXIQON A/S for providing RNAi information presented here.
007
miRNA LNA
microRNA プロファイリング・検出に優れた
Locked Nucleic Acid (LNA™)
miRNA
LNA
miRBase
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
microRNA (miRNA) は短鎖であり，GC 含有量にばらつきがある（5 - 95%）ため，マイクロアレイの利用が非常に困難です。このバリエーションにより
DNA プローブを用いた従来のマイクロアレイでは各標的 miRNA に対する捕捉プローブの結合親和性に大きな差が生じてしまいます。半数近くの
miRNA において検出結果の信頼性が乏しく，GC 含有量の低い多くの miRNA は検出不可能です。そのため DNA プローブを用いた miRNA マイクロ
アレイシステムでは miRNA 発現データにバイアスが含まれます。
LNA™ 強化型捕捉プローブは，全 miRNA に対するプローブの結合親和性が同程度になるようデザインすることで，miRNA の配列および GC 含有量
といったバリエーションによる課題を克服しました。LNA™ 含有量を種々変更することで特異的な２本鎖融解温度をもつ捕捉プローブのデザインが可能で
す。マイクロアレイプローブの Tm 値がノーマライズできるため，標的 miRNA の配列や GC 含有量にかかわらず実験手技に左右されない信頼性の高い
検出を可能としました。
EXIQON 社では，各 microRNA の GC 含有量にかかわらず同程度の結合親和性を持つように全 miRNA に対して LNA™ 修飾を施した捕捉プローブ
をデザインしました。一方，DNA 捕捉プローブでは GC 含有量の低い miRNA を標的するために十分な結合親和性が得られず，半数近くの miRNA に対
するプローブは信頼性に乏しくなっています（図 1）
。
次世代
シークエンシング
Signal strength [log2]
機能検証
LNA™-enhanced capture probe
8
4
0
100
200
300
400
500
600 miRNAs
16
DNA capture probe
8
0
100
98%のmiRNAが
GC率50%以下
siRNA
配列解析
サービス
200
300
400
66%のmiRNAが
GC率50%以下
500
600 miRNAs
Poor
Acceptable
detection signal detection signal
過剰発現
（ベクター）
Poor
Acceptable
detection signal detection signal
過剰発現
（オリゴ）
Signal strength [log2]
LNA
30%のmiRNAが
GC率50%以下
図 1
DNA プローブでは半数近くの microRNA に対してプローブの信頼性が低いが，LNA™ 修飾を施した捕捉プローブでは実験手技等に左右されず信頼性の高い microRNA 検出が可能である。660 種の合成 microRNA
を EXIGON 社 miRCURY LNA™ microRNA Array および他社 DNA based array にハイブリダイズした際のシグナル強度（log2 signal/100amol target）を図示した。4 log2 未満のシグナルは検出限界未満とし，
8 log2 より高いシグナルは許容範囲とした。DNA プローブによるバラツキと標的 microRNA の GC 含有量には関連性が見られた。
カスタム合成
サービス
Locked Nucleic Acid (LNA™) 技術
コントロール
siRNA
LNA™ は結合親和性を増強する効果をもつため，LNA™ 修飾オリゴを用いることで短鎖の RNA や DNA 標的の高感度，かつ特異的な解析が可能とな
ります。
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
EXIQON 社は LNA™ の総本家
EXIQON 社の研究員は，高い Tm 値，最適なミスマッチ識別，および高い特異的結合性をもち，かつ 2 次構造や自己相補性を最低限に抑えた LNA™
強化型オリゴデザインの専門知識をもちます。EXIQON 社独自の LNA™ 技術ならびに 10 年以上におよぶ LNA™ 使用経験を生かし，お客様のご研
究に適切な優れた解決策をご提案致します。
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
LNA™ の利点
si/shRNA
ライブラリー
技術情報
miRNA は短鎖である上にそのファミリー間では類似配列をもつものが
多いため，従来の DNA や RNA 技術では十分な特異性かつ感度での検出
が困難です。一方，LNA™ オリゴは従来の DNA や RNA オリゴに比べて
相補配列に対する結合親和性が実質的に高くなります。そのため前例のない
感度および特異性をもち，短鎖または非常に類似した DNA および RNA
標的検出に最適なツールです。
● DNA や RNA オリゴ／プローブに比べ感度が著しく高い
● GC 含有量に関わらず全 microRNA の安定した検出が可能
● 体液や FFPE といった扱いにくい臨床サンプルからの検出に優位
● DNA や RNA プローブに比べ高い特異性
● 1 塩基ミスマッチの識別が可能
● microRNA ファミリーの優れた識別
● in vivo および in vitro における高い安定性
● RNA や DNA への高い結合力
● in vivo での短鎖 RNA に対するアンチセンス阻害効果が高い
miRNA
プロファイリング
LNA™ とは
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
008
Locked nucelic acids（LNA™）は，高い親和性をもった RNA 類自体
であり，ワトソンークリック結合に理想的な立体構造でリボース環が“ロッ
ク”さ れ て い ま す（図 2）
。LNA™ オ リ ゴ は，相 補 配 列 を も つ DNA や
RNA に対して前例のない熱力学安定性を示します。組込んだ LNA™ モノ
マーごとに，2 本鎖の融解温度（Tm 値）は 2 - 8℃ ごと上昇し（図 3）
，
さらに，LNA™ オリゴは高い Tm 値を保ちつつ従来の DNA や RNA オ
リゴより短鎖に設計することが可能です。これは，検出目的の標的が短鎖で
あったり類似配列をもったりする場合，特に重要な要素となります。
LNA™ オリゴは LNA™ と DNA または RNA を混合して作ることが多
く，組込む LNA™ の数を変えることで感度や特異性を最適化することがで
きます。オリゴに LNA™ を組込むことで感度や特異性が改善することは
PCR，マイクロアレイおよび in situ ハイブリダイゼーションといった手
法で実証済みです。
図 2
リボース環の 2'-O と 4'-C 原子間がメチレンで架橋（オレンジ
色）されており，ワトソンークリック結合に最適な立体構造でリ
ボース環が「ロック」されている。LNA™ を DNA や RNA オ
リゴに組込んだ場合，相補鎖との対合がより迅速になり，2 本鎖
の安定性が上昇する。
Same length, higher T m
DNA
23-mer
tcgatcgattagctacgtacgta
T m: 60°C
DNA/LNA ™
23-mer
tcgatcgattAgctacgtacgta
T m: 64°C
DNA/LNA ™
23-mer
tcgatcGattAgctaCgtaCgta
T m: 78°C
+ LNA ™
Shor ter length, similar T m
T m: 60°C
DNA
23-mer
DNA/LNA ™
16-mer
---a tcgattAgctAcgta----
T m: 60°C
DNA/LNA ™
8-mer
---------- a
GCtacGT-----
T m: 61°C
DNA: a tcg
LNA: ATCG
tcgatcgattagctacgtacgta
+ LNA ™
図 3 DNA を LNA™ と置換し，高い Tm 値を期待
上図：DNA ヌクレオチドを LNA™ に置換することで，認識配列やプローブの特異性を維持したまま
オリゴの融解温度を上昇可能。
下図：LNA™ への置換により Tm 値を保ったままプローブを短鎖にすることが可能。
miRNA LNA
LNA™ を使う理由⇒“LNA™ を利用したオリゴは短鎖 RNA や DNA 標的を高感度かつ特異的に検出”
miRNA
● Tm 値ノーマライズ済み：GC 含有量に左右されない安定した検出
LNA™ 含有量を変更することで 2 本鎖の Tm 値を調節でき，GC 含有量が種々異なる短鎖配列群であっても Tm 値のノーマライゼーションが可能と
なります。AT リッチな配列では融解温度が低いため，2 本鎖の Tm 値を上げるためにより多くの LNA™ ヌクレオチドを LNA™ オリゴに挿入します。
これにより，LNA™ 強化型オリゴは標的配列の GC 含有量に関わらず同程度の結合親和力をもつようデザインが可能となります。LNA™ オリゴの Tm
値幅を最小限に抑えることができるため，マイクロアレイや PCR を始めとした，多岐にわたる標的に対し，高感度，かつ特異的結合が同一条件下で同時に
生ずることを期待される（プロファイリングに代表されるような）種々の実験手法に適しています。DNA または LNA™ プローブを用いてさまざまな GC
含有量をもつ miRNA 標的の検出を行い，Tm 値ノーマライゼーションの利点を実証しました（図 4）。
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
DNA capture probe
LNA™ capture probe
16,000
30
miRNA GC content
検出
図 4 Tm ノーマライゼーションの威力 -1
LNA™ 強化型プローブ（青色）または DNA プローブ（灰色）を利用した
マイクロアレイ実験におけるシグナル強度を図示した。GC 含有量の異な
る複数の microRNA を 100 amol ずつ添加した。DNA 捕捉プローブ
のシグナル強度は GC 含有量よってばらつきがみられ，多くの microRNA
において貧弱な検出結果であった。これに対し，LNA™ プローブでは全
microRNA を安定かつ確実に検出できた。
20
miR-572
miR-604
miR-593*
miR323-5p
miR-551a
miR-147
miR-151-5p
miR-199a-5p
miR-10b
miR-299-5p
4,000
miR-572
miR323-5p
miR-604
miR-593*
miR-551a
miR-151-5p
miR-147
miR-199a-5p
miR-10b
miR-302c
miR-299-5p
miR-410
miR-148b
miR-340
miR-29C
miR-190
4,000
40
miR-410
20
50
miR-302c
30
8,000
miR-148b
40
miR-340
50
60
miR-190
8,000
定量
70
GC content [%]
60
80
miR-29C
70
Signal strength [log2]
80
GC content [%]
Signal strength [log2]
16,000
miRNA GC content
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●１塩基差の識別に優れる
機能検証
LNA™ モノマーを注意深く組込むことで，わずか 1 塩基差の非常に類似した配列間の識別も可能となります。完全相補配列とミスマッチ配列間の Tm
差は Δ Tm で表されます。オリゴに LNA™ を導入することで完全相補結合とミスマッチ結合との Δ Tm を最大 8℃ まで引き上げることができます。Δ
Tm を上げることで miRNA ファミリー間のような類似配列の識別を大幅に改善することができます。
次世代
シークエンシング
● 幅広い適用性
LNA™ のもつ親和性促進効果により LNA™ オリゴはストランド侵入特性をもつため，in vivo での利用に優れています。 LNA™ をオリゴに組込むこと
でエンド / エキソヌクレアーゼ耐性が改善するため in vitro および in vivo での安定性が向上します。水への溶解度といった物理的特性は，RNA や
DNA と酷似しているため，通常の実験プロトコールに沿って使用 ( 流用 ) することができます。
siRNA
配列解析
サービス
● 困難な臨床サンプルからも優れた結果が期待
LNA™ 強化型オリゴは感度と特異性が改善されているため，標的の存在量が低い困難なサンプルに適しています。
例えば，血清や血漿を始めとする体液サンプル中の短鎖 RNA 定量には，LNA™ 強化型 PCR プライマー１）(p.24 ∼ p.35）
，分解した RNA が多く含まれる
FFPE サンプルを用いたマイクロアレイ実験では，高感度かつシグナル−ノイズ比が改善された LNA™ 強化型捕捉プローブ (p.18 ∼ p.21）が優れています。
1）Jensen et al . BMC Genomics 2011
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
LNA™ と microRNA ⇒“LNA™ は GC 含有量に関わらず全 microRNA 配列を確実に検出”
0.20
●
LNATM oligos
●
DNA oligos
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
0.15
Density
miRNA は短鎖かつ GC 含有量に大きな幅がある（5 - 95%）ため，これまでの手法で
は解析が困難でした。DNA や RNA を利用した miRNA 解析手法は，オリゴと miRNA
が形成する 2 本鎖の融解温度（Tm 値）が配列の GC 含有量によって大きく異なるため
不確定度が高く変動等の影響を受けやすくなります。マイクロアレイやハイスループット実
験といった多くの miRNA を同一条件下で解析する場合は特に問題となります。
上記は LNA™ 強化型オリゴを利用することで克服できます。組込む LNA™ 量を変更する
ことで microRNA の GC 含有量に関わらず特定の融解温度をもったオリゴがデザインで
きます。EXIQON 社では LNA™ 技術を利用して，同一実験条件下で同等の性能をもつ
Tm ノーマライズ済みプライマー，プローブおよびインヒビターを開発しました。
miRNA 研究の課題のひとつに配列類似性があります。miRNA ファミリメンバーでは
わずか 1 塩基異なるだけのものも存在します。プライマーやプローブに LNA™ を導入す
ることで，類似配列をもつ miRNA 群の識別能が改善できます。LNA™ により感度や特異
性が改善でき，全ての miRNA 標的に対して最適な性能が得ることができます。
ノックダウン検証
0.10
si/shRNA
ライブラリー
0.05
0.00
Melting temperature
関連試薬
図 5 Tm ノーマライゼーションの威力 -2
miRNA インヒビターの効果が均一
従来型の microRNA の全長を利用したインヒビターは GC 含有量に大きく左右さ
れ，Tm 値は 40℃ 以上の幅がある。一方，EXIQON 社インヒビターの Tm 値は最適
温度をはさんでその差がわずか 10℃ である。
トランスフェク
ション試薬
その他
LNA™ は核酸研究において強力なツール
LNA™ は特異な性質をもつため，miRNA 研究だけでなく低発現，短鎖，かつ類似配列をもつ標的の検出を目的とした多くのアプリケーションで強力な
ツールとなり得ます（図 6）
。
LNA™ を利用することで短鎖配列研究における課題が克服でき，non-coding RNA や他の短鎖 RNA 分子の特異的，かつ高感度検出が可能となりました。
非常に類似した配列を識別できるという LNA™ オリゴの特異な能力により，近年では mRNA などの長鎖 RNA 配列を対象としたアプリケーションにも活
用されています。さらに，存在量の少ない核酸や染色体 DNA 検出にも有効利用されています。
DNA
Real-time/quantitative PCR
SNP detection/allele specific PCR
Methylation analysis
Bead-based applications
Chromosomal FISH
Comparative genome hybridization
Proteomics of isolated chromatin
segments (PICh)
Antigene inhibition
Mutagenesis
mRNA
Real-time/quantitative PCR
Microarray analysis
In situ hybridization
Northern blotting
Bead-based applications
Fluorescence activated cell sorting
isolation
Inhibition of RNA function
RNA modification (frame shifting/exon
skipping )
ncRNA
Real-time/quantitative PCR
Microarray analysis
In situ hybridization
Northern blotting
Bead-based applications
Inhibition of RNA function
RNA modification (frame shifting/exon
skipping )
Inhibition of RNA function
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
ncRNA
Real-time/quantitative PCR
Microarray analysis
In situ hybridization
Northern blotting
Fluorescence activated cell sorting
技術情報
PCR based approaches
Hybridization based approaches
In vivo based approaches
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
DNAzymes
図 6 LNA™ アプリケーションの実績
LNA™ は通常の DNA や RNA オリゴでは十分な結合親和性や特異性が得られないようなアプリケーションにおいて強力なツールとなる。RNA および DNA 研究に使用されている LNA™ アプリケーションの一部を紹介する。
009
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
ExoMirTM キット エキソソーム分離・RNA 抽出
抽出 / 精製
miRBase
LNA
抽出 / 精製
大型の超遠心機は必要ありません！
血清・髄液・培地からフィルターを使ってエキソソーム由来の RNA を分離・RNA を抽出
ExoMirTM PLUS キット新登場！ 最大 60ml のサンプル処理が可能。
プロファイリング
プロトコール（ExoMirTM キット：品番 5145）
背景
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
生体内情報の仲介者であるエキソソームや微小胞のような小さな膜結合
微粒子は，血液や脳脊髄液にも存在します。エキソソームは多小胞体と呼ば
れる細胞内構造が細胞膜に融合し，その内容物が細胞外に放出されるとき
生じます。多小胞体はエンドソームコンパートメントを由来とし，細胞外分子
を包んで取り込む膜結合陥入から成ります。
エキソソームなどの微粒子は，in vitro 培養の細胞により培地に放出され
ます。微粒子は，細胞間で活性型の mRNA や miRNA を輸送すると考え
られています。悪性腫瘍において，エキソソームの放出は増加し，その種類
も様々です。従来のエキソソームの回収方法は，サンプル溶液を超遠心して，
連続して大きい微粒子から小さい微粒子の沈殿物を得ます。この方法では，
最低でも 100,000 × g の遠心力が必要で，数時間以上かかっていました。
本キットは超遠心が不要のフィルターを用いたシステムです。
① サンプルをシリンジに通します。
血清サンプルなら 4∼10mL
培地サンプルなら 12∼30mL
② 2 種類のフィルターを外します。
アポトーシス小体や微小胞等
使用目的
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
エキソソーム等
ExoMirTM キットは，血清，髄液，培地を含む細胞フリー溶液中のエキソ
ソームやその他の微粒子を分画し，その微粒子から RNA を抽出するキット
です。ExoMirTM キットは，2 種類の連結したフィルターにサンプルを通し
ます。上のフィルターは約 200nm のポアサイズでアポトーシス小体や
微小胞のような大きな微粒子を捕捉し，下のフィルターは約 20nm の
ポ ア サ イ ズ で エ キ ソ ソ ー ム を 捕 捉 し ま す。ExoMirTM Plus キ ッ ト に は
200nm のフィルター上に 700nm のフィルターがあり，目づまりを防
ぎ，大量サンプル用にご使用頂けます。サンプルを通した後，フィルターを
分割して別々に BiooPureTM -MP RNA 抽出試薬で微粒子から RNA を
回収します。BiooPureTM -MP は，グアニジニウム・チオシアン酸とフェ
ノールを含むシングルフェーズの RNA 抽出試薬です。次にキットに含ま
れる不活性な共沈殿剤（Linear Polyacrylamide）を使用して RNA を回
収します。ExoMirTM キットは血液血清，脳脊髄液，細胞培養液（培地含む）
を含む細胞フリー溶液を処理することができます。
③それぞれのフィルター内の微粒子由来の RNA を
BiooPure™ RNA 抽出試薬を用いて抽出します。
高純度の RNA を抽出
します。
RT-qPCR 実験などに
ご利用いただけます。
特長
●経済的：超遠心分離機やローターのような高価な装置はいりません。
●短時間：数分で完了。
●超微粒子をタイプごとに分画（プロトコール ②）
。
●細胞フリー溶液も処理可能。
●大容量（50mL 以上）のサンプルも処理可能。
●RNA 回収最大化。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
●微小胞及びエキソソームの miRNA や mRNA 研究に最適。
構成内容
●2 種類のフィルターの組立品 10 個
その他
●プロテナーゼ K（凍結乾燥品）10mg
●プロテナーゼ K 溶液（50％ グリセロール含有）1.0mL
●BiooPureTM-MP RNA 抽出試薬 30mL
●共沈殿剤（Linear Polyacrylamide）
（18μg/μL）0.3mL
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
●RNase フリーウォーター 7.5mL
●RNA 再懸濁溶液（0.15mM EDTA in nuclease-free water)1.8mL
●60mL シリンジ（ExoMirTM Plus キット 品番 5146 のみ）
図 1 本キットを用いてヒト血清から調製した RNA の Agilent Bioanalyzer の結果
上のフィルターから調製した RNA（赤）と下のフィルターから調製した RNA（青）
。
各 RNA サンプルとして複数の miRNA を RT-qPCR により検出（表１）した。
●20mL シリンジ 1 本
●3mL シリンジ 1 本
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Sample
miR-16
miR-150
miR-191
RNA from Top Filter
RNA from Bottom filter
RNA from post-filtration Flow-through
Negative control
23.66
27.96
30.51
Not detected
23.5
26.92
31.35
32.69
29.1
34.69
39.91
Not detected
表 1 ExoMir フィルターで捕捉したヒト血清の微粒子を RT-qPCR を使用して microRNA を検出した。
この実験では，12mL のヒトプール血清を酵素の前処理無しで，トップとボトムのフィルターに通した。値は，RT を 1 回，PCR を二重に行った平均 Ct 値である。
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
010
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
ExoMirTM kit
5145
1kit
¥52，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
ExoMirTM Plus kit
5146
1kit
￥59,000
室 ○
冷 ○
凍
○
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
血漿 / 血清中 エキソソーム RNA 分離キット
抽出 / 精製
miRBase
LNA
スピンカラムを用いて，血漿，血清，腹水サンプルからエキソソーム RNA を迅速に分離
抽出 / 精製
特長
プロファイリング
●迅速かつ簡単操作： スピンカラムフォーマットにより，
複数のサンプルを 45 分以内に処理できます。
定量
●多用途： 0.25 ∼ 2mL の血漿・ 血清サンプルから，
エキソソームRNA を分離可能。
●フェノール / クロロフォルム抽出操作不要： フェノールやクロロホルムといった有害な化学物質を用いずに RNA を分離できます。
検出
●様々なアプリケーションに使用可能： 阻害物質を含まない RNA が抽出できますので，RT-PCR，ノーザンブロッティング，マイクロアレイ解析などの
遺伝子の発現・ 機能解析にそのままお使いいただけます。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
構成内容
過剰発現
（ベクター）
● PS Solution A
● PS Solution B
機能検証
● PS Solution C
次世代
シークエンシング
● Wash Solution
● RNA Elution Solution
● Mini Filter Spin Columns
● Elution Tubes
● Collection Tubes
siRNA
● Product Insert
配列解析
サービス
図 1 様々な血漿量 (0.25 ∼ 2mL) から抽出したエキソソーム RNA 量の測定
仕様
RT-qPCR により，血漿から分離したエキソソーム RNA をテンプレートとして 5S 遺伝子を検出。様々な血漿量
(0.25 ∼ 2mL： 様々な色線で表示 ) で，5S 遺伝子を検出することができたことにより，高品質のエキソソーム RNA
が抽出されていることが分かる。
●最小サンプルインプット量： 0.25mL
●最大サンプルインプット量： 2mL
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
●精製RNA のサイズ： Small exosomal RNA species
●所要時間： ∼ 45 分
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
A社
B社
A社
Norgen
B社
Norgen
A社
B社
Norgen
図 2 血漿エキソソーム RNA を効率よく検出
各のキットを用いて，500uL のヒト血漿 ( クエン酸，EDTA，ヘパリン処理血液からそれぞれ調製 ) からエキソソーム RNA を単分離後，エキソソーム RNA から RT-qPCR により ５Ｓ rRNA（左）
，miR-21（中央），
miR-16（右）を測定。その際に得られた Ct 値を示す。ノルジェン社のキットを用いて得られた値が青，他社 A または B キットを用いて得られた値は赤または緑で示す。ノルジェン社のキットは，抗凝固剤の種類にかか
わらず，高品質の RNA を分離できたことが分かる。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
図 3 操作方法
■商品リスト
［メーカー：NOG］
商品名
Plasma/Serum Exosome RNA Isolation Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
49200
50 PREP.
¥60，
000
室
○
011
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
尿中 エキソソーム RNA 分離キット
抽出 / 精製
miRBase
LNA
スピンカラムを用いて，尿サンプルからエキソソーム RNA を迅速に分離
抽出 / 精製
プロファイリング
特長
●
●
●
●
定量
検出
迅速かつ簡単操作： スピンカラムフォーマットにより，複数のサンプルを 30 分以内に処理できます。
多用途：1 ∼ 10mL の尿サンプルから，エキソソーム RNA を分離可能。
フェノール / クロロフォルム抽出操作不要： フェノールやクロロホルムといった有害な化学物質を用いずに RNA を分離できます。
様々なアプリケーションに使用可能： 阻害物質を含まない RNA が抽出できますので，RT-PCR，ノーザンブロッティング，マイクロアレイ解析など
の遺伝子の発現・機能解析にそのままお使いいただけます。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
構成内容
仕様
● Solution A1
●最小サンプルインプット量： 1mL
● Solution A2
●最大サンプルインプット量： 10mL
● Solution B
●精製RNA のサイズ： Small exosomal RNA species
● Wash Solution
●所要時間： ∼ 50 分
● RNA Elution Solution
● Mini Filter Spin Columns
● Elution Tubes
siRNA
● Collection Tubes
● Product Insert
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
図 1 様々な尿量 (1 ∼ 15mL) からエキソソーム RNA を分離可能
図 2 様々な尿量から分離したエキソソーム RNA を検出
様々な尿量サンプルからエキソソーム RNA を分離でき，従来のナノろ過法と比べ
て高い収量が得られる。
RT-qPCR により，尿サンプルから分離したエキソソーム rRNA をテンプレート
として 5S rRNA を検出。様々な尿量 1 ∼ 15mL：様々な色線で表示 ) で，5S
rRNA を検出することができたことにより，高品質のエキソソーム RNA が抽出さ
れていることが分かる。
図 3 操作方法
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
A社
技術情報
miRNA
プロファイリング
B社
Norgen
A社
B社
Norgen
A社
Norgen
B社
図 4 尿エキソソーム RNA を一貫して効率よく検出
3 社のキットを用いて，5mL の尿サンプルからエキソソーム RNA を分離。単離したエキソソーム RNA を RT-qPCR により，５Ｓ rRNA，miR-21 および miR-16 を検出，その際に得られた Ct 値を示す。ノルジェン社
のキットを用いて得られた値が青，他社 A または B キットを用いて得られた値は赤または緑で示す。ノルジェン社のキットは，一貫して高品質の RNA を分離できたことが分かる。
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
012
■商品リスト
［メーカー：NOG］
商品名
Urine Exosome RNA Isolation Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
47200
50 PREP.
¥60，
000
室
○
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
miRCURYTM RNA Isolation Kit
抽出 / 精製
miRBase
LNA
有機溶剤を使用しない高純度・高収量のトータル RNA 抽出キット
抽出 / 精製
背景
適用
EXIQON 社独自のレジンを使用したスピンカラムによるトータル RNA
抽出キットです。
いずれのキットも mRNA，rRNA，miRNA など，さまざまなサイズの
RNA 抽出が可能です。
フェノールやクロロホルムといった毒性の高い薬品は使用しません。操作
は簡単で，20 ∼ 50 分程度でトータル RNA 抽出が可能です（サンプル
により所要時間が若干異なります）
。
miRCURYTM RNA Isolation Kit - Cell & Plant
プロファイリング
動物培養細胞，小組織片，血液，酵母，菌類，細菌類，植物に最適
定量
検出
miRCURYTM RNA Isolation Kit - Tissue
動物組織サンプルに最適
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
Lysis solutionを用いて細胞や組織サンプルを可溶化
特長
過剰発現
（ベクター）
●高性能：高純度，高収量のトータル RNA 抽出キット
Spin
●実験操作が簡便化：20 ∼ 50 分程度で完了
●実験操作に左右されない高い再現性
次世代
シークエンシング
Wash solutionでカラムを洗浄 (3回）
●RNAlater® に保存されたサンプルにも使用可能
Spin
●スピンカラムを利用したトータル RNA 抽出：有機溶剤の混入を回避
カラムに吸着したtotal RNAの溶出
●miRCURY シリーズに対応：qPCR キット，マイクロアレイ，ノーザ
ンブロット
siRNA
Spin
配列解析
サービス
精製 トータル RNA
プロトコール
RNA 抽出が困難な組織からも高純度なトータル RNA
抽出を実現
高純度のトータル RNA 抽出が可能
miRCURYTM RNA Isolation Kit - Tissue に は，筋 肉 な ど 線 維 の 多 い
組織や脳など高脂質の組織といった扱いにくいサンプルからのタンパク質
除去を目的として，Proteinase K が含まれています。
さまざまな“扱いにくいサンプル”からも，高純度のトータル RNA 抽出
が可能です（図 3）。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
®
RNAlater
に対応
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
-Colon
-Kidney
RNAlater® を用いて保存された組織からも，新鮮な凍結組織と同様の
高純度のトータル RNA が抽出できるため，実験効率が上がります（図 4）
。
-Liver
-Muscle
Exiqon
-Brain
miRCURYTM RNA Isolation Kit を用いて抽出したトータル RNA は，
OD 測 定 値 や Agilent Bioanalyzer に よ る 分 析 に よ り，フ ェ ノ ー ル /
クロロホルム抽出と同程度の高純度であることを確認済みです（図 2）。
特に，フェノール / クロロホルム抽出や TRIzol® を利用した手法と比べ，
簡便かつ再現性が高いことが特長です。
トータル RNA に残余した有機溶剤の影響を受けやすい qPCR，マイク
ロアレイ解析をはじめ，ノーザンブロット，RNase プロテクションアッセ
イ，プライマー伸長法など，さまざまな実験に安心してご利用ください。
miRCURY LNATM シリーズの qPCR キット，マイクロアレイ，ノーザン
ブロット商品に最適です。
B 社
カスタム合成
サービス
図 1 miRCURYTM RNA Isolation Kit を使用したトータル RNA 抽出の流れ
種々のサンプルに最適化されたプロトコールが添付されています。
操作概要（図 1）
A 社
機能検証
エタノールを加えてカラムに添加
●さまざまなサンプルに適応，シングルセルから抽出可能
関連試薬
0.980
相関係数[R2]
0.970
トランスフェク
ション試薬
0.960
0.950
その他
0.940
0.930
0.920
0.910
Ex
iq
on
Co
m
pe
tit
or
B
Co
m
pe
tit
or
A
0.900
技術情報
mmu-miRs
図 2 miRCURYTM RNA Isolation Kits と他社製品との比較
図 3 さまざまな組織サンプルからの高純度トータル RNA 抽出が可能
種々のキットを使用して，106 cells の HEK293 細胞よりトータル
RNA を抽出した。
ヒ ス ト グ ラ ム お よ び RIN（RNA integrity number, n=6）に 示 し
た通り，miRCURYTM RNA Isolation Kits により高純度のトータル
RNA が抽出可能であることがわかる。
A 社：フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出
B 社：フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出
およびカラム精製
miRCURYTM RNA Isolation Kit ‒ Tissue を 使 用 し て，5 種 類 の
マウス組織からトータル RNA を抽出した。脳や筋肉組織は脂質や
線維が豊富なため，一般に“扱いにくいサンプル”とされているものの，
本キットを使用することで高純度のトータル RNA が抽出可能である。
miRNA
プロファイリング
図 4 凍結組織または RNAlater® 保存済み組織から抽出したトータル
RNA の品質比較結果
miRCURYTM RNA Isolation Kit および他社製品を使用して，新鮮凍結
マ ウ ス 組 織（FF）ま た は RNAlater ® 保 存 済 み 組 織（RL）よ り
トータル RNA を抽出した後，miRCURY LNATM microRNA Array
にハイブリダイズした。図に示した通り，Exiqon RNA Isolation Kit
では，FF サンプルと RL サンプル間で miRNA 発現様式に良好な
相関係数（R2）が確認できた。
■商品リスト
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
［メーカー：EXQ］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
miRCURYTM RNA Isolation Kit - Cell & Plant
300110
50 回分
¥31，
000
室
○
miRCURYTM RNA Isolation Kit - Tissue
300111
50 回分
¥36，
000
室
○
miRCURY LNA RNA Isolation, Lysis solution additive for total RNA isolation
from fatty tissue (5mL)
300121
1 EACH
¥14，
000
室
○
013
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
miRNA 精製キット
抽出 / 精製
miRBase
LNA
ゲノムや高分子 RNA のコンタミネーションを最小限に抑えます
抽出 / 精製
特長
プロファイリング
●迅速かつ簡単なスピンカラムを用いたキットです（30 分で 10 サンプル処理可）。
●フェノールやクロロホルムは必要ありません。
定量
●200 塩基未満の低分子 RNA を分離します。
●高分子 RNA 除去カラムと miRNA 分離用カラムを用いるので，ゲノムや高分子
RNA のコンタミネーションが最小限に抑えられます。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
構成内容
●溶解バッファー
●洗浄バッファー
●高分子 RNA 除去カラム
●miRNA 分離用カラム ●コレクションチューブ
●溶出バッファー
●溶出用チューブ
●プロトコール
■仕様
カラム結合能
次世代
シークエンシング
50μgRNA まで
最大カラムローディング量
650μL
精製できる RNA のサイズ
200nt 未満
精製時間 (10 サンプル）
最大サンプル量
siRNA
図 1 ノルジェン社 miRNA 分離キットと他社製品の比較
miRNA の精製に成功したのは，ノルジェン社製品と TRI 試薬のみ。
30 分
動物細胞
3 × 106 cells
動物組織
バクテリア
5-25 mg
1 × 109 cells
［メーカー：NOG］
■商品リスト
植物組織
50 mg
商品名
血液
100μL
microRNA Purification Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
21300
1kit（25 回分）
￥44，
000
室
○
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
All-in-One 精製キット
抽出 / 精製
コントロール
siRNA
同じサンプルからゲノム DNA，トータルタンパク質，miRNA，RNA を精製
特長
shRNA クローン
コレクション
●完全なカラム精製：RNA，DNA やタンパク質をフェノール，クロロホルム
またはアセトンを使用せずにカラム精製することが可能です。
si/shRNA 発現
●トータルまたは micro-enriched RNA の単離：大きな rRNA から
miRNA ま で の 全 て の サ イ ズ の RNA を 分 離 す る プ ロ ト コ ー ル と，
miRNA 種（200nt 以下）やラージ RNA 種（200nt 以上）を別々
に単離するプロトコールの 2 つが提供されています。
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
●ばらつきの減少：同じライセートより RNA，DNA, タンパク質を分離する
ため，結果の不一致やばらつきが減少します。
●少量のサンプルからの単離：バイオプシーサンプルまたは単一の病巣のよ
うな入手が難しいサンプルに最適です。
関連試薬
●迅速な手順：トータル RNA，ゲノム DNA やトータルタンパク質の
単離が 40 分で終了します。
トランスフェク
ション試薬
●広範囲のサンプルタイプ：培養動物細胞，組織，血液，バクテリア，酵母，
菌類や植物からトータル RNA，ゲノム DNA やタンパク質を単離でき
ます。
その他
構成内容
●溶解液
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
●RNA 洗浄液
●RNA 溶出バッファー
●ゲノム DNA 洗浄液
●ゲノム DNA 溶出バッファー
●タンパク質洗浄液
●タンパク質 pH 結合バッファー
●タンパク質溶出バッファー
●タンパク質中和剤
●タンパク質ローディングダイ
●All-in-One スピンカラム
●マイクロ RNA 濃縮カラム
●コレクションチューブ
●溶出チューブ
●プロダクトインサート
図 1 単一サンプルからの精製が可能
■商品リスト
［メーカー：NOG］
商品名
All-in-One Purification Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
24200
1kit (20 回分）
¥42，
000
室 ○
凍
○
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
17200
1kit (50 回分）
¥34，
000
室 ○
凍
○
■関連商品
［メーカー：NOG］
商品名
Total RNA Purification Kit
014
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
miRNA 分離・定量キット
抽出 / 精製
miRBase
LNA
簡単かつ迅速に miRNA を分離・定量できるキット
抽出 / 精製
miRNA 分離キット
プロファイリング
背景
構成内容
バイオチェーン社の miRNA 分離キットは，少量の組織・培養細胞・血液
および血清から 200 塩基以下の低分子 RNA（miRNA，siRNA，tRNA，
5S rRNA 等）を分離・精製するキットです。本キットを用いて分離した低
分子 RNA は，qRT-PCR，ノーザンブロット，マイクロアレイなどのアプリ
ケーションに用いることができます。
遺伝子制御や機能性解析の研究に是非お役立て下さい。
●Lysis Enhancer Solution
検出
●Acidified Phenol:Chloroform
●Spin Column with Collection Tubes
●Wash Buffer 1
●Wash Buffer 2 (Concentrated)
●RNase-Free Water
●Elution Buffer
特長
定量
●Lysis Buffer
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
●スピンカラムを用いた簡単プロトコールで 30 分以内で miRNA を
分離することができます。
次世代
シークエンシング
●200 塩基以下の低分子 RNA と 200 塩基以上の高分子 RNA の
どちらにもご利用いただけます。
●分離した低分子 RNA は，様々なダウンストリームアプリケーション
でご利用いただけます。
EDVH
●高分子 RNA とゲノム DNA の混入が最小限に抑えられているため，
信頼性・再現性の高い結果が得られます。
仕様
●カラムの結合能：100μg
●推奨開始サンプル量
組織：0.5 ∼ 200mg
siRNA
配列解析
サービス
図 1
本キットを用いて分離した低分子 RNA と高分子 RNA
を 1% の変性アガロースゲルで解析した。サンプルはヒト
胎盤組織ライセートを用いた。
（Lane1: 精製した 200 塩基
以下の低分子 RNA，Lane2：精製した 200 塩基以上の
高分子 RNA，Lane3：RNA ラダー）
培養細胞：100 ∼ 1 × 107 cells
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
血液・血清：200μl
●カラムの最大ローディング量：650μl
shRNA クローン
コレクション
●最終溶出量：30 ∼ 100μl
si/shRNA 発現
■商品リスト
［メーカー：BCH］
商品名
microRNA Isolation kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
KS341025
1 kit
￥43，
800
冷
○
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
miRNA 検出キット
背景
関連試薬
構成内容
バイオチェーン社の miRNA 検出キットに含まれる MicroRNA qRTPCR プライマーは，ワンステップで簡単かつ安定にトータル RNA または
small RNA が多く含まれるサンプル中の miRNA の発現を定量するキット
です。本キットに含まれる EvaGreen® dye は，リアルタイム PCR 解析
と DNA の定量で用いられている DNA 結合型の優れた緑色色素です。
miRNA は，その長さが短いため，PCR を行うことが困難とされていますが，
本キットの microRNA qRT-PCR プライマーセットは，低温アニーリング
で特異的かつ高感度に miRNA が検出できるように最適化されています。
microRNA プライマーセットに含まれる Reverse Primer は，逆転写反応
の RT プライマーとしても用いることができます。本キットには，多くの
qPCR に適応できる ROX も別ボトルで含まれています。
●MicroRNA 2x qRT-PCR Reaction Mixture
トランスフェク
ション試薬
●MicroRNA qRT-PCR Enzyme Mix*
●ROX Reference Dye
その他
●qRT-PCR Primer Set
●Human Placenta Total RNA
●Nuclease-Free PCR Grade Water
＊Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，
Hotstart Taq DNA Polymerase を含みます。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
■商品リスト
［メーカー：BCH］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
miR-24 One-Step qRT-PCR Detection kit
KS081200
1 kit（200 回分）
￥43，
800
速
○
miR-16 One-Step qRT-PCR Detection kit
KS082200
1 kit（200 回分）
￥43，
800
速
○
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
015
miRNA 抽出 / 精製
miRNA
MaxRecoveryTM BiooPureTM RNA 精製試薬
抽出 / 精製
miRBase
LNA
使用目的
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
濃縮 small RNA の qRT-PCR
本製品は，組織，培養細胞および血清や血漿のような細胞フリー溶液サンプル
から，トータル RNA や miRNA を含む濃縮 small RNA を抽出します。
BiooPure 試薬は，グアニジンおよびフェノールを含みます。
miRNA の qRT-PCR 用サンプルを調製することができます。
特長
インヒビター
●組織および細胞からトータル RNA を高収量精製
過剰発現
（オリゴ）
●miRNA 濃縮用プロトコール付き
過剰発現
（ベクター）
●細胞フリー溶液も処理可能
トータル RNA
濃縮 small RNA
●miRNA の qRT-PCR 用サンプル調製可能（図 1）
●不活性な共沈殿剤により RNA 回収を最大化
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
プロトコール
①サンプル（組織，培養細胞，細胞フリー溶液）を BiooPureTM 試薬に溶解
②BCP (1-bromo-3-chloropropane) もしくはクロロホルムを加え，ボル
テックス
③遠心分離し RNA を含む上層の水相を回収
④Linear Polyacrylamide を添加後，イソプロパノールで RNA 沈殿
⑤エタノール沈殿して，RNase フリー水あるいは溶媒で再溶解
※ small RNA の濃縮用プロトコールは添付書に記載があります。
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
構成内容
図 1
●BiooPureTM 試薬 30mL
マウス脳組織ライセートから本試薬を用いてトータル RNA と濃縮 small RNA を調製した。それぞれの
サンプルについて input RNA 5ng を逆転写し（7.5μL）
，逆転写反応液の 20% を qRT-PCR に用いた。
miR-124 アッセイの結果は約 16 倍の濃縮を示す。
●共沈殿剤 (Linear Polyacrylamide)（15μg/μL）350μL
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
shRNA クローン
コレクション
TM
MaxRecovery
TM
BiooPure
RNA Isolation Reagent
si/shRNA 発現
品番
包装
5301-01
30ml
5301-03
120ml
希望販売価格
貯蔵
¥8，
000
冷 ○
凍
○
¥28，
000
冷 ○
凍
○
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
尿中 miRNA 精製キット
抽出 / 精製
尿中の miRNA をフェノールを使用せずに精製。
関連試薬
特長
トランスフェク
ション試薬
●迅速・簡便：スピンカラムを使用して 30 分以内で精製が可能です。
その他
●様 々 な 尿 サ ン プ ル 量 に 対 応：0.5 - 1ml の 尿 サ ン プ ル 量 か ら 尿 中
miRNA を精製します。
●フェノール，クロロホルムは使用しません。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
●インヒビターを含まない RNA を精製：精製した RNA は，RT-PCR，
ノーザンブロッティング，マイクロアレイ解析などの様々な遺伝子発
現制御・機能解析アプリケーションにお使い頂けます。
商品説明
【本キットの規格】
●最小サンプル量：0.5ml
●最大サンプル量：1ml
●RNA 精製のサイズ：200nt 以下
●所要時間：30 分以下
図 1
尿中 microRNA 精製キットの手順
■商品リスト
［メーカー：NOG］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
29000
1kit（25 回分）
¥32，
000
室
○
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Urine (EXfoliated Cell) RNA Purification Kit
22500
1kit（20 回分）
¥44，
000
室
○
Urine Total RNA Purification Maxi Kit
29600
1kit
¥67，
000
室
○
Urine microRNA Purification Kit
■関連商品
［メーカー：NOG］
商品名
016
miRNA 抽出 / 精製
抽出 / 精製
miRNA
RNAzol® RT RNA 分離試薬
miRBase
LNA
トータル RNA，mRNA，small RNA を効率良く簡単に分離
抽出 / 精製
クロロホルム使用の必要なし！
®
RNAzol RT は，ヒト，動物，植物，バクテリア，ウイルスサンプルから
トータル RNA，mRNA，miRNA（10 ∼ 40 塩基）を含む 200 塩基
未満の small RNA を効果的に単離できます。RNAzol® RT は，高 品 質
の RNA を単離でき，DNase 処理せずに，RT-PCR が可能です。
サンプルを RNAzol® RT 中で，ホモジナイズまたは溶解します。DNA，
タンパク質，多糖類やその他の分子は，水を加えることにより沈殿し，遠心
分離によって除去できます。エタノール沈殿後，洗浄と可溶化を行うことに
より，上清から高純度の RNA が単離できます。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
特長
機能検証
●高収量かつ高品質！
次世代
シークエンシング
●操作時間は 1 時間以内。
●クロロホルム使用の必要なし：クロロホルムによる分離ステップは必要
ありません。水を加えるだけです。
●様 々 な ア プ リ ケ ー シ ョ ン で 使 用 可 能：RT-PCR，マ イ ク ロ ア レ イ，
polyA セレクション，ノーザンブロッティング及び RNase プロテク
ションアッセイ等。DNase 処理の必要がありません。
siRNA
●冷却遠心機は必要なし：全てのステップを室温で行えます。
配列解析
サービス
図 1 ラット肝臓のトータル RNA 及び small RNA サンプルのアジレント社 RNA ナノチップ及び
small RNA チップ解析
カスタム合成
サービス
高品質トータル RNA（A）は，RNA Integrity Number（RIN）値が 9.2，28/18S の値が 1.6 の高純度
RNA。miRNA 領域（B の挿入図）は，small RNA の約 5％の割合で存在していることが示されている。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
■商品リスト
［メーカー：MOR］
商品名
RNAzol® RT Reagent
品番
RN190
包装
希望販売価格
貯蔵
50mL
￥15,000
室
○
100mL
￥26,000
室
○
200mL
￥48,000
室
○
500mL
￥119,000
室
○
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
017
miRNA プロファイリング
miRNA
miRCURY LNATM microRNA Array
プロファイリング
miRBase
LNA
使用目的
抽出 / 精製
本製品は，高感度で特異性の高い LNA™ 強化型かつ Tm 値が最適化された捕捉プローブにより，少量の Total RNA サンプルから " 真の " 網羅的
miRNA 発現様式解析を行なうことを目的とした miRNA マイクロアレイシステムです。LNA™ 捕捉プローブにより全 microRNA を高感度かつ均一に
検出することが可能です。EXIQON 社の第 7 世代アレイには約 3,100 種類の捕捉プローブが搭載され，miRBase v18 登録の全ヒト，マウス，ラット
miRNA およびこれら生物種に関与するウイルスの miRNA を網羅しており，その他の生物種についても検出可能です。各生物種の miRBase 登録配列カ
バー率は WEB ページよりご確認ください。
プロファイリング
定量
本製品には，LNA™ 捕捉プローブの利用により従来型の DNA プローブに比べて特に 2 つの利点があります（図 1 ∼ 3）。
検出
1. 高い親和性：LNA™ を捕捉プローブに組込むことでプローブと標的との２本鎖の融解温度（Tm）が高くなり，アレイの特異性と感度が上がります。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
2. 均一化された親和性：DNA 捕捉プローブと異なり，Tm 値がノーマライズされた LNA™ 捕捉プローブは miRNA の GC 含有量にかかわらず各標的配
列と同等の親和性で結合します。各プローブ中の LNA™ 組込み位置や数量を種々変更することで実現しました。
EXIQON 社では，RNA ラベリングからデータ解析までワークフローにそった製品をすべてご提供します。
特長
原理
●高感度：一般的な DNA プローブに比べて 10 倍程度高感度
次世代
シークエンシング
●特異的検出：わずか 1 塩基のミスマッチを識別検出
1. トータル RNA250ngを用意
●配列特異的バイアスのないサンプルラベリング
●Tm 値正規化捕捉プローブの利用：標的に対する捕捉能が均一化
2. RNAラベリング (Hy3/Hy5)
●トータル RNA 250ng で網羅解析
※ EXIQON 社実績：トータル RNA 30ng
siRNA
3. Overnightハイブリダイ
●ダイナミックレンジ：5 桁以上
配列解析
サービス
●miRBase 未登録の新規 miRNA：ヒト 25 種の miRPlusTM 搭載
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
4. 洗浄
■miRBase18.0 登録の miRNA カバー数
Human
Mouse
miRBase v.18
登録数
1921
1157
EXIQON 社
アレイ カバー率
99%
100%
Rat
680
100%
生物種
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
ゼーション
●miRBase ver.18 の mature miRNA をカバー
5. スキャニング
6. データ解析
その他の生物種の miRBase v.18 カバー率につきましては，下記の WEB ページをご参照ください。
http://www.exiqon.com/ls/PublishingImages/Figures/mirna-array-mirbase-v18-cover.htm
si/shRNA 発現
300
50
250
40
200
30
150
20
100
10
50
0
0
50
55
60
トランスフェク
ション試薬
65
70
75
Acceptable
detection signal
8
Poor
detection signal
4
0
100
200
300
400
500
600 microRNAs
16
DNA capture probe
Acceptable
detection signal
8
Poor
detection signal
100
200
300
400
500
DNA 捕捉プローブの場合，約半数の miRNA は検出不可能または検
出困難であった。EXIQON 社マイクロアレイと A 社の DNA アレイ
に対して 660 種の合成 miRNA をハイブリダイズし，シグナル強度
（log2 シグナル / 100amol ターゲット）を確認した。
% of microRNAs
detected at 1 amol:
100
0
50
60
70
80
90
100
Melting temperature (RNA T m)
図 3 LNA™ 捕捉プローブは均一かつ高い Tm 値をもつ
LNA™ プローブは DNA プローブに比べて高い Tm 値をもつ。ま
た Tm 値をノーマライズして全捕捉プローブのハイブリ温度を均一
化できるため，全捕捉プローブは高ストリンジェントな条件（high
stringency conditions）下でもうまく機能する。一方，DNA プロー
ブではスライド上の捕捉プローブ全ての Tm 値を均一化することは困
難である。
400
Hi 125
-P n
ow g
er
Hi 250
-P n
ow g
er
Hi 500
-P n
ow g
er
0
5
Po 00 n
w g
er
200
図 4 RNA テンプレートを半量にしても同数の
microRNA が検出可能
Hi-Power ま た は Power labeling kit に よ る
シ グ ナ ル 強 度 比 較 結 果。実 験 に は EXIQON 社
microRNA Array を使用した。
Log2 ratios Tumor vs. Normal (oesophagus)
- correlation between various RNA input amounts
1.5
80
1
70
60
-3
50
-2.5
-2
-1.5
0.5
-1 -0.5 -0
40
30
0
0,2
-1.5
2
20
microRNA detection limit (amol)
200
図 5 最も感度のよいアレイ
最適化された Tm 値ノーマライズ済み LNA™ 捕捉プローブと非常に効率の良いラベリ
ングのため，EXIQON 社アレイは他社アレイに比べて著しく高い割合の miRNA を検
出可能である。
1
1.5
-1
20
10
0.5
-0.5
Log2(T/N)
600
Exiqon - 70% microRNAs
Competitor A – 40% microRNAs
Competitor B – 32% microRNAs
90
Log2(T/N)
800
% detected microRNA on the array
Raw signal
1000
t Power labeling
t Hi-Power labeling
018
10
＊ストリンジェント（stringent）：核酸のハイブリダイゼーションを行うときの条件の強
さのこと。プローブが標的配列に結合する至適条件に対して洗浄バッファーの温度・塩濃
度などがどの程度厳しいか，洗浄バッファーがプローブを引き剥がす能力の程度，など。
miRNA
プロファイリング
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
20
600 microRNAs
技術情報
プール型 shRNA
ライブラリー
30
4
図 2 LNA™ 強化型捕捉プローブにより全 microRNA を確実に検出
DNA 捕捉プローブの場合，Tm 値に 30℃ 以上の幅があり，かつ
平 均 Tm 値 は 64℃（StDeV5℃）で あ っ た。こ れ に 対 し，LNATM
捕捉プローブでは Tm 値幅がわずか 10℃ であり，平均 Tm 値は
71.5℃（STDeV1.62℃）と高く設定可能である。
ヒト miRNA に対する LNATM 補足プローブと一般的な DNA 補足
プローブの Tm 値分布
miRNA
機能解析
40
Temperature
図 1 Tm 値正規化済み
その他
LNA™-enhanced capture probe
0
80
t DNA capture probes
t LNA™ capture probes
16
Frequency of capture probes (%)
LNA
● DNA
●
60
Signal strength [log2]
350
70
Number of LNA capture probes
関連試薬
Number of DNA capture probes
si/shRNA
ライブラリー
Signal strength [log2]
50
ノックダウン検証
-2
-2.5
-3
t T/N 1000 ng vs. T/N 300 ng R2 = 0.984
t T/N 1000 ng vs. T/N 100 ng R2 = 0.935
t T/N 1000 ng vs. T/N 30 ng R2 = 0.910
図 6 わずか 30ng の Total RNA で信頼性の高い microRNA 発現
プロファイリングが可能
食道がん（T）および正常な近隣組織（N）から得た RNA を種々の濃
度で使用して，4 種類のマイクロアレイ実験を行った。1000ng の
RNA を 使 用 し た 場 合 の 結 果 を そ れ ぞ れ 300ng，100ng，ま た は
30ng の RNA を使用した際の結果に対してプロットしたところ，非
常に高い相関性がみられた。
miRNA プロファイリング
miRCURY LNA™ microRNA Array,7th gen - hsa, mmu & rno
● １塩基差を識別可能な高い特異性
miRNA
let-7a let-7b let-7c let-7d let-7e
miRCURY LNA™ microRNA Array は標的 microRNA に対する特異性が高い
ことが特徴です。Tm 値ノーマライズ済みの LNA™ 捕捉プローブと高いストリン
ジェンシー結合に向けて最適化されたハイブリダイゼーション条件を使用すること
で，捕捉プローブの特異性を劇的に改善できました。EXIQON 社アレイでは非常に類
似した miRNA ファミリーメンバー間の識別も可能となりました（表 1）。
● 広範なダイナミックレンジ
miRCURY LNA™ microRNA Array では，5 桁以上のダイナミックレンジをも
つため，高発現または低発現の miRNA であっても直線的な検出範囲内で検出可能で
す。
let-7a
let-7b
let-7c
let-7d
let-7e
let-7f
let-7g
let-7i
let-7f
let-7g
let-7i
17%
4%
4%
2%
1%
2%
100%
4%
1%
1%
1%
1%
1%
8%
100%
0%
1%
0%
0%
0%
2%
2%
5%
100%
1%
0%
0%
0%
1%
0%
0%
0%
100%
0%
0%
0%
6%
3%
5%
3%
3%
100%
2%
3%
0%
0%
1%
0%
0%
1%
100%
4%
0%
3%
0%
0%
0%
0%
2%
100%
100%
2%
1%
0%
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
表 1 microRNA ファミリーメンバー間の優れた識別
let-7 ファミリーメンバー間であっても非常に低い交差性を示す。実験は tRNA バッ
クグラウンドに 300amol の合成 let-7 spike-in microRNA を添加して行った。
検出
インヒビター
miRCURY LNA™ microRNA Array の捕捉プローブは合成 miRNA を使用して
実験的に検証済みです。EXIQON 社の厳格な品質標準を満たさないプローブは他の
デザインに変更され，最終製品には組込まれません。
● 高い再現性を誇る安定したシステム
過剰発現
（オリゴ）
2
Up-regulated
1
過剰発現
（ベクター）
0
-1
Down-regulated
-2
機能検証
次世代
シークエンシング
-3
-4
-5
m
iR
m -A
iR
m -B
iR
m -C
iR
m -D
iR
m -E
iR
m -F
iR
m -G
iR
m -H
i
m R-I
iR
m -J
iR
m -K
iR
m -L
iR
m -M
iR
m -N
iR
m -O
iR
m -P
iR
m -Q
iR
m -R
iR
m -S
iR
m -T
iR
m -U
iR
m -V
iR
m -X
iR
m -Y
iR
m -Z
iR
-A
A
miRCURY LNA™ microRNA Array は，厳密な生産プロセスにより高品質が保証
されたスポットのため，非常に高い再現性を示します。4 つの反復スポットにおける
変動計数（CV）は非常に低いうえ，各アレイスライド間の相関性にも優れています。
このため，1 色法と 2 色法の何れのアレイ実験にも適しています。
Log2 ratios between tumor and normal
● 実験的に検証済みの捕捉プローブ
● EXIQON 社の qPCR システムによる結果検証
miRCURY LNA™ microRNA Array
EXIQON 社の microRNA qPCR システムは他社製品に比べて非常に簡便，かつ高
感度で特異性も高いため，マイクロアレイ実験結果の検証に最適です。ユニバーサルな
RT 反応と LNA™ 強化型 PCR プライマーの併用により類い稀な感度と特異性が得
ら れ ま す。Ready-to-use microRNA PCR panel を 利 用 し て 迅 速 か つ 簡 便 な
miRNA 発現プロファイリングが行えます（図 7）
。マイクロアレイと qPCR のプラッ
トフォームで同一のポジティブコントロールを使用すれば，結果のプラットフォーム相
互比較が可能となります。
siRNA
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR
図 7 良好な相関性を示すマイクロアレイと qPCR 結果
EXIQON 社のアレイシステムで得られた結果は，EXIQON 社 qPCR システムで検
証することが可能で信頼性の高い結果を得ることができます。アレイデータをノー
マ ラ イ ズ（quantile normalization）後，log2 比 が > 0.5 ま た は < 0.5 の
miRNA 群を用いて検討した。qPCR データはリファレンス遺伝子に対してノーマラ
イズし，繰返し実験全てにおいて検出できた miRNA 群（Cp < 36）を解析対象と
した。本検討には全 26 種の miRNA を使用した。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
miRCURY LNA™ Hi-Power microRNA Labeling Kit
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
● 強力なラベリングで２倍近いシグナル強度が実現
EXIQON 社 miRCURY LNA™ Hi-Power microRNA Labeling Kit では，従来品に比べて約 2 倍のシグナル / ノイズ比が期待でき，従来法では
検出限界ぎりぎりで検出できなかった miRNA の検出が可能となります。また，同量のサンプル RNA を使用した場合，以前より多くの miRNA 検出
が期待できます。さらに，従来に比べて約半量のサンプル RNA から同等数の miRNA を検出できる可能性があります（前ページ，図 4）。
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
● 無類の感度
本製品を使うことで EXIQON 社のアレイは無類の感度を示します（前ページ，図 5）。アレイに搭載された LNA™ 捕捉プローブの半数以上が検出感
度 )0.5 amol です。EXIQON 社の microRNA アレイは，わずか 30ng の total RNA で信頼性のある結果が得られます（前ページ 図 6）。高い特
異性をもつプラットフォームのため，データの精度を落とすことなくサンプルサイズをスケールアップできます。特に低発現の miRNA 群を対象とする
場合は重要なポイントになります。
関連試薬
miRCURY LNA™ microRNA Array Spike-in Kit
トランスフェク
ション試薬
● データ品質改善用の Spike-in miRNA Kit v2
第 7 世代の miRNA アレイには，アレイ上の特定捕捉プローブで検出できる 52 種類の合成 spike-in microRNA を用いたキットが付属されてい
ます。アレイハイブリダイゼーションの前段階のラベリング反応に spike-in microRNA を添加することで，spike-in 用捕捉プローブからのシグナル
強度をラベリング反応およびハイブリダイゼーション，スキャナー設定，データノーマライゼーション，アレイの再現性および実験手技などのバラツキに
おけるコントロールとして使用できます。
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
商品名
品番
包装
希望販売価格
208500
1 EACH (3 slides)
ご照会
室 ○
凍
○
miRCURY LNA™ microRNA Array, 7th gen - hsa, mmu & rno, 6 slides
208501
1 EACH (6 slides)
ご照会
室 ○
凍
○
miRCURY LNA™ microRNA Array, 7th gen - hsa, mmu & rno, 24 slides
208502
1 EACH (24 slides)
miRCURY LNA™ microRNA Hi-Power labeling kit, Hy3
208034
1 EACH (24 rnxs)
miRCURY LNA™ microRNA Hi-Power labeling kit, Hy5
208033
1 EACH (24 rnxs)
2
miRCURY LNA™ microRNA Hi-Power labeling kit, Hy3/Hy5
208035
1 EACH (12 rnxs* )
miRCURY™ LNA microRNA, Extended Spike-in miRNA Kit
208041
1 EACH
miRCURY™ LNA microRNA Array, washing buffer kit
208021
miRCURY™ LNA microRNA Array, 2X hybridisation buffer
208022
1EACH(salt buffer 125 mL; detergent 15 mL)
1 EACH (5 mL)
ご照会
室 ○
凍
○
¥308,000
凍
○
¥308，
000
凍
○
¥308，
000
凍
○
¥89，
000
凍
○
技術情報
¥40，
000
室
○
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
¥55，
000
miRCURY™ LNA microRNA Array, 20X Salt Buffer
208023
1 EACH (125 mL)
¥32，
000
miRCURY™ LNA microRNA Array, 10% Detergent solution
208024
1 EACH (15 mL)
¥32，
000
miRCURY LNA™ microRNA Array, v.11.0 - other species, R2S probe set
その他
貯蔵
miRCURY LNA™ microRNA Array, 7th gen - hsa, mmu & rno, 3 slides
miRCURY LNA™ microRNA Array, 7th gen - hsa, mmu & rno, ready-to-spot probe set
si/shRNA
ライブラリー
208510
1 EACH
ご照会
凍
○
208215-A
1 EACH
ご照会
凍
○
* miRCURY LNA™ microRNA Array には Spike-in miRNA Kit v2 (208041), washing buffer Kit (208021), hybridization buffer (208022) がセットになっています。
参考文献：Esguerra et al . PLoS ONE 2011, Huang et al . RNA Biol. 2011, Ralfkiaer et al . Blood 2011 ※その他の報告や商品情報は，www.exiqon.com/array をご参照ください。
019
miRNA プロファイリング
miRNA
プロファイリング
miRCURY LNATM microRNA Array 受託解析サービス
miRBase
LNA
迅速・丁寧な受託解析でラクラク miRNA プロファイリング
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
特長
解析の流れ
TM
●EXIQON 社 miRCURY LNA
miRNA 発現解析
STEP ①
microRNA Array を使用する網羅的
トータル RNA 抽出（組織，細胞，血液，血漿，血清）
●miRBase ver 18 登録の Human / Mouse / Rat の miRNA に対応
（2012 年 6 月現在）
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
サンプルの品質チェック：スペクトル解析にて品質確認および濃度測定
●small RNA の enrichment は必要なし
※ ELASV01 クオリティチェックをご注文頂かない場合には分光光度計による品質確認のみとなります
●わずか 1 塩基差も識別可能
STEP ③
●検出濃度域が広く，ダイナミックレンジは 4 桁以上
●結果報告書は PPT 形式，プレゼンテーションにすぐに使用可能
●データ保証期間：6 ヶ月 再データ解析を無償で承ります
STEP ④
ハイブリダイゼーション：サンプルをアレイ上にハイブリダイズ
製品概要
STEP ⑤
EXIQON 社 miRCURY LNATM microRNA Array を用いて miRNA 発現
解析を行うカスタムサービスです。
miRCURY LNATM microRNA Array は，miRBase（ver 18）に 登 録
されているヒト・マウス・ラットの全 miRNA および関連ウイルスやその
他の生物種の miRNA を対象としています。本アレイの miRNA カバー
率は WEB ページをご参照ください。
本サービスでは，解析後のシグナルデータ（生データ）のみではなく，基本
的な統計処理を行い有意な発現変動を示す miRNA の抽出データ，クラス
ター分析，ご希望によるサンプル間比較解析を行います。
データ保証期間の 6 ヶ月間は，再解析を無償で承ります。㊟
スキャニング：アレイをスキャンし，画像ファイルを作成
STEP ⑥
データ解析：各スポットの発現強度を数値データに変換，ノーマライゼー
ションと Ratio 算出を行い，発現差異のある miRNA の抽出を行います。
※クラスター解析や統計解析も追加料金は頂きません。ご希望の解析方法をお知らせください。
㊟データ保証期間およびサンプル保管期間は納品後 6 ヶ月となります。納品 6 ヶ月以降の再解析ご依頼に
は別途料金が発生しますこと，予めご了承ください。
EXIQON 社 miRCURY LNATM microRNA Array
shRNA クローン
コレクション
●高感度：一般的な DNA プローブに比べて 10 倍程度高感度
si/shRNA 発現
●配列特異的バイアスのないサンプルラベリング
si/shRNA
ライブラリー
サンプルの標識：トータル RNA に EXIQON 社のラベリングキットを
用いて，Hy3 / Hy5 を蛍光標識
●1 色法でも 2 色法でも同価格！
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
ノックダウン検証
STEP ②
●30ng - 2μg のトータル RNA で miRNA の網羅的発現解析が可能
■miRBase ver 18 登録の miRNA カバー数
●特異的検出：わずか 1 塩基のミスマッチを識別検出
生物種
miRBase v.18 登録数
Human
Mouse
1901
1157
EXIQON 社
アレイ カバー率
99%
100%
Rat
680
100%
詳細は，p.18，p.19 ページの miRCURY LNATM microRNA Array をご参照ください。
●Tm 値正規化捕捉プローブの利用：標的に対する捕捉能が均一化
●トータル RNA 250ng で網羅解析
※ EXIQON 社実績：トータル RNA 30ng
●ダイナミックレンジ： 4 logs 以上
●miRBase ver.18 の mature miRNA をカバー（2012 年 6 月現在）
●miRBase 未登録の新規 miRNA：ヒト 25 種の miRPlusTM 搭載
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
miRNA アレイ受託解析サービス レポート内容
miRNA アレイ受託解析サービスでは，PPT 形式の報告書を納品しています。また，miRBase を利用した共通ターゲット解析や GEO 解析なども可能
です。お問い合わせください。
1 枚のアレイ中に複数の
繰り返しスポット
その他
㻔㻓
100,000
Sample A
10,000
1,000
㻔
100
㻓
㻘㻓㻓
㻔㻓㻓㻓
㻔㻘㻓㻓
㻕㻓㻓㻓
10
1
技術情報
1
10
100
1,000 10,000 100,000
㻓㻑㻔
Sample A/Control
Control
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
EXIQON 社 miRCURY LNATM microRNA Array に は，1 枚 の ア レ
イ中に複数の繰り返しスポットがあり，受託解析サービスではその平均
値をプローブのデータとして採用しています。
また，データのバラツキの指標として，その複数のスポットのシグナル
値の（標準偏差 / 平均値 *100）として %CV を用いています（%CV
> 50 のプローブは棄却しています）
。
㻝㻚㻤
㻝㻚㻢
㻝㻚㻠
㻝㻚㻞
㻝
㻜㻚㻤
㻜㻚㻢
㻜㻚㻠
㻜㻚㻞
㻜
赤線で示した 2 倍と 1/2 倍の Fold change にシグナルが集中し，
サンプルのシグナル強度はほぼ均一であることを確認します。
Quality Check2：データ全体の信頼度の確認（sample A/Control）
2 色 法 で の 実 験 の 場 合，Hy3/Hy5（sample/Reference）Fold
Change 値を小さな順に並べ，データ全体に偏りがないことを確認し
ます。
Probe Gene name
name
Link
00000 hsa-miR-xxx
http://www.mirbase.org/
cgi-bin/mirna_entry.pl?acc
=MI000xxxx
http://www.mirbase.org/
cgi-bin/mirna_entry.pl?acc
=MI000yyyy
㻼㻡
11111 hsa-miR-yyy
㻼㻝㻝
㼔㼟
Statistical Analysis 1：スクリーニング
発現比（2 倍以上 or 1/2 倍以下）のような「変動している」と判
断できる CutOff 値を決めスクリーニングを行います。
020
Quality Check1：サンプルのシグナル強度の分布の確認
（Control vs sample A）
miRBase Link
㼔㼟
㼍㻙
㼙
㼕㻾
㼔
㼍㻙 㼟㼍㻙 㻙㼤㼤
㼙
㼙
㼤
㼔㼟 㼕㻾㻼 㼕㻾㻙
㼍㻙
㼤
㼙 㼘㼡㼟㻙 㼤㼤
㼕㻾
㻼㼘㼡 㼤㼤㼤
㼟 㼤㼤
㼔㼟 㻙㼤㼤
㼍㻙 㼤㼤
㼤
㼙
㼔㼟 㼔㼟 㼕㻾㻙
㼍㻙 㼍㻙
㼤
㼙 㼤
㼙
㼕㻾 㼕㻾 㼤
㻼㼘㼡 㻙㼤
㼤
㼟
㼤
㼔㼟 㼔㼟 㻙㼤㼤
㼍㻙 㼍㻙 㼤㼤
㼤
㼙
㼙
㼕㻾 㼕㻾
㻼㼘㼡 㻙㼤
㼟 㼤㼤
㼔㼟 㼔㼟 㻙㼤㼤
㼍㻙 㼍㻙 㼤㼤
㼙
㼤
㼙
㼕㻾 㼕㻾㻙
㻼㼘㼡 㼤
㼔㼟 㼟㻙 㼤㼤
㼍㻙 㼤㼤㼤
㼙
㼕㻾 㼤㼤
㼔㼟 㻼㻙
㼍㻙 㼤㼤
㼙
㼤
㼔㼟 㼕㻾㻙
㼍㻙
㼤
㼙 㼤㼤
㼕㻾
㻙㼤
㼤㼤
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
データのバラツキの指標
Statistical Analysis 2：
クラスター解析
ご希望によりクラスター解析を行い，
Heat Map を ご 提 供 し ま す。追 加 料
金は頂きません。樹形図による階層型
クラスターにより発現データが視覚的
に 理 解 し や す く な り ま す。PCA，
k-means などの非階層解析も可能です。
22222 hsa-miR-zzz
http://www.mirbase.org/
cgi-bin/mirna_entry.pl?acc
=MI000zzzz
miRBase Link：
miRNA の基礎情報へのアクセスが簡単，且つ検索時の間違いなどを
減らすことができます。
miRNA プロファイリング
解析フロー例
本 受 託 サ ー ビ ス で は 1 色 法 で も，2 色 法 で も 同 じ 価 格 設 定 の た め，
Universal Reference（サンプル等量混合液）を用いた 2 色法を推奨し
て お り ま す。Universal Reference で は，包 括 的 に 全 サ ン プ ル で の
microRNA 発現がカバーされますのでコントロールとして適しています。
また，一貫してサンプルには Hy3，Universal Reference には Hy5 を用い
ることでラベリング効率を検討しなくてよいというメリットがあり，アレイ
間 の ハ イ ブ リ 効 率 に つ い て も 補 正 す る こ と が で き ま す。Universal
Reference は，当社にて作成致しますため（無償），ご送付頂くサンプルが
倍量必要となります。
実験デザインの詳細は，p.120 の技術情報「miRCURY LNATM Array
FAQ」をご参照ください。
例 1 ヒトがん細胞 VS 非がん細胞での
miRNA 発現プロファイルの比較
miRNA
① 細胞ペレットまたはトータル RNA をコスモ・バイオへ送付
② Universal Reference を作製
③ ア レ イ 実 験 か ら 得 ら れ た サ ン プ ル の シ グ ナ ル 値 を Universal
Reference のシグナル値でノーマライズ
④ スクリーニングを行い，発現差異のある miRNA をご報告
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
例 2 分化細胞への薬物投与などの経時的
miRNA 発現プロファイルの比較
定量
① 細胞ペレットまたはトータル RNA をコスモ・バイオへ送付
② Universal Reference を作製
③ ア レ イ 実 験 か ら 得 ら れ た サ ン プ ル の シ グ ナ ル 値 を Universal
Reference のシグナル値でノーマライズ
④ スクリーニングを行い，分化または薬物投与によって発現量に差がある
miRNA を抽出
⑤ クラスター解析により発現差異を視覚化
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
サンプルのご準備と輸送
Total RNA 抽出の際には EXIQON 社 miRCURY Isolation Kit，Ambion 社 mirVana，Qiagen 社 miRNeasy などをご利用ください。small RNA
の画分のみを抽出するキットは，本アレイ解析には適しません。RNA の純度は，OD A260/A280，A260/A230 ともに 2 程度を推奨しています。奨
しています。
サンプル量 注 2）
サンプル濃度 注 2）
保存方法
Total RNA 注 1）
800ng 以上
血清・血漿
1ml 以上
100ng/μL 以上（5 μL 程度必要）
DNase/RNase free 水 注 3）
− 80℃（抗凝固材：EDTA, RNase Free Tube）
保存容器
輸送温度
細胞
1.0x106 cells 以上
組織
1mg 以上（ペレット）
推奨 : RNA later® などの RNA 安定化試薬に保管
siRNA
注 4）
0.5 ∼ 2mL 容量のスクリューキャップチューブ
ドライアイス便
通常ドライアイス便（RNA later® 使用時：4℃（保冷材同梱，冷蔵便））
ドライアイス便
次世代
シークエンシング
注 1）：Phenol/Chloroform を含む溶媒を用いて Total RNA を抽出された場合は，必ずカラム精製を行い，溶媒を除去してください。カラム精製はオプションにて承ります。
注 2）：サンプル量・サンプル濃度は目安となっておりますので，ご相談ください。Universal Reference は比較したいサンプルが複数ある場合に使用します。例えばサンプルを Hy3 で，Universal Reference を Hy5
で標識し，1 枚のアレイにハイブリダイズします。これを解析する際に対照として使用します。ご送付頂くサンプルの一部を混合して Universal Reference を作製します。
注 3）：DEPC 処理水は使用しないで下さい。（推奨：BIOO SCIENTIFIC 社 Nuclease-free Water Aliquots ，品番：801001）
RNA サンプルの純度は，ご送付前に必ず電気泳動および吸光度計で確認して下さい。RNA サンプル受入れ時，弊社にて品質確認を行います。RNA サンプルに分解が見られた場合，解析中止もしくはサンプルの再
提出をお願いすることがあります。予めご了承下さい。
注 4）：RNA latrer Ⓡ をお手持ちでない場合には RNAzol RT や Isogen などの AGPC（Acid guanidium phenol chloroform）溶液中に溶解し，-80℃でご送付ください。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
ご利用の例
例 1 組織サンプル 2 種 Universal Reference を使用した二色法
アレイスライド 2 枚使用
例 2 トータル RNA サンプル 3 種（コントロール含む）
一色法 アレイスライド 3 枚使用
・ RNA 抽出 ¥15,000 × 2
・ Universal Reference 作成 無償サービス× 1
・ クオリティチェック ¥10,000 × 2
・ 実験セットアップ ¥100,000 × 1
・ アレイ＋解析 ¥150,000 × 2
・ クオリティチェック ¥10,000 × 3
・ 実験セットアップ ¥100,000 × 1
・ アレイ＋解析 ¥150,000 × 3
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
合計 ¥580,000
合計 ¥450,000
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
■商品リスト
［メーカー：MIR］
品番
包装
希望販売価格
RNA 抽出サービス
商品名
ELASV00
1 ASSAY
￥15，
000
細胞，組織，血液，血漿などからトータル RNA を抽出
RNA サンプルクオリティチェック（QC）
ELASV01
1 ASSAY
￥10，
000
トータル RNA サンプルの濃度，量，純度をスペクトル解析により確認
実験セットアップ
ELASV02
1 SERV.
￥100，
000
セットアップ費用はサンプル数に関らず 1 回のサービスあたり一律料金
アレイ実験＋解析
ELASV03
1 ARRAY
￥150，
000
1 色法と 2 色法共に同額 / 使用するアレイの枚数に応じて加算
＊
＊
＊
＊
その他
サービス内容
1 QC および実験セットアップ費用は解析の結果如何に関わらず申し受けます，予めご了承ください。
2 QC の結果，当社サンプル受領の時点でサンプルに問題があることがわかった場合には，QC の費用のみ申し受けます。
3 解析結果がお客様の期待する結果と異なった場合でも，責任を負いかねますのでご了承ください。
4 感染性のあるサンプル（HCV・HIV など）の受け入れは当社では行っておりません。また，ヒト臨床サンプルの場合はインフォームドコンセントを得ていることをご確認ください。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
021
miRNA プロファイリング
miRNA
プロファイリング
miRCURY LNATM microRNA Array Analysis Software
miRBase
LNA
抽出 / 精製
EXIQON 社 miRCURY LNATM microRNA Array データ解析用ソフトウェア
BioDiscovery 社の ImaGene® 9 と Nexus ExpressionTM 3 を利用して，迅速かつ高精度な
データ解析が実現
プロファイリング
＜高度な解析機能と高い操作性を備えた，先進的なマイクロアレイ解析ソフト＞
特長
定量
TM
●EXIQON 社 miRCURY LNA microRNA Array 用に構築された
ImaGene® 9 および Nexus ExpressionTM 3 を搭載
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●miRCURY LNATM microRNA Array データを迅速かつ高精度に解析可
能：システムが簡便化されており，バイオインフォマティクス技術不要
●優れたグリッド配置，自動解析，かつ全スポットの品質確認（QC）を実施
●簡便かつ迅速に miRNA 発現レベルの変動（差次的 miRNA 発現）を検出
●各 miRNA 情報が miRBase や TargetScan に直接リンク
●買取形式でのご提供のため，毎年の年間ライセンス料金はありません！
miRCURY LNATM microRNA Array Analysis Software は，EXIQON
社の miRCURY LNATM microRNA Array データ解析に最適な包括的マイ
ク ロ ア レ イ 解 析 ソ フ ト で す。BioDiscovery 社 の ImaGene® 9 と
Nexus ExpressionTM 3 と，EXIQON 社 マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 用 セ ッ ト
アップファイルをパッケージとしてご提供致します。
発現レベルの変動がみられる miRNA 群の同定が簡便化され，サンプル間
の発現パターン解析も可能です。
※完結版データ解析ツール：シグナル強度の生データを，一般によく用いられる統計手法を用いて，使い易い
簡便な手順で意味のある情報 / データへと変換します。
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
ImaGene® 9
ImaGene® はマイクロアレイの画像解析に優れたツールです。直感的イン
ターフェースを利用して，スキャンしたアレイ画像よりシグナル強度を抽出し，
自動的またはマニュアルで不良と思われるスポットにフラグできます（図 1）。
さらに，マイクロアレイデータからスキャッタープロットや M-A プロット
も作製できます（図 2）。
●高度なスポット検索 / グリッド配置技術
コントロール
siRNA
●双方向性のスポットチェック
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
miRCURY LNATM microRNA Array 上
の異なる位置にスポットされているもの
を四角で示しています。
緑色：Landing lights
青色：Spike-ins
黄色：Spike-ins v.2
灰色：スポットなし
特長
カスタム合成
サービス
デザイン済み
siRNA
図 1 迅速かつ高精度なスポット配置特定
●分析が自動化 / 全スポットの品質確認を実施
図 2 データの視覚化が秀逸
●直感的インターフェースおよびナビゲーション
miRCURY LNA TM microRNA Array
は，同一のプローブがアレイスライド中
に 4 回繰返してスポットされています
が，スキャッタープロットに示した通り，
ほぼ全てのスポット群において 4 点の
スポットが確認できます。アレイ実験に
おいて均一なハイブリダイゼーションが
行われていることがわかります。投げ縄
ツール（Lasso tool）を使用してスポット
群 を 選 択 す る と，左 図 に 示 し た リ ス ト
内の対象箇所がハイライトされます。
●使用するスキャナー，アレイ，システム等に依存しない
●EXIQON 社 miRCURY LNATM microRNA Array に 特 化 し た セ ッ ト
アップファイル
●EXIQON 社マイクロアレイ用に特別デザインされた品質確認用テンプ
レートが付属
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
Nexus ExpressionTM 3
Nexus ExpressionTM はマイクロアレイ実験解析用のプログラムで，さ
まざまな特長を備えた非常に使い勝手の良い製品です。
手順が簡便化されており，まず ImaGene® から得た生データをバック
グラウンド補正した後，ノーマライズを行い，その後，ヒートマップの作製
や発現変動がみられた miRNA の同定を行います（図 3，4）
。
特長
●操作手順が簡便化：バイオインフォマティクスやプログラミング技能
を必要としない
●ワン - クリックで操作完了：miRBase や TargetScan に直接リンク
トランスフェク
ション試薬
●繰り返し実験した結果を統合可能
その他
●クラスター解析の実施：サンプル群や miRNA をクラスター解析
●発現変動を示す miRNA を同定
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
図 3 発現変動を示す miRNA の同定が容易
各プローブ情報として p-value および log 値も併せて表示されます。さらに，各 Probe
ID は miRBase や TargetScan を始めとし，関連する EXIQON 製品情報にリンクさ
れてます。
図 4 フレキシブルなデータクラスタリング
個別のクラスタリングアルゴリズムを用いるためヒートマップ作成が
非常に簡便です。
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
商品名
022
品番
包装
希望販売価格
Microarray Analysis Software ImaGene®/NexusTM - Perpetual license
208220
1EACH
ご照会
Microarray Analysis Software ImaGene®/NexusTM - 30 days license/24 slides
208221
1EACH
ご照会
miRNA プロファイリング
miRNA
GenoExplorerTM microRNA システム
プロファイリング
miRBase
LNA
生物種別の miRNA 網羅的発現解析マイクロアレイキット
抽出 / 精製
特長
プロファイリング
●生物種別に miRNA の網羅的解析が可能
ヒト，マウス，ラット，ショウジョウバエ，線虫，シロイヌナズナのそれぞ
れに対応する各 miRNA アレイキットをラインアップ。
定量
●前駆体と成熟型 miRNA の解析が可能
前駆体と成熟型 miRNA に対するプローブと，陽性及び陰性コントロー
ルプローブを 1 つのアレイにスポット。
検出
インヒビター
●トータル RNA から miRNA を高感度検出
1μg のトータル RNA（small RNA 濃縮不要）でサブフェムトモル
感度の miRNA を検出可能。
過剰発現
（オリゴ）
●2 倍未満の miRNA 発現相違を検出
過剰発現
（ベクター）
図 1 操作方法
●高い再現性：CV15％ 以下
サブアレイの数はスポットしてあるプローブの
数により異なります。
スライドサイズ：25mm × 75mm
Triplicate スポット
●最大 94% の特異性
機能検証
次世代
シークエンシング
構成内容
図 2 チップ上のサブアレイの配置
●miRNA アレイチップ
●標識キット
siRNA
●ハイブリダイゼーションバッファー
●洗浄バッファー 1 ＆ 2
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
操作方法
コントロール
siRNA
①トータル RNA の分離
Small RNA を含むトータル RNA を分離。
図 3 前駆体と成熟型 miRNA の同時解析
②ラベリング反応（図 1）
トータル RNA（推奨 1 ∼ 2.5μg）の 5' 末端にビオチン標識リン
カーをライゲーション。
3 セットの前駆体及び成熟型 miRNA に
対するプローブを用いて，2 種類の異なる
マウスの RNA サンプル（コントロールと
実験対象）を比較し，比率をグラフで示した。
③ハイブリダイゼーション（図 1）
ビオチン標識 miRNA とマイクロアレイチップとのハイブリダイゼー
ションを行います。SA-S Dye で蛍光標識。
成熟
904
746
195
162
215
445
445
113
80
117
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
Control
ポジティブ ネガティブ
7
7
4
4
4
4
4
4
4
4
図 4 アレイ間の高い再現性
Total
異なるアレイ間のシグナル強度を比較。
アレイ間の高い再現性が確認された。
1,360
1,202
316
250
340
図 5 プローブの高い特異性
ミスマッチを持たないプローブと 1 塩基
及び 2 塩基のミスマッチを持つプローブ
の ペ ア に つ い て，ヒ ト 脳 由 来 の RNA を
用いたシグナルを示した。最初の 2 つの
ペアは，1 塩基のミスマッチ（ホモロジー
94％），最後のペアは 2 塩基のミスマッチ
（ホモロジー 90%）。ミスマッチにより
シグナル強度に 10 倍以上の差がある。
■商品リスト
［メーカー：GSC］
GenoExplorerTM microRNA Kit
トランスフェク
ション試薬
その他
※チップ上には各プローブが 3 個ずつスポットされています。
2010 年 10 月現在，miRNA の配列は，Sanger miRBase Release Ver. 15.0 をベースにしていますので，
チップ上のプローブ数は上記表（Ver.14.0）の数と若干変動があります。ご照会ください。
商品名
shRNA クローン
コレクション
ノックダウン検証
■チップ上のプローブの種類（ご参考）
ヒト
マウス／ラット
線虫
ショウジョウバエ
シロイヌナズナ
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
si/shRNA 発現
④スキャニングと検出
635nm（Cy5 と同じチャンネル）にて検出。プローブの位置，配列情報
はジェノセンサー社ホームページ上（http：//www.genosensorcorp.
com/microRNA_full_kit.html）からダウンロードできます。
スタンフォード型マイクロアレイ用スキャナが対応します。
miRNA（v14.0）
前駆体
デザイン済み
siRNA
適用種
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Human
1101C
4 回分
¥262，
000
冷
○
Mouse/Rat
1111C
4 回分
¥262，
000
冷
○
C.elegance
1121C
4 回分
¥262，
000
冷
○
Drosophila
1131C
4 回分
¥262，
000
冷
○
Arabidopsis
1141C
4 回分
¥262，
000
冷
○
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
上記商品にはサイズ違い（20 回分 / ￥1，
230，
000）があります。詳細はコスモ・バイオホームページ上“サイト内検索”をご利用ください。
（キーワード：GenoExplorer システム）
023
miRNA 定量
miRNA
定量
miRCURY LNATM Universal RT miRNA PCR system
miRBase
最高の感度と特異性！ LNATM 技術とフレキシブルな miRNA 定量 PCR 解析！
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
● 超高感度：わずか 1 pg の total RNA で個々の miRNA 定量，網羅解析もわずか 40 ng
で可能
● 高い特異性：わずか 1 塩基差も識別可能，AT リッチな miRNA も識別可能
原理
Step 1: First-strand synthesis (RT)
Mature microRNA
定量
● 高いフレキシビリティ：実験スケールに合わせて選べる 4 タイプの miRNA 発現定量 PCR
解析
A)
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
検出
・ miRNome PCR panel …384 ウェルプレートで miRNA プロファイリング (Human
B)
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
インヒビター
/ Mouse & Rat)
3 degenerate anchor
・ Focus panel (Cancer, Serum / Plasma, Stem Cell)…がん関連，血清 / 血漿または
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
幹細胞サンプルに関連する miRNA に特化した解析 (Human)
・ Pick-&-Mix miRNA PCR Panel …プレートタイプ，PCR 機器，バッチサイズに併せて
Step 2: Real-time PCR amplification
お好みのプライマーを配置
・ miRNA Primer set …個別の miRNA 定量用，膨大なデザイン済プライマーセットは
miR-specific forward primer
A)
TTTTTTTTTTTTTTT
miR-specific reverse primer
全品検証済み
次世代
シークエンシング
● 秀でた精度：FFPE，LCM，血清／血漿，尿サンプルなど扱いにくいサンプルに最適
● 操作が簡便：2 ステッププロトコール，所用時間約 3 時間，microRNA ごとの cDNA
合成は必要なし！
● SYBR® Green 法を利用： 融解曲線分析による検証が可能
siRNA
5 universal tag
● テンプレートの増幅不要
※ SYBR® は Molecular Probes Inc. 社の登録商標です。
B)
図 1 miRCURY LNATM Universal RT miRNA PCR System の概要
step 1A: mature miRNA に polyA tail を付加。
step 1B: 3' -degenerate ancher と 5' -universal tag 付き polyT プライマー
を用いた cDNA 合成。
step 2A: cDNA をテンプレートとし，miRNA 特異的 LNA Forward/
Reverse プライマーを用いて PCR 反応。
step 2B: SYBR® Green 法による検出。
配列解析
サービス
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
● UniversalRT：１回の 1st-cDNA 合成反応（RT 反応）で作製したテンプレートを複数
の miRNA リアルタイム PCR 実験に使用可能。貴重なサンプルの節約，手技バラツキの
軽減，かつ労力を軽減。
● LNA™ PCR 増幅：PCR 増幅プライマー（forward / reverse）は何れも miRNA 特異
的かつ LNA™ 最適化済み。そのため，1) 非常に優れた感度と低いバックグラウンドによ
り，非常に低発現の miRNA の定量も高精度，2) 特異性が高く，類似 miRNA 配列の識
別が可能。
si/shRNA
ライブラリー
無類の感度と特異性！しかも全てのプライマーがバリデート ＆ 最適化済！
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
"Universal RT" かつ "LNA™ 利用および Tm ノーマライズ済みプライマー " により，本
製品は非常に高感度かつ特異性の高いアッセイを可能としました。わずか 1 pg の total
RNA を使用した 1st-cDNA 合成からであっても，各 miRNA の高精度かつ信頼のおける
定量が可能です。ステムーループや一般的な DNA プライマーを使用する他の miRNA リア
ルタイム PCR システムに比べ，LNA™ を利用したプライマーシステムでは，特に AU 塩基
を多く含む miRNA において，感度の高さが顕著です。
本製品では，わずか１塩基差の miRNA を識別する実験系をデザインすることが可能です。
非常に特異性の高いアッセイのため mature miRNA と precursor miRNA の識別もでき
ます（表.1, p.26)。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
さらに，全ての miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR プライマーセットは，
高感度であるよう最適化済みです。EXIQON 社の社内テストでは，80% 以上の PCR 反応
において少なくとも 100 コピーの miRNA が検出でき，ほぼ 50% の PCR 反応ではわ
ずか 10 コピーの miRNA 検出が可能でした。プライマーセットは各ターゲットの特異的増
幅，および低いバックグラウンドシグナルとなるよう，EXIQON 社でバリデート済です。
わずか３時間で完了する簡潔なプロトコールのため，実験室での労力が軽減されます。また，
同一 RT 反応溶液をその後の PCR 反応のテンプレートに使用することで，miRNA 特異的
1st-cDNA 合成が必要な他のシステムに比べて手技が大幅に簡潔化できます。 ピペッティン
グ頻度が最低限に抑えられているため，手技によるバラツキも低減します。その結果，日間差
だけでなく実験施設間差の少ない再現性の高い実験データを得ることが可能です。
実験スケールに合わせて 4 タイプの miRNA qPCR
本製品は，miRNA の網羅的発現解析（miRNome パネル）
，特定のサンプルに特化したスク
リ ー ニ ン グ (serum/plasma Focus Panel，Cancer Focus Panel, Stem Cell Focus
Panel)，中規模スクリーニング ( カスタム pick-&-mix パネル )，または単一の miRNA 定量
（primer set）にご利用頂ける qPCR システムです。p.26 ∼ p.29 をご参照頂き，4 タイプ
の製品からご自身の実験計画に合ったものをご選択ください。
024
RT
Universal cDNA
synthesis kit
Ready-to-use panel*
+
SYBR ® Green
master mix
Step-by-step
guides
R el ative expr es s ion (l og2)
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
P CR
デザイン済み
siRNA
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR は，市 販 の miRNA リ ア ル タ イ ム
PCR システムの中で最も性能と簡便性に優れたシステムで，２つの大きな特徴があります
( 図 1)。
Data anal ys is
コントロール
siRNA
LNA™ microRNA 定量システム
∼ 他に類をみない microRNA プロファイリングシステム ∼
3 hour s
カスタム合成
サービス
4
3
2
1
0
-1
Normal
miR-21
Tumor Total
Tumor
Tumor
stroma
let-7a
図 2 miRCURY LNATM Universal RT miRNA PCR System の操作の流れ
※プライマーセットは，miRCURY LNATM SYBR® Green master mix に最適
化されています。
他社製品などの master mix を使用された場合，結果の精度に影響を生ずる
可能性があります。
※ Ready-to-use panel をお使いの場合も，操作の流れは同様です。
miRNA 定量
最小のサンプルで高精度の miRNA qPCR 解析
A
miRNA
miRCURY LNA™ Universal RT PCR system で は，わ ず か 40 ng の total RNA が
あればヒト（742 種類）または，マウスおよびラット（752 種類）の miRNA について網
羅的発現解析が行えます。単一の miRNA であれば，わずか 1 pg の Total RNA から定量
的発現解析が可能です。そのためホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片や血清 / 血漿な
どの臨床サンプル，total RNA 抽出が困難なサンプルにおける高精度の miRNA 発現解析が
可能です（図.3）
。cDNA の増幅は必要ありません。
miRBase
LNA
抽出 / 精製
優れた特異性
PCR 反応用のプライマーは，Forword / Reverse とも LNA™ オリゴを使用しているた
めわずか 1 塩基ミスマッチが miRNA 配列のどのような位置にあっても識別可能です。
さ ら に，mature miRNA と precursor miRNA も 識 別 で き ま す（表 .1, p.26）。PCR
プライマーは全て最適化済みで，対象 miRNA の特異的増幅やバックグラウンドノイズに関
して EXIQON 社でバリデートされています。
（図 4）
R e l a tive ex pr e s s ion (l og2)
Normal
B
Tumor stroma
Tumor total
Tumor
4
プロファイリング
3
2
定量
1
0
-1
検出
Normal
miR-21
Tumor Total
Tumor
Tumor
stroma
let-7a
図 3 ホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片のレーザーダイセクション検体を
用いた 2 種類の miRNA 発現解析
ヒト大腸のホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片より，8000-13000 µm²
サイズの正常組織，腫瘍組織，および腫瘍間質をレーザーダイセクションにより分
離してサンプルとした（A）。
total RNA 抽 出 後，miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR System に
より miRNA 発現レベルを定量した（B）。
ノーマライズ後，正常組織との相対的発現レベルを log2 スケールで示した。リ
ファレンスには hsa-miR-103 および hsa-let-7a を使用した。
血清・血漿など体液中の microRNA プロファイリング
近年，体液中の miRNA はバイオマーカーとして認識が高まりつつあります。
とくに，血清や血漿中にはわずかながら miRNA が存在し，これらは高い安定性，かつ無細胞
状態で血中を循環することから，血中の RNA 崩壊酵素から保護されていると考えられます。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
がんを始めとする様々な疾患患者では，その血清 / 血漿中の miRNA 発現様式に変化が見
られます。このことから miRNA は，さまざまな疾患および生物学的プロセスのバイオマー
カーを非観血的に探索する有望な候補として注目されています。血液サンプルは，容易に入手
できる上，組織診や外科手技に比べてリスクが低いことも理由のひとつです。しかし，短鎖で
あるといった miRNA の特性や，血清 / 血漿サンプルから得られる RNA 量が少ないこと
などから，血液サンプルを用いた miRNA プロファイリングはこれまで容易ではありません
でした。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
信頼性の高い miRNA プロファイリングを行うためには，実験結果に歪みが生じないよう
血液細胞から RNA が混入していない血清 / 血漿を使用する必要があります。全血中に存在
する RNA のうち，ほんの一部のものが血清や血漿に存在し，多くの RNA は主に白血球や
血小板から構成されるバフィーコート中に存在しています（図 5）
。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
また，これらの miRNA プロファイリングを行う際には，さらにいくつかの課題があります。
● RNA 含量が低いため，一般的な RNA 純度管理が困難
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
● 血清 / 血漿中 RNA には PCR 酵素阻害剤が含まれる
図 4 miRNA を特異的かつ高感度に増幅可能
● U6 などの一般的なリファレンス遺伝子は血清 / 血漿中に含まれておらず，適切なリ
ヒト大腸 total RNA の希釈段階系列（1 pg-100 ng）を用いて hsa-miR-145
を増幅した結果（n=3）。
（A）増幅曲線（B）融解曲線
増幅曲線より，わずか 1 pg の total RNA からも高感度かつ再現性の高い増幅
が行うことができ，かつバックグラウンドノイズがほぼ無視できることがわかる。
融解曲線では何れの濃度のテンプレートを使用した場合でも期待される Tm 値に
ピークが得られ，hsa-miR-145 が特異的に増幅可能であることが示された。
ファレンス遺伝子選択が困難
これらの課題を克服するには非常に精度の高い miRNA 定量 PCR システムの利用が重要
です。miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR system は，血清 / 血漿サンプルの
miRNA 検出に高い信頼性がおけることが実験的に検証されています（図 6）
。
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
技術情報 p.121 ∼ , EXIQON 社の血清 / 血漿の miRNA プロファイリングのノウハウ
をはじめとした「miRNA プ定是 PCR ガイドライン」がございます。是非実験計画にお役
立ください。
si/shRNA
ライブラリー
簡便・迅速・高い再現性
関連試薬
個々の miRNA に特異的な 1st-strand cDNA を合成する他社製品と異なり，全ての
PCR 反応に同一のテンプレート（1st-strand cDNA）を使用するため，操作が簡便で 3 時
間程度で終了します。ピペッティングなどの操作ステップの軽減により，実験操作によるバラ
ツキが最小限に抑えられます。 日間差やラボ間での差がほとんどなく，高い再現性が得られ
ます（図 7，図 8）
。
20
miR-16
トランスフェク
ション試薬
その他
図 5 血清および血漿にはわずかな RNA が含まれる
多くの RNA はバフィーコートに存在する。血清 / 血漿にこれらの RNA を混入
させないことが重要である。
40
40
35
35
技術情報
26
miR-126
28
30
32
miR-451
let-7a
Raw Cq values RT2
Expression level (Cq)
24
Raw Cq values RT2
22
30
R 2= 0.99
25
20
34
miRNA
プロファイリング
R 2= 0.96
30
25
miRNA
機能解析
20
プール型 shRNA
ライブラリー
36
38
miR-337-3p
40
図 6 血清中の全 miRNA プロファイリング
EXIQON 社 の Serum / Plasma Focus microRNA PCR Panel は
一般的に血清や血漿でみられる 175 種のヒト miRNA プロファイリ
ング用にデザインしてある。500 種以上の血清サンプルより抽出した
total RNA を，３回繰返しで RT 反応を行い，Serum/plasma Focus
microRNA panel を用いてリアルタイム PCR によりプロファイリン
グ を 行 っ た。miRNA 群 の Cq 値（quantification cycle value）に
よる平均発現レベルを図示した。血清 / 血漿中での高発現で知られる
hsa-miR-16 および miR-451 は血清 / 血漿系における溶血 / 血液
細胞汚染の指標である（橙色）。その他の興味深い血漿 miRNA 群を赤
色で示した。
15
15
20
25
30
35
40
Raw Cq values RT1
図 7 miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR system による
日間の再現性
心臓および肝臓から抽出した 40 ng total RNA の miRNA 発現様式
を Ready-to-Use PCR human panel I および panel II を用いて複数
日にわたり実施した。全 miRNA のうち Cq 値が 35 未満のものに関
して，生 Cq 値の相関関係を図示した（297 データポイント）。
15
15
20
25
30
35
40
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Raw Cq values RT1
図 8 血清 total RNA を用いた RT 反応で得られた高い再現性
65 µL の血清より抽出した total RNA を用いて２回繰り返しで RT
反応を行った（RT1, RT2）ところ，低い Cq 値が得られた。全 730
種類の miRNA に関して発現プロファイルを確認し，Cq 値が 35 未
満のものについてのみ図示した（133 データポイント）。
025
miRNA 定量
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
cDNA 合成キットと SYBR® Green master mix
RNA 抽出効率の確認には，RNA spike-in（合成 RNA コントロール）を加える方法があ
り，EXIQON 社 Universal cDNA synthesis kit に 付 属 し て い ま す。添 加 し た RNA
spike-in は，RT-PCR で 逆 転 写 さ れ て cDNA と な り，EXIQON 社 の SYBR® Green
master mix や miRNA Ready-to-Use PCR Panel に付属のプライマーで検出することが
できます。RNA spike-in Kit（p.31）を別途ご購入することも可能です。
あ る い は，RNA spike-in を cDNA 合 成 ス テ ッ プ の 確 認 に 使 用 す る こ と も で き ま す。
cDNA 合成や PCR 酵素反応を阻害する可能性のある物質が RNA サンプルに残留してい
るかどうかの確認にもなります。 cDNA 合成ステップの効率を確認するには，cDNA 合成
反応カクテルに RNA spike-in を加えます。
一方，増幅物の融解温度（Tm）といったアッセイ特徴やアッセイ効率も品質管理に利用できます。
miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR system での検出に SYBR® Green を使用
することで，融解曲線を描くことができ，特異的増幅物の Tm 値の再現性が反応間でとれてい
るか確認することができます。このように，Tm 値をもとに得られた増幅物がサンプル間で同一
であるかどうかを判断できます。融解曲線のピークが１本であることにご留意ください。
表 1 mature と precursor miRNA 間の識別
LNA™ Universal RT miRNA PCR assay では，mature と precursor miRNA
ターゲット間の識別が可能である。mature miRNA は precursor miRNA の
5p（A）または 3p（B）側のアームに由来する。mature 配列が 5p アーム由
来 の 場 合，precursor と mature 配 列 の識 別 がよ り 効率 よ く行 え る。LNA™
Universal RT system を用いて 3p アーム由来の mature miRNA を識別す
る場合，その識別限界は競合製品と同程度である。ここでは mature ターゲット
から得られたシグナルに対する precursor ターゲットから得られたシグナルの
割合を示した（100% となるよう設定）
。
融解曲線はよいコントロールである一方，qPCR 機器によって温度較正が異なる場合があ
り，使用する機器によって得られる Tm 値が異なる可能性があります。そのため，各増幅物の
期待される Tm 値はポジティブコントロール使用のもとに，実験に使用する機器を用いて決
定することが重要です。
EXIQON 社 の miRNA Ready-to-use PCR panel お よ び primer set は，Universal
cDNA synthesis kit および SYBR® Green master mix kit との併用に最適化してあり
ます。他の試薬と併用することで結果の精度に影響を及ぼす可能性があります。
miRNome Panel ∼プロファイリング用 Ready-to -Use パネル (Human or Mouse & Rat)
本製品は，Human または Mouse / Rat の miRNA プロファイリングを目的とした，qPCR primer set が分注済みの 384 ウェル Ready-to-Use
定量 PCR パネルです。1st-cDNA および PCR master mix を加えるだけで，miRNA の qPCR 網羅解析が可能です。
＜ヒト Human ＞
Human パネルはⅠ，Ⅱ およびⅠ と Ⅱ がセットになった 3 タイプをご用意しています。384 well プレート 2 枚を 1 セットとして，742 種のヒト
miRNA を網羅しています。
Human パネル I には重要度の高いとされる 375 種の miRNA 用のプライマーセットが含まれております。これらの miRNA は，一般的により高発
現されている，疾患に分化発現していることが多い，論文に引用されることが多いなどの特徴があります。Human パネル II には，パネル I と比較すると，
重要度がそれほど高くないとされる 367 種の miRNA 用のプライマーセットが含まれています。プレート配置図は，弊社 WEB ページをご参照くださ
い。各プレートには 6 種類のリファレンス RNA（U6, SNORD38B, SNORD49A, hsa-miR-103, hsa-miR-191, hsa-miR-423-5p）とプレート間
キャリブレーターおよび Universal cDNA synthesis kit に付属の RNA spike-in 検出用コントロールプライマーが含まれます。
使用しているプレートは一般的な qPCR 機器に対応しています。
＜マウス Mouse ＆ ラット Rat ＞
2 プレートで 752 種のマウス＆ラット miRNA を網羅しています。( マウス 640 種 ＋ ラット 388 種 )
Mouse & Rat Panel のプレート配置図は，弊社 WEB ページをご参照ください。各プレートには 6 種類のリファレンス RNA（U6 snRNA, RNU5G,
RNU1A1, miR-103, miR-191, mmu-miR-423-3p）とプレート間キャリブレーターおよび Universal cDNA synthesis kit に付属の RNA spike-in
検出用コントロールプライマーが含まれます。
使用しているプレートは一般的な qPCR 機器に対応しています。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Cancer Focus microRNA qPCR Panel
∼がん関連 microRNA 用 Ready-to -Use パネル (Human)
本製品は，がんに関与する 85 種類の miRNA 検出用 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR primer を予め搭載した PCR パネルです。
cDNA や PCR マスターミックスを添加するだけで，すぐに実験が始められる 96 ウェルまたは 384 ウェルプレートのパネルをご用意しています。腫
瘍形成やがん診断に重要であることが示されている miRNA を対象としており，これらの miRNA が 27 種類のがんのマーカーとして使用できることが
示唆されています。対象 miRNA は，数千もの FFPE サンプルを保有するバイオバンクや論文報告をもとに選択しています。がん進行，再発，転移などに関
与する miRNA 解析用で，研究者が迅速かつ高精度にがんサンプルを解析でき，新規の miRNA バイオマーカー探索に役立つようデザインされています。
パネルに搭載した各 miRNA のリファレンスは弊社 WEB ページをご参照ください。
＜製品構成＞
● 96 ウェルプレート：1 プレートに 1 回（1 検体）分のがんに関与する miRNA 検出用 miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR primer
などを配置したプレートが 4 枚セット（4 種類のサンプルに利用可能）
。
● 384 ウェルプレート：1 プレートに 4 回（4 検体）分の miRNA 検出用 miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR primer などを配置
したプレートが 2 枚セット（8 種類のサンプルに利用可能）。
パネルには以下の miRNA 定量用 PCR プライマーが搭載されています。
● がんへの関与が知られる 85 種類の miRNA
● ３種類の miRNA リファレンス遺伝子：miR-103, miR-191, miR-423-5p
● ３種類の snRNA リファレンス遺伝子：SNORD49A, U6 snRNA, SNORD38B
● ３種類のプレート間較正因子（UniSP3 IPC）および１種類の RNA spike-in（UniSP6 CP）
本製品はほぼ全てのリアルタイム PCR 機器に対応しています。
026
miRNA 定量
Serum / Plasma Focus microRNA qPCR Panel
∼血清 / 血漿中の miRNA 定量発現解析用 Ready-to -Use パネル (Human)
miRNA
miRBase
本製品は，血清や血漿での存在が知られる miRNA 検出用 miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR assay を導入した PCR パネルです。
cDNA や PCR マスターミックスを添加するだけで，すぐ実験が始められる 96 ウェルまたは 384 ウェルプレートのパネルをご用意しています。
LNA
EXIQON 社は血清 / 血漿中の miRNA プロファイリングに関して広範な社内知見を持ち合わせています。例えば，健常個体の血清 / 血漿中には通常ど
の miRNA が発現しているか，特定疾患や他の生物学的プロセスによりどの miRNA が上方 / 下方制御されているかなどです。
抽出 / 精製
miRCURY LNA™ Universal RT miRNA assays の Serum / Plasma Focus panel に搭載した全 175 種の miRNA 定量用プライマーは，血清
/ 血漿サンプルにおける EXIQON 社独自の膨大な miRNA 発現解析をはじめ，厳正した査読済み論文情報を元に慎重に選択されたものです。健常者およ
び疾患患者の血清 / 血漿サンプルを用いた社内および共同研究者による 100 万を超えるデータポイントを用いて本パネルに適した miRNA 群を選択し
ました。例えば，種々のがんにおけるさまざまな疾患段階，神経疾患 / 神経変性疾患，アレルギー / 炎症などにおける miRNA 発現データも使用していま
す。EXIQON 社のデータベースは血清 / 血漿より抽出した全 miRNA 情報を基盤としているため，特定の循環型 miRNA に関してはそれがタンパク質結
合型か否か，エクソソームや微小胞に存在するか，または区画化されているか等に関わらずこのフォーカスパネルに搭載されており，汎用性のある包括的パ
ネルといえます。パネルに搭載した各 miRNA のリファレンスは弊社 WEB ページをご参照ください。
＜製品構成＞
● 96 ウェルプレート：2 プレートにヒト血清 / 血漿中に一般に存在する miRNA および 7 種のリファレンス miRNA を含む全 168 種の LNA™
microRNA primer set を配置（2 プレートで 1 検体分）したプレートが 8 枚セット（4 種類のサンプルに利用可能）。
● 384 ウェルプレート：1 プレートに 2 回（2 検体）分のヒト血清 / 血漿中に一般に存在する miRNA および 7 種のリファレンス miRNA を含む
全 168 種の LNA™ miRNA primer set を配置したプレートが 2 枚セット（4 種類のサンプルに利用可能）
。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
Stem Cell Focus microRNA PCR Panel
∼幹細胞関連 microRNA 用選べる Ready-to-Use パネル (Human)
本製品は，幹細胞に関与する miRNA 検出用 PCR パネルです。cDNA や PCR マスターミックスを添加するだけで，すぐ実験が始められる 96 ウェ
ルまたは 384 ウェルプレートのパネルをご用意しています。次項の Pick & Mix miRNA PCR Panel 同様，EXIQON 社 WEB サイトの "Pick-&-Mix
configurator" を用いて，ヒト胚性幹細胞（hESC）および人工多能性幹細胞 iPSC で発現する miRNA を対象とした 85 種類の miRNA 定量用プライ
マーリストからご研究内容にあわせて miRNA 定量用プライマーをお選び頂きます。フレキシブルな形態のため，ご自身のご希望に応じたプレートデザイ
ンが可能です。
EXIQON 社では，外部研究者と幹細胞の共同研究を行い，85 種類の幹細胞特異的 miRNA を選択してリストを作成しており，この結果は査読論文誌に報告
済 み で す。こ の う ち 66 種 類 の miRNA が hESC に 発 現 し，59 種 の miRNA は iPSC で の 発 現 が 確 認 さ れ て い ま す。ま た 40 種 類 の miRNA は
hESC と iPSC 双方で発現が確認されています。パネルに搭載可能な幹細胞関連 miRNA 定量用プライマーのリストは WEB ページをご参照ください。
< 製品構成>
パネルには以下の miRNA 定量用プライマーが搭載されています。
● 幹細胞に関与することが確認されている 85 種類の miRNA（任意に選択）
● 3 種類の miRNA リファレンス遺伝子：hsa-miR-103, hsa-miR-191, hsa-miR-423-5p
● 3 種類の snRNA リファレンス遺伝子：SNORD49A, U6, SNORD38B
● 3 種類のプレート間較正因子（UniSp3 IPC ）
● ポジティブコントロールなどとして使用可能な RNA spike-in control を 5 種類（任意に選択）
本製品はほぼ全てのリアルタイム PCR 機器に対応しています。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
027
miRNA 定量
miRNA
Custom miRNA qPCR pick-&-mix Panel
∼お好きな miRNA をお好みのレイアウトに配置！自分専用カスタムパネル
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
本製品は，7 種類の基本レイアウトを元に，お客様独自の 96 ウェルまたは 384 ウェル miRNA qPCR プレートをご利用の PCR 機器，バッチサイズ
に合わせてデザイン頂けます。研究対象の miRNA のみに焦点を絞った検討ができますので，サンプルと時間の節約をすることができます。わずか 20 ng
の total RNA を用いて，前段階の増幅を行うことなくパネルに搭載された数百もの miRNA の定量発現解析が可能です。デザインは，EXIQON 社の
online plate configurator を用いて miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR assay をパネル上にドラッグ＆ドロップするだけ，と非常に簡
便です。プレートレイアウトファイルは EXIQON 社の GenEx qPCR analysis software にもお使い頂けるため，簡単かつ迅速なノーマライゼーション
やデータ解析が実現します。作成したパネルは各ウェルに１回の反応量（10µL）用に分注し，Ready-to-use の状態でお届け致しますので，cDNA 合成
キット（品番：203300）と SYBR® Green master mix（品番：203450）を加えてお使いください。
本製品は，中程度から大量のサンプル数を用いた miRNA 定量・発現解析に適しています。マイクロアレイや PCR パネルスクリーニング結果の検証に
Pick-&-Mix microRNA PCR Panel をお使いください。研究対象の疾患または情報伝達経路特異的 qPCR プレートをデザインしたり，バイオマーカー探
索や大量サンプルの検証用に qPCR プレートをデザインしたり，幅広くご利用頂けます。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
パネルデザインとご注文方法
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel のデザインは，EXIQON 社の online plate configuration tool を使ってステップバイステップの簡単な操
作で行って頂けます（図 9）。下記の方法で，デザインを行って頂くと EXIQON 社より自動的にお客様と弊社にご注文内容確認のメールが参りま
す。弊社よりお客様へご注文内容確認のご連絡を致しますので，ご利用の代理店へご注文ください。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
10
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
22 microRNAs x 16 samples
16 x UniSp3 IPC・16 x UniSp6CP (optional)
46 microRNAs x 8 samples
8 x UniSp3 IPC・8 x UniSp6CP (optional)
94 microRNAs x 4 samples
4 x UniSp3 IPC・4 x UniSp6CP (optional)
384 microRNAs x 1 samples
3 x UniSp3 IPC・1 x UniSp6CP (optional)
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
↑
図 9 EXIQON 社の Online Pick-&-Mix miRNA PCR Panel
plate configurator
ス テ ッ プ バ イ ス テ ッ プ の plate configurator ツ ー ル を 使 い ご 自 身
の Pick-&-Mix miRNA PCR Panels を 簡 単 に 作 成 可 能。ご 希 望 の
miRNA assays をプレートにドラック - ドロップして作成。プレート
レ イ ア ウ ト フ ァ イ ル は Exiqon の GenEx qPCR analysis software
にもお使い頂けるため，簡単かつ迅速なノーマライゼーションやデータ解
析が実現。
10 microRNAs x 8 samples
8 x UniSp3 IPC3・8 x UniSp6CP (optional)
技術情報
miRNA
プロファイリング
図 10 Pick-&-Mix miRNA PCR Panel レイアウト
miRNA
機能解析
96 ウェルプレートに 3 種類，384 ウェルプレート用に 4 種類のレ
イアウトを用意。色は miRNA qPCR アッセイの繰返しを示している。
各セットとも１サンプル用。 何れのプレートレイアウトもプレート間較
正用コントロール（UniSp3 IPC）が配置済み。
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
028
→
22 microRNAs x 4 samples
4 x UniSp3 IPC3・4 x UniSp6CP (optional)
92 microRNAs x 1 samples
3 x UniSp3 IPC3・1 x UniSp6CP (optional)
miRNA 定量
miRCURY LNA™ Universal RT miRNA PCR Primer
∼検証済み個別 miRNA 定量用プライマー！
miRNA
miRBase
本製品は個別の miRNA の定量 PCR アッセイ用 Primer set (Foward / Reverse) です。LNA™ 技術を使用したプライマーは非常に高感度なため，
わずか 1 pg の total RNA から定量することができます。751 種類（ヒト），632 種類（マウス），348 種類（ラット）のデザイン済 miRNA 定量用
qPCR プライマーセットをご用意しており，全品実験的検証済みです。コントロールは，9 種類の内在性リファレンス RNA をご用意しております。
p.121 ∼ の「qPCR ガイドライン」や p.125 ∼ の「ノーマライゼーションとデータ解析」などもご参照頂き，実験系に応じてお選びください。
ご希望のデザイン済プライマーセットがない場合や pre-miRNA 定量には，カスタム miRNA LNA™ PCR プライマーセットをご利用ください。
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
ご注文方法
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
試薬使用量例
<cDNA 合成反応 > 実験系により cDNA 合成量が異なる
<RT-PCR 反応 > 実験系により cDNA 量，SYBR Green 量が異なる
逆転写反応 ( 血清，血漿サンプル )
Reaction setup for real-time PCR (individual assay)
Component
Volume / reaction
5x Reaction buffer
adjust to 40 μL
Enzyme mix
4 μL
Synthetic Spike in
2 μL
8 μL (human) or
1 μL (mouse) RNA
Template total RNA (adjusted)
Total volume
Volume / reaction
(384-well)
SYBR® Green master mix
5 μL
5 μL
Template cDNA --- diluted*
(* dilution varies)
4 μL
4 μL
コントロール
siRNA
PCR primer mix
1 μL
1 μL
デザイン済み
siRNA
Total volume
10 μL
10 μL
Component
40 μL
Volume / reaction
Final conc. / amount
5x Reaction buffer
4 μL
1x
Nuclease-free water
9 μL
Enzyme mix
2 μL
Synthetic Spike in
1 μL
Template total RNA
(adjusted)
4 μL
Total volume
20 μL
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
Volume / reaction
(96-well)
Volume / reaction
(384-well)
si/shRNA 発現
SYBR® Green master mix
5 μL
5 μL
ノックダウン検証
Template cDNA --- diluted*
(* dilution varies)
5 μL
5 μL
Total volume
10 μL
10 μL
Component
逆転写反応 ( 血清，血漿サンプル以外 )
Component
カスタム合成
サービス
shRNA クローン
コレクション
Reaction setup for real-time PCR (panel assay)
※ この場合 cDNA 合成キットは 16rxns となる
配列解析
サービス
Volume / reaction
(96-well)
8 μL
Nuclease-free water
siRNA
si/shRNA
ライブラリー
1x
Reaction setup for real-time PCR (pick & mix panel assay)
関連試薬
5 ng/ μL (or 5.5 ng/ μL)
Volume / reaction
(96-well)
Volume / reaction
(384-well)
SYBR® Green master mix
5 μL
5 μL
Template cDNA --- diluted*
(* dilution varies)
5 μL
5 μL
Total volume
10 μL
10 μL
Component
※ この場合 cDNA 合成キットは 32rxns となる
cDNA 希釈率例
血清，血漿サンプル (individual)
40 x
血清，血漿サンプル (pix&mix, panel)
50 x
血清，血漿以外のサンプル (individual)
80 x
血清，血漿以外のサンプル (pick&mix, panel)
100 x
トランスフェク
ション試薬
その他
SYBR®： Life Technologies 社の登録商標です。
LightCycler®： Roche Diagnostics 社の登録商標です。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
029
miRNA 定量
miRNA
miRBase
■商品リスト
共通製品
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
［メーカー：EXQ］
製品群
プロファイリング用パネル
（human）*1 *2
商品名
品番
包装
希望販売価格
Universal cDNA Synthesis Kit
203300
16-32 回分
¥71,000
SYBR ® Green master mix, Universal RT
203450
2,5 ml
¥81,000
SYBR ® Green master mix, Universal RT
203400
25 ml
￥386,000
miRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V2. M
ABI 7900HT 他，多種の機器に対応
203607
1 Each (4 set )
￥275,000
203608
1 Each (4 set )
￥275,000
miRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II, V2. R Roche LightCycler ® 480 対応
miRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V2. M
ABI 7900HT 他，多種の機器に対応
203609
1 Each (4 set )
￥233,000
定量
miRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I, V2. R
Roche LightCycler ® 480 対応
203610
1 Each (4 set )
￥233,000
検出
miRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II, V2. M
ABI 7900HT 他，多種の機器に対応
203703
1 Each (4 set )
￥275,000
203704
1 Each (4 set )
￥275,000
203705
1 Each (4 set )
￥233,000
203706
1 Each (4 set )
￥233,000
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
プロファイリング用パネル
（Mouse& Rat）*1 *2
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
Cancer Focus miRNA
qPCR Panel
（human）
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
Serum/Plasma Focus
miRNA PCR Panel
（human）
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
Stem Cell Focus miRNA
PCR Panel（human）
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
カスタム Pick-&-Mix パネル
(human, mouse,rat)
*9 *10
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
個別 miRNA
コントロール
プライマーセット
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
030
miRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II, V2. R
Roche LightCycler ® 480 対応
miRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I, V2. M
ABI 7900HT 他，多種の機器に対応
miRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I, V2. R
Roche LightCycler ® 480 対応
miRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel II, V2. M
ABI 7900HT 他，多種の機器に対応
203707
1 Each (4 set )
￥233,000
miRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel II, V2. R
Roche LightCycler ® 480 対応
203708
1 Each (4 set )
￥233,000
Cancer Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. RO) *3
203820
1 Each (4 plates)
￥167,000
Cancer Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. AF)
*4
203821
1 Each (4 plates)
￥167,000
Cancer Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. MI)
*5
203822
1 Each (4 plates)
￥167,000
Cancer Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. ST)
*6
203823
1 Each (4 plates)
￥167,000
Cancer Focus miRNA PCR Panel, 384 well (V1. R) *7
203828
1 Each (2 plates)
￥279,000
Cancer Focus miRNA PCR Panel, 384 well (V1. M) *8
203829
1 Each (2 plates)
￥279,000
Serum / Plasma Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. RO) *3
203824
1 Each (8 plates)
￥215,000
Serum / Plasma Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. AF)
*4
203825
1 Each (8 plates)
￥215,000
Serum / Plasma Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. MI)
*5
203826
1 Each (8 plates)
￥215,000
Serum / Plasma Focus miRNA PCR Panel, 96 well (V1. ST)
*6
203827
1 Each (8 plates)
￥215,000
Serum / Plasma Focus miRNA PCR Panel, 384 well (V1. R) *7
203830
1 Each (2 plates)
￥184,000
Serum / Plasma Focus miRNA PCR Panel, 384 well (V1. M) *8
203831
1 Each (2 plates)
￥184,000
Stem Cell Focus miRNA PCR Panel
カスタム Pick Mix
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel, 96 well Ready-to-Use
203801
8 Plate (1 set )
￥350,000
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel, 96 well Ready-to-Use
203801
12 Plate (1 set )
￥450,000
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel, 96 well Ready-to-Use
203801
4 Plate (Per additional
4 plates - 96well )
￥150,000
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel, 384 well Ready-to-Use
203802
8 Plate (1 set )
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel, 384 well Ready-to-Use
203802
12 Plate (1 set )
Pick-&-Mix miRNA PCR Panel, 384 well Ready-to-Use
203802
4 Plate (Per additional
4 plates - 384well )
￥320,000
Individual microRNA LNA™ PCR primer set *11
WEB 参照
200 回分
￥35,000
Custom miRNA primer set, UniRT
206999
200 回分
￥45,000
SNORD38B (hsa) PCR primer set, UniRT
203901
200 回分
￥35,000
SNORD44 (hsa) PCR primer set, UniRT
203902
200 回分
￥35,000
SNORD48 (hsa) PCR primer set, UniRT
203903
200 回分
￥35,000
SNORD49A (hsa) PCR primer set, UniRT
203904
200 回分
￥35,000
￥920,000
￥1,200,000
SNORA66 (hsa) PCR primer set, UniRT
203905
200 回分
￥35,000
5S rRNA (hsa，mmu) PCR primer set, UniRT
203906
200 回分
￥35,000
U6 snRNA (hsa, mmu) PCR primer set, UniRT
203907
200 回分
￥35,000
RNU5G (mmu, hsa) PCR primer set, UniRT
203908
200 回分
￥35,000
RNU1A1 (mmu, hsa) PCR primer set, UniRT
203909
200 回分
￥35,000
*1 プロファイリング用パネルのレイアウトにつきましてはお問い合わせください。
*2 品名の最後が「M」で終わる PCR panel ＝ ABI 7900HT およびその他の機種対応，
「R」で終わる PCR panel ＝ Roche LightCycler® 480 対応。
*3 For Roche LightCycler ® 480
*4 For ABI Fast series StepOne Plus
*5 For BioRad, Eppendorf, Stratagene, ABI7000
*6 For Stratagene Mx3000P
*7 For Roche LightCycler ® 480
*8 For ABI 7900HT and other instruments
*9 Online Pick-&-Mix microRNA PCR Panel plate configurator でご利用の定量 PCR 機器をご選択頂けます。
*10 EXIQON 社 WEB サイトでカスタムパネルをデザイン頂くと，自動的に弊社へ連絡が参りますので，折り返し弊社よりご連絡致します。EXIQON 社 WEB サイト上ではご注文となりません。
*11 該当する個別 microRNA 用 LNA™ PCR primer set がない場合や pre-microRNA の定量プライマーをご希望の場合は，カスタムプライマーデザインツールをご利用ください。
Custom microRNA LNA™ PCR primer（品番 206999）design tool: http://www.exiqon.com/miRNA-qpcr-designer
miRNA 定量
定量
miRNA
RNA Spike-In Kit
miRBase
LNA
RNA Spike-In Kit で RNA 抽出や cDNA 合成ステップの品質確認
抽出 / 精製
使用目的
特長
本製品は，miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR assay の
RNA 抽出や cDNA 合成ステップにおいて，サンプル RNA の品質管理
を目的としてご利用頂く RNA spike-in kit です。定量 PCR 実験では，
効率よく増幅が行われるようサンプル RNA の質が十分に高いことを確認
す る 必 要 が あ り ま す。RNA 抽 出 や cDNA 合 成 ス テ ッ プ で spike-in
RNA を 添 加 し，内 在 性 リ フ ァ レ ン ス 遺 伝 子 と spike-in RNA の 定 量
PCR 結果を比較することで，サンプルの品質に対する重要な情報を得るこ
とができます（表. 1）
。
● お使いの RNA サンプルや RT 反応に簡便なコントロール
プロファイリング
● 品質不良なサンプルを早期段階で同定し時間や試薬を節約
定量
● 使いやすいプレミックス溶液でご提供
● フレキシブル：必要なときのみに使用可能
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
コントロールタイプ
過剰発現
（ベクター）
Cq 増加
RNA 抽出時の RNA spike-in
cDNA 合成時の RNA spike-in
No
No
Yes
No
Yes
Yes
No
No
内在性リファレンス遺伝子
No
Yes
Yes
Yes
結果
良好
micoRNA 抽出効率に問題あり
阻害剤の混入
サンプル中の microRNA 濃度が
低い
措置
研究結果として使用
RNA の再抽出または結果の除外
結果の除外または RNA の再抽出
結果の除外
機能検証
次世代
シークエンシング
表 1 miRNA 定量 PCR 用サンプルの課題と結論のまとめ
siRNA
構成内容
Reagent
UniSp2,
UniSp4,
UniSp5 RNA
Spike-in
template mix
Synthetic UniSP5 RNA
[22 nt]
0.016 fmole
0.0002 fmole/μL
コントロール
siRNA
MS2 total RNA
50 ng
0.625 ng/μL
MS2 total RNA
template
0.6 fmole
0.002 fmole/μL
50 ng
0.625 ng/μL
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
si/shRNA 発現
40
ノックダウン検証
35
si/shRNA
ライブラリー
30
25
20
関連試薬
15
10
トランスフェク
ション試薬
5
その他
3p
9-
p6
iS
ce
l-m
iR
-3
Un
p5
p4
0
図 1 EXIQON 社 RNA Spike-In Kit は microRNA 発現レベル全域を網羅
技術情報
2 社 か ら 購 入 し た 血 漿 サ ン プ ル に RNA Spike-in kit を 添 加 し，定 量 PCR の コ ン ト ロ ー ル と し た（各
N=2）。マニュアルに準じて，RNA 抽出ステップで UniSp2 / UniSp4 / UniSP5 RNA Spike-in mix を添
加し（青色），RT 反応ステップで UniSp6 / cel-miR-39-3p RNA Spike-in mix を添加（赤色）した。Cq
値より，当該 Spike-in kit は広範なダイナミックレンジをもち，RNA 抽出や RT 反応のコントロールとし
て適切であったことがわかる。また，再現性の高い RNA 抽出および RT 反応結果が得られた。
miRNA
プロファイリング
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
商品名
デザイン済み
siRNA
shRNA クローン
コレクション
表 2 RNA spike-in Kit 内容
iS
本製品は，EXIQON Pick-&-Mix microRNA PCR Panel や miRCURY
LNA™ Universal RT microRNA PCR assay（p.24 ∼ p.30）に対応
しています。本製品を使用する上で実験データをどのように解釈するかが重
要となるため，EXIQON 社の製品マニュアルでは詳細にデータ分析方法や
その考察について簡潔かつ明瞭にご説明しています。
カスタム合成
サービス
Un
RNA Spike-in Kit は，これに対応した LNA™ primer set を別途ご購
入頂き併せてお使いください（UniSp6 は EXIQON 社 SYBR® Green
Master Mix に含まれます）。必要な spike-in のみをご利用頂くことがで
き，不要なプライマーセットを同時に購入する必要はありません。
0.02 fmole/μL
p2
製品詳細
1.6 fmole
iS
各バイアルには 50 反応分の RNA が含まれています。また，RNA
spike-in の安定性向上を目的とした MS2 キャリア RNA を含みますが，
これは以降の実験ステップに影響を及ぼしません。
Synthetic UniSP4 RNA
[22 nt]
Un
● バイアル ②：合成 cel-miR-39-3p が含まれています。Universal
cDNA Synthesis Kit に添付されている UniSp6 spike-in（RNA
spike-in と表示）と組み合わせてご利用ください。マニュアルに準じ
てこれら RNA テンプレートを添加した場合，各 RNA 濃度は 100
倍の濃度比になります（表 . 2）
。cDNA 合成時のコントロールとし
てご利用ください。
2 fmole/μ L
cel - miR-39-3p Synthetic cell-miR 39-p
RNA
RNA Spike-in
Cq values
● バイアル ①：3 種類の RNA spike-in（UniSp2, UniSp4,
UniSp5）が 100 倍の濃度比（表 . 2）で混合してあります。RNA
抽出時のコントロールとしてご利用ください。
160 fmole
iS
RNA spike-in キットは 2 つのバイアルでご提供致します。
配列解析
サービス
Synthetic UniSP2 RNA
[22 nt]
Un
EXIQON 社の RNA slike-in (UniSp2, UniSp4, UniSp5, UniSp6)
は，構造は miRNA と類似しているものの，既知の miRNA とは類似配列
をもちません。また，キットには C. elegans microRNA： cel-miR-393p の合成配列が含まれています。
Conc.
[re-suspended]
Amount
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
RNA Spike-in kit, UniRT
203203
50 RXN
¥25，
000
凍
○
UniSp2, LNA control primer set, UniRT
203950
200 RXN
¥25，
000
凍
○
UniSp5, LNA control primer set, UniRT
203951
200 RXN
¥25，
000
凍
○
cel-miR-39-3p, LNA control primer set, UniRT
203952
200 RXN
¥25，
000
凍
○
UniSp4, LNA control primer set, UniRT
203953
200 RXN
¥25，
000
凍
○
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
031
miRNA 定量
miRNA
定量
GenEx qPCR analysis software
miRBase
LNA
クリックひとつで qPCR 解析データ解析！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
使用目的
特長
EXIQON 社の miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR 用に最
適化した qPCR 解析用ソフトウェアです。GenEx は，
“クリックひとつ”
でリファレンス遺伝子の選択およびバリデーション，データ処理および包括的
な統計解析など，さまざまな解析が可能です。相対的定量実験と絶対的定量実
験の何れの解析にも使用でき，プレゼンテーションツールでは，実験デザイン
が複雑であっても専門的な図表を簡単に作成することができます。
EXIQON 社の WEB サイトより無償で 30 日間試用できるトライアル
バージョンをダウンロードすることができ，試用版にもステップ - バイ ステップガイドが付属します。是非フリートライアルバージョンをダウン
ロードして，qPCR データ解析をお試しください。
●qPCR デ ー タ を 包 括 的 に 前 処 理：プ レ ー ト 間 較 正，外 れ 値 検 出，
および効率補正
●geNorm と Normfinder によりリファレンス遺伝子選択が簡便化
●リファレンス遺伝子やグローバル平均値を用いた
簡潔なノーマライゼーション
●より高度な統計解析が，ワン - クリックで可能
●論文報告に使用可能なプロットや図表作成が可能
●ライセンスの制限がなくサポートが無料：詳細なマニュアルと専門家
によるオンライン - サポートをご用意
フリートライアルバージョンダウンロード：http：//www.exiqon.com/
genex-download
次世代
シークエンシング
GenEx を使用した解析の手順
siRNA
配列解析
サービス
①
③
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
②
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
図 1 フリートライアルバージョン (30 日間無償使用）のダウンロード
http：//www.exiqon.com/qpcr-software にアクセスし，"software donload" の
タブをクリック①。
shRNA クローン
コレクション
Download GenEX trial version
②をクリックして，セットアッププログラムをダウンロー
ドし，解凍，インストールしてご試用ください。シリアル番号なしで 30 日間試用することができます。オ
ンラインマニュアルや，ステップ - バイ - ステップガイドもこのページからご覧頂けます③。
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
図 2 リファレンス遺伝子の選択
NormFinder お よ び geNorm の 両 ア ル ゴ リ ズ ム は，各 遺 伝 子 の 変 動 値（NormFinder：SD，geNorm：
M-value）および最適な遺伝子もしくはその組合せを表形式で出力します。
両アルゴリズムは，最も安定に発現されている遺伝子を棒グラフで出力します（最も安定に発現されている遺
伝子が左側に来る）。NormFinder および geNorm は異なるアルゴリズムな為，常に同じ結果を出力しませ
んが，ただし，これらアルゴリズムの結果を双方とも参照することで，
「どの遺伝子が最も安定に発現されてい
るか」のよい指標となります。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
＜GenEx：システム要求仕様＞
- 対応プラットフォーム : Windows® Xp / Vista/7 ( Mac OS X 環境での使用には Windows エミュレータが必要です )
- 最小要求 : 700 MHz AMD® / Intel® CPU, 512 MB RAM
- 推奨 : 1600 MHz または AMD® 以上 / Intel® CPU, 1024 MB RAM 以上
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
商品名
品番
包装
希望販売価格
Exiqon GenEx Pro Industrial
207005
1 EACH
ご照会
Exiqon GenEx Pro Academic
207006
1 EACH
ご照会
Exiqon GenEx Enterprise Industrial
207007
1 EACH
ご照会
Exiqon GenEx Enterprise Academic
207008
1 EACH
ご照会
Exiqon GenEx USB key *
207011
1 EACH
ご照会
* GenEx 使用ライセンスとの共同購入が必要（1 ライセンスにつき、1 USB key）
032
miRNA 定量
miRCURY LNATM microRNA 定量 PCR 受託解析サービス
定量
miRBase
LNATM だから正確！ 迅速・丁寧な受託解析でラクラク microRNA 定量プロファイリング！
● EXIQON 社 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system を使用する網羅的
miRNA 定量発現解析
● miRBase ver 18 登 録 の 751 種 類（ヒ ト），632 種 類（マ ウ ス），348 種 類（ラ ッ ト）
の miRNA の網羅的解析
● 100ng（QC 使用分含む）の total RNA で miRNA の網羅的発現解析が可能
● small RNA の enrichment は必要なし
● わずか 1 塩基差も識別可能
● プロファイリング用パネル（ヒト，マウス & ラット），フォーカスパネル（ヒト： Cancer,
Stem Cell または Serum / Plasma）
，カスタム Pick-&-Mix パネルからお好みのパネルを選択
● 結果報告書は PPT 形式，プレゼンテーションにすぐに使用可能
● データ保証期間：6 ヶ月再データ解析を無償で承ります
LNA
抽出 / 精製
解析の流れ
製品概要
プロファイリング
STEP
Total RNA 抽出
1
( 細胞、組織、血清、血漿 )
STEP
血清・血漿以外の
サンプルの場合
スペクトル解析にて品質
確認および濃度測定
cDNA 合成
2
3
STEP
cDNA 合成
ご指定のパネルでqPCRアッセイ
（パネル代、試薬代、解析作業料すべてコミコミです）
4
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
STEP
データ解析：データをノーマライズしてサンプル間
の誤差を補正後、
ご希望に添った統計解析を行います
5
コントロール
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
● フォーカスパネル < Serum / Plasma >
適用範囲を最適化：血清や血漿中の miRNA プロファイリングに焦点をあてた市販製品の中で最も網羅的なプラットフォーム
立証された実績：数千もの血清 / 血漿の臨床サンプルを用いた実験によりバリデート済み
トランスフェク
ション試薬
その他
● カスタム Pick-&-Mix パネル
プレートレイアウトを選択してお好みの miRNA を配置する自分専用のプラットフォーム
▶ わずか1pg のtotal RNA を用いた高精度定量
カスタム合成
サービス
デザイン済み
siRNA
● フォーカスパネル < Cancer >
１つの PCR パネルにがん遺伝子や腫瘍抑制因子に関与する miRNA 検出用プライマーを全て搭載
がんサンプルの miRNA バイオマーカーや情報を迅速かつ簡便に同定
▶ LCM サンプルを用いた高感度かつ特異的な定量
技術情報
A
45
Step 1: First-strand synthesis (RT)
40
Mature microRNA
B)
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
5’ universal tag
Step 2: Real-time PCR amplification
miRNA
プロファイリング
35
30
miRNA
機能解析
25
20
プール型 shRNA
ライブラリー
15
10
Normal
B
miR-specific forward primer
TTTTTTTTTTTTTTT
miR-specific reverse primer
B)
5
0
1 pg
10 pg 100 pg 1 ng 10 ng 100 ng
Total RNA input in RT reaction
hsa-miR-145(C)
hsa-miR-21(C)
hsa-let-7e(C)
hsa-miR-145*(C)
hsa-miR-126(H)
hsa-miR-499-5p(H)
図 1 miRCURY™ LNA Uni-RT microRNA PCR System の概要
図 2 わずか 1pg の total RNA を用いた高精度定量
step 1A: mature microRNA に polyA tail を付加
step 1B: 3'-degenerate ancher と 5'-universal tag 付き polyT
プライマーを用いた cDNA 合成
step 2A: cDNA をテンプレートとし，microRNA 特異的 LNA
Forward/Reverse プライマーを用いて PCR 反応
step 2B: SYBR Green 法による検出
ヒト大腸（C）または心臓（H）の total RNA の段階希釈系列を用いて，
6 種類の microRNA の定量を行った結果。
わずか 1pg の total RNA から microRNA の発現レベルの定量が可
能なことが 示された。
R e l a tive ex pr e s s ion ( l og2)
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
C yc l e num be r
A)
A)
過剰発現
（オリゴ）
機能検証
qPCR で典型的な血清・
血漿 miRNA の存在を確認
すべてのプライマーが実験検証済み！
わずか 20ng の total RNA を用いて 384 well panel1 枚の miRNA を網羅的に定量 PCR 解析
並外れた精度：わずか 5 コピーの miRNA を信頼性高く検出可能な感度および特異性を保持
プロファイリング用パネル < Human 用，Mouse & Rat 用 >
miRBase ver 18 登録の 751 種類（ヒト）
，632 種類（マウス），348 種類（ラット）の miRNA の網羅的解析
3’ degenerate anchor
インヒビター
過剰発現
（ベクター）
EXIQON 社 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system
▶ SYBR Green 法を利用
融解曲線分析により検証が可能
定量
検出
血清・血漿
サンプルの場合
STEP
EXIQON 社 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system を使用して網羅
的 miRNA 定量発現解析を行うカスタムサービ スです。miRCURY LNA™ Universal RT
microRNA PCR Panel から実験計画に合わせてパネルをご選択頂けますので無駄のない発
現解析が可能です。
プロファイリング用の miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Panel は，Sanger
miRBase（ver16.0）に登録されているヒト：742 種類またはマウス：640 種類 & ラッ
ト：388 種類，合計：752 種類の 2 種からご選択頂けます。また研究目的によりがんに関
与する miRNA 検出用（ヒト）または，血清や血漿での存在が知られる miRNA 検出用（ヒ
ト）のフォーカスパネルをご利用頂いたり，miRNA アレイなどの大規模プロファイリング結
果をもとにカスタム pick-&-Mix パネルを作成して中規模プロファイリングを行ったり，安
価に多検体の発現解析をすることも可能です。
本サービスでは，解析後の Cq 値データ（生データ）のみではなく融解曲線解析を行い，ヒー
トマップや階層的クラスタリング，PCA（群比較）データ，およびご希望によるサンプル間比
較解析を行います。
データ保証期間の 6 ヶ月間は，再解析を無償で承ります。㊟
●
●
●
●
miRNA
Tumor stroma
Tumor total
Tumor
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
4
3
2
1
0
-1
Normal
miR-21
Tumor Total
let-7a
Tumor
Tumor
stroma
図 3 ホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片のレーザーダイセクショ
ン検体を用いた 2 種類の microRNA 発現解析
ヒト大腸のホルマリン固定・パラフィン包埋組織切片より，8000 13000μm² サイズの正常組織，腫瘍組織，および腫瘍間質をレーザー
ダイセクションにより分離してサンプルとした（A）。
total RNA 抽出後，miRCURY™ LNA Universal RT microRNA PCR
System により microRNA 発現レベルを定量した（B）。
033
miRNA 定量
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
血清・血漿サンプルに適した EXIQON 社 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system
全血中に存在する RNA の内，ほんの一部のものが血清や血漿に存在し，この発現解析には非常に精度の高い microRNA qPCR システムの利用が重要
です。miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system は，血清・血漿サンプルの microRNA 検出に高い信頼性がおけることが実験的に検証
されています。
▶ 血清・血漿サンプルに最適実験的検証済！
▶ 血清中の全miRNA プロファイリングデータ
プロファイリング
定量
検出
図 5 血清中の全 microRNA プロファイリング
EXIQON 社の Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel
は，一般的に血清や血漿でみられる 175 種のヒト microRNA
プロファイリング用にデザインしてある。
500 種以上の血清サンプルより抽出した total RNA を用い，
３回繰返しで RT 反応を行ってリアルタイム PCR を行った。
Serum/plasma Focus microRNA panel を用いてプロファ
イ リ ン グ を 行 っ た microRNA 群 の Cq 値（quantification
cycle value）による平均発現レベルを図示した。血清・血漿中
での高発現で知られる hsa-miR-16 および miR-451 は，血
清・血漿に溶血・血液細胞汚染の指標である（橙色）
。その他の
興味深い血漿 microRNA 群を赤色で示した。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
miRCURY LNA™ microRNA 定量 PCR 受託解析サービスレポート内容
miRCURY LNA™ microRNA 定量 PCR 受託解析サービスでは，PPT 形式の報告書を納品致します。その他の統計解析や図表の作成も可能です。
お問合せください。
▶ 血清・血漿由来サンプル RNA の QC
t serum sample1
デザイン済み
siRNA
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
▶ 発現量の異なる miRNA のデータ
hsa-miR-15
t serum sample2
hsa-miR-26
0
10
Normalized exp ression ( Cq)
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
▶ ヒートマップおよび階層的クラスタリング
8
0
normalized expression (dCp)
配列解析
サービス
-1
-2
-3
-4
-5
6
-1
-2
-3
-4
-5
-6
1
7
13
4
10
2
8
14
5
11
1
7
13
4
10
2
8
14
5
11
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
sample # and group
Reference
genes
sample # and group
hsa-miR-4
4
hsa-miR-8
0
2
0
-1
normalized expression (dCp)
siRNA
血清・血漿中の miRNA プロファイリングは他の多くのサンプルに
比べてより感度の高い PCR システムが必要である。EXIQON 社の
PCR システムではわずか 1pg の total RNA でも直線相関のとれる
検出が可能である。
normalized expression (dCp)
次世代
シークエンシング
図 4 EXIQON 社の PCR システムは血清・血漿サンプルに最適
normalized expression (dCp)
機能検証
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
1
7
13
4
10
3
9
15
6
12
1
7
13
4
10
3
9
15
6
12
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
hsa-miR-17
hs
normalized expression (dCp)
0
血清・血漿由来の Total RNA サンプルは，”血清・血漿 miRNA”
としてよく知られている下記４種の miRNA の定量 PCR を行う
ことで品質を確認します。
・hsa-miR103 ・hsa-miR-191 ・hsa-miR-423-3p ・hsa-miR-451
0
normalized expression (dCp)
-1
03
-1
0b
am
iR
-2
6a
hs
am
iR
93
hs
am
iR
-2
hs
1
am
iR
-1
hs
6
am
iR
-2
0a
sample # and group
hsa-miR-15
iR
hs
a-
a-
m
m
iR
le
t
ahs
hs
si/shRNA
ライブラリー
-7
a
sample # and group
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-1
-2
-3
-4
-5
-6
1
7
13
4
10
3
9
15
6
12
1
7
13
4
10
3
9
15
6
12
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
A
A
A
A
A
C
C
C
C
C
sample # and group
sample # and group
関連試薬
▶ Spike-in Control を使用したデータ QC
その他
▶ ノーマライゼーション
hsa-miR-26
RT-qPCR performance
22.00
Raw Cp
21.50
21.00
20.50
DNA spike-in
20.00
RNA spike-in
19.50
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Sample
技術情報
EXIQON 社の miRNA 定量 PCR パネルには，DNA spike-in control
が各プレート中に n=3 で搭載されており，各ウェルに鋳型 DNA お
よびプライマーが入っています。
上図のように RNA および DNA spike-in がサンプル間で一定に発現
していると，RT 反応および qPCR 反応が巧く行ったと判断できます。
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
034
下記の 2 点を確認し，基準を満たさない Cq 値に関しては解析対象
データから削除します。これにより，質の高いデータを使用して解析
を行うことができます。
● 融解曲線解析
● ネガティブコントロールの Cq 値をバックグラウンドとして使用
Normalized expression (dcp)
▶ データの QC
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
-0.50
-1.00
-1.50
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
C
C
C
C
C
B
C
C
C
C
C
hsa-miR-15
2.00
Normalized expression (dcp)
トランスフェク
ション試薬
1.50
1.00
0.50
0.00
-0.50
A
A
A
A
A
B
B
B
B
-1.00
-1.50
ノーマライズは全てのサンプルの平均値を使用 (Mestdagh, P. et.al.)。
上図では，バックグランドのシグナルよりも高かった 110 の miRNA
平均値を用いてノーマライズしています。これらの miRNA 平均値の
安定性はどの個別の miRNA を NormFinder ソフトウェアにて測定
した結果よりも高いことが知られています。
(Reference: Andersen, C. et al .)
miRNA 定量
サンプルのご準備と輸送
miRNA
Total RNA 抽出の際には EXIQON 社 miRCURY Isolation Kit，Ambion 社 mirVana，Qiagen 社 miRNeasy などをご利用ください。
市販の RNA 抽出キットのなかには，本解析に適さないものもございますのでご注意ください。
RNA の純度は，OD A260/A280，A260/A230 ともに 2 程度を推奨しています。
Total RNA
血清・血漿由来
サンプル量
注 2）
100ng 以上
サンプル濃度
注 2）
20ng / μL 以上
(45 μL 程度必要 )
LNA
抽出 / 精製
RNA 抽出前の検体
血清・血漿以外の由来
注 1）
少量サンプルの場合も
ご相談ください
miRBase
血清・血漿
細胞
組織
ヒト：250 μL 以上
マウス：50 μL 以上
1.0 × 106 cells 以上
1mg ( ペレット ) 以上
プロファイリング
定量
20ng / μL 以上
(5 μL 程度必要 )
検出
Human または Mouse & Rat プロファイリング用パネルセット
（384 well パネル 2 枚）でスクリーニングする場合
DNase/RNase free 水
DFPC 処理水 不可
保存方法
保存容器
推奨： RNA later® などの RNA
安定化試薬に保管 注 4）
- 80℃ RNase Free Tube 使用
抗凝固財 EDTA, ヘパリン非含有
0.5 ∼ 2mL 容量のスクリューキャップチューブ
輸送温度
®
ドライアイス便
通常：ドライアイス便 / RNA Later 使用時：4℃ ( 保冷材同梱，冷蔵便 )
注 1）： サンプル量・サンプル濃度は目安となっておりますので，少量サンプルの場合もご相談ください。
注 2）： Phenol / Chloroform を含む溶媒を用いて Total RNA を抽出された場合は，必ずカラム精製を行い，溶媒を除去してください。
カラム精製は品番：ELASVQ01 ∼ 03(RNA 抽出・精製サービス）としてお受けできます。RNA サンプルの純度は，ご送付前に必ず電気泳動および吸光度計で確認 して下さい。RNA サンプル受入れ時，弊社にて品
質確認を行います。RNA サンプルに分解が見られた場合，解析中止もしくはサンプルの再提出をお願いすることがあります。予めご了承下さい。
注 3）： DEPC 処理水は使用しないで下さい。
推奨：BIOO SCIENTIFIC 社 Nuclease-Free Water Aliquots 品番：801001，インビトロジェン社 Distilled water (DNase / RNase Free) 品番：10977-015。
注 4）： RNA latrer Ⓡ をお手持ちでない場合には RNAzol ( 品番：RN190) や Isogen などの AGPC（Acid guanidium phenol chloroform）法に準拠した RNA 抽出用試薬溶液に溶解し，- 80℃ ( ドライアイス多め )
でご送付ください。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
■ご利用例
例 1 ヒトがん細胞 : 3 検体 VS 非がん細胞 : 1 検体（N=2）での microRNA
例 2 分化細胞への薬物投与などの経時的 microRNA 発現プロファイルを網羅
発現プロファイルの比較
的に比較
サンプル : 細胞，Cancer Focus Panel 384well 使用
薬物±，4 タイムポイント，N=1
② RNA 抽出
￥15,000 × 4
① Total RNA をコスモ・バイオへ送付
③ RNA サンプル QC( スペクトル解析 )
￥10,000 × 4
② RNA サンプル QC( スペクトル解析 )
￥20,000 × 4
③ cDNA 合成
④ cDNA 合成
⑤ 定量 PCR
配列解析
サービス
サンプル : Total RNA，Human Profiling Panel 384well 使用
① 細胞ペレットをコスモ・バイオへ送付
￥10,000 × 8
￥20,000 × 8
④ 定量 PCR
￥500,000 × 1
￥240,000 × 8
Human Profiling Panel 384well ( 2 枚 × 8set 使用 )
Cancer Focus Panel 384well (2 枚 )
合計 ￥2,160,000
合計 ￥680,000
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
⑤ データ解析をした結果報告書と Raw Data を納品
⑥ データ解析をした結果報告書と Raw Data を納品
siRNA
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
例 3 疾患患者血清 : 3 検体 VS 非疾患患者血清 : 1 検体（N=2）での網羅的
例 4 miRNA アレイ実験結果を基に興味のある miRNA 90 種について疾患血
microRNA 発現プロファイルの比較
清 40 検体，非疾患検体 6 検体を使用してスクリーニング（N=1）
サンプル : 血清，Human Profiling Panel 384well 使用
サンプル : Total RNA，Custom pick & Mix Panel 384well 使用
① 血清をコスモ・バイオへ送付
※ Custom Panel をデザイン 90 種の miRNA を 4 回繰返して 384well panel に配置
1set [12 枚入 ] を用意
② RNA 抽出
￥15,000 × 4
③ RNA サンプル QC ( 血清・血漿 miRNA4 種 qPCR)
￥38,000 × 4
① cDNA をコスモ・バイオへ送付 (EXQ 社製品にて cDNA 合成 )
④ cDNA 合成
￥20,000 × 4
② RNA サンプル QC( 血漿 miRNA4 種 qPCR)
⑤ 定量 PCR
￥200,000 × 12
Custom pick&Mix Panel ( 12 枚× 1set 使用 )
Human Profiling Panel 384well ( 2 枚 × 8)
④ データ解析をした結果報告書と Raw Data を納品
⑥ データ解析をした結果報告書と Raw Data を納品
si/shRNA
ライブラリー
￥38,000 × 46
③ 定量 PCR
￥240,000 × 8
ノックダウン検証
合計 ￥4,148,000
合計 ￥2,212,000
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
■商品リスト
実験作業ステップ
RNA 抽出 / 精製
RNA サンプル QC
cDNA 合成
定量 PCR
［メーカー：MIR］
品番
品名
包装
希望販売価格
ELASVQ01
RNA 抽出 / 精製サービス ( 細胞 )
1 SERV.
(1 sample)
¥15，
000
ELASVQ02
RNA 抽出 / 精製サービス ( 組織 )
1 SERV.
(1 sample)
¥15，
000
ELASVQ03
RNA 抽出 / 精製サービス ( 血清・血漿 )
1 SERV.
(1 sample)
¥15，
000
ELASVQ04
RNA サンプルクオリティチェック（QC : スペクトル解析）
1 SERV.
(1 sample)
¥10，
000
ELASVQ05
血清・血漿由来 RNA サンプルクオリティチェック（QC : 血清・血漿 miRNA4 種 qPCR）
1 SERV.
(1 sample)
¥38，
000
ELASVQ06
cDNA 合成（血清・血漿以外）
1 SERV.
(1 sample)
¥20，
000
ELASVQ07
cDNA 合成（血清・血漿）
1 SERV.
(1 sample)
¥20，
000
ELASVQ08
miRNA Real time PCR profiling service 384well 2run
1 SERV.
(1 sample)
¥240，
000
ELASVQ09
miRNA Real time PCR service Cancer Focus Panel 384well 2run
1 SERV.
(8 sample)
¥500，
000
ELASVQ10
miRNA Real time PCR service Serum /Plasma Focus Panel 384well 2run
1 SERV.
(4 sample)
¥400，
000
ELASVQ11
miRNA Real time PCR service Custom pick & mix panel 384well 1run *1
1 SERV.
(1 sample)
¥200，
000 ∼
ELASVQ12
miRNA Real time PCR service 96well 1run
1 SERV.
(1 sample)
ご照会
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
*1 カスタム pick-and-mix パネルを使用した受託解析サービスの場合には，事前にパネルのデザインが必要です。また，カスタムパネルは 1set (96well パネル 8 枚入 ) が最小包装単位となります。
*2 上記の価格に試薬代，実験作業料金，データ解析の料金をすべて含みます。
035
miRNA 定量
miRNA
定量
SensiMix miRNA 検出アッセイシステム
miRBase
LNA
定量 PCR，コピー数が分かります！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
オリジンテクノロジーズ社の，ユニークなプライマーベースの SYBR®
Green qPCR microRNA 検出システムは，迅速かつ簡単に miRNA 発現
レベルのプロファイリングができるだけではなく，定量解析により miRNA
のコピー数も測定できます。
※ SYBR® は Molecular Probes Inc 社の登録商標です。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
特長
●ヒトおよびマウス miRNA をゲノムワイドにカバー
●テンプレートスタンダードを用いて，miRNA のコピー数まで決定
●トータル RNA サンプルからダイレクトに miRNA を検出可能
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
図 1 qSTAR miRNA 検出アッセイの原理図
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
システムの概要
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
Ⓐ
ファースト
ストランド
cDNA
合成キット
Ⓑ
miRNA
プライマーペア
プライマーパネル
Ⓒ
miRNA
テンプレート
スタンダード
Ⓓ
SYBR®Green
マスターミックス
ノックダウン検証
※ⒶⒷⒸは，ユニークですので，オリジンテクノロジーズ社の qPCR miRNA 検出システムでのみお使いいただけます。
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
Ⓐ SensiMix ファーストストランド cDNA 合成キット
その他
内容：2 ステッププロトコールです。
技術情報
構成内容
1．RNA サンプルに poly x（A）xtail を添加
●poly（A）polymerase reaction 10X buffer
2．anchor linker oligo dT を使用してファーストストランド cDNA
を合成
●poly（A）polymerase（5U/μl）
●10 mM ATP
●5X MMLV buffer（dNTPs included）
miRNA
プロファイリング
●MMLV Reverse Transcriptase（200U/ul）
●Oligo dT mix
miRNA
機能解析
●control primer pair（U6）
プール型 shRNA
ライブラリー
●Application Guide
ご注意：miRNA cDNA は，SYBR® Green qPCR 用の効果的な qPCR テンプレートになります。
本キットは，オリジンテクノロジーズ社の miRNA 検出システムにのみお使いいただけます。
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■商品リスト
［メーカー：ORG］
商品名
First-strand cDNA Synthesis kit for miRNA
036
品番
包装
希望販売価格
HP100041
10 回分
¥33，
000
貯蔵
凍
○
HP100042
50 回分
¥115，
000
凍
○
miRNA 定量
Ⓑ SensiMix miRNA プライマーペア／プライマーパネル
miRNA
miRBase
■SensiMix miRNA プライマーペア
LNA
SensiMix miRNA プライマーぺアは，SYBR® Green qPCR に最適
化されており，オリジンテクノロジーズ社の miRNA 検出システム用
にデザインされています。全てのプライマーは，正常および卵巣癌サンプル
を用いた発現プロファイル実験により，予め検証されています。
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
特長
検出
●全てのプライマーは検証済
インヒビター
●濃縮サンプルや分解したサンプルをはじめ，どんな RNA サンプルに
おいても miRNA を検出
過剰発現
（オリゴ）
●オリジンテクノロジーズ社の miRNA 検出システム用にデザイン
卵巣癌 cDNA
正常 cDNA
過剰発現
（ベクター）
図 2 卵巣癌での miRNA 検出
正常組織と卵巣癌組織において，全てのヒト miRNA プライマーをプロファイリング。qPCR は，SYBR
Green I，ABI7900HT を用いて検出。miRNA の 90% 以上が正常サンプルでうまく同定された。
ご注意：コピー数を得るためには，サンプルに適した miRNA テンプレートスタンダード商品と一緒に
お使いいただく必要がございます。
機能検証
次世代
シークエンシング
構成内容
●primer mix（1nmol each）
siRNA
配列解析
サービス
■商品リスト
［メーカー：ORG］
商品名
種
Lyophilized miRNA primer pair
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Human
HP3xxxxx
Mouse
MP3xxxxx
200 回分（25μL 反応系）
¥35，
000
凍
○
200 回分（25μL 反応系）
¥35，
000
凍
○
※品番中の xxxxx は，コスモ・バイオホームページ上の“商品検索”に，ご希望の miRNA 番号をキーワードに検索してください。
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
■SensiMix miRNA プライマーパネル
si/shRNA 発現
特長
オリジンテクノロジーズ社がゲノムワイドにカバーする miRNA プライ
マーをパネルとしてご利用いただけます。SYBR® Green ベースのリアルタ
イム qPCR 実験で miRNA 発現の評価を迅速かつ簡単にしていただけます。
miRNA プライマーは，正常サンプルと卵巣癌サンプルにおける発現
プロファイル実験で検証されています。
ノックダウン検証
●プライマーは予め検証済
●96 ウェル，384 ウェルフォーマットをご用意
●オリジーンテクノロジーズ社の miRNA 検出システム用にデザイン
si/shRNA
ライブラリー
●濃縮サンプルや分解したサンプルをはじめ，どんな RNA サンプル中
の miRNA も検出
関連試薬
■商品リスト
［メーカー：ORG］
種
品番
623 miRNAs pre-arrayed in single-use 96-well PCR plates
商品名
Human
HPP3001A
2plate
包装
希望販売価格
貯蔵
ご照会
凍
○
623 miRNAs pre-arrayed in single-use 96-well PCR plates
Human
HPP3001B
10plate
ご照会
凍
○
623 miRNAs pre-arrayed in single-use 384-well PCR plates
Human
HPP3002A
2plate
ご照会
凍
○
623 miRNAs pre-arrayed in single-use 384-well PCR plates
Human
HPP3002B
10plate
ご照会
凍
○
485 miRNAs pre-arrayed in single-use 96-well PCR plates
Mouse
MPP3001A
2plate
ご照会
凍
○
485 miRNAs pre-arrayed in single-use 96-well PCR plates
Mouse
MPP3001B
10plate
ご照会
凍
○
485 miRNAs pre-arrayed in single-use 384-well PCR plates
Mouse
MPP3002A
2plate
ご照会
凍
○
485 miRNAs pre-arrayed in single-use 384-well PCR plates
Mouse
MPP3002B
10plate
ご照会
凍
○
miRNA プライマーパネルは，ABgene 社（AB-0600）の 96 ウェル PCR プレート，または，Applied Biosystems 社（Part#4309849）の 384 ウェルプレートにアレイされています。これらのプレートに対応
する qPCR 装置でお使いいただけます。適合するか不明な場合には，コスモ・バイオ（[email protected]）までお問い合わせください。
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
miRNA プライマーパネル作製受託サービス
ご希望の miRNA プライマーパネル（ヒト / マウス）を作製いたします。フォーマットは，10 または 200 反応分。オリジンテクノロジーズ社の
miRNA qPCR 検出システム用にデザインされます。90 ∼ 384 プライマー（ユニークな miRNA または replicates のどちらか）をアレイできます。
お見積もりのご要望は，受託サービス担当（[email protected]）までお問い合わせください。
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
037
miRNA 定量
miRNA
Ⓒ SensiMix miRNA テンプレートスタンダード
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
ヒトおよびマウス転写産物に対する miRNA テンプレートスタンダード
を 1100 種類以上取り揃えており，対応する miRNA プライマーペアも
含 ま れ て い ま す。各 テ ン プ レ ー ト ス タ ン ダ ー ド は，高 純 度 で SYBR®
Green qPCR 実験を定量化するためにお使いいただけます。
特長
●SYBR® Green qPCR を用いた miRNA 検出におけるポジティブ
コントロールとして
●オリジーンテクノロジーズ社の miRNA 検出システム用にデザイン
●標準曲線法を用いて，実験サンプルの絶対転写産物コピー数を決定
構成内容
●相対的な Ct 法において PCR 効率を定量するために標準曲線を作製
●miRNA テンプレートスタンダード
（500 million gene copies, double-stranded DNA, 100 回分）
検出
インヒビター
●相当する SYBR® Green qPCR 用 miRNA プライマーペア
（200 回分 25 μL /rxu）
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
■商品リスト
［メーカー：ORG］
商品名
Gene specific qPCR template standard
種
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Human
HKxxxxxx
1set
¥82，
000
凍
○
Mouse
MKxxxxxx
1set
¥82，
000
凍
○
※品番中の xxxxxx は，コスモ・バイオホームページ上の“商品検索”に，ご希望の miRNA 番号をキーワードに検索してください。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
Ⓓ SensiMix SYBR® マスターミックス
市販のマスターミックスの 10 倍以上高感度です！
他社A
発 現 レ ベ ル の 低 い 42 遺 伝 子 を 解 析 し て 比 較 検 討 し た と こ ろ，
SensiMix SYBR® マスターミックスは，他社 A マスターミックスでは得
られなかった 12 遺伝子の発現を検出することに成功しました。その他
30 遺伝子について，SensiMix マスターミックスで得られた Ct 値が，
他社 A マスターミックスで得られた平均 Ct 値よりも 4.56 倍低い値で
した。
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
特長
●ずばぬけた感度と特異性：StarTaq は独自のホットスタート PCR 酵素
で，非特異的な増幅やプライマーダイマー形成を防ぎます。
●ほとんどのリアルタイム PCR 装置で検証済
関連試薬
●簡単操作
トランスフェク
ション試薬
図 3 SensiMix SYBR® マスターミックスまたは他社 SYBR® マスターミックスを用いて，ABI7900HT
その他
で同時に qPCR 反応を行った。増幅プロットでは，SensiMix マスターミックスが他社 A の結果
と比べてより小さい Ct 値が得られた。
■商品リスト
［メーカー：ORG］
商品名
技術情報
SensiMix SYBR® Master Mix（2x）
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
SensiMix SYBR® Master Mix - Low Rox（2x）
ABI - 7000, 7300, 7700,
7900, 7900HT, SteponeTM
ABI - SteponeTM plus, 7500；
Stratagene -MX4000PTM,
MX3000PTM,MX3005PTM
®
SensiMix SYBR® Master Mix - Fluorescein（2x）
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
※上記は全て 25uL 反応系です。
038
対応 qPCR 装置
BioRad - iCycler ,
MyiQTM, iQTM5
品番
サイズ※
QP100001
100 回分 （1.25mL）
QP100002
QP100003
QP100004
希望販売価格
貯蔵
¥62，
000
凍
○
400 回分 （5mL）
¥121，
000
凍
○
1600 回分 （20mL）
ご照会
100 回分 （1.25mL）
凍
○
¥62，
000
凍
○
QP100005
400 回分 （5mL）
¥121，
000
凍
○
QP100006
1600 回分 （20mL）
ご照会
凍
○
QP100007
100 回分 （1.25mL）
¥62，
000
QP100008
凍
○
400 回分 （5mL）
¥121，
000
凍
○
QP100009
1600 回分 （20mL）
ご照会
凍
○
miRNA 定量
All-in-OneTM miRNA qRT-PCR 検出キット
＆ 検証済み miRNA qPCR プライマー
定量
miRNA
miRBase
LNA
All-in-OneTM miRNA qRT-PCR 検出キット
抽出 / 精製
miRNA 発現の高感度かつ実用的な定量プロファイリング
プロファイリング
All-in-OneTM miRNA qRT-PCR 検 出 キ ッ ト は，PCR 技 術 と SYBR®
Green を 組 み 合 わ せ，100pg の ト ー タ ル RNA サ ン プ ル か ら 成 熟
miRNA を迅速かつ正確に定量解析できます。
定量
検出
※ SYBR® は Molecular Probes Inc. 社の登録商標です。
インヒビター
特長
過剰発現
（オリゴ）
●100pg のトータル RNA から miRNA を検出。
●成熟 miRNA のみを検出。
過剰発現
（ベクター）
●ジーンコピア社の検証済み miRNA 特異的プライマーと組み合わせて使用。
● ジーンコピア社の precursor miRNA プラスミドコンストラクトと
併せて実験できます。
機能検証
次世代
シークエンシング
● ジーンコピア社の ORF expression-ready クローンを使用した機能
検証研究をフォローアップ。
構成内容
●Poly A Polymerase
●RTase Mix, qPCR Mix
●ROX Reference Dye
●buffers
siRNA
図 1 アッセイ原理
3' 末端のポリアデニル化ステップでは，M-MLV RTase とオリゴ dT アダプタープライマー
が Poly A miRNA を逆転写します。本キットの qRT-PCR ミックスは，SYBR® Green を含み，逆転写
された miRNA を特異的に検出します。
●Universal Adaptor PCR Primer
■商品リスト
［メーカー：GCP］
商品名
All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
AOMD-Q020
20 回分
ご照会
凍
○
AOMD-Q050
50 回分
ご照会
凍
○
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
All-in-OneTM miRNA qPCR 検証済みプライマー
si/shRNA 発現
独自のアルゴリズムでデザイン，700 種類以上のヒト miRNA で検証済
TM
®
All-in-One SYBR Green miRNA qRT-PCR キットと組み合わせて
使用することで，All-in-OneTM miRNA プライマーは，全ての miRNA の
高性能遺伝子発現プロファイリングを行うことができます。
（包装：20μL × 500 回分）
A
ノックダウン検証
B
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
図 1 プライマー検証
All-in-One miRNA qPCR プ ラ イ マ ー は，シ ン グ ル の 解 離 曲 線 ピ ー ク が 得 ら れ，タ ー ゲ ッ ト と さ れ る
miRNA の正確な増幅サイズを得られることを検証済。
10 のヒト組織トータル RNA サンプルから逆転写された産物を含む cDNA プールを，検証テンプレート
として用いた。qPCR は，2X All-in-One qPCR Mix で 0.2μM プライマーを使用。
(A)：増幅曲線の検証結果
(B)：解離曲線の検証結果
■商品リスト
［メーカー：GCP］
■商品検索の手順
ジーンコピア社ホームページ上の miRNA 紹介ページ（http://www.genecopoeia.com/
product/mirna/）を開きます。
Search Clones
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【キーワード検索】
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
①ご希望の分野を選択します。
②precursor miRNA 名，mature miRNA 名，precursor miRNA Accession，mature
miRNA Accession，カタログ / 製品 ID，precursor 配列，mature 配列等のキーワード
で検索できます。
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右の 希望販売価格はご照会ください。
039
miRNA 定量
miRNA
定量
MiraMasTM キット microRNA qPCR 用 cDNA 合成
miRBase
LNA
microRNA / smallRNA の qPCR 用 cDNA サンプル調製，バイオマーカー探索に！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
使用目的
特長
MiraMasTM キットは microRNA / small RNA を qPCR 解析する cDNA
ライブラリを調製するための試薬です。
5' - アデニル化／ 3' 保護オリゴヌクレオチドアダプター（アデニル化
3' ライゲーションアダプター）と small RNA の 3' 末端とのライゲー
ションに基づいています。その後，M-MLV 逆転写酵素で small RNA か
ら cDNA へ逆転写します。ライゲーションさせるアダプターにより逆転写
プ ラ イ マ ー の 結 合 サ イ ト が 得 ら れ ま す。Second-strand cDNA を
miRNA 特異的 forward PCR プライマーで合成した後も，同じ逆転写プ
ライマー結合のための同じアダプター配列を維持しています。アデニル化ア
ダプターの使用により効率化が図れ，特異性が向上します。本キットのプロ
トコールはシングルチューブフォーマットを用いており，ライゲーション，
逆転写，cDNA ライブラリの希釈まで 1 バイアル内で行います。ハイス
ループット解析に最適です。
1 キットで 30 サンプル中の数百種の miRNA を解析，もしくは 150
サンプル中の 25 種までの miRNA を解析するのに十分な試薬が含まれま
す。
●More Target；1 サンプル当たり 100 種以上の miR を解析できる
●More Sample；1 キット当たり最大 150 サンプル調製
●フレキシブル；インプット RNA 量が多い（数 mg）場合も少ない
（10ng ∼ 300ng）場合も対応可能
●シンプル；修飾不要，シンプルなプライマーデザイン
●コントロール RNA & コントロールプライマー入り；miR-16（ほとんど
の組織に発現）
，miR-122（肝臓に発現），miR-124（神経組織に発現）
●ExoMirTM（別販売，10 ページ参照）と組み合わせて，エキソソーム
サンプル中の miRNA を解析可能
プロトコール
Step1：ライゲーション
混合：RNA（10ng - 2μg），リンカー，AIRTM RNA リガーゼ
Step2：逆転写反応
添加：dNTPs，RT primer，MMLV-RT
siRNA
構成内容
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
Step3：逆転写反応物の希釈
Step 1: ライゲーション
●アデニル化 3' ライゲーションアダプター
●アダプターバッファー
TM
●AIR
リガーゼ（RNA リガーゼ）
TM
●10X AIR
リガーゼバッファー
TM
●AIR
リガーゼ希釈バッファー
●PEG 溶液
Step4：qPCR
アプリケーション例
Step 2 & 3: 逆転写反応
10X RT バッファー
●4 dNTP ミックス
●RT プライマー
●MMLV 逆転写酵素
●10X MMLV バッファー
●nuclease-free H O
2
●
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
Step 4: qPCR
Universal Reverse PCR プライマー
●50X プライマーバッファー
●
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
コントロール
コントロール RNA1
（small RNA-enriched fraction, mouse brain）
●コントロール RNA2
（small RNA-enriched fraction, mouse liver）
●Forward コントロールプライマー 1（miR-16）
●Forward コントロールプライマー 2（miR-122）
●Forward コントロールプライマー 3（miR-124）
●
注）microRNA-specific forward プライマーは含まれません。
推奨プライマー配列はお問い合わせください。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
マ ウ ス 組 織 か ら BiooPureTM 試 薬（16 ペ ー ジ）を 用 い て small RNA 画 分（100base よ り 小 さ い
RNA）を 精 製 し，本 キ ッ ト を 用 い て（Low input マ ニ ュ ア ル）サ ン プ ル 調 製 し た。RNA サ ン プ ル
100ng または 10ng を AIR リガーゼによりアデニアル化アダプターとライゲートし，MMLV-RT で逆
転写し，希釈した（10ng input RNA サンプルは 180μL，100ng input RNA サンプルは 360μL）。
その後，9μL をテンプレートとして 30μL の qPCR 反応に使用し，BioRad iCycler を用いて qPCR
を行った。
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
MiraMasTM kit
040
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
5208
1 kit
¥70，
000
凍
○
miRNA 検出
検出
miRCURY LNATM microRNA Detection Probes
miRNA
miRBase
LNA
LNATM なら miRNA がキレイに見える !
抽出 / 精製
特長
プロファイリング
●miRNA 検出プローブ：in situ hybridization ならびに Northern blot 用
●高感度：発現量の低い miRNA も検出可能
定量
●特異的：1 塩基または 2 塩基のミスマッチを識別可能
●高い結合親和性
検出
●デザイン済 プローブ：哺乳動物，植物など，miRBase 登録の mature miRNA に対応
インヒビター
●カスタムプローブ：miRBase に登録がない配列や Pre-miRNA のみを検出したい場合など
●ラベル：お好みのラベリング方法でプローブ作製可能
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
In situ hybridization
機能検証
whole mounts，組織切片，単一細胞，（ホルマリン固定，パラフィン切片など）幅広いサンプルに適応
A
B
次世代
シークエンシング
C
B Gallus gallus 胚ステージ 16 における let7a/let-7j の検出
miRCURY LNATM detection probe を使用
デ ー タ 提 供：Drs. Darnell, DK and Antin PB,
University of Arizona, Tucson, USA.
（GEISHA database / website 参照）
A miR-122a，miR-124a，miR-206 の検出
C タバコ (N. benthamiana) の apex 切片にお
ける miR-159 の検出
サンプル：ゼブラフィッシュ胚の whole mount
プローブ：DIG ラベル済みプローブ
データ提供：Dr. Plasterk, Hubrecht Lab, Netherlands.
miRCURY LNATM detection probe を使用
データ提供：Drs. Havelda and Burgya,
Agricultural Biotechnology Center, Hungary.
D
E-1
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
E-2
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
D マウス細胞における肝臓特異的 miR-122a（赤色）検出。DNA は DAPI
（青色）により染色
E ダブルまたはシングル DIG-labeling プローブの比較
組織片を用いて hsa-miR-21 を検出した結果
データ提供：Dr. Javier Martinez, IMBA - Institute of Molecular Biotechnology,
Vienna, Austria.
1) 5' -/3' - ダブル DIG ラベルプローブ，40nM
2) 3' - シングル DIG ラベルプローブ，80nM
関連試薬
1
Northern blot analysis
トランスフェク
ション試薬
通常の 1/10 以下のサンプル量かつ短時間の exposure で検出可能
アイソトープを使わない方法にも対応 , e.g. DIG-tailing
その他
DNA probe miRCURY™ probe
A
100 50 25 10 5 2.5
100 50 25 10 5 2.5
μg RNA
2
A 32P ラベルした DNA プローブまたは miRCURY LNATM
プ ロ ー ブ を 用 い て Northern blot を 行 い，miR-171 お よ び
miR-319 を検出した結果。サンプルは A.thaliana total RNA。
技術情報
miR171
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
miR319
F Double DIG プローブ使用による ISH 検出感度の向上
1) Double DIG プローブ 40nM 使用
2) 5'- DIG プローブ 80nM 使用
プール型 shRNA
ライブラリー
le
Do
ub
Pe
rfe
ct
m
m
at
ism
ch
B
1
1
2
Si
n
at
ch
Po gle
,
sit mis
io m
Si n 1 atc
ng
1 h,
Po le m
sit is
i
Si on 8 mat
n
ch
,
Po gle
sit mis
io m
n at
14 ch
,
EtBr
2
1
2
1
2
1
2
B miRCURY LNATM プローブにより配列特異的な miRNA 検出。
A. thaliana -miR171 に対しパーフェクトマッチまたはミスマッチ
を含む miRCURY LNATM プローブを用いて Northern blot
を行った結果。サンプルは，flower (1) または leaves (2) より
抽出したトータル RNA。
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Low stringency
2xSSC,45℃
High stringency
0.1xSSC,65℃
EtBr
Válóczi et al. 2004, Nucleic Acids Res. e175; reprinted by
permission of Oxford University Press.
041
miRNA 検出
miRNA
■商品リスト
製品群
miRBase
LNA
抽出 / 精製
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（ベクター）
修飾
カスタム
プローブ
機能検証
次世代
シークエンシング
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
miRCURY LNATM Detection probe
ready to label
250pmol
￥67，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection probe
5'-DIG labeled
250pmol
￥89，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection probe
5'-amino labeled
250pmol
￥74，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection probe
5'-biotin labeled
250pmol
￥77，
000
凍
○
250pmol
￥83，
000
凍
○
250pmol
￥95，
000
凍
○
TM
デザイン済み miRCURY LNA Detection probe
プローブ
miRCURY LNATM Detection probe
プロファイリング
過剰発現
（オリゴ）
［メーカー：EXQ］
商品名
5'-fluorescein labeled
ご照会
3'-DIG labeled
※
miRCURY LNATM Detection probe
3'-amino labeled
250pmol
￥76，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection probe
3'-biotin labeled
250pmol
￥79，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection probe
3'-fluorescein labeled
250pmol
￥85，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection probe
5'-DIG and 3'-DIG labeled
250pmol
￥116，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
ready to label
99999-00
250pmol
￥76，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
5'-DIG labeled
99999-01
250pmol
￥96，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
5'-amino labeled
99999-02
250pmol
￥84，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
5'-biotin labeled
99999-03
250pmol
￥87，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
5'-fluorescein labeled
99999-04
250pmol
￥92，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
3'-DIG labeled
99999-05
250pmol
￥104，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
3'-amino labeled
99999-06
250pmol
￥86，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
3'-biotin labeled
99999-07
250pmol
￥89，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
3'-fluorescein labeled
99999-08
250pmol
￥94，
000
凍
○
miRCURY LNATM custom Detection probe
5'-DIG and 3'-DIG labeled
99999-15
250pmol
￥124，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
ready to label
99003-00
250pmol
￥49，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
5'-DIG labeled
99003-01
250pmol
￥63，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
5'-amino labeled
99003-02
250pmol
￥52，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
5'-biotin labeled
99003-03
250pmol
￥57，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
5'-fluorescein labeled
99003-04
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
3'-DIG labeled
99003-05
250pmol
￥63，
000
凍
○
配列解析
サービス
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
3'-amino labeled
99003-06
250pmol
￥54，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
3'-biotin labeled
99003-07
250pmol
￥59，
000
凍
○
カスタム合成
サービス
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
3'-fluorescein labeled
99003-08
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Sense miR-159, Control
5'-DIG and 3'-DIG labeled
99003-15
250pmol
￥85，
000
凍
○
コントロール
siRNA
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
ready to label
99004-00
250pmol
￥49，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
5'-DIG labeled
99004-01
250pmol
￥63，
000
凍
○
デザイン済み
siRNA
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
5'-amino labeled
99004-02
250pmol
￥52，
000
凍
○
凍
○
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
5'-biotin labeled
99004-03
250pmol
￥57，
000
5'-fluorescein labeled
99004-04
250pmol
￥59，
000
凍
○
3'-DIG labeled
99004-05
250pmol
￥63，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
3'-amino labeled
99004-06
250pmol
￥54，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
3'-biotin labeled
99004-07
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
3'-fluorescein labeled
99004-08
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
5'-DIG and 3'-DIG labeled
99004-15
250pmol
￥85，
000
凍
○
TM
コントロール miRCURY LNA Detection, Scramble miR, Control
プローブ
miRCURY LNATM Detection, Scramble miR, Control
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
ready to label
99002-00
250pmol
￥49，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
5'-DIG labeled
99002-01
250pmol
￥63，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
5'-amino labeled
99002-02
250pmol
￥52，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
5'-biotin labeled
99002-03
250pmol
￥57，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
5'-fluorescein labeled
99002-04
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
3'-DIG labeled
99002-05
250pmol
￥63，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
3'-amino labeled
99002-06
250pmol
￥54，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
3'-biotin labeled
99002-07
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
3'-fluorescein labeled
99002-08
250pmol
￥59，
000
凍
○
miRCURY LNATM Detection, U6, hsa/mmu/rno, Control
5'-DIG and 3'-DIG labeled
99002-15
250pmol
￥85，
000
凍
○
※ EXIQON 社 web サイトより品番を検索してください。
コントロールは scramble，sense-miR159，U6 をご用意しております。実験条件に応じてお選びください。
技術情報
miRNA
プロファイリング
・sense-miR-159
Ath- miR159 の相補鎖側配列です。この配列は，現在知られている miRNA との交差性が限りなく無視できると考えられるため，ネガティブコント
ロールとして選択されています。
・U6
U6 snoRNA は，比較的一般に一定レベル存在しており，small RNA としては house keeping 的な位置づけで使用されます。miRNA に対するポジティ
ブコントロールとしてご利用いただけます。
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■ ご注文方法
1.
ZZZH[LTRQFRPOV
࡬࢔ࢡࢭࢫࠋ
⏬㠃ୖ㒊ࡢ 0HQX ࡼࡾ
3URGXFWV
ЍPLFUR51$5HVHDUFK
ЍLQVLWXK\EULGL]DWLRQ
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042
2.
ࡇࡇࢆࢡࣜࢵࢡ
3.
PLFUR51$QDPH ࡶࡋࡃࡣ
6HTXHQFH ࡢḍ࡟ࠊ᳨ฟࡋࡓ
࠸ PLFUR51$,' ࡲࡓࡣ㓄ิ
ࢆグධࡋ࡚ࠕ)LQG3URGXFWࠖ
ࢆࢡࣜࢵࢡ
4.
ࢹࢨ࢖ࣥ῭ࣉ࣮ࣟࣈ
࣭ ࡛ᚓࡽࢀࡓ࢝ࢱࣟࢢ㸡
࣭PLFUR51$,'
࣭⏕≀✀
࢝ࢫࢱ࣒ࣉ࣮ࣟࣈ
࣭࢝ࢱࣟࢢ㸡
᳨࣭ฟࡋࡓ࠸㓄ิ
࣭⏕≀✀
5.
ࡢ᝟ሗࢆ
ࡈ฼⏝ࡢ௦⌮ᗑ࡟
ࡈ㐃⤡࠸ࡓࡔࡁࠊ
ࡈὀᩥࡃࡔࡉ࠸ࠋ
miRNA 検出
検出
miRCURY LNATM microRNA ISH Optimization Kit
（FFPE）
miRNA
miRBase
LNA
miRNA in situ ハイブリダイゼーションのセットアップおよび最適化に適しています。
抽出 / 精製
使用目的
特長
miRCURY LNA™ microRNA ISH Optimization Kit（FFPE）は，ホ
ルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルを用いた microRNA
in situ hybridization（ISH）実験のセットアップ及び最適化に適していま
す。本 キ ッ ト で は，検 出 感 度 の 高 い double（5’and 3’
）DIG-labeled
miRCURY LNA™ microRNA Detection Probes を 利 用 す る た め，
microRNA を 高 感 度 か つ 特 異 的 に 検 出 で き ま す。さ ら に，キ ッ ト に は
FFPE 組織切片に対して LNA™ プローブを使用するために最適化した試
薬と，ISH 実験の各ステップの詳細説明や実験成功のコツ・アドバイスを
記載した便利なマニュアル，さらに，迅速でスムーズな（トラブルのない）
ISH 実験を行うために，1 日で実施可能な検証済みプロトコールも付属さ
れています。
また本キットは，細胞及び細胞成分に存在する microRNA の局在化研
究や microRNA の空間的発現パターンの同定等，様々な用途に応用できま
す。さらに，実験手技に左右されない手法のため，HT ISH 解析や個々の
microRNA の局在化研究等にも適しています。
microRNA in situ ハイブリダイゼーション実験のセットアップ及び最
適化に便利
● 高感度・優れた特異性：各キットには，最適な double DIG-labeled
miRCURY LNA™ microRNA Detection Probes 及び試薬が含ま
れます。
● 高い再現性（結果が個人の技量に左右されない）
：ハイスループット
及び各 microRNA の局在研究の双方に有効
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
● 迅速・簡便：1 日で完了する ISH プロトコール
● 高い応用性：高度な機器が不要
過剰発現
（ベクター）
機能検証
原理
次世代
シークエンシング
構成内容
●microRNA LNATM probe
（double DIG-labeled, ターゲット microRNA はキットごとに異なる）
siRNA
●Scrambled LNATM probe
（double DIG-labeled, ネガティブコントロール）
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
●U6 LNATM probe（5' DIG-labeled, ポジティブコントロール）
●ハイブリダイゼーションバッファー（2x，ホルムアミド非含有）
図１ miRCURY LNATM microRNA ISH Optimization Kit（FFPE）の原理
●プロテイナーゼ K
検証済み組織
1．組織をプロテイナーゼ K を用いて「open」にします。
2．ハイブリダイゼーションステップでは，DIG-labeled LNATM probe がターゲット miRNA と特異的に
結合します。
3．アルカリフォスファターゼ（AP）接合抗 DIG 抗体を加えた後，NBT-BCIP を行います
（オプション： Nuclear Red による対比染色）
Kit 1（miR-1）
Kit 2（miR-21） Kit 3（miR-122）Kit 4（miR-124）Kit 5（miR-126）Kit 7（miR-145）Kit 8（miR-205）Kit 9（miR-223）
筋肉
肺
腎臓
肝臓
結腸
子宮頸
心臓
乳腺
肺癌
結腸直腸癌
乳癌
腎臓癌
子宮頸癌
精巣癌
食道癌
細胞種
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
キット名（ターゲット microRNA プローブ）
脳
目
コントロール
siRNA
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
○
si/shRNA
ライブラリー
○
○
○
○
○
○
○
○
筋細胞
細胞腫は異なる
肝細胞
ニューロン
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
内皮細胞
平滑筋細胞
○
○
関連試薬
○
トランスフェク
ション試薬
○
その他
基底細胞
○
顆粒球
表１ 適切な miRCURY LNATM microRNA ISH Optimization Kit の選択
それぞれのキットが検証された組織リスト。ご利用になる組織タイプからどのキットが適しているかご確認ください。
技術情報
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
microRNA ISH Optimization Kit 1 (FFPE)
品名
90001
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 2 (FFPE)
90002
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 3 (FFPE)
90003
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 4 (FFPE)
90004
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 5 (FFPE)
90005
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 7 (FFPE)
90007
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 8 (FFPE)
90008
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Optimization Kit 9 (FFPE)
90009
1 KIT
¥310，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Buffer set (FFPE)
90000
1 EACH
¥129，
000
冷 ○
凍
○
microRNA ISH Buffer and Controls Kit
90010
1 KIT
¥220，
000
冷 ○
凍
○
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
043
miRNA 検出
miRNA
miRBase
Kit 1
Kit 2
ターゲット miRNA プローブ：
ターゲット miRNA プローブ：
miR-1
miR-21
miRNA 発現細胞例：
miRNA 発現細胞例：
骨格筋細胞，筋細胞，心筋細胞
がん関連線維芽細胞，免疫細胞
発現結果：
発現結果：
成体マウス心臓 FFPE 組織中
の miR-1 検出
ヒト直腸腺がん FFPE 組織中の
miR-21 検出
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
Kit 3
Kit 4
ターゲット miRNA プローブ：
ターゲット miRNA プローブ：
miR-122
miR-124
microRNA 発現細胞例：
microRNA 発現細胞例：
肝細胞
ニューロン
siRNA
発現結果：
発現結果：
配列解析
サービス
マ ウ ス 肝 臓 FFPE 組 織 中 の
miR-122 検出
ヒ ト 脳 障 害 FFPE 組 織 中 の
miR-124 検出
機能検証
次世代
シークエンシング
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
Kit 5
Kit 7
ターゲット miRNA プローブ：
ターゲット miRNA プローブ：
miR-126
miR-145
shRNA クローン
コレクション
miRNA 発現細胞例：
miRNA 発現細胞例：
si/shRNA 発現
内皮細胞
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
平滑筋細胞，血管平滑筋細胞
（周皮細胞），筋上皮細胞
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
発現結果：
発現結果：
ヒト炎症結腸（直腸壁）FFPE
組織中の miR-126 検出
ヒト結腸壁（下部筋層含む）
FFPE 組織中の miR-145 検出
Kit 8
Kit 9
ターゲット miRNA プローブ：
ターゲット miRNA プローブ：
miR-205
miR-223
miRNA 発現細胞例：
miRNA 発現細胞例：
基底ケラチン生成細胞，筋上皮細
胞，扁平上皮がん（SCC）細胞
骨髄性細胞，顆粒球細胞，
造血システム（単球性区画）
発現結果：
発現結果：
ヒ ト 乳 が ん FFPE 組 織 中 の
miR-205 検出
ヒ ト 食 道 が ん FFPE 組 織 中 の
miR-223 検出
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
044
表２ 各キットに含まれる組織特異的 microRNA LNATM probe のリストおよび対象となる miRNA の発現部位例
発現結果はすべて NBT-BCIP（青色）染色。切片を Nuclear Red により対比染色した。
miRNA 検出
検出
miRNA
miRNA in situ hybridization 受託解析サービス
miRBase
LNA
サンプル調製から，ハイブリダイゼーションまでおまかせのラクラク miRNA ISH
抽出 / 精製
使用目的
サービスの流れ
In situ hybridization（ISH）は，組織中での特異的な核酸配列を検出し，
発現部位を解析する手法です。本サービスでは，EXIQON 社 miRCURY
LNA™ microRNA Detection Probe を用いて＊1，miRNA の ISH に関
わる一連の作業を行ないます。ご要望に応じて，動物の解剖から切片および
プローブの作製，ISH の実施，報告書の作成まで一貫してお引き受けいた
します。
一般的に ISH は繁雑かつ技術を要する手法と考えられていますが，研究
現 場 の ニ ー ズ に お 答 え し，EXIQON 社 の LNA™ 技 術 を 利 用 し て
miRBase 登録のすべての生物種について，組織中の miRNA 発現部位を
明らかにします。
① 見積依頼書の送付：見積依頼書へ必要事項をご記入いただき，コスモ・
バイオ商品取扱代理店またはコスモ・バイオ（[email protected]）
までメールでお送りください。
② ご依頼内容の確認：お客様と技術担当者にてサービス内容のお打合せ及び，
EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA double DIG Detection
Probe の手配。
③ お見積書提示：代理店よりお見積もりのご連絡。
④ 解析お申込書の送付：ご注文確定後に，作業内容，検体名等を記載した
お申込書をお送りください。ご依頼内容書確定後，納期を回答致します。
⑤ 動物の解剖および組織の固定：ご要望に応じて動物を解剖し，組織を固
定します。
特長
コース 1：GNF 社にて動物を解剖，正常マウスとラットはご用意して
います。
コース 2：出張解剖（GNF 社技術担当者がご研究室にお伺いして動物
を解剖）。
コース 3：お手持ちの組織をお送りいただく。
● EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA Detection Probe を 使 用
する miRNA 発現部位解析
● 高感度：double DIG probe の使用で発現量の低い miRNA も検出可能
● 特異的：miRCURY LNA™ microRNA Detection Probe は一塩基や
二塩基のミスマッチも識別可能
* 組織をお送りいただく場合にご利用いただける固定液もございます。
灌流固定などの技術が必要となりますので，ご相談下さい。
● 哺乳動物，植物等，Sanger miRBase 登録の mature miRNA に対応＊1
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
⑥ 組織ブロックの作製 : 独自の手法により ISH に適した高品質な組織ブ
ロックを作製します。
● 組織切片染色写真（デジタル）付の結果報告書も納品
プロファイリング
⑦ 切片の作製：注目部位や薄切方向（冠状断・矢状断）など，ご要望に応
じて切片を作製します。
組織切片作製のみの受託サービスにも承ります。
⑧ ISH の実施：② でお選び頂いた EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA
double DIG Detection Probe を使用して ISH を実施します。
ご希望に応じてポジティブコントロール（U6) やネガティブコントロー
ル（スクランブル）も実施します。
⑨ 納品：発色部位の画像と発色部位についての報告書および発色スライド
を納品します。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
* 臨床診断等を目的とした報告書ではございません。
画像ファイルの最大倍率は，× 400 となります
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
図１ ISH 染色例
ヒト結腸における miR-145 検出。EXIQON 社 hsa-miR-145，miRCURY LNA™ microRNA Detection
Probe, 5’
-DIG and 3’
-DIG labeled を使用して，ヒト結腸壁（下部筋層含む）FFPE 組織中の miR-145
の検出を行った。NBT-BCIP（青色）染色。ここでは，切片を Nuclear Red により対比染色した。
関連試薬
■商品リスト
［メーカー：GNF］
品名 / サービス内容
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
トランスフェク
ション試薬
その他
In situ hybridization 実験受託解析サービス−基本料金−＊ 1
組織ブロック作製
組織切片作製
HE 染色
パラフィンブロック 1 種の HE 染色
免疫染色
お見積方法
①コスモ・バイオ WEB ページの（サポート→書類→ダウンロード）から
見積依頼書をダウンロード
②見積依頼書に必要事項をご記載のうえ，コスモ・バイオまでお送りください
連絡先：販売支援部 RNA グループ
TEL (03)5632-9615
FAX (03)5632-9619
[email protected]
ご提供いただいた抗体を用いた免疫染色
EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA Detection Probe ( p.41 ∼ p.42 をご参照ください ）
*1 プローブは EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA Detection Probe を使用致します。プローブは別料金となりますのでご注意ください。
*2 受託解析の受け入れサンプルは拡散防止措置 P1 レベルに該当するものに限ります。感染性のあるサンプル（HCV，HBV 等）は受け入れておりません。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
045
miRNA インヒビター
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor &
Power Inhibitor
miRNA
インヒビター
miRBase
LNA
LNATM で確実に miRNA をノックダウン！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
特長
製品概要
TM
●miRBase 登録の全 miRNA および EXIQON 社独自の miRPlus
配列（miRBase 未登録の新規 microRNA）に対するデザイン済み
インヒビターをご用意
●洗練された画期的なデザインにより効果的かつ配列特異的な miRNA
阻害が可能
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●セルフアニーリングが少なく，AT リッチな miRNA に対しても高い
阻害効果
●高効率かつ阻害活性が均一化されているため低濃度でのマルチプレックス
反応が可能
●オフターゲット効果が低減されたデザイン
機能検証
●特異性が高く生化学的安定性に優れ，長期にわたるアンチセンス活性が
期待
次世代
シークエンシング
●末端修飾が可能なため，トランスフェクション効率の調製が簡便化
● 4 nM
40.0
20.0
0.0
●20 nM
shRNA クローン
コレクション
● 40 nM
si/shRNA 発現
si/shRNA
ライブラリー
miRCURY LNATM
Inhibitor
p-miR
no
target
● 100 nM
0.0
0.1
1.0
10.0
50.0
100.0
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
競合D
0.0
0.1
1.0
10.0
50.0
100.0
競合A
60.0
0.0
0.1
1.0
10.0
50.0
100.0
デザイン済み
siRNA
80.0
0.0
0.1
1.0
10.0
50.0
100.0
コントロール
siRNA
100.0
0.0
0.1
1.0
10.0
50.0
100.0
カスタム合成
サービス
120.0
0.0
0.1
1.0
10.0
50.0
100.0
配列解析
サービス
140.0
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
p-miR-Reporter Expression (normalized)
RLU
siRNA
ノックダウン検証
miRCURY LNA TM microRNA Inhibitor と Power Inhibitor は，
EXIQON 社新開発の強力 miRNA インヒビターです。miRBase 登録済
みの脊椎動物，無脊椎動物および植物 miRNA と，EXIQON 社独自の配列
miRPlusTM の全てに対してデザイン済み miRCURY LNATM microRNA
Inhibitor および Power Inhibitor をご用意しています。
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor シリーズには，蛍光ラベル（6FAM）または ready-to-label オリゴがあり，脱塩，HPLC 精製済，
乾燥状態のオリゴをご提供致します。トランスフェクションやエレクトロ
ポレーションにそのままご利用頂けます。
p-miR-27a
p-miR-24
p-miR-15a
p-miR-16
p-miR20a
p-miR-21
miR-Inhibitors (nM)
図 1 他社製品に比べて高い阻害効果が期待
図 2 一般的な miRNA の阻害効果
MCF7 細胞に miR-21 標的配列をもつ Firefly Luciferase
レポータープラスミド（pmiR-21）
，Renilla Luciferase
レポータープラスミド（トランスフェクションコントロール），
および各社の miR-21 インヒビターを共トランスフェクション
した。トランスフェクションの 48 時間後に Dual Luciferase
assay（Promega）を用いて遺伝子発現レベルを測定した。
Firefly/Renilla Luciferase 比は，Relative Light Units（RLU）
で示した。
HeLa 細胞に miRNA 標的配列をもつ Firefly Luciferase レポータープラスミド，Renilla Luciferase レポータープラスミド（トランスフェクション
コントロール），および miRCURY LNATM microRNA Inhibitor を共トランスフェクションから 48 時間後に Dual Luciferase assay（Promega）
を用いて確認した。 Firefly と Renilla Luciferase 活性比を算出後，microRNA 標的配列をもたない Firefly Luciferase レポーター（p-miR no-target）
を用いてノーマライズした。
関連試薬
その他
技術情報
製品詳細
セルフアニーリングが少なく，高効率かつ効果が均一化
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor は，EXIQON 社の次世代型インヒビターです。新開発の洗練されたデザインにより，これまでに前例のない
LNATM 技術を利用した高く均一な効率が期待できます。インヒビターごとに LNATM 数やポジションを最適化し，Tm 値の均一化やセルフアニーリングの
回避を行っています。さらに，各インヒビターの効率を均一化したことでマルチプレックスアッセイが可能になりました。
新開発のデザインアルゴリズムでは，標的とする miRNA の GC コンテンツ如何に関わらず，全てのインヒビターにおいて一様に高効率が期待できるデザ
インが可能です。miRNA の GC コンテンツは 5％ ∼ 95% と非常に多様であるため，この点は特に重要なポイントとなります。他社で販売している従来
のアンチセンスインヒビター（2'-OMe）は，標的とする miRNA の GC コンテンツによって結合親和性が大きく左右され，AT リッチな miRNA に対して
ほとんど効果が得られなかったことからも注目すべき点といえます。インヒビターオリゴへの LNATM 導入技術の成果は図 1 ∼ 3 をご参照ください。
miRNA
プロファイリング
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Density
miRNA
機能解析
0.20
80
0.15
70
60
0.10
GC %
トランスフェク
ション試薬
50
0.05
図 3 AT リッチな（含有の高い）miRNA も含め，効率が均一化
された EXIQON 社の miRNA inhibior
40
30
0.00
‫ە‬LNA™ oligos
‫ە‬DNA oligos
046
Melting temperrature
20
‫ە‬LNA™ oligos
‫ە‬DNA oligos
RNA Tm
従 来 の miRNA イ ン ヒ ビ タ ー と 異 な り，miRCURY LNATM
microRNA Inhibitor は，Tm 値が均一化されています（左図）
。
右 図 に は，miRBase v.13 登 録 の 全 miRNA に 対 す る LNA
ま た は DNA イ ン ヒ ビ タ ー の Tm 値 を 示 し て い ま す。従 来 の
miRNA 全長を使用したインヒビターは GC コンテンツに大きく
影響され，各インヒビターの Tm 値には 40℃ 以上の開きがあり
ます。
一方，EXIQON 社のインヒビターでは，Tm 値の差が 10℃ 程度
に抑えられています。
miRNA インヒビター
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
miRNA
EXIQON 社デザイン済み強力 miRNA インヒビター
miRBase
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor は miRNA 活性を特異的に阻害します。miRNA ターゲットの同定や検証，細胞プロセスや病理経路における
miRNA 機能，遺伝子発現における miRNA 調節の研究などにご利用ください。LNATM を導入して Tm 値の均一化を行ったインヒビターのため（p. 46, 図 3），
マルチプレックス反応やスクリーニングにもご利用頂けます。
本製品は，従来のデザイン済み miRCURY LNATM Knockdown Probe の改良版です。新開発の洗練されたデザインアルゴリズムを用いて，効果と安定性
の両面から最適化を行っています。
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
■商品リスト
製品群
［メーカー：EXQ］
商品名
修飾
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
品番
ready to label
デザイン済
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
インヒビター
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
ご照会※
5'-fluorescein labeled
3'-fluorescein labeled
包装
希望販売価格
貯蔵
5nmol
￥73，
000
凍
○
5nmol
￥88，
000
凍
○
5nmol
￥88，
000
凍
○
※品番は EXIQON 社 web サイトより検索のうえ，ご注文ください。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
次世代
シークエンシング
通常のインヒビターと同デザイン + PS 骨格を使用。阻害効率と安定性が増進。
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor は，通常のインヒビター
と同様の新開発デザインアルゴリズムによるデザインに加え，安定性を考慮
し，ホスホロチオエート（PS）骨格を使用しています。酵素分解に高い耐性
を示すため，高い効率と長期安定性が期待できます。
特に，下記のような困難な条件下でのご利用をお奨めしています。
・トランスフェクション効率が低い：初代培養細胞，浮遊細胞
siRNA
・miRNA ターゲットが高発現
・トランスフェクション後，表現型が得られるまでに 72 時間以上要する場合
・一般的な miRNA インヒビターで効果が見られなかった場合
カスタム合成
サービス
■商品リスト
製品群
配列解析
サービス
［メーカー：EXQ］
商品名
修飾
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
デザイン済
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
インヒビター
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
品番
ready to label
ご照会※
5'-fluorescein labeled
3'-fluorescein labeled
包装
希望販売価格
貯蔵
5nmol
￥84，
000
凍
○
5nmol
￥99，
000
凍
○
5nmol
￥99，
000
凍
○
※品番は EXIQON 社 web サイトより検索のうえ，ご注文ください。
＊注意：筋肉や中枢神経系（CNS）由来の細胞や株化細胞に Power inhibitor を使用することはお勧めしていません。
これらの細胞型はホスホロチオエート修飾オリゴの配列依存性の毒性に対して特に感受性が高いことが知られています。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
Custom miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
si/shRNA
ライブラリー
miRBase 未登録，pre-miRNA 用などカタログ外製品も EXIQON 社でカスタムデザイン
miRBase 未登録の配列用など，miRNA インヒビターのカスタムデザインも承ります。阻害する miRNA の配列をご連絡ください。
関連試薬
■商品リスト
製品群
［メーカー：EXQ］
修飾
品番
包装
Custom miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
商品名
ready to label
199999-00
5nmol
希望販売価格
￥88，
000
貯蔵
凍
○
Custom miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
5'-fluorescein labeled
199999-04
5nmol
￥103，
000
凍
○
Custom miRCURY LNATM microRNA Inhibitor
カスタム
インヒビター Custom miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
3'-fluorescein labeled
199999-08
5nmol
￥103，
000
凍
○
ready to label
199998-00
5nmol
￥99，
000
凍
○
Custom miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
5'-fluorescein labeled
199998-04
5nmol
￥114，
000
凍
○
Custom miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor
3'-fluorescein labeled
199998-08
5nmol
￥114，
000
凍
○
※ 阻害したい miRNA 配列と生物種を [email protected] までご連絡ください。
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
商品検索方法
1.
www.exiqon.com/ls
へアクセス。
画面上部の Menu より
Products
→ microRNA Research
→ Functional Analysis
へとすすむ
2.
ここをクリック
3.
microRNA name もしくは
Sequence の欄に、阻害した
い microRNA ID または配列
を記入して「Find Product」
をクリック
4.
デザイン済プローブ
・3. で得られたカタログ＃
・microRNA ID
・生物種
カスタムプローブ
・カタログ＃
・阻害したい配列
・生物種
5.
4. の情報を
ご利用の代理店
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
にご連絡いただき、
ご注文ください。
047
miRNA インヒビター
miRNA
miRBase
さらに高い効果を期待できる Power Inhibitor
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor はホスホロチオエート（PS）骨格を持ち，より高い効果と安定性が期待できるようデザインされています。
図 4 に示した通り，Power inhibitor では通常の miRCURY インヒビターに比べ阻害効果が改善されています。図 5 には，Power Inhibitor の利用例
をご紹介しています。
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
RLU (Firefly / Renilla)
LNA
35
30
25
20
15
10
5
0
図 4 さ ら に 高 い 効 果 を 期 待
できる Power inhibitor
4
20
40
100
Final Oligonucleotide concentration (nM)
٨miRCURY LNATM microRNA
Inhibitor
٨miRCURY LNATM microRNA
Power Inhibitor
miR-16 を阻害する miRNA
インヒビターと miR-16 の標的
配列をもつレポータープラスミド
を，種々の濃度で HeLa 細胞に
共トランスフェクションした。
トランスフェクションから 48 時間後
に Dual Luciferase assay を
用いてレポーター活性を測定した。
Firefly/Renilla Luciferase 比は
Relative Light Units（RLU）
で示した。
図 5 miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor による阻害効果
miR-181a の Power Inhibitor をトランスフェクションした細胞（図 .B）は，正常な分化（図 .A）を示さなかった。
LHCN-M2 細胞を播種後，50nM の micoRNA インヒビターまたはコントロールをトランスフェクトした。導入
24 時間後に低血清培地に置換して分化を促進した。培養 7 日後にフォルマリン固定し，トリトンにより透過処理
した。細胞は後期分化マーカー（Myosin Heavy Chain(MHC)-Alexa488）および Hoechst 33258 を用いて
染色した。miR-181a の Power Inhibitor をトランスフェクトした細胞からは MHC（緑色）は観察されなかっ
た。また，図 .B より筋管（myotube）が形成されなかったことがわかる。miR-181a は MyoD 阻害に関与する
HoxA11 の下方制御に必要なことがわかっている。したがって，インヒビターによる miR-181a 阻害の結果，
MyoD 抑制が生じ，細胞分化が生じなかったことが示唆された。
優れた特異性
低毒性かつオフターゲット効果の回避
LNATM 導入により，配列が類似した miRNA ファミリーメンバー間の
識別が可能です。そのため，これらのインヒビターによる影響は，非特異的
結合による影響というより，標的 miRNA 阻害効果であると考えられます。
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor と Power Inhibitor は，何 れ も
高い阻害効果が期待できるため，低濃度で使用する際にも，予期しない二次
的効果を避けることが可能です。さらに，インヒビターオリゴに LNATM を
導入することで，インヒビター − LNATM/miRNA の 2 本鎖が RNase H
に認識されないという利点があります。その結果，mRNA に対するオフ
ターゲットも低減できると考えられます。
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
miRCURY LNATM microRNA Antisense control
miRCURY LNATM microRNA Antisense Control は，下記 2 点の特徴を持った in vitro miRNA 阻害実験用ネガティブコントロールインヒビターです。
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor および Power Inhibitor と同様の鎖長，配列および LNATM デザイン
human, mouse, rat の既知の miRNA や mRNA 配列と相同性をもたない
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor および miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor それぞれ 2 種類ずつ，計 4 種類のネガティブコント
ロールをご用意しています。 Power Inhibitor 用ネガティブコントロールには PS 骨格を使用しています。
全 miRNA インヒビターコントロールは，ready-to-label または 3'/5'-fluorescein（6-FAM）ラベル済みをご用意しています。コントロールは，
HPLC 精製・脱塩済みを乾燥状態で 5nmol ご提供致しますので，そのままトランスフェクションやエレクトロポレーションにご利用頂けます。
カスタム miRNA インヒビターコントロールのデザインは，お問い合わせください。
ネガティブコントロール A：従来の Scramble-miR コントロールタイプ
NCBI および miRBase 登録の何れの生物種における配列とも 70% 以上相同しません。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
ネガティブコントロール B：従来の Sense miR-159 コントロールタイプ
NCBI および miRBase 登録の human, mouse, rat 配列と 70% 以上相同しません。植物への利用は推奨していません。
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor 用ネガティブコントロールインヒビター
■商品リスト
製品群
修飾
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
miRCURY LNATM microRNA Antisense Control A
ready to label
199004-00
5nmol
￥73，
000
凍
○
miRCURY LNATM microRNA Antisense Control A
5'-fluorescein labeled
199004-04
5nmol
￥88，
000
凍
○
TM
コントロール miRCURY LNA microRNA Antisense Control A
インヒビター miRCURY LNATM microRNA Antisense Control B
3'-fluorescein labeled
199004-08
5nmol
￥88，
000
凍
○
ready to label
199005-00
5nmol
￥73，
000
凍
○
miRCURY LNATM microRNA Antisense Control B
5'-fluorescein labeled
199005-04
5nmol
￥88，
000
凍
○
miRCURY LNATM microRNA Antisense Control B
3'-fluorescein labeled
199005-08
5nmol
￥88，
000
凍
○
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
miRCURY LNATM microRNA Power Inhibitor 用ネガティブコントロールインヒビター
■商品リスト
製品群
048
［メーカー：EXQ］
商品名
［メーカー：EXQ］
商品名
修飾
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control A
ready to label
199020-00
5nmol
￥84，
000
凍
○
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control A
5'-fluorescein labeled
199020-04
5nmol
￥99，
000
凍
○
TM
コントロール miRCURY LNA microRNA Power Antisense Control A
インヒビター miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control B
3'-fluorescein labeled
199020-08
5nmol
￥99，
000
凍
○
ready to label
199021-00
5nmol
￥84，
000
凍
○
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control B
5'-fluorescein labeled
199021-04
5nmol
￥99，
000
凍
○
miRCURY LNATM microRNA Power Antisense Control B
3'-fluorescein labeled
199021-08
5nmol
￥99，
000
凍
○
miRNA インヒビター
インヒビター
miRNA
miRCURY LNA™ microRNA Family Inhibitor
miRBase
LNA
microRNA ファミリーメンバー全体に対する機能解析用 LNA™ インヒビター
抽出 / 精製
使用目的
図 1 microRNA family inhibitor デ ザ イ ン
例：miR-30 ファミリー
microRNA family inhibitor は、高度に関与し合ったり、共発現したり、
また重複した機能をもつ microRNA（miRNA）群の調節的役割を研究す
るためのツールです。各ファミリーメンバーに対して個別にインヒビターを
使用した場合では明らかにできなかった microRNA（miRNA）機能を探
求します。
miR-30 ファミリー内で共有され、かつ特異的
な配列（太字）を同定した。
こ の 例 で は、miR-30 Family Inhibitor（FI）と
し て miR-30 フ ァ ミ リ ー メ ン バ ー に 対 し て
高い特異性をもって結合可能な、高い融解温度
（Tm）をもった 1 種類の短鎖相補配列をデザイ
ンすることが可能である。
* M=A, C
* ファミリーメンバー間で塩基が異なるものは色
分けして示している。
特長
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
● microRNA（miRNA）ファミリーメンバー全体に対する機能解析が可能
● LNA™ を利用するため、各 microRNA（miRNA）の GC 含有量に関
わらず何れの microRNA（miRNA）ファミリーメンバーに対して同程
度の高い阻害効果が期待できる。
● 40 種類以上の microRNA（miRNA）ファミリーに対するデザイン済み
インヒビターをご提供
● 各ファミリーメンバーを阻害したのでは明らかにできなかった新規の
microRNA（miRNA）機能探索が可能
図 2 microRNA family inhibitor デ ザ イ ン
例：miR-200 ファミリー
miR-200 ファミリーメンバーを 1 種類のイ
ンヒビターで抑制することは不可能である。し
かし、3 種類のインヒビターを使用することで
5 つのメンバーの抑制が可能である。miR-200
Family Inhibitor（FI-2）は 5' 末端から 7 塩基
目を塩基混合によりオリゴ合成した場合の例を示
しており、2 種類の異なるオリゴが作製できる。
* M=A, C
* ファミリーメンバー間で塩基が異なるものは色
分けして示している。
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
商品詳細
a
miR-30 family inhibition - D10
anti-neg
配列解析
サービス
miR-30a and miR-30d overexpression - D4
anti-miR-30
pre-miR-neg
pre-miR-30a
カスタム合成
サービス
pre-miR-30d
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
D10
miR-30 family inhibition
b
D4
miR-30a/d overexpression
D10
miR-30 family inhibition
c
Relative expression
compared to control
40
30
20
10
PPAR
FABP4
D4
miR-30a overexpression
C/EBP
PPAR
2.0
ノックダウン検証
1.5
si/shRNA
ライブラリー
1.0
0.5
an ant
ti- i-n
m eg
iR
an ant 30
ti- i-n
m eg
iR
an ant 30
ti- i-n
m eg
an
iR
-3
t
0
pr i-m
e- iRan miR neg
ti- -3
pr m 0a
e- iRan miR neg
t
pr i-m 30a
e- iRm n
iR eg
-3
0a
-3
0a
-3
0d
eg
pr
e
-m
iR
iR
m
pr
e-
0
iR
-n
-3
m
pr
e-
iR
tim
an
図 3 miR-30 ファミリーは hMAD 細胞の脂肪細胞分化に対して正の制御を行う
（a）サブコンフルエントになった hMADS 細胞に anti-miR コントロール（anti-neg）
、anti-miR-30、premiR コントロール（pre-miR-neg）
、pre-miR-30a、または pre-miR-30d をトランスフェクションし、３
日後に脂肪細胞分化誘導を行った。 図示したタイムポイント（D4 または D10）において顕微鏡写真撮
影（上図）およびオイルレッド O とクリスタルバイオレットの対比染色（下図）を行い、分化の状態を評
価した。
（b）GDPH 酵素活性による脂肪生成評価。24-well plate を用いて 3 ウェルずつ培養した際の平均値を示し
た。エラーバーは平均値±標準誤差を示す（N=3）
。*P < 0.05.
（c）qPCR による脂肪生成誘導遺伝子である CEBPb, PPARg および FABP4 発現確認。各遺伝子のコント
ロール細胞（anti-miR-neg または pre-miRneg）における発現レベルを１とした。
※ Zaragosi et al. Genome Biology 2011, 12:R64. Reprinted with permission from BioMed Central.
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
商品名
デザイン済 miRCURY LNA™ microRNA Family Inhibitors
デザイン済 miRCURY LNA™ microRNA Power Family Inhibitors
si/shRNA 発現
FABP4
0
0
ne
g
GPDH activity
(nmol/min/mg protein)
C/EBP
an
ti-
本製品は、miRNA ファミリーメンバー個々を対象用というよりも、全
ファミリーメンバーを抑制するために特異的にデザインされたインヒビ
ターです。種々の検討を重ね、標的 miRNA に対する特異性を保持しつつ、
全ファミリーメンバーのノックダウンが可能な特殊なインヒビターを開発
しました。EXIQON 社では、本製品の開発にあたり、下記のことを実施し
ています。
● 配列最適化：全 miRNA ファミリーメンバー共通で使用するために必
要最低限な鎖長、かつファミリーを決定するに足る最長配列を決定。
● 混合塩基合成：標的配列同士がわずか１塩基のみ異なる場合、アンチセ
ンスオリゴ合成時、そのポジションには 2 種類の塩基を混合して使用。
これにより 1 回のオリゴ合成で 2 種類のオリゴ合成が可能。
● インヒビターの混合：1 種類のインヒビターでは全 miRNA ファミ
リーメンバーを標的できない場合、複数種類のインヒビターを混合して
使用。
● LNA™ 最適化：ファミリーインヒビターは短鎖（10-16mers）であ
るが、LNA™ 含有量を調節することで個々の miRNA を対象とした
EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA inhibitor と同等の親和性
（Tm）を維持。
現在、マウスでも保存された 40 種類以上のヒト miRNA ファミリーに
対するインヒビターをご提供しています。上述のデザイン基準を満足した
miRNA ファミリーに対してのみ Family inhibitor をご提供しており、
個々の miRNA ファミリーメンバーに対するインヒビターを単純に混合し
て用いる場合に比べて優れています。miRNA ファミリーとは、標的認識に
重要なシード配列（塩基 2-8 位）を共有する非常に関与の深い miRNA
群と定義しています。ただし、miR-200 ファミリーなど例外もいくつかあ
ります。現在ご提供可能な miRCURY LNA™ microRNA Family Inhibito
ｒはコスモ・バイオ WEB ページのリストからご確認ください。
通常の microRNA family inhibitor とホスホロチオエート骨格により安
定性と作用効力を高めた Power family inhibitor の 2 種類をご提供して
います。
品番
※ EXIQON 社 WEB サイトより
品番を検索のうえ、ご注文ください。
包装
装飾
希望販売価格
貯蔵
5nmol
ready to label
¥97，
000
凍
○
5nmol
ready to label
¥110，
000
凍
○
＊注意：筋肉や中枢神経系（CNS）由来の細胞や株化細胞に Power inhibitor を使用することはお勧めしていません。これらの細胞型はホスホロチオエート修飾オリゴの配列依存性の毒性に対して特に感受性が高いことが
知られています。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
049
miRNA インヒビター
miRNA
インヒビター
in vivo LNATM microRNA Inhibitor
miRBase
LNA
低毒性かつ効果的な in vivo microRNA ノックダウン実験を実現 !!
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
使用目的
LNATM オリゴは通常の DNA や RNA オリゴとは異なり，ターゲット
miRNA に対してより高い親和性を持ちます。そのため，in vivo ノックダ
ウン実験に最適な“短鎖かつ配列特異的なオリゴ”のデザインが可能です
（EXIQON 社では生体拒否反応を最小限に抑えるため 15 ∼ 16 塩基で
デザイン）。また，LNATM 技術の利用により高い親和性をもつため，生理的
温度や低濃度であっても高い効果を示します。ノックダウン効果以外に生ず
るかもしれない，期待しない 2 次的作用を最小限に抑えており，血清やヌ
クレアーゼに対して安定です。
わずか 10mg/kg-bodyweight（ED50）の投与で miRNA の効果的
なノックダウンが確認できています。
商品形態：EXIQON 社にてデザインを行ない，15-16 塩基の S 化（ホス
ホロチオエート）LNA オリゴを合成。蛍光，コレステロール修
飾も可能。
合成収量：5 ∼ 300mg
品質保証：凍結乾燥，HPLC および ESI-MS にて品質確認：純度 85 % 以上
3' cholesterol 修飾：純度 70% 以上（Analytical reversed
phase HPLC）
※最終提供量が，ご発注量の +/- 10％ 程度となる場合もござ
います。ご了承ください。
納 期：約 8 ∼ 9 週間
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
●in vivo での miRNA ノックダウンに最適化
●高い安定性：血清中で安定かつヌクレアーゼに耐性
●低毒性
< 参照文献 >
1. Elmen et al . Nature 2008
2. Lanford et al . Science 2009
3. Hollander et al . Nature 2010
●S 化オリゴを利用
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
●価格表に記載のない容量，蛍光またはコレステロール修飾も承ります
■商品リスト
［メーカー：EXQ］
商品名
品番
包装
希望販売価格
保存温度
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 5mg yield
199900
5MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 10mg yield
199900
10MG
ご照会
凍
○
デザイン済み
siRNA
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 20mg yield
199900
20MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 25mg yield
199900
25MG
ご照会
凍
○
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 40mg yield
199900
40MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 50mg yield
199900
50MG
ご照会
凍
○
shRNA クローン
コレクション
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 100mg yield
199900
100MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 150mg yield
199900
150MG
ご照会
凍
○
si/shRNA 発現
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (ready-to-label), 300mg yield
199900
300MG
ご照会
凍
○
コントロール
siRNA
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
050
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 5mg yield
199900_FAM
5MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 10mg yield
199900_FAM
10MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 20mg yield
199900_FAM
20MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 25mg yield
199900_FAM
25MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 30mg yield
199900_FAM
30MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 40mg yield
199900_FAM
40MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 50mg yield
199900_FAM
50MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 100mg yield
199900_FAM
100MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 150mg yield
199900_FAM
150MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM), 300mg yield
199900_FAM
300MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 5mg yield
199900_CHOL
5MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 10mg yield
199900_CHOL
10MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 20mg yield
199900_CHOL
20MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 25mg yield
199900_CHOL
25MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 30mg yield
199900_CHOL
30MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 40mg yield
199900_CHOL
40MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 50mg yield
199900_CHOL
50MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 100mg yield
199900_CHOL
100MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 150mg yield
199900_CHOL
150MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (3'-Chol), 300mg yield
199900_CHOL
300MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 5mg yield
199900_FC
5MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 10mg yield
199900_FC
10MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 20mg yield
199900_FC
20MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 25mg yield
199900_FC
25MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 30mg yield
199900_FC
30MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 40mg yield
199900_FC
40MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 50mg yield
199900_FC
50MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 100mg yield
199900_FC
100MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 150mg yield
199900_FC
150MG
ご照会
凍
○
Custom miRCURY™ LNA Inhibitor probe, in-vivo (5'-FAM + 3'-Chol), 300mg yield
199900_FC
300MG
ご照会
凍
○
miRNA インヒビター
インヒビター
miRNA
miRCURY LNA™ microRNA Inhibitor Library
miRBase
LNA
miRNA の網羅的な機能解析のための LNA™ インヒビターコレクション ( in vitro 用 )
使用目的
抽出 / 精製
特長
TM
本 製 品 は，miRNA 機 能 解 析 ス ク リ ー ニ ン グ 用 の LNA microRNA
Inhibitor Library です。
最新版の miRBase 登録の Human および Mouse の miRNA カバー
率は，業界最多です。ライブラリーに使用している各インヒビタープローブ
は，鎖長，配列，LNATM 修飾の位置など種々の要因を考慮してデザインし
ています。
プローブの Tm 値が至適温度近郊で正規化され，かつセルフアニーリン
グを最小限に抑えているためハイスループットスクリーニングに最適です。
miRBase v.16.0 登 録 の Human，Mouse の mature miRNA を カ
バーしています (2012 年 6 月現在 )。
● miRBase ver.16.0 を カ バ ー す る Human お よ び Mouse の
microRNA Inhibitor ライブラリー
Human：954 種（78%），Mouse：739 種 (70%)
● 低濃度で高効率の microRNA 機能阻害
● ライブラリー中のすべての Inhibitor プローブを同条件でトランスフェク
ション可能
● 標的とする miRNA の GC コンテンツに関わらず，miRNA 機能阻害
用に Tm 値を正規化済み
● ハイスループットスクリーニングに最適な 96 ウェルプレートフォー
マット
商品詳細
構成内容
本製品は，LNATM 技術の活用により標的 miRNA に対する結合親和性
が，その他の核酸技術と比べ飛躍的に高く，さらに酵素耐性が高いため，安
定性が高いことが特徴です。さらに，EXIQON 社がインヒビターオリゴ上
の LNATM 数とその位置を最適化したデザインを行うことで，より一層
miRNA 阻害効果が高められています。低濃度でも高い miRNA 阻害効果
が得られるため，予期しない二次的効果を最小限に抑えることが可能で，さ
らに毒性のリスクを低減させるため，本製品は HPLC 精製，脱塩した状態
で凍結乾燥し，96 ウェルプレートに分注して提供されます。
miRCURY LNATM microRNA inhibitor は，そ の 標 的 miRNA に 対 す
る特異性が非常に高いことに加え，inhibitor-LNATM ／ miRNA の 2 本
鎖が RNase H に認識されない，という利点があります。この特異性の高
さにより，オフターゲット効果を低減し，インヒビターのアンチセンス活性
以外に起因するその他の表現型の変化などを最小限に抑えることができる
と考えられます。
大規模のスクリーニング実験を行う際に最も大きな問題となるのは，
900 以上もの microRNA Inhibitor に対して，それぞれトランスフェク
ション条件を最適化することです。EXIQON 社では，LNATM コンテンツ
やインヒビターオリゴの長さを調節することで，ライブラリー全てのインヒ
ビター活性を最大限均一にするデザインを行っており，セルフアニーリング
を低減した Tm 値均一化済みインヒビターをご提供しています。そのた
め，ライブラリー全てのインヒビターはどれも同一条件でトランスフェク
ションすることができ，各インヒビターが標的 miRNA に対して均一な阻
害効率で作用すると考えられます。一方，2’
-O-Me 修飾 RNA（DNA）の
ような従来のインヒビターの活性（阻害効率）は，標的 miRNA の GC コ
ンテンツに大きく影響されます。
高度なデザインアルゴリズムを用いて LNATM microRNA Inhibitor を
デザインすることで，オリゴのセルフアニーリングを最小限に抑えることが
できます。さらに，LNATM は標的 miRNA への結合親和性が非常に高いた
め，インヒビターの阻害効果を損なわずにオリゴをより短く設計することが
可能です。2’
-O-Me 修飾 RNA（DNA）のような従来技術の miRNA イ
ンヒビターでは，鎖長を短くするとオリゴの Tm 値を維持することが困難
なため miRNA の全長配列を標的としたアンチセンスインヒビターを設計
しています。多くの miRNA は自己相補的な末端配列をもつため，このよ
うな miRNA の全長配列を標的としたアンチセンスインヒビターを使用し
た場合，インヒビター自体もセルフアニーリングする可能性が高くなりま
す。そのため miRNA の機能阻害実験ではインヒビターオリゴを短く設計
することが重要となります。
miRCURY LNATM microRNA inhibitor は非常に安定性が高く，他社の
追随を許さない特異性と長期間の高い阻害効果をご提供します。
miRCURY LNATM microRNA Inhibitor Librariey は，下 記 の 3 種 類
の製品があります。各ライブラリーは HPLC 精製，脱塩，凍結した LNA
インヒビターを 0.25nmol ずつ，96 ウェルプレートに分注しています。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
● miRCURY LNA microRNA Inhibitor Library-Human miRBase
v.16.0 に登録にされている 954 種類のヒト mature microRNA と
miRBase 未登録の 40 種類の miRPlusTM（EXIQON 社独自の配列）
をカバーする，ヒト microRNA 研究用
siRNA
● miRCURY LNA microRNA Inhibitor Library-Mouse miRBase
v.16.0 にされている 739 種類のマウス mature microRNA をカ
バーする，マウス microRNA 研究用
カスタム合成
サービス
● miRCURY LNA microRNA Inhibitor Library-Human and Mouse
miRBase v.16.0 に登録されているヒト（954 種類）とマウス（739
種類）の 2 つがセットになったライブラリー。miRNA は種間で配列
保存性が高く，インヒビター配列についてもヒトとマウスとで共通デザ
インとなるものが多くあります。本製品では，これらの共通のインヒビ
ターを重複せず，まとめて提供しますので，ヒトのみのライブラリー，マ
ウスのみのライブラリー，としてそれぞれご使用頂けます。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
50
40
関連試薬
30
トランスフェク
ション試薬
20
その他
1nM
10
5nM
20nM
TM
技術情報
LN
A
-O
M
e
tB
miRNA
プロファイリング
m
iR
CU
Pr
RY
2’
od
uc
A
0
Pr
od
uc
t
Fold upregulation of microRNA reporter gene expression
ヒトまたはマウスのライブラリーを先にご利用頂き，後で一方を追加購入
する場合に，重複しないインヒビターのみを購入することもできますのでお
問い合わせください。各ライブラリーの配置図はコスモ・バイオの WEB
ページよりダウンロードできます。
配列解析
サービス
図 1 他社製品および競合テクノロジーに比べて高い阻害効果
MCF7 細胞に各社（各テクノロジー）の hsa-miR-21 インヒビターを 1,5,20nM の濃度でトランスフェ
クションし，60 時間後に遺伝子発現レベルを測定した。
miR-21 標的配列をもつ pMIR-21 レポータープラスミドの発現は，インヒビターなしのコントロールと
比較して，アップレギュレートされている。
EXIQON 社の LNA™ インヒビタープローブをトランスフェクションした細胞では，他社のインヒビター
DNA (Product A and B) および競合テクノロジー（2’
-O-Me オリゴ）よりも格段に miR-21 抑制効果
が高いことが確認された。
■商品リスト
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
［メーカー：EXQ］
商品名
品番
包装
希望販売価格
miRCURY LNA microRNA Inhibitor Library-Human (0.25 nmol)
190102-2
1 EACH
ご照会
保存温度
凍
○
miRCURY LNA microRNA Inhibitor Library-Mouse (0.25 nmol)
190202-00
1 EACH
ご照会
凍
○
miRCURY LNA microRNA Inhibitor Library-Human and Mouse (0.25 nmol)
190302-00
1 EACH
ご照会
凍
○
051
miRNA インヒビター
miRNA
インヒビター
miRBase
LNA
miArrestTM miRNA ベクターベースインヒビター＆
化学合成インヒビター
miRNA を確実にノックダウンします！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
ジーンコピア社では，miRNA 機能解析や検出ツールの包括的なコレクションに miArrestTM miRNA インヒビターを加えています。
miRBase にあるヒト，マウス，ラット miRNA がすべてご利用いただけます。
ベクターベース miRNA インヒビター発現クローン
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
レンチウイルスまたは非ウイルス性のベクターバックボーンをご用意しています。
miRNA インヒビタークローンは，ターゲット miRNA に特異的に結合し，ターゲット遺伝子の安定的な抑制，一過性の抑制にお使いいただけます。
プロモーター（H1 あるいは U6）をお選びいただけ，事実上全てのタイプの哺乳類細胞でインヒビターを構成的に発現できます。
2 種類のベクターベースバックボーン
―実験にあわせてお好みのベクターをお選びください―
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
■ HIV ベースレンチウイルス miRNA インヒビター発現ベクター
■ 非ウイルス性 miRNA インヒビター発現ベクター
特長
miRNA インヒビターベクターの特長
●多 用 途：レンチウイルスと非ウイルス性の哺乳類発現ベクターバック
ボーンの両方をご用意
ベクター
●便 利：非分裂細胞やトランスフェクションが難しい細胞にも簡単に
デリバリー
pEZX-AM01
mCherry
Puromycin
H1
Mammalian
pEZX-AM02
mCherry
Puromycin
U6
Mammalian
：レポーター蛍光タンパク質により，導入または感染細胞を簡
単にスクリーニング
レポーター
遺伝子
miRNA インヒビターコンストラクトは，細胞にトランスフェクション後，
ターゲット miRNA に特異的に結合します。翻訳後プロセッシングにより，
目的とする miRNA の 2 分子に結合し，引き込まれて取り込み構造を形成
します。このことがひいては，ターゲット mRNA への内因性 miRNA の
結合を妨げます。従って，ターゲット遺伝子上の miRNA の効果を抑制し，
ターゲット遺伝子発現を促進します（図 1）
。
タイプ
pEZX-AM03
mCherry
Hygromycin
H1
HIV
mCherry
Hygromycin
U6
HIV
抑制
特異性
ベクターベースの
インヒビター
+++++
+++++
合成 2'-OMe
インヒビター
++
+++
その他合成
インヒビター
++
+++
安定性
持続性
+++++
長期
+
一過性
+++
一過性
−
−
+
+++++
−
−
細胞毒性
休止中の細胞や導入困難
な細胞へのデリバリー
作用機序
プロモーター
pEZX-AM04
●パワフル：化学合成 miRNA インヒビターの他のタイプと比較して，細
胞毒性がかなり低く，抑制が長続きし，より優れた効能を発揮
（表 1）
●高 品 質：miRNA インヒビターの発現カセットは，独自のアルゴリズムを
用いてデザインされており，注意深くデザインした実験によっ
て厳密にテスト済
セレクション
マーカー
表 1 ベクターベースのインヒビターと合成 miRNA インヒビターの比較
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
図 1 ベクターベース miRNA
インヒビターの作用機序
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
052
図 2 miArrestTM miRNA インヒビターの用量依存的効果を示すデータ
miR-125a インヒビター発現プラスミド（品番：HmiR-AN0094-AM01）を下記プラスミドと一緒に HEK293
細胞にトランスフェクション。
1) miR-125a precursor expression plasmid（品番：HmiR0309-MR03)
2) miR-125a に対するターゲット遺伝子である LIN28 を発現する miRNA ターゲット配列発現クローン
（品番：HmiT019205-MT02，LIN28 の 3'-UTR 配列がインサートされている gaussia ルシフェラーゼ - ア
ルカリフォスファターゼデュアルレポーター発現ベクター）
トランスフェクションしてから 24 時間後，GLuc 活性と内部コントロール AP 活性を測定。AP 活性に対する
GLuc 活性の比を，LIN28 3'-UTR ターゲット配列発現クローンを用いたシングルトランスフェクションサンプルに対
して 1 とし（データ左端），他のサンプルを正規化。
この結果は，mir-125a が Gluc-LIN28 3'-UTR クローンからルシフェラーゼ活性を 70% 以上抑制したことを示
す（データ左から 2 番目）。
この抑制効果は，miR-125a に対して miArrestTM インヒビタークローンの異なる量の導入によって用量依存的にブ
ロックされた。最高用量では，レポーター GLuc 活性はコントロールより高い（データ右端）。これは，ベクターベースの
インヒビターが，GLuc-LIN28 3'-UTR 転写物の転写活性の増加をもたらす内因性の miR-125a の調節効果をブロッ
クした可能性があると考えられる。
miRNA インヒビター
化学合成 miRNA インヒビター
miRNA
合成 miRNA インヒビターは，配列特異的な一本鎖核酸分子で，特定の miRNA 分子に結合するように最適化＆デザインされています。
結合後，高い特異性と効率をもってターゲット遺伝子上の miRNA 分子の効果をブロックします。一過性のトランスフェクションに理想的です。
miRBase
LNA
特長
●既知のヒト，マウス，ラット miRNA に利用可能
ベクターベース＆化学合成 miRNA インヒビターの
アプリケーション：
抽出 / 精製
プロファイリング
●化学的に改良し，効率と寿命を改善
●明らかになっていない miRNA 機能や機能喪失効果の研究
●トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによる
●miRNA ターゲットの検証と同定
定量
簡単デリバリー
●多能性幹細胞の構成や細胞分化をはじめとする病理学的なパスウェイ
や細胞の過程における miRNA の役割を解明
検出
●診断や治療上のバイオマーカーやターゲットの検証と同定
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
図 3 miArrestTM miRNA 合成インヒビター用量依存的の効果を示すデータ
化学合成 miR-125a インヒビターの様々な量を下記プラスミドを HEK293 細胞にコトランスフェク
ションした。
1) miR-125a precursor 発現プラスミド（品番：HmiR0309-MR03
2) miR-125a に対する既知ターゲット遺伝子である LIN28 を発現する miRNA ターゲット配列発
現クローン（品番：HmiT019205-MT01，LIN28 の 3' -UTR 配列が FLuc-RLuc デュアルレ
ポーター発現ベクターにインサート）
トランスフェクションしてから 24 時間後に，ホタルルシフェラーゼ活性と内部ウミシイタケルシフェラーゼ
活性を測定。LIN28 3'-UTR ターゲット配列発現クローンでのシングルトランスフェクションサンプル用に，
RLuc に対する FluC の活性比を 1 とし（データ左端）
，他のサンプル活性を正規化。結果は，mir-125a は，
Fluc-LIN28 3'-UTR クローンからのルシフェラーゼ活性を 60% 以上抑制した（データ左から 2 番
目）。様々な量の miArrestTM インヒビタークローンの導入によって用量依存的に miR-125 を抑制した。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
［メーカー：GCP］
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
■商品検索の手順
shRNA クローン
コレクション
ジーンコピア社ホームページ上の miRNA 紹介ページ（http://www.genecopoeia.com/
product/mirna/）を開きます。
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
Search Clones
のアイコンをクリックし，検索ページを開きます。
【キーワード検索】
①ご希望の分野を選択します。
②precursor miRNA 名，mature miRNA 名，precursor miRNA Accession，mature
miRNA Accession，カタログ / 製品 ID，precursor 配列，mature 配列等のキーワード
で検索できます。
Search ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
右の 希望販売価格はご照会ください。
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
053
miRNA インヒビター
miRNA
インヒビター
miR-locker miRNA インヒビター
miRBase
LNA
レンチウイルスベクタータイプの miRNA インヒビター発現プラスミド
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
使用目的
内因性遺伝子の発現を抑制する miRNA の機能を，細胞内のプラスミド
やウイルスを用いて発現させた人工的な miRNA 結合部位により効果的に
抑制できることが報告されています。
Biosettia 社 の miRNA 阻 害 剤，miR-Locker は，タ ー ゲ ッ ト miRNA
のバルジを挟んだ 5’および 3’末端と完全に相補的な一本鎖ヌクレオチド
計 2 コピーをレンチウイルス発現システムにより発現することで，効果的
かつ安定的に相補鎖を過剰発現し，長時間の miRNA 抑制を実現します。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
● レンチウイルス発現システムを用いることで，長時間 miRNA を抑制し
ます。
● 多数のヒトおよびマウス miRNA に対する製品を提供しています。
● 1 mL 大腸菌グリセロールストックの状態での供給です。
図 1 pLV-miR-Locker レンチウイルスベクター
A
使用例
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
1. レポーターアッセイによる評価
pLacZ-miR-Locker プラスミドと，相当する pLV-miRNA 発現クロー
ン（品番 mir-p###）を 293T 細胞に共導入し，続いてβ - ガラクトシ
ダーゼレポーターアッセイを行いました。図 2 で示すのは，hsa-mir-1,
7, 9, 17, 30a, 30c, 125b, 146a, let-7a に 対 し て miR-Locker を
用いた際のレポーターアッセイの結果です。miR-Locker を共導入した
こ と に よ り β - ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ 活 性 の 低 下 が み ら れ る の は，pLVmiRNA 発現ベクターが発現した成熟 miRNA が，LacZ 遺伝子の 3’
非翻訳領域にある miR-Locker 配列に結合し，β - ガラクトシダーゼの
翻訳を阻害した結果によります。lacZ レポーターアッセイの結果は，
miR-Locker が miRNA の偽標的として作用することで，miRNA によ
る内因性遺伝子の翻訳阻害を抑制していることを示しています（図 2）
。
miR-Locker LacZ Reporter Assay
2, TaqMan 法による評価
miR-Locker レンチウイルスを作成し，内因性 mir-17, 20a, 30a-5p,
30b, 30c 成熟 miRNA を標的として BJ ヒト包皮線維芽細胞に形質
導入しました。miRNA 阻害の効果は，Taqman 法を用いて評価しまし
た（図 3）
。その結果，先にレポーターアッセイによって示された結果と
同様，miRNA の翻訳阻害作用を抑制することが確認できました（図 3）
。
［メーカー：BOT］
関連試薬
■商品検索の手順
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
B
Biosettia 社 ホ ー ム ペ ー ジ 上 の miRNA Inhibition 紹 介 ペ ー ジ
(http://biosettia.com/mirna/vector-inhibition/product-pricelist) 上で，ターゲット miRNA に対するインヒビター (miR-Locker
plasmid) をお選びください。
各 pLV-miRNA locker plasmid DNA 製 品 は，1 ml 大 腸 菌 グ リ セ
ロールストックで供給されます。
希望販売価格はご照会ください。
% of remaining β-galactosidase activity
siRNA
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
mr-locker
locker ctrl
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
mir-9
33%
100%
mir-17
42%
100%
mir-20a
73%
100%
mir-30a-5p mir-30c
55%
41%
100%
100%
mir-125b mir-146a
60%
38%
100%
100%
let-7a
50%
100%
図 2 レポーターアッセイによる miR-Locker の有効性の実証。
（B）遺伝子導入 24 時間後のβ - ガラクトシダーゼ活性。共導入した miR-Locker によるβ - ガラクトシ
ダーゼ活性の低下は，LacZ 遺伝子の 3’
非翻訳領域にクローニングした miR-Locker 配列が，pLVmiRNA ベクターが発現した成熟 miRNA と結合したことを示す。
120%
100%
% of remaining endogenous miRNA
プール型 shRNA
ライブラリー
mir-7
31%
100%
（A）pLacZ-miR-Locker プラスミドと相当する pLV-miRNA 発現ベクターを 293T 細胞に物質量比
1 ∼ 10 で共導入。
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
mir-1
28%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
80%
60%
43%
40%
28%
21%
20%
23%
mr-locker
locker ctrl
11%
0%
miR-17
miR-20a
miR-30a-5p
miR-30b
miR-30c
図 3 レンチウイルスにより BJ 細胞に形質導入した miR-Locker の Taqman 法による効果測定
054
miRNA 過剰発現 ( オリゴ )
miRNA
miCENTURY OX miNatural / siMature
過剰発現（オリゴ）
miRBase
LNA
miRNA を過剰発現するための合成 miRNA
使用目的
抽出 / 精製
特長
miNatural と siMature は，miRNA を過剰発現し機能解析をするため
の 合 成 miRNA で す。Sanger miRBase（ver 18）に 登 録 の mature
miRNA に対応しています。miNatural は，pre-miRNA が Dicer に切断
された後の状態を想定しており，mature miRNA とその相補鎖との間に
ミスマッチを保持した，より自然に近い状態を再現しています。siMature
は，mature miRNA をもとに相補鎖と 100% マッチの 2 本鎖を合成
しています。
●Sanger miRBase（ver 18）に登録の mature miRNA に対応した
合成 2 本鎖 RNA
●miNatural：相補鎖との間にミスマッチを保ったより自然に近い状態
を再現
●miRBase に登録されている全生物種に対応（10nmol：29,800 円）
●Human，Mouse は格安で小容量を販売（5nmol：20,000 円）
■商品リスト
［メーカー：MIR］
miCENTURY OX miNatural
miCENTURY OX siMature
定量
検出
●siMature：相補鎖と 100% マッチした 2 本鎖合成 RNA
●各種デザイン済みのコントロールもございます
商品名
プロファイリング
種
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
miRBase 登録全種
ご照会
10nmol
¥29，
800
凍
○
ヒト・マウスのみ
ご照会
5nmol
¥20，
000
凍
○
miRBase 登録全種
ご照会
10nmol
¥29，
800
凍
○
ヒト・マウスのみ
ご照会
5nmol
¥20，
000
凍
○
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
※ 脱塩・脱保護・アニーリング済・純度 80% 以上
siRNA
■商品検索の手順
配列解析
サービス
①コスモ・バイオホームページ上の右上の ｢試
薬検索｣ をクリック。
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
②「品名」
に mature microRNA ID を，
「メーカー
略号」に MIR を入力し，｢検索｣ をクリック。
③該当品目が表示されます。
※品名に含まれる mature microRNA ID，および
容量をご確認ください。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
デザイン済みコントロール製品
si/shRNA
ライブラリー
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
コントロール，ac/eGFP
品番
¥5，
000
凍
○
S5CM-0301
5 nmol
¥15，
000
凍
○
10 nmol
¥25，
000
凍
○
1 nmol
¥5，
000
凍
○
5 nmol
¥15，
000
凍
○
10 nmol
¥25，
000
凍
○
S5CM-0300
S10CM-0300
S1CM-0100
1 nmol
¥5，
000
凍
○
S5CM-0100
5 nmol
¥15，
000
凍
○
10 nmol
¥25，
000
凍
○
1 nmol
¥6，
000
凍
○
凍
○
S10CM-0100
S1CM-0102
コントロール，Luciferase（GL2）-Fluorescein
S5CM-0102
S10CM-0102
S1CM-0200
コントロール，Luciferase（GL3）
S5CM-0200
S10CM-0200
コントロール，Luciferase（GL3）-Fluorescein
¥28，
000
凍
○
1 nmol
¥5，
000
凍
○
5 nmol
¥15，
000
凍
○
10 nmol
¥25，
000
凍
○
1 nmol
¥6，
000
凍
○
5 nmol
¥17，
000
凍
○
10 nmol
¥28，
000
凍
○
S1CM-0600
1 nmol
¥5，
000
凍
○
S5CM-0600
5 nmol
¥15，
000
凍
○
10 nmol
¥25，
000
凍
○
1 nmol
¥5，
000
凍
○
凍
○
S1CM-0400
S5CM-0400
S10CM-0400
S1CM-0410
コントロール，Lamin（Mouse/Rat/Human）
¥17，
000
S5CM-0202
S10CM-0600
コントロール，Lamin A/C（Human）
5 nmol
10 nmol
S1CM-0202
S10CM-0202
コントロール，Non-target RNA
貯蔵
1 nmol
S1CM-0300
コントロール，Luciferase（GL2）
希望販売価格
S1CM-0301
S10CM-0301
コントロール，eGFP
包装
S5CM-0410
S10CM-0410
5 nmol
¥15，
000
10 nmol
¥25，
000
凍
○
1 nmol
¥5，
000
凍
○
5 nmol
¥15，
000
凍
○
10 nmol
¥25，
000
凍
○
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
※オーバーハングは「UU」となります。
※ 脱塩・脱保護・アニーリング済・純度 80% 以上
055
miRNA 過剰発現 ( オリゴ )
miRNA
過剰発現（オリゴ）
合成 mature microRNA ゲノムワイドライブラリー
miRBase
LNA
Sanger miRBase ver 18 に準じた合成 mature miRNA コレクション
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
使用目的
Human
miRNA は，現在世界中で研究対象・研究ツールとして注目を浴びています。そこで，
miRNA 研究のサポートツール「合成 miRNA・ゲノムワイドコレクション（過剰発現系）」
を発売致しました。コレクションでは miRBase の全 mature 配列に対応した合成済
miRNA を揃え，セット販売でも個別でもご希望に応じてご提供致します。実験にあわせて
お選びください。
合成 mature miRNA ゲノムワイドライブラリーは，miRNA の機能解析スクリーニング
を過剰発現実験系で行うための研究ツールです。miRBase ver.18 に登録されている
Human および Mouse の全 mature 配列に対応した合成済 miRNA コレクションです。
各配列は miNatural (p.55 をご参照ください）と同様に脱塩・脱保護・アニーリング済・
凍結乾燥品で純度は 80% 以上となります。各 1nmol ずつをマイクロチューブに分注し
てお届けいたします。
H
Mouse
M
2012ᖺ6᭶⌧ᅾࠉ
miRBase ver 18࡟ᑐᛂ
2109✀ࡢྜᡂmicroRNA
2012ᖺ6᭶⌧ᅾࠉ
miRBase ver 18࡟ᑐᛂ
1284✀ࡢྜᡂmicroRNA
＊ miRBase の最新バージョンに対応した商品に関してはお問い合わせください。
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
●miRBase ver.18（ヒト・マウス）の全 Mature 配列に対応した合成 microRNA
●最新の miRBase にあわせた追加アップグレードも作成できます
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
種
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Synthetic microRNA Library
Human
MILH0018.0
1 SET
ご照会
凍
○
Synthetic microRNA Library
Mouse
MILM0018.0
1 SET
ご照会
凍
○
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
カスタム 1 本鎖 RNA 合成サービス
使用目的
miRNA の mature，Precursor に対応する RNA オリゴをご自身でデザインし，合成できます。
2'-Omethyl オリゴ修飾も承ります。お問合せください。標準ではバッファーが含まれています。
バッファーなしをご希望の場合は，ご注文時にお申し付けください。いずれの場合も乾燥の状態でお届けします。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
■商品リスト
商品名
その他
カスタム１本鎖
RNA 合成サービス
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
056
※ 収量保証はございません。
［メーカー：MIR］
精製度
鎖長
品番
包装
精製品 （純度 95％以上）
51 - 60 塩基 1 本鎖 RNA
SS51-60-1.4P
1.4 nmol
精製品 （純度 95％以上）
61 - 70 塩基 1 本鎖 RNA
SS61-70-1.4P
約 1.4 nmol
精製品 （純度 95％以上）
71 - 75 塩基 1 本鎖 RNA
SS71-75-1.4P
約 1.4 nmol
未精製品（純度 80％以上）
21 塩基 1 本鎖 RNA
SS21-25
未精製品（純度 80％以上）
22 塩基 1 本鎖 RNA
未精製品（純度 80％以上）
23 塩基 1 本鎖 RNA
精製品 （純度 95％以上）
希望販売価格
貯蔵
¥69，
800
凍
○
※
¥79，
800
凍
○
※
¥89，
800
凍
○
25 nmol
¥21，
000
凍
○
SS22-25
25 nmol
¥22，
000
凍
○
SS23-25
25 nmol
¥23，
000
凍
○
21 塩基 1 本鎖 RNA
SS21-25P
25 nmol
¥34，
000
凍
○
精製品 （純度 95％以上）
22 塩基 1 本鎖 RNA
SS22-25P
25 nmol
¥35，
700
凍
○
精製品 （純度 95％以上）
23 塩基 1 本鎖 RNA
SS23-25P
25 nmol
¥37，
300
凍
○
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
過剰発現（ベクター）
miRNA
miRNA 発現プラスミド
miRBase
LNA
簡単にターゲット miRNA の発現研究が行えます！
抽出 / 精製
オリジンテクノロジーズ社では，ターゲット miRNA の過剰発現用
クローンを販売しています。
各 miRNA を網羅する 600bp までの領域を CMV プロモーター下流域に
クローン化しており，miRNA クローンインサートは，pre-mir（60 ∼ 70nt）
とその franking ゲノム配列（250 ∼ 300nt）からなります。トランス
フェクション後，細胞内機構が CMV によって発現した miRNA 前駆体を
成熟 RNA に変換します。miRNA 発現プラスミドを使って細胞内機能を
解析することができます。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
特長
過剰発現
（ベクター）
●ゲノムワイドに miRNA をカバー（miRBase Release Ver.13.0）
ヒト 652 種，マウス 486 種
機能検証
●CMV プロモーターにより miRNA 前駆体を発現
次世代
シークエンシング
●全インサートは Sgf I /Mlu I 間にクローン化
●GFP によりトランスフェクションのモニタリングが可能
●安定細胞樹立用のネオマイシン選択マーカー
●Transfection-ready
●miRNA ターゲット研究用に 3'-UTR を持つ TrueClone も別途販売
siRNA
配列解析
サービス
構成内容
図 1 miRNA のプロセシング
miRNA は，21 ∼ 23nt の非コーディング RNA に
より自然に起こり，多くの生態学的過程や病気の発症に
関わっている。miRNA は多様なステップにより処理
される。
●目的の miRNA 発現プラスミド
（Transfection-ready プラスミド 10μg）
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
●シーケンシング用コントロールプライマー
［メーカー：ORG］
■3レベルのバリデーション
カスタム合成
サービス
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
■商品検索の手順
si/shRNA 発現
①前駆体配列の配列確認
全配列はオリジンテクノロジーズ社ホームページ上
ノックダウン検証
（http：//www.origene.com/）で公開しています。
si/shRNA
ライブラリー
②トランスフェクトした細胞の GFP 発現を検証
関連試薬
１
トランスフェク
ション試薬
その他
③対象となる miRNA の過剰発現を実証
2
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
方法：HEK293 細胞に miRNA 発現プラスミドをトランスフェクト
し て，48 時 間 後 に ト ー タ ル RNA を 抽 出 し た。miRNA は ABI
（TaqMan® MicroRNA Assay）の RT-PCR 法により検出した。
全実験は duplicate で行い，正規化コントロールとして beta-actin
を利用した。
①オリジンテクノロジーズ社ホームページの miRNA 特集ページ
（http：//www.origene.com/MicroRNA/）上の検索欄にご希望の
miRNA 名を入力します。
（今回は“mir205”を検索します。）
②右の Go ボタンを押すと検索が開始され品番が表示されます。
コスモ・バイオホームページ上の商品検索欄に“mir205”を入れる
ことでも検索できます！
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
希望販売価格は￥82,000／10μg です。
TaqMan® は，Poche Molecular Systems Inc の登録商標です。
057
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
miRNA
過剰発現（ベクター）
miExpressTM Precursor miRNA 発現クローン
miRBase
LNA
miRNA の調節制御・機能効果の研究に！ レンチウイルスベクターもご用意
抽出 / 精製
プロファイリング
使用目的
eGFP レポーター遺伝子を発現するレンチウイルスまたは非ウイルス性のベクターベースのコンストラクトを用いて，precursor miRNA を過剰発現します。
定量
特長
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
●非分裂細胞や導入が困難な細胞にも簡単デリバリー
（レンチウイルスベースの発現コンストラクト）
●安定化細胞株選択マーカー（ネオマイシン）により，長期と一過性発現
の両方の調節研究が可能
●ベ ク タ ー プ ラ ス ミ ド の 導 入 と ウ イ ル ス 感 染 導 入 効 率 は e G F P
レポータータンパク質で簡単にモニタリング
●miRNA 発現コンストラクトの発現カセットはすべてシークエンス確認済
●miRBase デ ー タ ベ ー ス（ver.13.0）に リ リ ー ス さ れ て い る，ヒ ト
（750 種）
，マウス（450 種）
，ラット（270 種）の precursor miRNA
発現クローンをご用意
図 1 レンチウイルスベクターベースの precursor miRNA 発現クローンとベクターを介した miRNA
遺伝子調節のメカニズム
2 種類のベクターコンストラクト
‒ 実験にあわせてお好みのベクターをお選びください ‒
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
■ FIV- ベースレンチウイルス miRNA 発現ベクター
ノックダウン検証
■ 非ウイルス性 miRNA 発現ベクター
si/shRNA
ライブラリー
Precursor miRNA ベクターの特長
ベクター
レポーター
遺伝子
セレクション
マーカー
タイプ
メリット
関連試薬
pEZX-MR01
eGFP
Neomycin
FIV
FIV based for transduction into difficult to target cells
トランスフェク
ション試薬
pEZX-MR04
eGFP
Puromycin
Mammalian
Mammalian vector for transient or stable transfection
into commonly used cell types
その他
引用文献
Kim, H W et al. (2009) Ischemic Preconditioning Augments Survival of Stem Cells via miR-210 Expression by Targeting Caspase-8-associated Protein 2*. The Journal of Biological Chemistry
284(48):33161‒33168. [pEZX-miR-210 and luciferase reporter construct containing the 3-UTR of Casp8ap2]
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■商品リスト
［メーカー：GCP］
■商品検索の手順
ジーンコピア社ホームページ上の miRNA 紹介ページ（http://www.genecopoeia.com/
product/mirna/）を開きます。
Search Clones
のアイコンをクリックし，検索ページを開きます。
【キーワード検索】
①ご希望の分野を選択します。
②precursor miRNA 名，mature miRNA 名，precursor miRNA Accession，mature
miRNA Accession，カタログ / 製品 ID，precursor 配列，mature 配列等のキーワード
で検索できます。
Search ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
右の 希望販売価格はご照会ください。
058
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
過剰発現（ベクター）
miRNA
Lenti-Pac™ レンチウイルスパッケージングキット
miRBase
miExpress™ Precursor miRNA や miArrest™ miRNA のレンチウイルスベクターと併せて
お使いいただけます！
LNA
GeneCopoeia 社の Lenti-Pac HIV および FIV 発現パッケージング
システムは，レンチウイルスパッケージングプラスミドミックス，eGFP
ポジティプコントロールプラスミド，ウイルス産生用に最適化された新規ト
ランスフェクション試薬の EndoFectin，力価を 5 ∼ 10 倍に増加させ
る 試 薬 の TiterBoost か ら 構 成 さ れ ま す。Genecopoeia 社 の ORF
cDNA，shRNA，miRNA レンチウイルスコンストラクトと併用した場合，
高力価を示し発現量も良好です。
HIV，FIV パッケージングシステムのどちらも，レンチウイルスパッケージ
ングに必須な因子を高発現するため，組換え転写体を効率よく感染性ウイル
ス粒子へとパッケージングするよう，またウイルス配列が自己複製しないよ
うにも設計されています。
構成内容
プロファイリング
Genecopoeia 社の ORF cDNA，shRNA，miRNA レンチウイルスコ
ンストラクトと併用した場合，以下のことが期待されます。
定量
抽出 / 精製
● in vivo ，in vitro 問わず，ほとんどの 哺乳動物細胞に高効率での遺
伝子導入が可能
検出
● 導入遺伝子を高発現（ORF 発現クローン）
インヒビター
● 標的 mRNA に対して高いノックダウン効率（shRNA クローン）
● 高効率な標的遺伝子の翻訳阻害または mRNA 分解（miRNA クローン）
● 自己不活性化機構と，不本意なウイルス複製防止機構
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
構成内容
● FIV / HIV パッケージングミックス
● eGFP ポジティブコントロールプラスミド
● EndoFectin レンチトランスフェクション試薬
siRNA
● TiterBoost ウイルス力価試薬
配列解析
サービス
■商品リスト
［メーカー：GCP］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Lenti-Pac™ FIV Expression Packaging Kit
FPK-LVTR-20
20RXN
ご照会
冷
○
Lenti-Pac™ FIV Expression Packaging Kit
FPK-LVTR-40
40RXN
ご照会
冷
○
Lenti-Pac™ HIV Expression Packaging Kit
HPK-LVTR-20
20RXN
ご照会
冷
○
Lenti-Pac™ HIV Expression Packaging Kit
HPK-LVTR-40
40RXN
ご照会
冷
○
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
■関連商品
shRNA クローン
コレクション
Lenti-Pac 293Ta レンチウイルス パッケージング セル ライン
si/shRNA 発現
GeneCopoeia 社は，レンチウイルス由来ベクターの ORF cDNA，shRNA，miRNA コンストラクト用に最適化されたパッケージングプラスミドを用
いることで高力価なウイルス産生が可能な 293Ta パッケージング細胞も提供します。Lenti-Pac 293Ta パッケージング細胞では簡単かつ効率的なトラ
ンスフェクションが可能で，ウイルスタンパク質を高発現させることができます。
■商品リスト
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
［メーカー：GCP］
商品名
293Ta Lentiviral packaging cell line: 1.5 x 106 cells
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
CLV-PK01
1unit
ご照会
凍
□
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
Lenti-Pac™ レンチウイルス 濃縮溶液
その他
Lenti-Pac レンチウイルス濃縮溶液は，迅速かつ簡単にレンチウイルス粒子を濃縮する目的で作られました。本試薬とレンチウイルス培養液を混合し，短
時間のインキュベート後に一般的な遠心分離をすることで，濃縮が完了します。
■商品リスト
［メーカー：GCP］
商品名
Lenti-Pac™ Lentivirus Concentration Solution (6x)
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
LPR-LCS-01
50ml
ご照会
冷
○
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
059
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
miRNA
過剰発現（ベクター）
miRNASelectTM ヒト / マウス miRNA 前駆体発現クローン
miRBase
LNA
miRNA 配列コンストラクト済クローン
抽出 / 精製
プロファイリング
使用目的
セルバイオラボ社は，ヘアピン構造を保持した様々な種類の miRNA を
作成できる，ヒト及びマウス miRNA ベクターをご提供いたします。
miRNA 前駆体の全長配列がプロモーターと共にコントラクトされています。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
ヒ ト 用 ベ ク タ ー ：ピューロマイシン耐性マーカー付
（pEP-miR ベクター（図 1））
マウス用ベクター：GFP- ピューロマイシン耐性マーカー付
（pEPG-miR ベクター（図 2 ）
）
機能検証
［メーカー：CBL］
次世代
シークエンシング
■商品検索の手順
siRNA
商品リストは下記 URL をご参照ください。
http://www.cosmobio.co.jp/mirna
お探しの miRNA がない場合はクローニングベクター（下記商品）を
ご利用ください。
配列解析
サービス
希望販売価格：¥124,000 / 100μl
カスタム合成
サービス
図 1 pEP-miR 発現ベクター
カルタヘナ：本製品群は，
「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」
（通称：カルタヘナ法）の使用規制対象品です。ご使用に関しては，規制に即し適切にお取扱いください。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
過剰発現（ベクター）
miRNASelectTM クローニング発現ベクターおよびコントロールベクター
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
哺乳類細胞用 miRNA クローニングベクター
使用目的
miRNASelectTM 哺乳類細胞発現ベクターは前駆体 miRNA をクロー
ニングするのに簡単で効果的なツールです。デザインした miRNA 配列を
ベクターに含まれるヒトβグロビンのイントロンにクローニングします。
下記 2 つのフォーマットから選べます。
pEP-miR ベクター（図 1）：ピューロマイシン耐性マーカー付
pEGP-miR ベクター（図 2）：GFP- ピューロマイシン耐性マーカー付
その他
各発現マーカーは空のコントロールベクターが含まれます。このコント
ロールベクターは単品販売もしています。
技術情報
miRNA
プロファイリング
図 2 pEGP-miR 発現ベクター
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■商品リスト
［メーカー：CBL］
商品名
miRNASelectTM pEGP-mir Cloning and Expression Vector
miRNASelectTM pEP-mir Cloning and Expression Vector
miRNASelectTM pEGP-mir Null Control Vector
miRNASelectTM pEP-mir Null Control Vector
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
MIR-EXP-GP-C
100μL※
￥123，
000
凍
○
MIR-EXP-C
100μL※
￥124，
000
凍
○
MIR-NULL-GP
100μL※
￥92，
000
凍
○
MIR-NULL
100μL※
￥92，
000
凍
○
※大腸菌グリセロールストック
カルタヘナ：本製品群は，
「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」
（通称：カルタヘナ法）の使用規制対象品です。ご使用に関しては，規制に即し適切にお取扱いください。
060
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
過剰発現（ベクター）
miRNA
miRNA レンチウイルス発現ベクター
miRBase
LNA
メチル化による発現抑制を受けない miRNA レンチウイルス
抽出 / 精製
ヒト miRNA（hsa-mir）前駆体と約 100bp 上流及び下流の隣接する
ゲノム配列を PCR 増幅し，pLVmiRNA ベクター（図 1）にクローニング
しています。miRNA が適切に発現して作用しますので，内因性のものと
同様の機能が期待できます。
プロファイリング
定量
検出
特長
インヒビター
●pLV-miRNA ベクターは，miRNA 発現に最適化されています。
他社製品とは異なり，miRNA 前駆体がヒトハウスキーピング遺伝子の
EF1αプロモーター領域にクローニングされているため，イントロン内
での miRNA プロセスが選択マーカーの発現に与える影響を最小限に
抑えます。miRNA 前駆体と選択マーカーが同じ転写ユニットに入って
いますので，miRNA の転写活性を簡単にモニタリングできます。
●レンチウイルスベースですので，分裂細胞や非分裂細胞にも効果的に導入
することができます。レトロウイルスシステムとは異なり，レンチウイルス
の導入は細胞周期に依存しません。
●宿主の染色体に組込まれますので，miRNA は導入細胞株で安定して発現
します。
●ヒト EF1αプロモーターは，細胞内で発現が抑制されることはありません。
CMV や SV40 等 の ウ イ ル ス プ ロ モ ー タ ー 活 性 は，し ば ら く す る と
DNA のメチル化により発現が抑制されることが報告されています。
miRNA 前駆体やピューロマイシン選択マーカーの発現に使われるヒト
EF1αプロモーターは，ハウスキーピング遺伝子のプロモーターです。
したがって，in vitro や in vivo でメチル化により発現が抑制される
ことはありません。
●EF1α プ ロ モ ー タ ー か ら 発 現 し た rPuro 遺 伝 子 産 物 は，赤 色 蛍 光
puromycin-N-acetyl- トランスフェラーゼです。レンチ -miRNA を導入
し た 細 胞 は ，ピ ュ ー ロ マ イ シ ン の 存 在 下 で 選 択 さ れ る だ け で な く ，
587 / 610nm（励起 / 発光）の波長で赤色蛍光を示します（図 2）。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
図 1 miRNA を発現するレンチウイルスベクター
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
図 2 hsa-mir-24-1 レンチウイルスを形質導入した 293T 細胞の顕微鏡画像
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
■ miRNA レンチウイルス発現ベクターの比較
miRNA 発現
バイオセティア社
A 社
B 社
C 社
フォーマット
レンチウイルス／ベクター
（pLV-miRNA）
合成 RNA
レンチベクター
レンチベクター
恒常的発現
○
×
○
○
∼ 100bp
―
隣接配列
発現方法
発現する miRNA
選択マーカー
転写／発現
デリバリー効果
コレクション数（706）＊ 2009.04 現在
EF1 α -［miRNA］-rPuro
（1 プロモーター）
イントロン内
RFP-Puro 融合
イントロン内の miRNA の加工は
RFP-Puro 発現への影響を
最低限に抑える
レンチウイルス -ready
620 以上
∼ 200bp
∼ 250bp
CMV-RFP-miRNA-IRES-Puro
（1 プロモーター）
エクソン内
RFP / Puro
CMV-RFP-miRNA-EF1 α -GFP
（2 プロモーター）
エクソン内
GFP
―
miRNA の加工が mRNA の
分解を引き起こす
miRNA と GFP は 2 つの異なる
プロモーターにより発現
トランスフェクションによる
470 以上
パッケージングによる
―
パッケージングによる
596 以上
―
―
×
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
■関連商品
miRNA レンチウイルス粒子
Ready-to-use の miRNA レンチウイルスストック
技術情報
miRNA レンチウイルスストックは，HEK293T 細胞に lenti miRNA
ベクターと Gag-Pol 遺伝子産物及び水疱性口内炎ウイルスエンベロープ
G（VSV-G）を発現するプラスミドを co-transfection して作製してい
ます。レンチウイルスの上清は，トランスフェクション後 48 時間で回収し，
− 70℃ で保存しています。ウイルスの力価は，通常 1 × 10 7 IU/mL
以上です。
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
図 3 EF1 αイントロン中にクローニングされた miRNA 発現レンチウイルス
［メーカー：BOT］
■商品検索の手順
バイオセティア社では，620 種以上のヒト miRNA レンチウイルスベクターを取り揃えています。コスモ・バイオホームページ上“商品検索”で，
ベクターは“pLV ‐ ”
，ウイルスストックは“Lentiviral stock”で検索してください。希望販売価格等の詳細は，コスモ・バイオまでご照会ください。
061
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
miRNA
過剰発現（ベクター）
ViraSafeTM miRNA レンチウイルス発現システム
miRBase
LNA
レンチウイルスを用いた遺伝子デリバリーをトータルでサポートします！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
使用目的
特長
HIV- 1 をもとにしたレンチウイルスは分裂細胞にも非分裂細胞にも感染
する能力を持つことから，遺伝子導入の強力な手段となります。近年開発さ
れた第三世代のウイルス発現システムでは複製可能なウイルスを作り出すリ
ス ク が 減 少 さ れ て き て は い る も の の，ま だ そ の リ ス ク は 存 在 し ま す。
ViraSafeTM レンチウイルス発現システムは第三世代のレンチウイルスシス
テムに比べてより安全なツールです。配列相同性さらに 80 - 90% 減少し，
それにより複製可能なレンチウイルスのリスクを大幅に軽減しています。さ
らに，各ベクターを個別に提供しており，ベクター比率を最適化できます。
ViraSafeTM miRNA レンチウイルス発現システムはターゲット細胞に
miRNA が発現するようにデザインされています。
●安全：第三世代のレンチウイルス発現システムと比べ配列相同性が
80 - 90％以下
●高い力価：第三世代システムと同程度の力価
●フレキシブル：ベクターは安全性，また使用比率を最適化していただく
ために，別包装で供給
機能検証
次世代
シークエンシング
エコトロピックシステム；マウス細胞およびラット細胞
パントロピックシステム；どの種にも
構成内容
●pSMPUW-miR-GFP-Puro Lentiviral 発現ベクター（図 1）
siRNA
●pRSV-Rev パッケージングベクター
配列解析
サービス
●pCMV-VSV-G エンベロープベクター
カスタム合成
サービス
●pSMPUW-LacZ コントロールベクター
コントロール
siRNA
●pCgpV パッケージングベクター
レンチウイルスによる遺伝子デリバリーについては技術情報をご覧下さい。
図 1 pSMPUW-miR-GFP-Puro Lentiviral 発現ベクター
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
■商品リスト
［メーカー：CBL］
商品名
TM
ViraSafe
miRNA Lentiviral Expression System
エンベロープ
品番
Ecotropic
VPK-220-ECO
1Kit
￥226，
000
凍
○
Pantropic（VSVG）
VPK-220-PAN
1Kit
￥226，
000
凍
○
―
VPK-220
10μg
￥114，
000
凍
○
pSMPUW-miR-GFP-Puro Lentiviral Expression Vector
包装
希望販売価格
貯蔵
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
■関連商品
レンチウイルスによる遺伝子デリバリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
［メーカー：CBL］
カテゴリー
パッケージングセルライン 293LTV Cell Line
その他
コントロールベクター
技術情報
miRNA
プロファイリング
タイター測定 / 定量
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
濃縮および精製
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
トランスダクション
062
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
LTV-100
1VIAL
￥81,000
凍
□
GFP Lentivirus Control
LTV-300
1VIAL
￥109,000
凍
□
RFP Lentivirus Control
LTV-301
1VIAL
￥109,000
凍
□
β -Galactosidase Lentivirus Control
LTV-302
1VIAL
￥78,000
凍
□
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector
LTV-400
1VIAL
￥114,000
凍
○
pSMPUW-GFP-Puro Lentiviral Control Vector
LTV-401
1VIAL
￥114,000
凍
○
pSMPUW-MNDnLacZ Lentiviral Control Vector
LTV-402
1VIAL
￥114,000
凍
○
pLenti-RFP-Puro Lentiviral Control Vector
LTV-403
1VIAL
￥114,000
凍
□
QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit (Lentivirus Associated HIV p24)
VPK-107
96WELL
￥154,000
冷 ○
凍
○
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit (20 assay)
VPK-112
1KIT
￥98,000
QuickTiter™ FIV Lentivirus Quantitation Kit (FIV p24 ELISA, 96 Tests)
VPK-108-FIV P24
1KIT
￥154,000
冷 ○
凍
○
冷 ○
凍
○
冷
○
QuickTiter™ Lentivirus Quantitation Kit (HIV p24 ELISA, 96 Tests)
VPK-108-HIV P24
1KIT
￥123,000
ViraBind™ Lentivirus Concentration and Purification Kit (2 preps)
VPK-090
1KIT
￥70,000
冷
○
ViraBind™ Lentivirus Concentration and Purification Kit (5 preps)
VPK-091
1KIT
￥156,000
冷
○
ViraBind™ PLUS Lentivirus Concentration and Purification Kit
VPK-095
2 回分
￥61,000
冷
○
ViraBind™ PLUS Lentivirus Concentration and Purification Mega Kit
VPK-096
2 回分
￥266,000
冷
○
ViraDuctin™ Lentivirus Transduction Kit
LTV-200
40TEST
￥47,000
冷
○
ViraDuctin™ Lentivirus Transduction Kit
LTV-201
200TEST
￥117,000
冷
○
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
過剰発現（ベクター）
miRNA
RAPAd® miRNA アデノウイルス発現システム
miRBase
LNA
アデノウイルスによる遺伝子デリバリーをトータルでサポートします！
抽出 / 精製
使用目的
特長
RAPAd® アデノウイルス発現システムは，wild-type のアデノウイルス
を大幅に減らし，短期間でリコンビナントアデノウイルスを産生します。
本システムでは，パッケージングシグナルと E1 配列が除かれた 5' LTR
由来のバックボーンベクターを使用しています。
RAPAd® miRNA ア デ ノ ウ イ ル ス 発 現 シ ス テ ム は，迅 速 に 個 々 の
miRNA 前駆体を発現するリコンビナントアデノウイルスを産生すると同時
にヘアピン構造と内因性のプロセシング機構を保存し，適切に切断された
miRNA を導き出すように設計されています。
プロファイリング
●迅速なウイルス産生：わずか 2 ∼ 3 週間で高感染価のウイルスを産生
できます。
●実 質 的 に wild-type の ウ イ ル ス 不 含：従 来 の 発 現 系 よ り，100 ∼
10,000 倍 wild-type プラークの産生を抑えるように設計されてい
ます。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
構成内容
次世代
シークエンシング
●pacAd5 miR-GFP/Puro Shuttle ベクター
●pacAd5 9.2-100 ベクター
●pacAd5 CMV-GFP コントロールベクター
●pacAd5 CMV-ntLacZ コントロールベクター
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
アデノウイルスによる遺伝子デリバリーについては技術情報ご覧下さい。
図 1 pacAd5 miR-GFP/Puro Shuttle ベクター
デザイン済み
siRNA
■商品リスト
［メーカー：CBL］
商品名
RAPAd® miRNA Adenoviral Expression System
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
VPK-253
1 Kit
￥203，
000
凍
○
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
■関連商品
si/shRNA
ライブラリー
アデノウイルスによる遺伝子デリバリー
［メーカー：CBL］
カテゴリー
パッケージングセルライン
商品名
293 AD Cell Line
タイター測定 / 定量
濃縮および精製
トランスダクション
包装
希望販売価格
貯蔵
AD-100
1VIAL
￥70,000
凍
□
ADV-001
50μL
￥123,000
凍
□
β-galactosidase Adenovirus Vector
ADV-002
50μL
￥154,000
凍
□
SEAP (Secretory Alkaline Phosphatase) Recombinant Adenovirus
ADV-003
50μL
￥154,000
凍
□
Null Adenovirus Vector
コントロールベクター
品番
GFP Adenovirus Vector Recombinant Adenovirus
ADV-004
50μL
￥154,000
凍
□
Cre Recombinant Adenovirus
ADV-005
50μL
￥154,000
凍
○
Firefly Luciferase Recombinant Adenovirus
ADV-008
50μL
￥175,000
凍
○
QuickTiter™ Adenovirus Quantitation Kit (20 Tests)
VPK-106
1KIT
￥92,000
冷
○
QuickTiter™ Adenovirus Titer Immunoassay Kit (100 Tests)
VPK-109
1KIT
￥92,000
冷 ○
凍
○
QuickTiter™ 96-well Adenovirus Titer ELISA Kit (2x96 Tests)
VPK-110
1KIT
￥101,000
冷 ○
凍
○
ViraBind™ Adenovirus Miniprep Kit (10 preps)
VPK-099
1KIT
￥97,000
室
○
1KIT
￥101,000
室
○
ViraDuctin™ Adenovirus Transduction Reagent (CAR-independent)
ViraBind™ Adenovirus Purification Kit (10 preps)
VPK-100
AD-200
10TEST
￥62,000
冷
○
ViraDuctin™ Adenovirus Transduction Kit
AD-201
50TEST
￥162,000
冷
○
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
063
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
miRNA
過剰発現（ベクター）
miRNA レトロウイルス発現ベクター
miRBase
LNA
レトロウイルスを用いた遺伝子デリバリーをトータルでサポートします！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
使用目的
pMXs-miR-GFP/Puro レトロウイルスベクターはターゲット細胞に導入
するリコンビナントレトロウイルスにパッケージングするためのベクターで，
興味のある miRNA 配列をクローニングできます。
miRNA を効果的に MMLV- ベースのレトロウイルスにパッケージング
できる。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
レトロウイルスによる遺伝子デリバリーについては技術情報をご覧下さい。
図 1 pMXs-miR-GFP-Puro レトロウイルス発現ベクター
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
■商品リスト
コントロール
siRNA
pMXs-miR-GFP/Puro Retroviral Vector
［メーカー：CBL］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
RTV-017
10μg
￥114，
000
凍
○
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
■関連商品
レトロウイルスによる遺伝子デリバリー
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
［メーカー：CBL］
カテゴリー
パッケージングセルライン
コントロールベクター
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
タイター測定 / 定量
濃縮および精製
トランスダクション
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
064
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic
RV-101
1VIAL
￥110,000
凍
□
Platinum-A Retroviral Packaging Cell Line, Amphotropic
RV-102
1VIAL
￥110,000
凍
□
Platinum-GP Retroviral Packaging Cell Line, Pantropic
RV-103
1VIAL
￥110,000
凍
□
pCMV-VSV-G Envelope Vector
RV-110
10μg
￥109,000
凍
○
Null Retroviral Vector
RTV-001(HYGRO)
10μg
￥98,000
凍
○
Null Retroviral Vector
RTV-001(NEO)
10μg
￥98,000
凍
○
Null Retroviral Vector
RTV-001(PURO)
10μg
￥98,000
凍
○
GFP Retroviral Vector
RTV-002
10μg
￥123,000
凍
○
QuickTiter™ Retrovirus Quantitation Kit (20 assays)
VPK-120
1KIT
￥106,000
冷
○
ViraBind™ Retrovirus Concentration and Purification Kit (2preps)
VPK-130
1KIT
￥70,000
冷
○
ViraBind™ Retrovirus Concentration and Purification Kit (5preps)
VPK-131
1KIT
￥156,000
冷
○
ViraBind™ PLUS Retrovirus Concentration and Purification Kit
VPK-135
2 回分
￥61,000
冷
○
ViraBind™ PLUS Retrovirus Concentration and Purification Mega Kit
VPK-136
2 回分
￥266,000
冷
○
ViraDuctin™ Retrovirus Transduction Kit
RV-200
1KIT
￥50,000
冷
○
miRNA 過剰発現 ( ベクター )
過剰発現（ベクター）
miRNA
miRNA 発現プラスミド構築サービス
miRBase
LNA
お手持ちのベクターでご希望の miRNA を発現するコンストラクトをカスタム構築します
抽出 / 精製
使用目的
納品内容
本製品はお手持ちの miRNA 発現ベクターにご希望の pre-miRNA を
発現するための DNA を組み込み，コンストラクトをカスタム構築する
サービスです。組み込み用の DNA 合成も承ります。DNA 配列を組み込み，
シークエンシングにより周辺配列の確認を行います。
プロファイリング
●miRNA 発現プラスミド
定量
●ベクター，DNA などの残った材料
●QC データ（シークエンシング）
検出
●納品案内書（作業報告）
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
特長
ご注文方法
●他社のベクターでも承ります
●QC データ（シークエンシング）も添付します
●構 築 済 み miRNA 発 現 プ ラ ス ミ ド が み つ か ら な い 場 合 に ご 利 用
ください。
①miRBase（http://www.mirbase.org/）で microRNA ID と
アクセッション番号を確認
②コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）
から購入申込書をダウンロード
③購入申込書に microRNA ID 名，アクセッション番号，種（ヒト・
マウス・ラット）ベクター情報など必要事項を明記し当社取扱の
代理店にご提出ください。ご希望のオプションがある場合には合わせて
ご明記ください。
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
pre-miRNA 発現用 DNA 組込みサービス
カスタム DNA70-75 塩基
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
PMV-VCS
1 SERV.
¥75，
000
凍
○
SV70-5
5nmolx2
¥20，
000
凍
○
1nmol
¥12，
000
凍
○
DNA HPLC 精製（1nmol 保証）
SVDHP-1
DNA PAGE 精製（1nmol 保証）
SVDPG-1
1nmol
¥13，
000
凍
○
DNA 5' リン酸化オプション（1nmol 保証）
SVD5P-1
1nmol
¥15，
000
凍
○
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
065
miRNA 機能検証
miRNA
LightSwitch ルシフェラーゼ 3’UTR レポーター GoClone
機能検証
miRBase
LNA
microRNA 機能検証用レポータークローン
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
LightSwitch 3’UTR Reporter GoClone コレクションは，最新型の RenSP luciferase 技術を使用した 12,000 以上のヒト 3’UTR 領域挿入済
み transfection-ready ルシフェラーゼレポーターコンストラクトです。LightSwitch システムに最適化されたルシフェラーゼアッセイ試薬との組み合わ
せで高感度のアッセイを実現しました。それぞれの遺伝子に対して，RNA 安定性，翻訳効率，miRNA 関与の解析を行うことができます。
LightSwitch 3’UTR Reporter GoClone コレクションを使用して，3’UTR 活性の測定をすることにより下記の検討を行うことができます。
● UTR（非翻訳領域）の転写後遺伝子制御への関与
● miRNA，siRNA の転写制御安定性または翻訳効率への関与
● 配列変異体が UTR 機能に及ぼす影響
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
miRNA の解析に
定量性
in silico 予測解析の検証および転写抑制・翻訳効果を測定した発現データ
を補い，miRNA のターゲットの特定が可能
最 新 型 RenSP luciferase 技 術 は，miRNA，siRNA お よ び UTR の
遺伝子制御への関与が（業界トップの感度・ダイネミックレンジ）測定可能
配列検証済み
簡単！迅速！なソリューション
Switchgear 社配列検証済みの 12,000 種類のヒト 3’UTR 領域挿
入済み transfection-ready コンストラクトから製品をご選択
クローニング，DNA 精製，試薬の条件検討の必要なし！
UTR ル シ フ ェ ラ ー ゼ コ ン ス ト ラ ク ト を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し，
LightSwitch システム用に最適化した試薬で測定
siRNA
経済的
様々な刺激に対する反応から，ターゲット miRNA の機能解析が可能
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
luciferase
3’UTR
promoter
miRNA mimic
or
non-targeting control
co-transfect
3’UTR
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
④ 合 成 miRNA ま た は miRNA イ ン ヒ ビ タ ー を co-transfection
することで，これらが転写物の安定性や翻訳効果に与え る影響を測
定できる
shRNA クローン
コレクション
⑤ 最 大 の 感 度 と ダ イ ナ ミ ッ ク レ ン ジ を 得 る た め，Light -Switch
luciferase 試薬を使用する
Hybrid
LUC-3UTR
Transcript
si/shRNA 発現
② 定常発現プロモーターが RenSP /human 3’UTR コンストラクト
を転写発現
③ ルシフェラーゼの検出量は RenSP /human 3’UTR 転写物の安定
性や翻訳効果の影響を受ける
RISC
complex
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
① 細胞へ Goclone 3’UTR をトランスフェクション
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
Y
4
M
PT
R0
3
R0
2
R0
1
R0
H
PD
3U
TR
_E
GA
PP
IA
1
HA
その他
10
LD
トランスフェク
ション試薬
100
TB
関連試薬
AC
Relative Luminescence Units (RLU)
Range of activites for 3’ UTR control constructs
1000
3’UTR Insert Sequencing Primers
技術情報
Forward: GGGAAGTACATCAAGAGCTTCGT
Reverse: CCCCCTGAACCTGAAACATAAA
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
図 1 ベクター MAP
図 2 SwitchGear 社 3’UTR control vector のデータ例
各ベクター 50ng ずつを FuGene6（Promega 社）を用いて HT1080 細胞へトランスフェクションした。
図は Log スケール値をプロットした。
絶対活性および相対活性は細胞株，実験条件およびトランスフェクション試薬などにより異なる。
製品検索
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
① http://www.cosmobio.co.jp/sgg_3utr にアクセス
② 画面をスクロールすると，左図の検索フレームがあります
③ 検索フレームに標的遺伝子名または，Gene ID，アクセッション番号
をご入力ください。
④ 改行すると複数の製品を検索することができます。
⑤ ④の検索結果をご利用の代理店にご連絡いただき，ご注文ください。
066
miRNA 機能検証
■商品リスト
［メーカー：SGG］
商品名
品番
包装
希望販売価格
ご照会
5μg
￥79,000
R01_3UTR, Random sequence (negative) control construct
S890001
5μg
￥39,000
R02_3UTR, Random sequence (negative) control construct
S890002
5μg
￥39,000
R03_3UTR, Random sequence (negative) control construct
S890003
5μg
￥39,000
R04_3UTR, Random sequence (negative) control construct
S890004
5μg
￥39,000
EMPTY_3UTR, Empty vector (no 3'UTR)
S890005
5μg
￥39,000
LightSwitch 3’UTR Reporter GoClone ( 標的遺伝子名）
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
＊ 1 本製品の製造過程では，対象とする遺伝子により約 10% 程度の割合でクローニングができず，ご注文後にご連絡をさせて頂く場合がございます。予めご了承ください。
＊ 2 ご利用の前に WEB ページ記載の「製品使用に関するライセンス」をご確認ください。
＊ 3 他社のルシフェラーゼアッセイ試薬で検出することはできません。ご利用の際には LightSwitch Luciferase Assay System を組み合わせてご使用ください。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
機能検証
LightSwich ルシフェラーゼアッセイ用試薬
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
特長
機能検証
4000
ACTB promoter GoClone
R01 negative control GoClone
3500
次世代
シークエンシング
3000
2500
RLU
SwitchGear 社では，レポーターベクターの遺伝子改良と並行して独自
の最新型 LightSwitch Assay Reagent を開発し，最適化されたレポー
タシステムを構築しました。従来のセレンテラジン系ルシフェラーゼアッセ
イでは，バックグラウンドが高く検出されてしまう問題がありましたが，
LightSwitch Assay Reagent と RenSP レポーター遺伝子を組合わせ
て使用することにより，この問題を克服できるだけでなく，下記の利点も得
ることができます。
2000
1500
siRNA
1000
●明るく安定なシグナル： 桁違いの長時間発光，かつ低バックグランド
（図 1）
●簡便： 培養細胞にワンステップで試薬を直接添加 (FBS の有無に関係
なし)
●柔軟性： 少数サンプルにも大規模スクリーニング実験にも使用可能
●最 適 化 済 み：RenSP ベ ク タ ー は，LightSwitch Assay Reagent
と組合わせて使用できるよう最適化済み
背景
海洋性ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼより容易にレポーター
アッセイができ，ホタルルシフェラーゼよりも高感度かつシグナルダイナ
ミックレンジが広域であるため，その代替として普及するようになりまし
た。ウミシイタケルシフェラーゼタンパク質はセレンテラジン基質の酸化を
触媒し，480nm の発光を生成しますのでルミノメーターで容易に測定が
できます。
SwitchGear 社 で は 全 般 的 な 酵 素 活 性（発 光）を 増 強 し，さ ら に
RenSP タンパク質の半減期を短縮させるタンパク不安定化領域を付加す
る こ と に よ り，最 適 化 さ れ た Renilla 発 光 型 レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 で あ る
RenSP を開発しました。
まず，天然のウミシイタケ遺伝子の塩基配列を基盤としてさまざまな改良
を施した数千ものバリアントを合成し，機能的スクリーングを行いました。
さらに，遺伝子配列から発光測定に悪影響を及ぼす転写制御因子結合部位の
配列を除去し，他の人工的ウミシイタケルシフェラーゼよりも発光強度が
2 倍強い RenSP ルシフェラーゼの開発に成功しています（図 2）
。
500
配列解析
サービス
0
0
20
25
30
35
40
45
50
55
60
minutes after adding reagent
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
図 1 LightSwitch Assay Reagent のシグナル安定性
LightSwitch Reagent の シ グ ナ ル 安 定 性 を 検 討 す る た め，96well プ レ ー ト 上 で ACTB プ ロ モ ー
タ ー GoClone お よ び R01 ネ ガ テ ィ ブ コ ン ト ロ ー ル GoClone を，そ れ ぞ れ 別 の well に FuGENE
HD(Promega 社 ) を使用して HT1080 細胞にトランスフェクションした。24 時間インキュベート後，
各 well に LightSwitch Reagent を 100 μl 添 加 し，LmaxII-384 ル ミ ノ メ ー タ ー で 60 分 間，5
分毎に 2 秒間測定した。発光出力は，セレンテラジン系ルシフェラーゼアッセイに共通の初期強発光後に安
定した。
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
RenSP
si/shRNA
ライブラリー
coelenteramide + light
coelenterazine
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
図 2 最新型のレポーターアッセイに最適化されたウミシイタケ（Renilla）
ルシフェラーゼ - 酵素活性と発光強度の強化
その他
ウミシイタケ（Renilla）について
技術情報
海洋性生物発光は独自に幾度も進化してきたため，同じ基質（セレンテラジン）をターゲットとしているルシフェラーゼ群に属していても，互いにあ
まり似ていません。
Renilla reniformis は，機械的刺激に反応して青緑色の生物的発光を生成するウミシイタケです。Renilla reniformis のルシフェラーゼ遺伝子とタ
ンパク質 (936bp and 36kD) が小さい点と，ATP 非依存性である点は，ホタルルシフェラーゼ（∼ 1.6kb and 62kD）のようなサイズがより大き
い ATP 依存性ルシフェラーゼに比べ明らかに優る利点です。
■商品リスト
［メーカー：SGG］
品番
包装
LightSwitch Assay Reagents
商品名
LS010
100 ASSAY
￥22,000
LightSwitch Assay Reagents
LS100
1000 ASSAY
￥125,000
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
希望販売価格
＊ 1 ご利用の前に WEB ページ記載の「製品使用に関するライセンス」をご確認ください。
＊ 2 SGG 社の GoClone は，他社のルシフェラーゼアッセイ試薬で検出することはできません。ご利用の際には本製品を組み合わせてご使用ください。
067
miRNA 機能検証
miRNA
機能検証
LightSwitch Transfection Optimization Kit
miRBase
LNA
使用目的
抽出 / 精製
本製品は，ご使用の細胞系へのトランスフェクション条件を最適化するために必要なトランスフェクション試薬とプロトコール，LightSwitch Assay
Reagent で構成されています。
本キットのトランスフェクション試薬は FuGENE® HD です。FuGENE® HD はヒト及び動物由来の成分フリーの次世代のトランスフェクション試薬で
す。特に，タンパク質発現のための接着および浮遊細胞，昆虫細胞へのトランジェントなトランスフェクションに適しています。
プロファイリング
定量
検出
特長
構成内容
インヒビター
●低毒性な試薬：低毒性で細胞機能への影響も最低限
● Optimization Protocol
●シンプルなプロトコール：培地交換不要のためバラつきが低減され，
血清
にも適応
● GoClone™positive control construct
●多くの細胞タイプに効果的：幅広い細胞株での導入実績
● 100 μ l FuGENE HD
●最適化済み：ルシフェラーゼアッセイにも最適：より効率的な発現と高
感度なデータ
● LightSwitch Assay Reagent（ルシフェラーゼアッセイ試薬）
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
■商品リスト
［メーカー：SGG］
商品名
LightSwitch Transfection Optimization Kit
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
068
● GoClone™negative control construct
品番
包装
希望販売価格
TFXOPT
1 KIT
￥99,000
miRNA 機能検証
機能検証
miRNA
miRNA 機能検証用 3' -UTR レポータークローン
miRBase
背景
特長
3' -UTR レポータークローンは，miRNA による目的遺伝子の阻害効果
を定量します。目的遺伝子の 3' -UTR 配列はホタルルシフェラーゼ遺伝子
の下流にクローニングされています。遺伝子の転写レベルは miRNA との
相互作用によって調節されるため，ルシフェラーゼ活性を化学発光アッセイ
で測定することにより miRNA を定量します。
オリジンテクノロジーズ社の pMirTarget ベクターは，Petersen C. P. ら
（2006）のデザインを採用しています。ホタルルシフェラーゼと 3' UTR
microRNA ターゲット配列は，SV40 プロモーターで転写され，IRES
（internal ribosome entering sequence）配 列 で 翻 訳 さ れ ま す。IRES
配列は miRNA とそのターゲットの相互作用に影響しません。しかし，
IRES 配列によってルシフェラーゼの発現レベルは劇的に減少するため，
わずかな活性変化の検出も可能です。
LNA
●20,000 種類以上のヒト遺伝子をゲノムワイドにカバー
抽出 / 精製
●レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼをコード
●トランスフェクションモニターとして RFP 蛍光タンパク質（赤色）
をコード
プロファイリング
定量
●高感度：IRES 翻訳発現カセットを採用
検出
構成内容
インヒビター
●3' UTR reporter clone：10μg プラスミド DNA
●Forward & reverse DNA ベクターシークエンス用プライマー
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
（各 100 pmole）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
図１ 3' -UTR レポータークローンのアッセイ原理
（左）miRNA と UTR の相互作用によりルシフェラーゼ発現が減少
した。
（右）miRNA と UTR の相互作用が生じないため，ルシフェラーゼ
発現に影響しない。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
140
120
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
100
80
Percentage
of control
shRNA クローン
コレクション
60
40
20
si/shRNA 発現
Em
pt
y
67
62
N
M
_0
14
9
51
N
M
_0
01
5
N
M
_0
30
7
N
M
_0
01
9
82
0
ノックダウン検証
図 3 3' UTR ルシフェラーゼレポータークローンにおける突然変異育種配列による mir205 効果の廃止
（グレイ：3' UTR レポーターコントロールクローン，ダークグレイ：mir205 と 3' UTR レポーター
クローン，黒：mir205 と変異型 3' UTR レポータークローン）
si/shRNA
ライブラリー
図 2 3' UTR レポータークローン ベクターマップ
関連試薬
［メーカー：ORG］
商品検索の手順
トランスフェク
ション試薬
その他
①オリジンテクノロジーズ社のホームページ（http://www.origene.
com）上の右上の検索欄にご希望の遺伝子名を入れます。
1
②右のプルダウンメニューを表示します。
今回は 3' -UTR Clone を選択してください。
③右の Go ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
希望販売価格はお問い合わせください。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■関連商品
［メーカー：ORG］
商品名
pMirTarget, Luciferase reporter vector for cloning a target sequence or as a control vector
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
PS100062
1 clone
¥109，
000
室
○
069
miRNA 機能検証
miRNA
miTargetTM miRNA 3' -UTR ターゲット配列発現クローン
機能検証
miRBase
LNA
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を利用して予想したターゲットを検証
抽出 / 精製
定量
ジーンコピア社のゲノムワイドな miRNA 3' UTR ターゲットコンスト
ラクトは，予想したターゲットの機能検証実験にお使いいただけます。
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する哺乳類発現ベクターシステム
としてご使用いただけます。
検出
特長
プロファイリング
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●3' UTR 配列は全て公共のドメイン遺伝子配列データベースから得て
おり，発現カセットは，哺乳類細胞で SV40 プロモーターによって制御
されるホタルまたはカイアシルシフェラーゼレポーター遺伝子の下流
に挿入
機能検証
●ウミシイタケルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ遺伝子は，
ターゲット細胞中の miRNA コンストラクトの発現やトランスフェク
ション効率の追跡指標として使用可能
次世代
シークエンシング
●ターゲット上の特定の miRNA の調節効果は，ホタルまたはカイアシル
シフェラーゼの機能アッセイで評価可能
アプリケーション
●遺 伝 子 発 現 調 節：miRNA の mRNA 調 節 効 果 は，ト ラ ン ス フ ェ ク
シ ョ ン ま た は ウ イ ル ス 感 染 さ せ た タ ー ゲ ッ ト 細 胞 に precursor
miRNA を導入することで個々あるいは集合的に研究できます。
●miRNA タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 の 同 定 と 検 証：miTarget miRNA
ターゲット検証発現クローン，miRNA 発現クローンは，ターゲット
遺伝子の同定・検証にお使いいただけます。
［メーカー：GCP］
■商品検索の手順
ジーンコピア社ホームページ（http://www.genecopoeia.com）上の
右 上「Search Products」内 の miRNA target clones タ ブ ま で
検索してください。
●発現プラスミドは，3' UTR ターゲット配列とホタルまたはカイアシル
シフェラーゼコーディング配列からなるキメラ mRNA を転写
siRNA
配列解析
サービス
●ルシフェラーゼ発現量は，3' UTR ターゲット配列に miRNA が結合
することで調節され，ルシフェラーゼ活性は比色アッセイで定量可
2 種類のベクター
―実験にあわせてお好みのベクターをお選びください―
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
ホタルルシフェラーゼを用いて
細胞ライセートのアッセイ
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
カイアシルシフェラーゼを用いて
生細胞でのアッセイ
ベクター
レポーター遺伝子
追跡用遺伝子
利点
pEZX-MT01
ホタルルシフェラーゼ
ウミシイタケルシフェラーゼ
細胞溶解液を用いてアッセイを行う
使用可能なアッセイキット
pEZX-MT05
カイアシ（Gaussia）
ルシフェラーゼ
分泌型アルカリホスファターゼ
(SEAP)
生細胞においてアッセイ可
Luc-Pair™ mir
Luciferase Assay Kit
Secrete Pair™ Dual
Luminescence Assay Kit
■関連商品
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
Luc-PairTM miR ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼアッセイにより miRNA 活性を簡単に検証できます
Luc-PairTM miR ルシフェラーゼアッセイキットは，ホタル及びウミシイタケ
のルシフェラーゼの経時的な測定に便利な 96 ウェルプレートフォーマット
の効果的なシステムです。ジーンコピア社の miRNA 標的配列 3' UTR
発現クローン用に最適化されており，簡単かつ経済的に miRNA 活性を検証
できます。
その他
特長
●広範囲にわたり高感度 ●連続的なレポーターシステム
●一貫した再現性 ●経済的
●シンプルアッセイフォーマット
●ハイスループットスクリーニングにも対応
技術情報
A
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
80
60
40
20
Control
miR-125a
RLU
ジ ー ン コ ピ ア 社 の Luc-PairTM miR ル シ フ ェ ラ ー ゼ
ア ッ セ イ キ ッ ト を 使 用 し て，標 的 配 列 3' UTR 発 現
ク ロ ー ン に お け る miRNA の 阻 害 効 果 を 測 定 し た。
HEK293 細 胞 を 6 ウ ェ ル プ レ ー ト に ま き，2 日 目
に細胞へ 1.0μg の標的配列 3' UTR 発現クローン
（pEZX-MT01-Lin28 UTR-fLuc） 及 び 1.4μg の
miRNA 発現ベクター（または miRNA コントロール
ベ ク タ ー ）を ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し た 。ト ラ ン ス
フェクションして 18 時間後，細胞を 96 ウェルプレート
に移し，さらに 24 時間培養した。ホタルとウミシイタケ
の両方のルシフェラーゼ活性は，Victor Ⅱで測定した。
ホ タ ル の ル シ フ ェ ラ ー ゼ 活 性 は ，同 じ ウ ェ ル 中 の
ウミシイタケのルシフェラーゼの活性で標準化した。
RLU
100
0
100000
図 1 標的配列における miRNA の阻害効果を測定
120
最大活性（％）
miRNA
機能解析
B
10000
miRNA
プロファイリング
1000
10000
1000
100
1
10
100
100
1
100
1000
図 2 放射光と HEK293 細胞にトランスフェクションしたルシフェラーゼ発現ベクター量間の直線関係
HEK293 細胞を 6 ウェルプレートにまき，2 日目に細胞へ量を変えてジーンコピア社 pMRO または
pEZXMT01miRNA 3' UTR 標的配列クローンをトランスフェクションした。トランスフェクションして
18 時間後，細胞を 96 ウェルプレートに移し，さらに 24 時間培養した。ホタルとウミシイタケの両方
のルシフェラーゼ活性は，Victor Ⅱで測定した。ホタルのルシフェラーゼアッセイには pMRO ベクター
（A），ウミシイタケルシフェラーゼアッセイには pEZX-MT01 ベクター（B）を用いた。
■商品リスト
［メーカー：GCP］
商品名／構成内容
Luc-PairTM miR Luciferase Assay Kit
●基質 ●バッファー
070
10
pMT01 (ng)
pMRO (ng)
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
LPFR-M010
LPFR-M100
100 回分
1,000 回分
ご照会
ご照会
凍
○
凍
○
miRNA 機能検証
Secrete-PairTM Dual Luminescence Assay Kit
miRNA
培養上清中の GLuc と SEAP のレポーター活性を測定
miRBase
使用目的
LNA
細胞培養上清サンプル中に分泌される 2 種類のレポータータンパク質，GLuc と
SEAP の活性を測定します。細胞溶解操作は不要です。内部標準コントロールの SEAP
を用いて，トランスフェクションの正規化を行い，トランスフェクションの変動の影響が
ないサンプル間の比較が可能です。
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
特長
検出
● 非常に安定した活性が得られるバッファーを採用
キット中の GL-S バッファーにより，発光の半減期を約 30 分まで延長
キット中の GL-H バッファーにより，低発現の GLuc をも検出可能
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
● デュアルレポータータンパク質を検出
GLuc と SEAP，トランスフェクション正規化を行うことでサンプル間の比較可能
● ハイスループット対応
迅速勝簡単アッセイフォーマット，多数サンプルも処理可能
図 1 異なるバッファーシステム（本製品と他社ルフェラーゼアッセイキット）の
GLuc シグナル安定性の比較
ヒト化 GLuc レポータークローンをトランスフェクションした細胞から細胞培養上清
wp10μL とりアッセイに用いた。各キット中のバッファーシステムを用いて，各製造元
推奨のプロトコ−ルによりアッセイを実施。シグナルの % は，シグナル安定性の指標と
して用いた。安定剤を含んだバッファー GL-S を使用したアッセイでは他社品に比べて
非常に安定的な GLuc シグナルが得られた。
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
構成内容
● Buffer GL-S (10×)：GLuc buffer（安定剤含）
GLuc シグナルの減衰を改善し，安定的な活性測定に有用です。
siRNA
● Buffer GL-H (10×)：GLuc buffer（高感度用）
低発現 GLuc 検出に有用です。
配列解析
サービス
● Substrate GL (100× ) GLuc substrate
● Buffer AP (10×)：SEAP buffer
● Substrate AP (100× ) SEAP substrate
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
■商品リスト
［メーカー：GCP］
品名
Secrete-PairTM Dual Luminescence Assay Kit
品番
包装
希望販売価格
SPDA-D010
SPDA-D100
10 rxn
10 rxn
ご照会
ご照会
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
071
miRNA 機能検証
miRNA
機能検証
miRNASelectTM 機能解析レポーターシステム
miRBase
LNA
使用目的
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
原理
miRNASelectTM 機能解析レポーターシステムは miRNA のポテンシャル
ターゲットを評価できる便利なツールです。細胞内の miRNA 配列と
クローニングした miRNA のターゲット配列候補との結合がレポーターの
翻訳抑制を導きます。
このシステムでは，3' UTR のような miRNA のターゲット配列をキット
内の pMIR-GFP ベクターの GFP 遺伝子配列のすぐ下流のマルチクローニング
サイトにクローニングします。もし miRNA が発現し，ターゲット配列に
結合すれば，翻訳が抑制され，GFP が検出されません。もし miRNA が
ターゲット配列に結合しなければ，GFP は翻訳されて蛍光を検出します。
miRNA ターゲット配列を
クローニング
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
実験の流れ
●GFP により miRNA の発現を確認
機能検証
次世代
シークエンシング
●pMIR-GFP ベクターのマルチクローニングサイトに 3' UTR miRNA
ターゲット配列をクローニング
●miRNA 存在下で，GFP が分解されて蛍光が弱まる。
miRNA がある場合
構成内容
siRNA
配列解析
サービス
miRNA がない場合
●miRNASelectTM pMIR-GFP レポーターベクター
●miRNASelectTM pMIR-β-Gal コントロールベクター
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
分解
デザイン済み
siRNA
翻訳
阻害
翻訳
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
蛍光なし
蛍光検出
ベクターマップ
図 1
si/shRNA
ライブラリー
■商品リスト
［メーカー：CBL］
商品名
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
072
miRNASelectTM pMIR-GFP Reporter System
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
MIR-GFP
1 Kit
￥123，
000
凍
○
miRNA 次世代シーケンシング
次世代シーケンシング
miRNA
NEXTflex™ Small RNA シーケンシングキット
miRBase
LNA
ハイスループット対応！シーケンシングサンプル調製キット
NEXTflex™ Small RNA シーケンシングキットは，Illumina® GAIIx 及び HiSeq 2000 のシーケンシングプラットフォームでシーケンシングするため
のシングルまたはマルチプレックスライブラリを small RNA から調製する簡便でフレキシブルなキットです。キットには，3’ヒドロキシル基を持つ
microRNA やその他 small RNA に特異的にライゲートする 3’アデニル化アダプターが含まれます。アダプターライゲーション後，バーコードプライ
マーを使用してライブラリを最大 48 サンプルまで増幅します。NEXTflex™ Small RNA シーケンシングキットと NEXTflex™ Small RNA バーコード
プライマーを組み合わせることにより 48 サンプルを同時プロファイルすることが可能です。
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
特長
3’ NEXTex™
Adenylated Adapter
3’ ligation
2 hours
22°C
RNA
● マルチプレックス解析のためのバーコードが最大 48 種類まで
● 簡便なプロトコール
● 自動化対応
5’ NEXTflex™
Adapter
5’ ligation
● ゲル精製ステップ不要
1 hour
20°C
st
1 Strand Synthesis Product
Reverse Transcription
● 3’NEXTflex™ Adenylated Adapter
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
3’ NEXTflex™ Adenylated Adapter
Ligated RNA
構成内容
インヒビター
次世代
シークエンシング
NEXTflex™ RT primer
1 hour
44°C
5’ and 3’ NEXTflex™ Adapter Ligated RNA
● M-MuLV Reverse Transcriptase Buffer（10 ×）
Optional
Stop Point
NEXTflex™ Barcode
primer 1
● M-MuLV Reverse Transcriptase
st
1 Strand Synthesis Product
1-2 hours
PCR
● AIR™ Ligase Buffer（10 ×）
NEXTflex™ Universal
primer
● 5’NEXTflex™ Adapter
Optional
Pooling
● NEXTflex™ RT Primer
● NEXTflex™ Universal Primer
Optional
Stop Point
1.5 hours
room temperature
Gel Electrophoresis
● NEXTflex™ Barcode Primer 1
● Ready to Load Low MW Ladder
● Nuclease-free Water
3 hours or overnight
Room temperature
Nucleic Acid
Precipitation
● 50% PEG
● T4 RNA Ligase 1
カスタム合成
サービス
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
図 1 フローチャート
● ATP
配列解析
サービス
コントロール
siRNA
Optional
Pooling
● Elution Buffer（10 ×）
siRNA
variable
PCR Product
● dNTP Co-precipitant
si/shRNA 発現
● DuroTaq Master Mix（5 ×）
● Resuspension Buffer
ノックダウン検証
● Loading Dye（6 ×）
si/shRNA
ライブラリー
● microRNA Control
■商品リスト
［メーカー：BIO］
品名
NEXTflex™ Small RNA Sequencing Kit
NEXTflex™ Small RNA Sequencing Kit, 詳細データ
品番
包装
希望販売価格
5132-01
5132-02
24 RXN
48 RXN
￥231，
000
ご照会
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
■関連商品：NEXTflex™ Small RNA Barcode Primers
品名
NEXTflex™
NEXTflex™
NEXTflex™
NEXTflex™
Small
Small
Small
Small
RNA
RNA
RNA
RNA
Barcode
Barcode
Barcode
Barcode
Primers
Primers
Primers
Primers
［メーカー：BIO］
品番
(Set
(Set
(Set
(Set
A)
B)
C)
D)
513301
513302
513303
513304
包装
96
96
96
96
RXN
RXN
RXN
RXN
希望販売価格
￥70，
000
￥70，
000
￥70，
000
￥70，
000
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
073
miRNA 次世代シーケンシング
miRNA
AIRTM バーコードアダプター
次世代シーケンシング
miRBase
LNA
TM
AIR
抽出 / 精製
プロファイリング
small RNA シーケンシングキットと組み合わせてマルチプレックス解析に！
3' 末端でブロックされたアデニル化 3' アダプターです。ライゲーション
時に，ATP を必要とせず，small RNA プールの 5' リン酸基との結合による
環状化を最小限に抑えます。
使用方法
アダプター
定量
検出
使用目的
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●ハイスループットシーケンスのためのサンプル調製
●シーケンシングスケールを増やす
●複数のライブラリーを同時解析
機能検証
次世代
シークエンシング
3 アダプターをリンク
した RNA フラグメント
５ アダプター
●未知の miRNA の同定
T4 RNA リガーゼ
特長
●複数のサンプルや複数の実験条件を伴う研究をサポート
●フローセル当たりの解析サンプル数を最大限に
RT-PCR
●1 サンプル当たりの解析コストを下げる
構成内容
siRNA
●3' AIR™ バーコードアダプター
●SR プライマー 1
●SR プライマー 2
配列解析
サービス
●5' SR アダプター
●SR RT プライマー
●SR シーケンシング プライマー
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
■使用例
使用した商品名
AIRTM small RNA シーケンシングキット +
AIRTM バーコードアダプター
使用したフローセル
リード長
リード数
ユニークリード
アダプターコンタミ
1
36
27,328,173
5,403,304
3.65％
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
ノックダウン検証
AIRTM Barcoded Adapters set 1
TM
si/shRNA
ライブラリー
AIR Barcoded Adapters set 2
AIRTM Barcoded Adapters set 3
その他
包装
希望販売価格
貯蔵
510501
1 kit（10 Barcoded Adapters 25 回分）
ご照会
凍
○
510502
510503
1 kit（20 Barcoded Adapters 25 回分）
1 kit（30 Barcoded Adapters 25 回分）
ご照会
ご照会
凍
○
凍
○
AIRTM アデニル化リンカー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
品番
次世代シーケンシング
次世代シーケンシング用，miRNA クローニングに最適
技術情報
miRNA
プロファイリング
使用目的
配列情報
AIRTM アデニル化リンカーは RNA リガーゼ反応において ATP を必要
としない活性型アデニル化オリゴマーです。これにより特異的でクリーンな
ライゲーションが可能になります。リンカーはジデオキシ C（ddC）で
3' 末端を修飾されるため，セルフライゲーションを抑制しています。
AIRTM Adenylated Linker A：制限酵素サイト Ban Ⅰ
5' rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC/3'
miRNA
機能解析
AIRTM Adenylated Linker B：制限酵素サイト Ava Ⅰ および Sty Ⅰ
5' rAppCACTCGGGCACCAAGGA/3ddC/3'
AIRTM Adenylated Linker C ：制限酵素サイト Eco R Ⅰ
5' rAppTTTAACCGCGAATTCCAG/3ddC/3'
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
AIRTM Adenylated Linker A
AIRTM Adenylated Linker B
TM
AIR
074
Adenylated Linker C
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
510201
1nmol
¥22,000
凍
○
510205
5nmol
¥75,000
凍
○
510301
1nmol
¥22,000
凍
○
510305
5nmol
¥75,000
凍
○
510401
1nmol
¥22,000
凍
○
510405
5nmol
¥75,000
凍
○
miRNA 次世代シーケンシング
次世代シーケンシング
miRNA
Custom AIRTM アデニル化アダプター / リンカー
miRBase
LNA
ハイスループットシーケンシング用アダプターおよびリンカー受託作製サービス
抽出 / 精製
使用目的
SOLiD，454 FLX，Illumina または他の次世代シーケンシングプラット
フォームに適したハイスループットシーケンシングのためのアダプター
およびリンカーを受託作製いたします。
本サービスをご利用いただくには，事前お見積もりが必要になります。
コスモ・バイオ（株）HP 上サポート情報→書類ダウンロード→見積
依頼書より見積書をダウンロードし，必要事項をご記入の上，弊社代理店また
は弊社まで，FAX ください。
・遺伝子の配列情報
・ご希望収量
・修飾の有無
・純度（脱塩か HPLC 精製）
コスモ・バイオ（株）
受託サービス担当窓口
TEL：03-5632-9610
FAX：03-5632-9619
e-mail：[email protected]
定量
検出
<< お見積もりに必要な情報 >>
本サービスのお問い合わせ先
プロファイリング
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
次世代シーケンシング
miR-MouseTM Enriched Small RNA
siRNA
背景
特長
TM
miR-Mouse Enriched Small RNAs は，Balb/c マウスの各組織最大
10 回分のプールから精製して得た small RNA です。本製品はフェノール
とグアニジン・チオシアネートを含むシングルフェーズの試薬で抽出し，
small RNA 画分はイソプロパノールによって濃縮しました。濃縮低分子量
RNA のサイズは約 10-100 bp で，miRNA や特定の臓器に存在する
内在性 small RNA の解析に有用です。本製品はヌクレアーゼフリー，
0.2 mM EDTA pH 8 のバッファー中に 50μg / μl の濃度でご提供
いたします。
また，お客様のお求めに応じて，種，性，年齢に応じた RNA をカスタム
でご提供致しています。
配列解析
サービス
●高品質，濃縮 small RNA
カスタム合成
サービス
●時間を削減
コントロール
siRNA
●ハイレベルな品質管理
デザイン済み
siRNA
適用
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
●遺伝子発現解析
shRNA クローン
コレクション
●マイクロアレイ解析
●miRNA クローニング
si/shRNA 発現
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
miR-MouseTM Brain
TM
miR-Mouse
Heart
TM
Kidney
TM
Liver
miR-Mouse
miR-Mouse
miR-MouseTM Lung
miR-MouseTM Ovary
TM
miR-Mouse
Spleen
miR-MouseTM Testes
性別
＊
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
F
5156
15μg
¥28，
000
凍
○
M
F
5158
5160
15μg
15μg
¥28，
000
¥28，
000
凍
○
凍
○
M
5162
15μg
¥28，
000
凍
○
F
5164
15μg
¥28，
000
凍
○
M
5166
15μg
¥28，
000
凍
○
F
5168
15μg
¥28，
000
凍
○
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
M
5170
15μg
¥28，
000
凍
○
F
5172
15μg
¥28，
000
凍
○
トランスフェク
ション試薬
M
F
5174
5176
15μg
15μg
¥28，
000
¥28，
000
凍
○
凍
○
その他
F
5178
15μg
¥28，
000
凍
○
M
5180
15μg
¥28，
000
凍
○
M
5182
15μg
¥28，
000
凍
○
＊ F: female, M: male
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
075
miRNA 次世代シーケンシング
miRNA
次世代シーケンシング
AIRTM リガーゼ；Truncated T4 RNA リガーゼ 2
miRBase
LNA
miRNA シーケンシング，directional mRNA シーケンシングの際のライブラリー調製をサポートします
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
次 世 代 シ ー ケ ン シ ン グ 用 に 開 発 し た 強 力 な RNA リ ガ ー ゼ で す。
ライゲーション時に ATP 不要 RNA の 3' 末端にアデニル化アダプター
とライゲートします。
特長
インヒビター
図 1 25-mer miRNA を 24-mer AIRTM アデニル化
リンカーと高効率にライゲーション
●ほぼ 100% のライゲーション効率
過剰発現
（オリゴ）
●トランケートされているのでリン酸化 5' 末端 RNA とライゲーション
しません。
過剰発現
（ベクター）
●RNA，5' RACE，3' 末端ラベリングのライゲーションに
レーン 1：AIRTM リガーゼ 200 Unit
レーン 2：他社リガーゼ 200 Unit
レーン 3：他社リガーゼ 400 Unit
機能検証
次世代
シークエンシング
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
AIRTM Ligase（T4 RNA Ligase 2, truncated）
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
076
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
512105
5,000 unit（12 回分）
￥28，
000
凍
○
RNAi とは
RNA干渉(RNAi：RNA interference)は、
ノーベル生理学・医学賞受賞者の Andrew Z. Fire と Craig C. Mello(1) によって線虫の実験で発見され、2001 年には Elbashirら(2)
により哺乳類での siRNA による RNAi 誘導が明らかとなりました。従来の手法に比べ簡便であることから、今日では遺伝子の機能抑制方法として広く普及し、研究ツールの
一つとなっています。
RNAi とは、21∼23bp の短鎖二本鎖 RNA (siRNA : small interfering RNA) または長鎖二本鎖 RNA (double-strand RNA；dsRNA) が、その標的遺伝子の
転写産物 (mRNA) の相同部分を切断することにより、
遺伝子の発現を抑制する現象です。
RNAi の活性はトランスポゾンの転移や遺伝子発現制御、細胞運命の決定に関係しています。また、
ウイルス感染防御の重要な因子となっています。RNAi の発見によって
核酸医薬開発および遺伝子治療への応用への期待が高まっています。
(1) Fire, A.at al., Nature
391: 806-811 (2) Elbashir SM, et al：Nature 411:494-498
RNAi 実験をはじめるにあたって
1
RNAi 実験に必要な道具
大きく分けて、”
siRNA を細胞に導入し RNAi 効果を誘導するため”と ”
RNAi 効果の検出をするため”のふたつの試薬、設備、および機器を準備します。
必要な機器・試薬などは下記のようなものがあげられます。
細胞培養設備 − CO 2 インキュベーターとクリーンベンチ
siRNA として用いる材料−合成 siRNA、sh/siRNA ベクター
siRNA の導入に必要な試薬・機器 − トランスフェクション試薬、エレクトロポレーター、ウイルスベクター
RNAi 効果の確認に必要な試薬・機器−リアルタイム PCR 、
レポーターベクター、ルミノメーター、蛍光顕微鏡、蛍光分光光度計、Northern Blotting
用器具と定量化システム
2
siRNA 効果の誘導
■ RNAi 効果を誘導する siRNA 形態の決定
研究対象となる細胞や遺伝子の特徴ならびに研究目的に応じ、
合成 siRNAを用いるか sh/siRNA 発現
Yes or A
No or B
ベクターを用いるのかを決定します。
研究対象の
哺乳類を対象とした RNAi 実験を始める場合には、
培養細胞を用いて下記の 2 点を確認することが一般的です。
① 使用する siRNA が RNAi 効果を誘導できるか/ターゲット配列が有効な配列であるかどうか
② 対象とする遺伝子が容易にノックダウンできる遺伝子であるか
遺伝子がある
RNAi 遺伝子
One-by-One
スクリーニング
の実験をしたい
実験をしたい
合成 siRNA を使用
合成 siRNA
一過性の反応となります。
プラスミドベクターもしくはウイルスベクターを使用する
si/shRNA
A: 一過性発現
ライブラリー
B: 定常発現
基本的に一過性の反応となりますが、
stable 株も樹立可能です。
ウイルス粒子を利用する場合はゲノムに integrate されますので、Stable 株が構築できます。
主に下記の 3 点を考慮します。
① プロモーター：polⅡ または polⅢ 系
トランスフェクション
A:si/shRNA 発現
プラスミド
B: ウイルス粒子
が難しい細胞を
使用する予定
② ベクター骨格：プラスミドベクターまたはウイルスベクター
③ RNA 発現方法：siRNA 発現系または shRNA 発現系
※ とくに、
初代培養細胞や非分裂細胞など、
トランスフェクションの困難な細胞を利用する場合にはレンチウイルスベクターの利用をご検討ください。
■ siRNA 配列デザイン
RNAi メカニズムをよく理解したうえで、
ノックダウン効率が高くかつ配列特異的オフターゲット効果を回避できるような siRNA 配列をデザインする必要があります。
無料で使用できるデザインツールもいくつかあります。当社では、
目的に合わせて種々のデザインサービスを行っています。
合成 siRNA を使用する場合
● siTrioTM（p.87 参照）
当社独自の siRNA 配列デザインアルゴリズム“B-Algo”により3種類の siRNA 配列がすでに選択されており、
ノックダウンをより確実にします。
75％ のノックダウン保証がついた製品です。配列特異的オフターゲットを回避するデザインを行います。
● siRNA 配列解析サービスと解析 + siRNA 合成セット（p.88 参照）
SNPs やスプライシングバリアント、他の遺伝子との交差性を詳細に考慮し、配列特異的オフターゲット効果を最小限に抑えるデザインを行います。
また、
他種間共通の siRNA 配列デザインが可能です。mRNA レベルで、
実績平均 80％ 以上のノックダウン効率です。
si/shRNA 発現ベクターを使用する場合
● shRNA 配列解析サービス と解析 + siRNA / 組み込み用 DNA 合成セット（p.91 参照）
siRNA としてよい配列であっても、
ベクター用としてよい配列であるとは限りません。
これは細胞内で発現ベクターから siRNA が産生される過程で
様々な因子が関与しているためです。後にベクターを使用して実験をする計画がある場合にははじめからこの点を考慮して、ベクターにも使用できる
配列を用いることがよいでしょう。
shRNA 配列デザインを行うと同時に対応する siRNA を合成し、in vitro で siRNA の機能を検証する予備実験を行うことも有効です。
078
■ 合成 siRNA の入手方法
siRNA は、
3’末端に 2 塩基のオーバーハングを持つ 21∼23 塩基の二本鎖 RNA です。アニーリング処理された ready-to-use の siRNA を利用することが
一般的です。
アニーリング済み二本鎖の siRNA を購入する場合
● siRNA 配列指定：通常、
ターゲット遺伝子配列を指定します。
● 塩基数の指定：21∼27 塩基が一般的。
● オーバーハングの指定：RNA オリゴまたは RNA-DNA のキメラオリゴから選択。
● センス鎖とアンチセンス鎖間でミスマッチがある場合はポジションを明記します。
● 通常はアニーリングバッファーが含まれています（不要な場合は明記します）
。
※ 2 塩基のオーバーハングには、多くの場合チミン（TT）やウラシル（UU）が使用されます。もちろんその他のオーバーハングを使用した場合でも RNAi 効果に大きな影響を与えるという
報告はありません。
しかし、
siRNA 末端を平滑にする、5’
末端のみをオーバーハングにする、
オーバーハングの長さを変えるといったことを行うとRNAi効果に影響を与える場合があります。
● Elbashir et al., EMBO
J ,20:6877-6888
siRNA配列指定の例：
ターゲット遺伝子配列： 5’- C G G A A G A T G A A G A G G A A G A - 3 ’
センス配列
： 5’- C G G A A G U GA A G A G G A A A G A TT - 3 ’
アンチセンス配列 ： 5’- U C U U C C U C U U C A U C U U C C GTT - 3 ’
一本鎖 RNA を購入する場合
一本鎖の RNA を購入し、
ご自身でアニーリングすることもできます。
● RNA オリゴまたは RNA-DNA のキメラオリゴから選択
● 通常、
RNA は糖鎖の 2’に保護基がついた状態で合成されるために脱保護が必要
※ 2001年ころには、
「ターゲット遺伝子の AA からはじまる 19 塩基に相補する配列」が RNAi 効果が高いといった報告がありました（1,2,3）。そのため多くの研究者が AA から始まる
19塩基を siRNA のターゲット配列として使用し、
文献上では AA + 19 塩基と記載されています。
この文献情報をもとに、
「AA + 19 塩基 + 2延期のオーバーハング（合計 23 塩基）
」
の二本鎖 siRNA を合成すると、文献に紹介された配列とは異なる配列となってしまいますので注意が必要です。
(1 ) Nature
, 411, 494-498, 2001
J 20, 6877-6888, 2001
（2）EMBO
.,
Genes Dev ., 15, 188-200, 2001
（3）
■ si/shRNA 発現ベクターの構築
si/shRNA 配列および使用する発現ベクターが決定したら、次にサブクローニングサイトを決定します。一般に、polⅢ 系のプロモーターは転写開始がポジショニングや
塩基配列（プリン塩基）に依存するといわれ、注意が必要です。
挿入配列のデザイン
下記のように、
末端に制限酵素サイトをもたせた挿入配列をデザインすることが一般的です。
GATCC
G
G
CTTAA
DNA オリゴの入手
下記のような２本のオリゴを入手します。
5’- GATCC
5’- AATTC
G -3’
G -3’
アニーリングした後、
ベクターのプロモーター下流にライゲーションします。サブクローニング後は、sequencing により配列確認を行います。
■ ポジティブ、
ネガティブコントロールの選択
RNAi 実験を行う際は、
ネガティブコントロール siRNA とポジティブコントロール siRNA での実験を並行して行います。ネガティブコントロールは実験に使用する
ポジティブコントロールはあるターゲット遺伝子に対して優れた RNAi 効果を示すことが
すべての遺伝子配列と一致しないもの *1（すなわち RNAi 効果のないもの）、
実証されているものを使用します。これは、RNAi を誘導しようとする細胞の RNAi 効果（RNAi 効果の持続性や発現抑制効率）
を事前に確認するためや、独立した実験
ごとの再現性を確認するために使用します。なお、
DNA プラスミドと合成 siRNA のトランスフェクション至適条件は異なるので、
合成 siRNA に最適化する必要があります。
*1：下記の ３ 種類のうちいずれかを使用することが一般的です。
① 市販のコントロール siRNA（ゲノム上に存在しない配列）
② RNAi を誘導する生物のゲノム上に存在しない遺伝子をターゲットする siRNA
例：哺乳類細胞を利用する場合、ルシフェラーゼ遺伝子や GFP 遺伝子を標的する siRNA
③ ターゲット遺伝子特異的な siRNA 配列をもとに、
これをスクランブル（G, A, U, Cそれぞれのヌクレオチドの比率を変えずに配列だけをランダムに変更
する）
して、
ゲノム上に存在しない配列にした siRNA
079
3
細胞への導入
■ トランスフェクション方法の決定
合成 siRNA または si/shRNA 発現ベクターのいずれを用いて RNAi 実験を行う場合にも、細胞内にこれらを導入する必要があります。
使用する細胞系の培養設備が整っていれば、あとはトランスフェクションの系を確立すればよいことになります。
合成 siRNA およびプラスミドベクターを使用する場合
一般的には一過性の反応であるため、
できるかぎり高いトランスフェクション効率での実験が望まれます。使用する細胞の導入効率や細胞毒性などの性質
によって、
トランスフェクション試薬の種類、あるいはエレクトロポレーションを用いるかを決定します。
■ トランスフェクション条件の検討
トランスフェクション試薬を用いる場合（以下一例。詳細はご利用のトランスフェクション試薬のプロトコール参照）
① 6 ウェルプレートに 24 時間後に 50∼70％ confluent になるように細胞を播種する。
② ポジティブコントロール siRNA (100μM ストックを 1μL)を MEM（血清無添加）
に加えて100μL
とする。GFP などのレポーターベクターがある場合は、co-transfection してもよい。
③ 種々のトランスフェクション試薬濃度の溶液を調整する。
A：トランスフェクション試薬 1μL と培地
（血清無添加）
を加えて 100μL とする。
B：トランスフェクション試薬 2μL と培地
（血清無添加）
を加えて 100μL とする。…など
トランスフェク
ション試薬 1μL
siRNA なし
トランスフェク
トランスフェク
ション試薬 1μL
ション試薬 1μL
Negative Control
Positive Control
siRNA
siRNA
混和し、
④ ③で調整したトランスフェクション試薬溶液に、②の siRNA 溶液を各100μL ずつ添加、
室温で 15 分程度放置する。
⑤ 細胞を培地で洗浄後、
培地
（血清無添加）
を 0.8ml 添加する。
トランスフェク
ション試薬 2μL
⑥ ④で調整した siRNA - トランスフェクション試薬複合体をそれぞれの dish に滴下する。
siRNA なし
トランスフェク
トランスフェク
ション試薬 2μL
ション試薬 2μL
Negative Control
Positive Control
siRNA
siRNA
⑦ 数時間培養する。
⑧ 通常使用している倍量の血清と抗生物質を含むMEMを 1mL 添加して、
24∼48 時間培養する。
実際には、
トランスフェクション試薬や siRNA 導入により問題が生じないかを確認するために、
siRNA 存在下、非存在下の両方で検討するとよい。細胞毒性が低く、
かつノックダウン効果の
高い条件を選択する。
4
RNAi 効果を確認する方法の選択
■ RNAi 効果の確認
siRNA による RNAi は、mRNA の切断がそのメカニズムであることから、通常 mRNA 発現レベルの変化でノックダウン効率を測定します。
タンパク質の発現レベル変化を確認することもあります。
また、RNAi 効果によりタンパク質発現レベルの低下も期待されることから、
■ mRNA発現レベルの変化を調べる
mRNAレベルを直接測定する方法：qPCR (リアルタイム PCR)、Northern Blotting
qPCR は、mRNA を定量する方法として広く用いられています。専用の qPCR 機器と qPCR 試薬を使用する点は一般的な mRNA 定量と同様です。
しかし、
RNAi 実験の場合には特別に考慮することが必要であり、通常は mRNA 発現を検出できているプライマーにもかかわらず、RNAi 効果は正確に検出
できない場合があります。そのため、
RNAi 実験用にデザインしたプライマーセット（p.103 参照）を必要とすることもあります。
間接的に mRNA 発現レベルを測定する方法：レポーターアッセイ
より簡便に RNAi 効果を確認する方法としてレポーターアッセイがあります。
レポーター遺伝子とターゲット遺伝子の配列のキメラ分子を発現するベクターを
利用する方法で、ルシフェラーゼや GFP などが広く利用されています。すなわち、mRNA がターゲット配列部分で切断されることによって、
レポーター遺伝子
mRNA も分解されることを利用するものです。
■ タンパク質レベルの変化を調べる
多くの研究者は、
目的とするタンパク質の発現レベルを低下させることを目的として RNAi 実験を行うため Western Blotting によりターゲット遺伝子のタンパク発現
レベルを検出するケースも多々あります。
しかし、
たとえ mRNA レベルが低下しても、
タンパク質レベルには変化が見られないというケースもあるため、あくまでも間
接的な検出方法であることを理解しておく必要があります。タンパク質への影響のみを確認し、
ノックダウン効果が確認できない（RNAi 効果が見られない）という場合
には、使用した siRNA に RNAi 効果がないのか、mRNA はノックダウンされているにもかかわらずタンパク質には影響がみられないのか、はっきりと判断をすること
ができません。遺伝子によっては mRNA がノックダウンできても何らかの理由（ターンオーバーが遅いなど）でタンパク質のレベルでは変化しにくい場合があります。
5
その他、RNAi 実験を行う際の注意点
■ ターゲット遺伝子の選択
ターゲット遺伝子の発現量確認
mRNA やタンパク質のターンオーバーの情報を可能な限り入手する
ターゲット遺伝子がほとんど発現していない環境下では、RNAi 誘導実験そのものが成立しません。使用する細胞や遺伝子自身の日周性などによる mRNA
発現レベルを理解しておくことが大切です。また mRNA の寿命や代謝サイクルの情報があれば、実験条件の設定の際に役立ちます。
■ 使用する培養細胞種の決定
研究目的に則した細胞での実験計画を思い浮かべられるかもしれません。
しかし、細胞によっては siRNA の導入が困難なものや RNAi メカニズムの中核をなすDicerや
RISC の細胞内レベルが異なったり、
インターフェロン応答活性化が生じやすかったりします。一方で、
とくに一過性のノックダウン実験を行う場合には siRNA を効率よく
トランスフェクションする必要があります。まずは、扱いやすい細胞を使用して siRNA のノックダウン効果を確認しておくとよいでしょう。
080
■ 複数種類の siRNA を試す
1種類の siRNA では期待した効果が得られないことがあるため、
１つのターゲット遺伝子に対して複数種の siRNA を用いてノックダウン実験を行うことが大切です。
また、3 種類の siRNA カクテル（p.87 siTrio TM 参照）を利用することで、
ノックダウン効果がより確実になることも知られています。一方で、
ノックダウン効果が
あるsiRNA を複数使用して、
同じ表現型が得られるかを確認することも大切です。これは、複数種の siRNA が引き起こすオフターゲット効果が同じであることが考えに
くいためです。
■ siRNA の取り扱い方
酵素による分解ならびに機械的な分解の可能性があるので、
この両方に留意します。
① 常に RNase-free の環境で扱う
② 使用するチューブやチップ、
水やバッファーなどは RNase-free のものを用いる
③ 溶解した後は分注、冷凍保存し凍結融解をを繰り返さないようにする
溶解方法
乾燥状態の合成 siRNA は、
添付の指示に従って溶解し、stock solution を調整します。濃度は 200μM 以下が適切で、一般には 50∼100μM です。
保存方法
① 乾燥状態
-20℃ で 1 年間は安定です。
② 溶解保存
凍結融解を繰り返すと分解する原因となります。そのため、
実験サイズを考慮して siRNA 溶液を分注し、
冷凍保存します。-20℃ で半年間は安定ですが、
フリーザー内の温度上昇で凍結融解が繰り返される場合があるので注意する必要があります。
実験に使用する際の注意
一旦融解した siRNA は 4℃ で保存しておけば、
1 週間程度は実験に使用できますが、
あくまでも RNase-free の状態で保存されている場合です。
そのため取り扱いには十分注意が必要です。万が一、使用していた siRNA の活性が急に低下した場合は、凍結保存してある stock solution を使用しましょう。
■ レスキュー実験
究極的には、siRNA には認識されない核酸配列をもつターゲット遺伝子を導入することで、表現型を復帰できるはずです。そのため、RNAi 実験のレスキュー実験として
試される方法があります。
ターゲット遺伝子の核酸配列に変異を導入
ターゲット遺伝子の cDNA クローンに対し、
野生型のタンパク質配列は変更することなく核酸配列に変異を導入し、
siRNA 効果がレスキューできるか
確認します。
3’
-UTR を標的する siRNA と ORF クローンの利用
ターゲット遺伝子の 3’
-UTR を標的とする siRNA を用いてノックダウン実験を行い、
表現型を確認します。次に CDS 領域のみをコードする ORF
クローン（open reading frame clone）を用いてレスキュー実験を行います。当社ではオリジンテクノロジーズ社、
ジーンコピア社など多くの ORF クローン
を取り扱っています。
※ 期待する目的タンパク質の発現量調節が比較的困難であること、
また、過剰発現することにより弊害が生ずる可能性があることから、
レスキュー実験は非常に困難で一般的な手法とはいえないことが現状です。
TECHNICAL NOTE
RNAi 技術を利用した in vivo 実験
in vivo 実験対応 siRNA
合成 siRNA
末端修飾の有無
末端無修飾の siRNA（nakid-siRNA）を利用方法や、2’
-OMe, 2’
-F
などの末端修飾基を施した siRNA を利用する方法があります。
修飾基の種類はお問合せください。
合成 siRNA の純度
当社の siRNA は「GMP に準拠した製造施設」で製造しています。バリデー
ションを行い製造工程がエンドトキシンフリーであることを確認しています。
既に、当社の合成 siRNA を in vivo 実験に使用している研究者も多く、
in vivo 実験に適合した純度の siRNA をご提供致します。また、ご注文頂いた
siRNA のエンドトキシンテスト結果のご提供も別途お承ります。
[ 参考文献 ]
Naked-siRNA や siRNA 発現ベクターの利用
・McCaffrey et al., Nature, 418:38-39, 2002.
・Chang et al., J. Virol, 75:3469-3473, 2001.
・Heidel et al., Nat Biotechnol, 22:1579-1582, 2004.
・Song et al., Nat Medicine, 9:347-351, 2003.
化学修飾した siRNA の利用
siRNA 発現 DNA ベクター
2 本 鎖 siRNA 発 現システム ま た は ヘ ア ピ ン・ル ー プ 構 造 を も つ
shRNA 発現システムといった siRNA 発現様式や、siRNA をドライ
ブするプロモーターの種類など、種々取り揃えています。
レンチウイルスシステム
レンチウイルスシステムは、核膜を通過できるため、細胞分裂期に関
係なく宿主ゲノムに integration できるシステムです。脳や神経細胞
への導入実績もあります。
TM
in vivo 用に高タイターウイルスの調製用“ViraBind
・Soutschek et al., Nature, 432:173-178, 2004.
・Morrissey et al., Nat Biotechnol, 23:1002-1007, 2005.
( キャリヤーも同時に利用）
・Elmen et al., Nucl Acids Res, 33:439-447, 2005.
Lentiviral System の利用
・Dittgen et al., ProNAS, 101:18206-18211, 2004.
・Singer et al., Nat Neurosci, 8:1343-1349, 2005.
・Clements et al., Tissue Eng, 12:1741-1751, 2006.
キャリヤーの利用
・Reich et al., Mol Vis, 9:210-216, 2003.
・Li et al., Nat Medcine, 11:944-951, 2005.
レンチウイルス濃縮＆精製キット”もござい
ます (CBL 社 品番 :VPK-090)。
超遠心を利用することなく、ウイルス粒子を 10 9 ∼ 10 10 TU/ml まで濃縮可能（P,62 を
ご参照ください。
）
。
081
siRNA 配列解析サービス
miRNA
配列解析サービス
B-AlgoTM コスモ・バイオの siRNA 設計アルゴリズム
miRBase
LNA
解析の「質」が違う
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
配列設計にはポイントとなる複数の要因をどのような比重で考慮に入れるかということが非常に重要です。そこで，コスモ・バイオでは複数の要因につい
て多次元の最適化を試み独自の siRNA 配列設計法 B-AlgoTM を完成させました。この B-AlgoTM を応用し，siRNA から，shRNA 用（ベクター別最適化）
配列解析まで幅広い解析サービスを展開しています。
配列はオン・ターゲット，オフ・ターゲットを最小限に
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
●オフターゲット：最小限に抑えます。
100％ 抑えることのできないオフターゲットを最小限に抑えるには，
メカニズムを知る必要があります。B-AlgoTM では，ノックダウン効果を
最大に，かつオフターゲットを最小限に抑えるよう考慮した配列選択を行い
ます。
●バリアント：考慮しています。
●SNPs：NCBI 登録の SNPs は全て取り除かれます。
●種：ヒト・マウス・ラット・ゼブラフィッシュ（その他の種もお問い
合わせ下さい）
＊ siTrioTM はヒト・マウス・ラットの NM，XM から始まるアクセッ
ション番号に対応した商品となります。
●mRNA 抑制率：実績平均 80％ ∼
配列解析サービスでは，オフターゲットにも考慮して配列選択を行いま
すので，保証はありません。
B-AlgoTM を用いた保証付製品 siTrioTM（p.87 参照）では，ノックダ
ウンに比重を置いた配列選択で，mRNA レベルで 75％のノックダウ
ン効率を保証しています。
●ホモロジー：異種・異なった遺伝子間からの共通・回避など可能です。
●NCBI に登録されていない配列：解析可能です。その他，スプライシン
グバリアントを同時にノックダウンしたいといった特別な要望もお問
い合せ下さい。
TM
siRNA
●ミスマッチ検出システム：siPRECISE
独自に開発したユニークなシステム，siPRECISETM はどこにミスマッ
チがあっても検出可能。BLAST とは異なります。センス鎖・アンチセ
ンス鎖両方を見ています。
●解析システムのメンテナンス
NCBI の遺伝子データベースの更新や研究成果をうけ更新をしています。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
CosmoBio の siRNA 配列設計法とその応用
これまで様々な共同研究グループと siRNA のターゲット配列設計について研究を重ねてきた結果として，47 種類の要因について計算し最も効率が高い
と思われる候補を選択しております。
パラメーターの一例を以下に示します。
shRNA クローン
コレクション
●GC 含有量
●siRNA のエネルギー分布
●センス鎖とアンチセンス鎖のエネルギーバランス
●siRNA 配列の水素結合数
si/shRNA 発現
●siRNA の末端エネルギー
●siRNA の 5' と 3' 末端の 5 塩基のエネルギー差
●siRNA の Tm 値
ノックダウン検証
●siPRECISETM の結果
●SNPs 検索の結果
si/shRNA
ライブラリー
●スプライシングバリアント検索の結果
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
㻔㻓㻓
࢙ࢾ࣭ࣜ࢟࡞ࡻࡾฦ㢦
㻘㻓
㻓
㻓㻑㻓㻓
㻘㻓㻑㻓㻓
㻔㻓㻓㻑㻓㻓
㻘㻓㻑㻓㻓
㻐 㻘㻓
図 1 エネルギーに関連する要因と発現抑
制効果の相関
HeLa，または 293 細胞を使用し，異なる
遺伝子についての発現抑制とエネルギーに
関する要因のスコア
mRNAࡡṟ㔖䟺䟸䟻
㒼า࡞ࡻࡾฦ㢦
㻔㻓㻓
㻥㻐㻤㼏㼊㼒䛴㒼า䜽䜷䜦
関連試薬
様々な研究から上記に示すような要因が siRNA の設計において重要
であることが明らかになりました。但し，実際の配列設計では，どの要因
を ど れ だ け の 比 重 で 考 慮 に 入 れ る か と い う こ と が 重 要 に な り ま す。
そこで，上記で紹介した全ての要因を異なる比重で加えて最適化を試みま
。
した（B-AlgoTM）
コンピュータ解析を使用した B-AlgoTM では，共同研究者から収集した
様々なターゲット（ヒト遺伝子）に対する実験結果のデータベースをもとに，
各要因の重要度を予測し，全ての結果に当てはめました。全ての要因を
一度に解析することは困難であるため，エネルギーに関連する 23 種類
の要因（各塩基のエネルギー分布，部分エネルギーの差，GC 含有量，
，配列に関する 24 種類の要因（配列中
siPRECISETM の結果）（図 1）
の位置と塩基の種類との関係，Tm 値，両末端の GC 含有量，全配列の
GC 含有量，siPRECISETM の結果）
（図 2）と発現抑制効果の相関を検証
しました（n=200）
。ターゲット遺伝子間でかなりばらつきがあり，上記
で紹介した要因だけでは，幾つかのターゲットで予想値と実測値が大きく
異なることも見られたが，全てのターゲットにおいて非常に類似した傾向
があることが分かり，B-AlgoTM ではこれらを最適化し，より正確な予想
が可能となりました。
㻥㻐㻤㼏㼊㼒䛴䜬䝑䝯䜲䞀䜽䜷䜦
●siRNA 配列中の重要箇所
㻘㻓
㻓
㻐 㻘㻓㻓㻑㻓㻓
㻕㻓㻑㻓㻓
㻕㻓㻑㻓㻓
㻗㻓㻑㻓㻓
㻗㻓㻑㻓㻓
㻙㻓㻑㻓㻓
㻙㻓㻑㻓㻓
㻛㻓㻑㻓㻓
㻛㻓㻑㻓㻓
㻔㻓㻓㻑㻓㻓
㻐 㻔㻓㻓
mRNAࡡṟ㔖䟺䟸䟻
図 2 配列に関する要因と発現抑制効果の
2 配列に関する要因と発現抑制効果の
相関 相関
HeLa,
異なる
HeLa，または
ま た は 293
293 細胞を使用し，
細 胞 を 使 用 し，
異な
遺伝子についての発現抑制と配列に関する
る遺伝子についての発現抑制と配列に関す
要因のスコア
る要因のスコア
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
［メーカー：MIR］
本サービスのお問い合わせ先
コスモ・バイオ（株）販売支援部（RNA グループ）
TEL: 03-5632-9615
FAX: 03-5632-9618
e-mail : [email protected]
082
siRNA 配列解析サービス
配列解析サービス
miRNA
siRNA/shRNA 配列解析サービス
miRBase
LNA
カスタム設計に対応可能
抽出 / 精製
本製品は，当社独自の si/shRNA 配列解析アルゴリズムを用いて，ご指
定の標的 mRNA 配列をもとに siRNA または shRNA を設計するサー
ビスです。B-AlgoTM（p.82 参照）がノックダウン効率を最大にかつ，配
列特異的なオフターゲットを最小限に抑えるデザインを行います。
■商品リスト
［メーカー：MIR］
品番
希望販売価格
siRNA 配列解析（SNPs 解析込み）
商品名
SKSV-R
￥29，
000
shRNA 配列解析（SNPs 解析込み）
SKSV-SHR
￥33，
000
※納期：4 ∼ 7 営業日
インヒビター
●カスタム設計に対応可能
過剰発現
（オリゴ）
●さまざまな生物種に対応可能
●si/shRNA 共通配列解析も可能
過剰発現
（ベクター）
ご注文方法
コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）から
注文書をダウンロード
注文書に必要事項を明記し，当社取扱の代理店にご提出ください。
配列解析サービス
定量
検出
発注に必要な情報
- ターゲット遺伝子名と種（Accession 番号）- 使用細胞情報
- オプションサービスの有無
特長
プロファイリング
ホモロジー特別解析
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
原理
ホ モ ロ ジ ー 特 別 解 析 は，配 列 解 析 サ ー ビ ス や 解 析 ＋ 合 成 セ ッ ト 製 品
（p.83, p.88, p.91 参照）をご依頼いただいた場合にご利用いただける
オプションサービスです。
下記のようなケースにご利用ください。
次世代
シークエンシング
siRNA
使っている配列は本当に落としたいターゲット配列ですか？
使用目的
機能検証
コントロール
siRNA
ホモロジー特別解析オプション B（共通配列の選択）の例
例）Casein Kinase 1 ε のヒトとマウスの共通配列から siRNA を選択する。
Accession 番号：AB0245979（ヒト）
，AB028736（マウス），AB028241（マウス）
●ファミリー遺伝子のうち，特定の遺伝子のみノックダウンしたい
目的：ヒトとマウス細胞の両方で共通のターゲット配列を見つけたい。
●ファミリー遺伝子すべてをノックダウンしたい
●マウス・ヒトいずれでも効果のあるターゲット配列を使いたい
Target : AB024597 (Source: 1..1434)
Compare: AB028736 (Source: 1..1392)
Compare: AB028241 (Source: 1..1392)
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
3 遺伝子で 100% 一致
している配列を検索
ノックダウン検証
AB024597 ( 259.. 293 ) cacatcgagagcaagttctacaagatgatgcaggg
AB028736 ( 236.. 270 ) cacatcgagagcaagttctacaagatgatgcaggg
AB028241 ( 236.. 270 ) cacatcgagagcaagttctacaagatgatgcaggg
・
・
・
AB024597 ( 1378..1405 ) gaccagtgtttgcttagtgtcttcactg
AB028736 ( 1354..1381 ) gaccagtgtttgcttagtgtcttcactg
AB028241 ( 1354..1381 ) gaccagtgtttgcttagtgtcttcactg
特長
●独自に開発したユニークなミスマッチ検索システム，siPRECISETM を利用
●どこにミスマッチがあっても検出可能
si/shRNA
ライブラリー
●NCBI の BLAST とは異なります
L から 19 塩基は 3 つの Accession 番号で 100% 一致している
配列登録されている SNPs は全て選択部位から削除している。
●センス鎖・アンチセンス鎖両方を確認
TM
siPRECISE
241 acaaagcacccccagctgcacatcgagagcaagttctacaagatgatcagggtggcgtg
LLLLLLLLLLLLLLLLL________________
LLL
301 gggatcccgtccatcaagtggtgcggagctgagggcgactacaacgtgatggtcatggag
LLLLLLLL____________
LLLLLLLLLLL_______
361 ctgctggggcctagcctcgaggcctgttcaacttctgttcccgcaaattcagcctcaag
___________
LLL________
421 acggtgctgctcttggccgaccacatgatcagccgcatcgagtatatccactccaagaac
_________ LLLLLLLLLLLLL________________
LLLLLLLL___
だからこれができる！
無料の検索エンジンでのサーチは，siRNA のセンス鎖のみのホモロジー
を検索しているものが多く，アンチセンス鎖側のホモロジーは確認されてお
りません。また，アンチセンス鎖のホモロジー検索ができる場合でも，ミス
マッチによるオフターゲット効果を予測できるものではありません。このよ
うな問題を解決するために，siRNA/shRNA 配列デザイン用のホモロジー
検索プログラム siPRECISETM を開発いたしました。本プログラムにより，
ファミリー遺伝子や関連遺伝子で交差反応があると思われる遺伝子は全て
除外できます（SNPs も考慮されています）
。また，ご希望に応じて様々な
サブタイプを持つターゲットや生物種間で共通の部位をターゲットとする
siRNA/shRNA を設計することも可能です。
L から始まる 19 塩基
は，3 つの遺伝子で共
通なのでハイライトした
領域からターゲット配列
を選択
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
（以下の配列選択結果は，表示の例ですので実際の配列解析では異なるものとなります。）
共通部分から，配列選択基準に基づき最終的に 5 種類の候補を選択，
候補 1：
候補 3：
候補 12：
候補 22：
候補 28：
ターゲット 500 (AGCCCGACAACUUCCUCAU ; siPRECISE™ の結果 ; 2)
ターゲット 500 (AGCCCGACAACUUCCUCAU ; siPRECISE™ の結果 ; 2)
ターゲット 613 (CGGGAAAACAAGAACCUGA ; siPRECISE™ の結果 ; 2)
ターゲット 797 (GCGAGAAGAAGAUGUCAAC ; siPRECISE™ の結果 ; 2)
ターゲット 1193 (AUACUUCUCCCAGAGCGAU ; siPRECISE™ の結果 ; 2)
技術情報
手順
1
3 つの Accession# で 100％マッチしている領域を 19 塩基を単位とし
て検索。SNPs がある場合はその配列はマッチしないと判断する。
2
それら共通配列の中から配列選択基準に基づきターゲット配列を選ぶ。
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
ホモロジー解析オプション A; 共通配列の回避（5 種まで）
ホモロジー解析オプション B; 共通配列から選択（5 種まで）
品番
希望販売価格
SDSN-A
SDSN-B
￥10，
000
￥10，
000
083
siRNA 配列解析サービス
miRNA
配列解析サービス
オフターゲット・レポートオプション
miRBase
LNA
ミスマッチの位置とポジション，遺伝子情報が一目瞭然のレポートを提示
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
■商品リスト
使用目的
オフターゲット・レポートオプションは，配列解析サービスや解析＋合成
セット製品（p.83, p.88, p.91 参照）をご依頼いただいた場合にご利
用いただけるオプションサービスです。最終の 5 配列候補に対し，オフ
ターゲット効果を起こすと思われる配列情報をレポートします。レポートでは
通常 16 / 19 塩基以上が一致する配列が一目瞭然，かつ NCBI のデータ
ベースへリンクされていますので，1 クリックでオフターゲット候補遺
伝子情報を簡単に参照することができます。
［メーカー：MIR］
商品名
オフターゲット・レポートオプション
品番
希望販売価格
SKSV-RPTO
１件あたり￥10，
000
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
配列解析サービス
オフターゲット・レポートサービス
効果のあった配列を in vivo で試す前に
siRNA
使用目的
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
原理
オフターゲット レポートサービスは，任意の 19 塩基 siRNA 配列
（ご自身でご利用の配列）1 本のみに対してオフターゲットのレポートを提供
します。
論 文 か ら の 配 列 ，ご 自 身 で 行 っ た 配 列 解 析 結 果 や 他 社 の 配 列 の
オフターゲット検索にご利用ください。
使用中の配列を in vivo で試す前に交差する配列を見たい，という際にも
お勧めです。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
オフターゲット・レポートサービス
品番
希望販売価格
SKSV-OT
￥15，
000
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
発注に必要な情報
- ターゲット配列（19 塩基 siRNA 配列）
- ターゲット遺伝子
- 使用細胞種（ヒト・ラット・マウス・他）
ご注文方法
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）か
ら注文書をダウンロード
注文書に必要事項を明記し，当社取扱の代理店にご提出ください。
siPRECISE™
7DUJHW$FFHVVLRQ10B*,
1(1)は19/19がヒトRefSeqデータベース内に1つ（ター
ゲット配列自身）しか存在しないことを示しています
VL35(&,6(5HVXOWV
&DQG3RV&DQGLGDWH*&WRWDO
**$$$&8$&88&&8*$$$$
8888&$**$$*8$*888&&
$*$&&&$**8&&$*$8*$$
88&$8&8**$&&8***8&8
&$*$$$$&&8$&&$***&$
8*&&&8**8$**8888&8*
*&$8&88$8&&*$*8**$$
88&&$&8&**$8$$*$8*&
*$$$888*&*8*8**$*8$
8$&8&&$&$&*&$$$888&
&DQG0DWFK6HTXHQFH$FFHVVLRQ3RVLWLRQ*HQH,'
6HQVH
**$$$&8$&88&&8*$$$$10B
**$$$&8$&88&&8*$$$$10B
6HQVH
**$$$&8$&88&&8*$$$$10B
6HQVH
**$$$&8$&88&&8*$$$$10B
$*$$$88$&88&&8*$$$$10B
6HQVH
**$$$&8$&88&&8*$$$$10B
**$$$&8$&88888$$$$$10B
**$$$*8$&88&&8*8$$*;0B
**$$$&8$&8&&$**$$$$10B
*&$$$88$&88&&8*$&$$10B
*&$$$88$&88&&8*$&$$10B
**$$$$8$&88&&8**$*$10B
**$$$&$$&888&8*$$*$10B
$*$$$&8$&888&8*$$*$10B
$*$$$&8$&888&8*$$*$10B
*$$$$&8$&88&$8*$*$$10B
**&$$&8$&88&&8*$$&&10B
**$$*&8&&888&8*$$$$10B
$QWLVHQVH
8888&$**$$*8$*888&&10B
$QWLVHQVH
8888&$**$$*8$*888&&10B
$QWLVHQVH
8888&$**$$*8$*888&&10B
8888&$**$$*$$&888&&;0B
これらの赤はミスマッチを表します
つまり：候補＃1 に対しては 3 つのミス
マッチ（赤字）を持つ 16 の Accession#
が存在します。2 つの遺伝子 A・B にバ
リアントがあるため GeneID＃14 になっ
ています。
Accession＃
は NCBI のデータベースへリンク
されているので，オフターゲット遺伝子
情報も簡単に参照することが
できます。
オフターゲットはアンチセンス鎖も確認
します。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
084
オフターゲット効果：特定の siRNA が標的遺伝子以外の遺伝子に対しても，非特異的に RNAi 効果を示してしまうこと
siRNA カスタム合成サービス
miRNA
siRNA カスタム合成サービス
カスタム合成サービス
miRBase
使用目的
特長
お客様ご指定の配列で siRNA をカスタム合成致します。
大 量 合 成，in vivo グ レ ー ド，各 種 修 飾 基 付 加 に 加 え GMP レ ベ ル の
siRNA 合成も可能です。
Option
クラス X クラス Z
2' - 脱塩・脱保護
2' - 保護基がはずされ，本来の 2' -OH 状態
になっています。
●
アニーリング済み
siRNA が Duplex の状態にアニーリングさ
れています。
●
精製
修飾
HPLC 精製されています
各種修飾基の対応が可能
●
●
LNA
●RNAi 実験にパーフェクトな純度・品質
抽出 / 精製
●21 塩基（19 塩基 ＋ オーバーハング 2 塩基）と
27 塩基（ブラントエンド）
プロファイリング
●合成後の処理が異なるクラス X（80％ 以上純度保証）とクラス Z
（95％ 以上精製保証）
●カタログ外容量もお見積いたします
定量
検出
●各種修飾基の対応が可能
●アニーリング処理済み
インヒビター
●
●
過剰発現
（オリゴ）
ご注文方法
過剰発現
（ベクター）
コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）
から注文書をダウンロード
注文書に必要事項を明記し，当社取扱の代理店にご提出ください。
■商品リスト
機能検証
次世代
シークエンシング
［メーカー：MIR］
商品名
品番
包装
希望販売価格
カスタム siRNA 21 塩基（>80% purity）
25nmol
SY21-25
¥29，
800
カスタム siRNA 21 塩基（>80% purity）
50nmol
SY21-50
¥59，
000
カスタム siRNA 21 塩基（>80% purity）
100nmol
SY21-100
¥74，
000
カスタム siRNA 27 塩基（>80% purity）
25nmol
SY27-25
¥58，
000
カスタム siRNA 21 塩基（>95% purity）
25nmol
SY21-25P
¥59，
800
カスタム siRNA 21 塩基（>95% purity）
50nmol
SY21-50P
¥98，
000
カスタム siRNA 21 塩基（>95% purity）
100nmol
SY21-100P
¥128，
000
SY21-1400P
¥480，
000
SY27-25P
¥128，
000
カスタム siRNA 21 塩基（>95% purity）
20mg
カスタム siRNA 27 塩基（>95% purity）
25nmol
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
■修飾基追加商品リスト（HPLC 精製）
修飾の場合にはクラス Z での siRNA 合成が必要です。その他の容量でも承ります。お問合せください。
末端
修飾価格（両鎖）
Biotin
￥38，
000
￥76，
000
6-FAM
￥25，
000※1
￥50，
000※1
ノックダウン検証
￥38，
000
￥76，
000
￥20，
000
￥40，
000
si/shRNA
ライブラリー
Thiol
アミノ化 C6
リン酸化
￥19，
000
￥38，
000
Cy3
￥45，
000
￥90，
000
Cy5
￥45，
000
￥90，
000
Biotin
￥61，
000
￥122，
000
6-FAM
￥49，
000
￥98，
000
※2
￥61，
000
￥122，
000
￥36，
000
￥72，
000
Thiol
5' 修飾（保証収量：25nmol）
アミノ化 C6
リン酸化
￥56，
000
￥112，
000
Cy3
￥109，
000
￥218，
000
Cy5
￥109，
000
￥218，
000
￥70，
000
￥140，
000
Cy3
￥212，
500
￥425，
000
Cy5
￥212，
000
￥424，
000
Biotin
￥12，
500
￥25，
000
6-FAM
￥30，
000
￥60，
000
Thiol※2
￥10，
000
￥20，
000
6-FAM
5' 修飾（保証収量：50nmol）
3' 修飾（保証収量：5nmol）
★エンドトキシンテスト追加 30,000 円
※ 1 保証量 15nmol です。
※ 2 Thiol 基保護基の脱保護を行わない状態で納品させて頂きます。
si/shRNA 発現
修飾価格（片鎖）
※2
5' 修飾（保証収量：10nmol）
［メーカー：MIR］
修飾名
アミノ化 C7
￥20，
000
￥40，
000
リン酸化
￥18，
750
￥37，
500
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
085
コントロール siRNA
miRNA
カスタムネガティブコントロール
コントロール siRNA
miRBase
LNA
論文提出用にご利用下さい
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
本製品は独自のアルゴリズムを用いて，ご指定の 19 塩基 siRNA 配列を
基にスクランブル配列を設計・合成するサービスです。論文提出の際に，
ターゲット配列に対してスクランブル設計したネガティブコントロールの
実験結果の提出を求められることがあります。このようなご用途に，同一の
GC 含量の配列を同種内でオフターゲット効果をできる限り最小とする
デザインが可能なカスタムネガティブコントロールをご利用ください。
候補配列（2 本）をレポートにてご報告し，その中から任意の配列をお選び
頂くことも可能です（オプション）
。
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
包装
品番
希望販売価格
貯蔵
21mer siRNA Duplex with Scramble Design 25nmol SYDSC-25
￥39，
000
凍
○
Analysis Report, Option (siRNA / shRNA) 1serve SKSV-RPT
￥10，
000
室
○
発注に必要な情報
・ターゲット配列（ターゲット配列が複数ある場合は別途承ります）
・ターゲット遺伝子（アクセッション番号または全配列）
・生物種
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
デザイン済みコントロール siRNA
コントロール siRNA
使用目的
特長
本製品は siRNA 実験にポジティブコントロールまたはネガティブ
コントロールとして利用できるデザイン済みのコントロール siRNA です。
siRNA のトランスフェクション効率は使用時の細胞の状態（生長状態や
健康かどうかなど）に大きく影響を受けることが知られており，そのため，
siRNA 実験結果もこれに影響を受けます。また対象とする遺伝子によっても
その発現レベルが影響を受ける可能性があります。siRNA 導入により標的
遺伝子レベルが高かった場合や，逆に低かった場合であっても，siRNA
効果が得られなかった，またはノックダウン効果が高かったのか，細胞の
状態によるものであったかといった判断のために，当社ではポジティブ
コントロールおよびネガティブコントロールを side-by-side でご利用する
ことをおすすめしております。
ネガティブコントロール
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
■商品リスト
ネガティブコントロール
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
包装
Negative Control
S5C-0600
miRNA
機能解析
ネガティブコントロール
［メーカー：MIR］
品番
包装
Ac/eGFP
S5C-0301
凍
○
S10C-0600
S20C-0600
10nmol
20nmol
￥25，
000
￥38，
000
凍
○
凍
○
S10C-0301
S20C-0301
S80C-0600
80nmol
￥78，
000
凍
○
S80C-0301
Luciferase（GL2）
S5C-0100
貯蔵
5nmol
￥15，
000
凍
○
S10C-0100
S20C-0100
10nmol
20nmol
￥25，
000
￥38，
000
凍
○
凍
○
80nmol
￥78，
000
凍
○
5nmol
￥15，
000
凍
○
10nmol
20nmol
￥25，
000
￥38，
000
凍
○
凍
○
80nmol
￥78，
000
凍
○
siTrio 用カクテル
S80C-0100
Trio Negative Control
S6C-0126
6nmol（Total）
￥18，
000
凍
○
S15C-0126
15nmol（Total）
￥30，
000
凍
○
S30C-0126
30nmol（Total）
￥50，
000
凍
○
包装
希望販売価格
貯蔵
※
5nmol
￥18，
000
凍
○
S10C-0102
10nmol
￥29，
000
凍
○
S20C-0102
S80C-0102
20nmol
80nmol
￥40，
000
￥82，
000
凍
○
凍
○
ポジティブコントロール
品番
［メーカー：MIR］
21 塩基
Luciferase（GL3）
S5C-0200
5nmol
￥15，
000
凍
○
S10C-0200
10nmol
￥25，
000
凍
○
5nmol
￥15，
000
凍
○
S20C-0200
20nmol
￥38，
000
凍
○
S10C-0410
10nmol
￥25，
000
凍
○
80nmol
￥78，
000
凍
○
S20C-0410
20nmol
￥38，
000
凍
○
S80C-0410
80nmol
￥78，
000
凍
○
S80C-0200
Luciferase（GL3）FL 6-FAM
S5C-0202
※
5nmol
￥18，
000
凍
○
S10C-0202
10nmol
￥29，
000
凍
○
プール型 shRNA
ライブラリー
S20C-0202
20nmol
￥40，
000
凍
○
S80C-0202
80nmol
￥82，
000
凍
○
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Luciferase（GL4）
S5C-0700
5nmol
￥15，
000
凍
○
S10C-0700
10nmol
￥25，
000
凍
○
S20C-0700
20nmol
￥38，
000
凍
○
S80C-0700
80nmol
￥78，
000
凍
○
S5C-0300
S10C-0300
5nmol
10nmol
￥15，
000
￥25，
000
凍
○
凍
○
S20C-0300
20nmol
￥38，
000
凍
○
S80C-0300
80nmol
￥78，
000
凍
○
Lamin（Human・Mouse・Rat）
S5C-0410
※蛍光修飾には，これまで異性体が混合した FITC を“FL”標識の際に使用していました。この場合，
Fluorescein 部分は同一ですが，製造過程の反応で，isothiocyanate group の一部が置換されることが
ありました。近年，
“FACS 解析を行うと異性体間で蛍光シグナルの差異がみられる”，
“逆相 HPLC で複数
のピークがみられる”といった報告があり，当社では 6-FAM を利用した，異性体を含まない Fluorescein
標識へ移行しました。さらに，従来品に比べて光退色耐性との報告もあります。
eGFP
086
希望販売価格
21 塩基
￥15，
000
S5C-0102
miRNA
プロファイリング
貯蔵
●内在性タンパク質をノックダウンすることが分かっている配列
・Lamin（Mouse/Rat/Human）
ウエスタンブロッティングや免疫蛍光法などを使用して導入効率や
ノックダウン効率を確認できます。ウェット検証済。
5nmol
Luciferase（GL2）FL 6-FAM
技術情報
希望販売価格
ポジティブコントロール
21 塩基
トランスフェク
ション試薬
その他
［メーカー：MIR］
品番
●ヒト・マウス・ラットのいずれの遺伝子とも一致しない配列
・Negative Control
・Luciferase GL2，GL3，GL4
Plasmid を同時に導入する場合，抑制効果確認にもご利用頂けます
・eGFP および Ac/eGFP
GFP 発現ベクターとの Co-transfection で，導入効率とノック
ダウン効率を同時に確認できます。
＊すべてクラス Z（純度 95% 以上）
。
デザイン済み siRNA
siTrioTM（Human，Mouse，Rat）
75% ノックダウン保証付きデザイン済 siRNA セット
デザイン済み siRNA
単一遺伝子の
高効率ノックダウン！
3 種の siRNA カクテルで簡単・確実にノックダウン！
背景
特長
Relative mRNA Level
NCBI データにある既知のヒト，マウス，ラット遺伝子をほぼ網羅した
siRNA セット（3 種の siRNA カクテル＋各 siRNA ＋配列情報）です。
独自の配列選択アルゴリズムにより，3 種のターゲット配列がすでに選択
されており，カクテルでは，対象遺伝子を mRNA のレベルで 75% 以上
ノックダウンすることを確約します＊1。
合成 siRNA は純度 80％ 以上，3' オーバーハング dTdT，脱塩・脱保
護，アニーリング処理済みです。
ヒト，マウス，ラット以外の生物種でご希望の場合はカスタム siSET，
カスタム siSET mini，siRNA コンボセット（siCombo）をご利用ください
（p.88 参照）
。
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
●75％ の発現抑制効果を確約＊1
定量
●カクテルで手軽に 1 アッセイ・ノックダウン
●ヒト，マウス，ラット遺伝子の NCBI データを網羅
検出
●オーダーはアクセッション番号で
●siTrioTM 用ネガティブコントロールもあります
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
siTrioTM のご注文方法
過剰発現
（ベクター）
①NCBI ホ ー ム ペ ー ジ の ア ク セ ッ シ ョ ン 番 号（ReferenceSequence の NM_ または XM_ の番号に限ります）を確認
TM
＊2
を行いますので，コスモ・バイオのホーム
②siTrio 対応の確認
ページ（http://www.cosmobio.co.jp/sitrioorder）「オンライン
申込み」よりお申し込みください。
cocktail
機能検証
次世代
シークエンシング
③siTrioTM 対応確認後，専用のご注文書をお送りいたします。
siRNA
ご利用の代理店にご連絡いただき，ご注文ください。
siRNA
siRNA
siRNA
配列解析
サービス
A (2,7,9)
B(1,6,4)
C(3,5,8)
D(2,6,4)
カスタム合成
サービス
E(2,6,5)
■商品リスト
TM
siTrio
商品名
包装
品番
siTrioTM 用ネガティブコントロール（カクテル）
貯蔵
SHF-27A-xxxx（Human）
SMF-27A-xxxx（Mouse）
¥66，
000
凍
○
凍
○
6nmol
15nmol
SRF-27A-xxxx（Rat）
S6C-0126
S15C-0126
¥18，
000
¥30，
000
凍
○
凍
○
凍
○
30nmol
S30C-0126
¥50，
000
凍
○
・カクテル 15nmol
・各 siRNA3nmolx3 本
・配列情報
siTrioTM フルセット
対応確認：オンラインでお申込み［メーカー：MIR］
希望販売価格
＊ 1 100nM の siRNA を細胞に導入し，導入が確認された細胞で 24 時間後に対象とする mRNA のレベルを 25% 以下にまで抑制する。
保証対象：使用細胞はどのような細胞を使用していただいてもかまいません。ただし，コントロール試薬（ポジティブコントロール，ネガティブコントロール）を使用した比較実験が必要です。
Lamin A/C, MAPK14（validated）などのターゲットで RNA 効果（25% 以下に抑制）の証明が取れれば，内在性ターゲットと外来性ターゲットのどちらの場合も保証の対象となります。
＊ 2 標的遺伝子の配列によっては，75％ の抑制を示す配列をデザインすることが出来ない場合があります。
＊ 3 ファミリー遺伝子のノックダウンをご希望の場合，ご用途に合わせて siSET または siCombo（p.88）に，ホモロジー解析オプションを組合わせてご利用ください。
siTrioTM マルチ遺伝子ノックダウン法
図Ａ
マルチ遺伝子ノックダウンとは，同時に複数の遺伝子をノックダウンする
ことです。基礎実験（図 A，B）では，本手法による RNAi 実験が可能で
あることが示唆されています。
以下のような実験系への応用が考えられます。
3 種の siTrioTM それぞれ細胞に導入
図Ｂ
Relative mRNA Level
Relative mRNA Level
㻓㻑㻛
㻓㻑㻙
㻓㻑㻗
㻓㻑㻕
#1
3. 遺伝子ファミリー・バリアントをマルチノックダウン
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
si/shRNA
ライブラリー
3 種の siTrioTM を混合して細胞に導入
㻓㻑㻛
関連試薬
㻓㻑㻙
トランスフェク
ション試薬
㻓㻑㻗
㻓㻑㻕
#2
#1
#3
#2
#3
その他
Target Genes
Target Genes
㊟ これらの応用例をはじめ，同一パスウェイ上あるいはクロストークを示す分子群の発現が抑制された
場合には複雑な変化を生ずることが予想されますため，siTrioTM の保証対象外となりますことを予め
ご了承ください。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
ノックダウン検証
㻓㻑㻓
㻓㻑㻓
2. 下流遺伝子を共有する遺伝子をマルチノックダウン
デザイン済み
siRNA
㻔㻑㻓
㻔㻑㻓
1. 類似遺伝子のマルチノックダウン
コントロール
siRNA
3 遺伝子に対して各々 siTrioTM を設計し，各遺伝子の発現レベルを qPCR で測定した。
その結果，3 種の遺伝子に対する siTrio カクテルを用いた場合も，単独の siTrioTM を用いた
場合と同程度の各遺伝子のノックダウンが確認された。
（図Ａ，Ｂ)
Ａ：3 種の siTrioTM をそれぞれ細胞に導入
Ｂ：3 種の siTrioTM を混合して細胞に導入
技術情報
■こんな場合に siTrioTM カクテルを使用したマルチ遺伝子ノックダウン実験をご検討ください。
1. 類似遺伝子のマルチノックダウン
2. 下流遺伝子を共有する遺伝子を
マルチノックダウン
目的遺伝子 A と類似配列をもつ遺伝子 B，C が存在す
る。個々の遺伝子の機能が重複しているかどうかを確認
するため“siTrio™ マルチ遺伝子ノックダウン法”を用
いて，シングル / ダブル／トリプルノックダウン実験を
行う。
遺伝子 D の上流には遺伝子 A，B，C の存在が知られ
ている。これらの遺伝子が各々どの程度，どのように遺
伝子 D へ影響を与えるのか確認するため，
“siTrio™
マルチ遺伝子ノックダウン法”を用いてシングル / ダ
ブル / トリプルノックダウン実験を行う。
上 流
上 流
上 流
上 流
A B C
A B C
A B C
A B C
下 流
下 流?
下 流?
下 流?
A B C
A B C
A B C
A B C
D
D?
D?
D?
3. 遺伝子ファミリー・バリアントを
マルチノックダウン
遺伝子 A には数個の類似遺伝子の存在が知られているが，個々の
機能の重複度や，組織特異的な発現様式など，よくわかっていない。
ただし，アミノ酸レベルで保存されており，抗体では交差反応を
生ずる。そこで，個々の遺伝子に特異的な siRNA を設計し ”
siTrioTM
マルチ遺伝子ノックダウン法”を用いてシングル / ダブル / トリプル
ノックダウン実験を行う。
Ϩ
ϩ
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
Ϫ
A1
A2
A3
087
デザイン済み siRNA
miRNA
デザイン済み siRNA
カスタム siSET・カスタム siSET mini・siCombo
miRBase
LNA
siRNA 配列解析と 21 塩基 siRNA 合成のセット
抽出 / 精製
プロファイリング
使用目的
siRNA 配列解析を行い，その結果から（1，3，5）本（カスタム siSET mini では，
（1，2，3）本）の siRNA を合成するサービスです。
siSET，siSET mini では，ノックダウン効果に比重をおいた配列選択，siCombo では，オフターゲット回避に比重を置いた配列選択を行います。
合成する siRNA は，クラス X，25nmol（カスタム siSET mini では 5nmol）
，
（dTdT/UU オーバーハング）です。
共通配列からの選択・回避（オプション A，B）
，オフターゲットレポートサービスも別途追加可能です。
※クラス Z での合成，各種修飾基の付加も承ります。お問い合わせください。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
特長
過剰発現
（ベクター）
ノックダウン効果に比重をおいた配列選択
オフターゲット回避に比重を置いた配列選択
●サービス内容
カスタム
カスタム
カスタム
カスタム
カスタム
カスタム
siCombo-1（クラス X，25nmol）
siCombo-3（クラス X，25nmol）
siCombo-5（クラス X，25nmol）
●ターゲット配列デザイン
指定のターゲット mRNA 配列を元に，siRNA 配列を設計。独自のアルゴリズム B-Algo がノックダウン効率を
最大に，かつ配列特異的なオフターゲットを最小限に抑えるデザインを行います。
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
●生物種
カスタム合成
サービス
● ターゲット遺伝子情報
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
特に制限無し。但し，オフターゲット検索をするデータベースは Human / Mouse / Rat / Zebra のみ
※オーダー時に指定がない場合は，Human のデータベースを使用
お客様ご指定（アクセッション番号またはオリジナル配列も承ります）
（1）CDS 領域 +3' UTR （2）CDS 領域のみ （3）3' UTR 領域のみ
●解析範囲の指定
※オーダー時に指定がない場合は，CDS 領域 +3' UTR を解析
バリアントを同時にノックダウンするか否かは考慮しません。
※ホモロジー特別解析をご参照ください。
●バリアント
（1）オプション A（共通配列の回避：5 種まで）
●ホモロジー特別解析（オプション） （2）オプション B（共通配列から選択：5 種まで）
※ファミリー遺伝子をノックダウンしたい場合，交差を避けたい遺伝子がある場合，ヒト・マウス共通でノックダウンしたい場合などにご利用ください。
※ホモロジー特別解析の詳細は，p.83 をご参照ください。
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
siSET-1（クラス X，25nmol）
siSET-3（クラス X，25nmol）
siSET-5（クラス X，25nmol）
siSETmini-1（クラス X，5nmol）
siSETmini-2（クラス X，5nmol）
siSETmini-3（クラス X，5nmol）
●合成配列
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
●解析レポート
カスタム siSET・カスタム siSET mini
siCombo
コスモ・バイオにお任せ
当社にて配列選択し，そのまま合成手配へと進めます。
最終候補 5 配列より合成配列を選択
当社にお任せいただくこともできます。
なし
配列デザイン結果を製品添付書にてご提供。
オフターゲット情報は記載されません。
オフターゲットレポートサービスをご利用ください。
あり
配列デザイン結果とオフターゲット候補リストを製品
添付書にてご提供します。
ターゲット配列デザイン → 最終候補 5 候補から選択。
詳細なオフターゲットレポートをご希望の場合には
オプションサービスをご利用ください。
※合成配列を選択されたい場合は，オプションの解析レポートをご利用ください。
関連試薬
※配列選択をお任せいただく場合は，ご注文時にお申し付けください。
トランスフェク
ション試薬
■商品リスト
その他
［メーカー：MIR］
商品名
品番
包装
希望販売価格
SYD21-125
1 × 25nmol
¥48，
000
凍
○
ノックダウン重視
SYD21-325
SYD21-525
3 × 25nmol
5 × 25nmol
¥79，
000
¥108，
000
凍
○
凍
○
SYD21-105
1 × 5nmol
¥19，
800
凍
○
ノックダウン重視
SYD21-205
2 × 5nmol
¥38，
000
凍
○
カスタム siSET-1
カスタム siSET
カスタム siSET-3
カスタム siSET-5
カスタム siSET mini-1
貯蔵
技術情報
カスタム siSET mini-2
カスタム siSET mini-3
SYD21-305
3 × 5nmol
¥56，
000
凍
○
miRNA
プロファイリング
siCombo-1
siCombo-3
SYA21-125
SYA21-325
1 × 25nmol
3 × 25nmol
¥55，
000
¥100，
000
凍
○
凍
○
siCombo-5
SYA21-525
5 × 25nmol
¥150，
000
凍
○
オプションＡ：共通配列の回避
オプションＢ：共通配列からの選択
解析オプションオフターゲットレポートサービス
解析レポート
SDSN-A
SDSN-B
SKSV-RPTO
SKSV-RPT
1EACH
1EACH
1EACH
1EACH
¥10，
000
¥10，
000
¥10，
000
¥10，
000
̶
̶
̶
̶
siCombo
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
オプション
オフターゲット回避重視
※ ターゲット配列選出は，あくまでも統計的に最も良いと思われる配列を推薦させていただくサービスので，選出された配列の効果に対する責任は一切負いかねます。あらかじめご了承ください。
※ RNAi 効果の確認に用いるリアルタイム PCR 用プライマーカスタムデザインサービスにつきましては，p.103 をご覧ください。
ご注文方法
①NCBI ホームページのアクセッション番号を確認。
②コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）から購入申込書をダウンロード。
③購入申込書に商品名，アクセッション番号，種（ヒト・マウス・ラット等）を明記し当社取扱の代理店にご提出ください。
088
デザイン済み siRNA
デザイン済み siRNA
miRNA
Trilencer-27 siRNA キット
miRBase
LNA
21mer の siRNA デザインに比べて，10 倍以上の特異性と効果を発揮
抽出 / 精製
背景
プロファイリング
21mer の siRNA は ダ イ サ ー 産 物 を 模 倣 し た り，ダ イ サ ー に よ る
プロセシングを避ける問題点があります。一方，27mer の siRNA は，
ダイサープロセシングにより最適化され，21mer の siRNA と比較して
高い特異性を示します。
オ リ ジ ン テ ク ノ ロ ジ ー ズ 社 の Trilencer-27 siRNA キ ッ ト は，
GenBank の RefSeq コレクションから選択されたヒト，マウス，ラット
の目的遺伝子に特異的な 27mer の dicer-substrate duplex（3 コンス
トラクト）がセットされています。これらはスプライスされるエキソンや，
既知の SNP を含まないように設計されています。
ダイサーによる自然なプロセシングを受け，21mer の siRNA よりも
10 倍効果的かつ特異的にノックダウン実験を行うことが可能です。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
●ヒト，マウス，ラット遺伝子をゲノムワイドにカバー
●ノックダウンの効率が高く，最小限のインターフェロン応答
●70％ 以上のノックダウンを保証＊
siRNA
＊【保証内容】 下記条件を満たす場合で，Dicer-Substrate duplex 3 コンストラクトのうち少なく
とも 2 コンストラクトが qRT-PCR によって，70% 以上のターゲット mRNA のノックダウンを示
さない場合，RT-PCR のデータを確認させて頂いた上で，アドバイスまたは無償リプレース等の対応をさ
せて頂きます。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
・濃度 10nM で使用
・TYE-563 蛍光トランスフェクションコントロール duplex ( 品番 SR30002) により，90% を越える
トランスフェクション効率を確認
・HPRT ポジティブコントロール ( 品番 SR30003) により 90% のノックダウン効率を確認
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
構成内容
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
図 1 RNA interference の原理
●遺伝子特異的二本鎖 27 mer siRNA duplex
（各 2nmol）
（3 コンストラクト）
shRNA クローン
コレクション
●ネガティブコントロール（2nmol）
si/shRNA 発現
●RNase free siRNA duplex re-suspension buffer
ノックダウン検証
［メーカー：ORG］
商品検索の手順
1
2
si/shRNA
ライブラリー
3
①オリジーンテクノロ ジ ー 社 の ホ ー ム ペ ー ジ（http://www.origene.
com/siRNA/）上の検索欄にご希望の遺伝子名を入力します。
（今回は ABCA で検索します。
）
関連試薬
②下のプルダウンメニューを表示します。
siRNA を選択してください。
トランスフェク
ション試薬
③右の Go ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
その他
希望販売価格は ¥108,000 / 3 × 2nmol です。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
■関連製品
Trilencer-27 コントロール siRNA
商品名
［メーカー：ORG］
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Trilencer-27 Fluorescent-labeled transfection control siRNA duplex
SR30002
1nmol
¥28，
000
凍
○
Trilencer-27 HPRT Positive control siRNA duplex
Trilencer-27 Universal scrambled negative control siRNA duplex
SR30003
SR30004
1nmol
2nmol
¥28，
000
¥28，
000
凍
○
凍
○
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
089
デザイン済み siRNA
miRNA
siRNA 遺伝子サイレンサー
デザイン済み siRNA
miRBase
特長
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
A
●タンパク質コード遺伝子推定数の 99% 以上をターゲットとする
siRNA 商品をご用意しています。
・推定 23,775 のタンパク質コードヒト遺伝子の 99% 以上
・推定 25,654 のタンパク質コードマウス遺伝子の 99% 以上
B
●サンタクルズ社の siRNA は，各特異的な遺伝子の発現を抑制する
ようにデザインされており各末端に 2-3nt 3' オーバーハングを持つ，
1 種類以上の 20 ∼ 25nt の siRNA がプールされています。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●評価用にウェスタンブロット検出用かつ／または免疫蛍光細胞染色用
抗体 ，m R N A 分 解 検 出 用 の 遺 伝 子 特 異 的 R T - P C R プ ラ イ マ ー
（品番末尾：-PR）もご用意しています。さらに，トランスフェクション
試薬，バッファー，トランスフェクション効率をモニターできる蛍光標識
コントロール siRNA，ネガティブコントロール siRNA も別途ご利用
いただけます。
図 2 p53 siRNA（h）
（品番：SC-29435）を用いてメタノール固定した HeLa 細胞を免疫蛍光染色した。
（A）コントロール HeLa 細胞，
（B）siRNA を用いて p53 をノックダウンした HeLa 細胞。
各細胞は，p53 抗体（品番：SC-6243）でプローブした。
A
機能検証
B
siRNA プラスミド DNA
次世代
シークエンシング
siRNA 遺伝子サイレンサー
shRNA ࣞࣥࢳ࢘࢖ࣝࢫ⢏Ꮚ
siRNA
配列解析
サービス
核内に shRNA を転写
（品番：sc-29228）を用いてメタノール固定した HeLa 細胞を免疫蛍光染色した。
図３ c-Src siRNA（h）
（A) コントロール HeLa 細胞，(B)siRNA を用いて c-Src をノックダウンした HeLa 細胞。
各細胞は c-Src 抗体（品番：sc-18) でプローブした。
カスタム合成
サービス
shRNA
コントロール
siRNA
81 K –
デザイン済み
siRNA
A
< `PAK
Dicer
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
Dicer により siRNA
へプロセシング
shRNA クローン
コレクション
48 K –
48 K –
siRNA
si/shRNA 発現
< GAPDH
36 K –
ノックダウン検証
B
RISC
si/shRNA
ライブラリー
siRNA の巻き戻し
図 4 β PAK siRNA(h)（品番：sc-36181) をトランスフェクトした細胞をウェスタンブロッティング
で解析した。
（A) コントロール ノントランスフェクト HeLa 細胞，(B)siRNA を用いてβ PAK
をノックダウンした HeLa 細胞。β PAK(N-19) 抗体（品番：sc-1871) と，GAPDH(FL-335)
抗体（品番：sc-25778) で検出した。
活性化した RISC
［メーカー：SCB］
ターゲット mRNA と結合
関連試薬
サンタクルズ社 siRNA 商品
希望販売価格：￥48,000 / 10μM
トランスフェク
ション試薬
（50 ∼ 100 トランスフェクション）
ターゲット mRNA を分解
その他
※コスモ・バイオホームページ上「商品検索」に登録がない場合がございます。随時ご照会ください。
図 1
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■関連商品
siRNA サポート試薬
品名
Control siRNA
Control siRNA
（Fluorescein
Conjugate）
siRNA Dilution Buffer
siRNA Transfection
Reagent
siRNA Transfection
Medium
［メーカー：SCB］
内容
品番
包装
希望販売価格
sc-37007
10μM（10 回分）
¥15，
000
凍
○
●蛍光顕微鏡でトランスフェクション効率をモニタリングできるコントロール
●スクランブル配列
sc-36869
10μM（10 回分）
¥20，
000
凍
○
¥1，
000
冷
○
¥27，
000
冷
○
¥2，
000
冷
○
●siRNA 保存＆希釈用バッファー
（TRIS-EDTA based buffer, RNAse-free; pH8.0）
●細胞ダメージを最小限に抑えて siRNA を細胞にトランスフェクション
●HeLa，A549，Jurkat，NIH-3T3 をはじめとした様々なセルラインに
効率よく siRNA をトランスフェクション
●細胞トランスフェクションの直前に，siRNA 懸濁液と siRNA トランス
フェクション試薬に添加するのに適した血清使用量低減培地
sc-29527
sc-29528
sc-36868
1.5ml
0.3ml（50 - 100 回分）
20ml
※ siRNA サポート試薬は，サンタクルズ社 siRNA 商品を哺乳類細胞にデリバリーする実験用に最適化されています。リスト上に記載された容量は，12 ウェルプレートでの使用目安です。
090
貯蔵
●目的の siRNA トランスフェクション時のネガティブコントロール
●スクランブル配列
shRNA 配列解析（カスタム解析）
shRNA 配列解析（カスタム解析）
カスタム shSET（shRNA 配列解析＋組込み用 DNA 合成）
・shCombo（shRNA 解析＋ siRNA 合成）
miRNA
miRBase
LNA
siRNA で効果のある配列をそのままベクターで使用しても同じ効果を得られるとは限りません
shRNA 配列解析では，shRNA のメカニズムを考慮した配列候補を推薦します
抽出 / 精製
プロファイリング
バックグラウンド
shRNA 配列解析を行い，その結果からカスタム shSET ではベクター組込み用 DNA を，shCombo は予備実験用 siRNA を 1，3，または 5 セット
合成するサービスです。ご利用のベクターに合わせてカスタマイズ致します。
合成する DNA は純度 80％ 以上，5nmol 保証，約 70mer x 2 本，siRNA は純度 80％ 以上，3' オーバーハング dTdT，脱塩・脱保護，アニーリング
処理済み，25nmol，21mer です。
クラス Z での合成，合成 DNA の 5' リン酸化，siRNA の各種修飾基付加，shRNA 発現プラスミドカスタム構築などのオプションも併せて承ります
。
（P.100 をご参照ください）
特長
●すぐに shRNA 発現ベクターに組込み，shRNA コンストラクトで
ノックダウン効果の検討をしたい→カスタム shSET
●当社独自の配列選択アルゴリズムは実績平均 80％ 以上のノックダウン
効率
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
ご注文方法
●siRNA オリゴで予備実験を行い，ノックダウン効果の高い配列選択を
選択したい→ shCombo
定量
①NCBI ホームページのアクセッション番号を確認，
オリジナルの配列も承ります
機能検証
次世代
シークエンシング
②コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）
から購入申込書をダウンロード
●SNPs，ホモロジーを考慮，どこにミスマッチがあっても検出可能
③購入申込書に商品名，アクセッション番号，生物種およびご利用予定
のベクター情報を明記し当社取扱の代理店にご提出ください。
●ご利用のベクターにあわせて配列をカスタマイズ
●オプションにて共通配列からの選択や回避が可能
siRNA
配列解析
サービス
●配列デザイン結果は製品添付書に記載
カスタム合成
サービス
●サービス内容
カスタム shSET-1（DNA,5nmol）
カスタム shSET-3（DNA,5nmol）
カスタム shSET-5（DNA,5nmol）
●ターゲット配列デザイン
指定のターゲット mRNA 配列を元に，shRNA 配列を設計。
独自のアルゴリズム B-Algo がノックダウン効率を最大に，かつ配列特異的なオフターゲットを最小限に抑える
デザインを行います。
shCombo-1（siRNA,25nmol）
shCombo-3（siRNA,25nmol）
shCombo-5（siRNA,25nmol）
コントロール
siRNA
特に制限無し。但し，オフターゲット検索をするデータベースは Human / Mouse / Rat / Zebra のみ
●生物種
※オーダー時に指定が無い場合は，Human のデータベースを使用
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
●ターゲット遺伝子情報
お客様ご指定（アクセッション番号を指定 / オリジナル配列も承ります）
●ベクター別最適化
ベクターにあわせて配列をカスタマイズします。ご利用のベクターの商品名，販売元（市販の場合），コード番号，
プロモーターの種類，前後配列（制限酵素の切断サイトを含む），ループ配列をお知らせください。
（1）CDS 領域 +3' UTR （2）CDS 領域のみ （3）3' UTR 領域のみ
●解析範囲の指定
デザイン済み
siRNA
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
※オーダー時に指定が無い場合は，CDS 領域 +3' UTR を解析
バリアントを同時にノックダウンするか否かは考慮しません。
●バリアント
※ご希望の場合はホモロジー解析をご利用ください。
（1）オプション A（共通配列の回避：5 種まで）
●ホモロジー特別解析（オプション） （2）オプション B（共通配列から選択：5 種まで）
関連試薬
※ファミリー遺伝子をノックダウンしたい場合，交差を避けたい遺伝子がある場合，ヒト・マウス共通でノックダウンしたい場合などにご利用ください。
●合成配列
●解析レポート
カスタム shSET
shCombo
コスモ・バイオにお任せ
当社にて配列選択し，そのまま合成手配へと進めます。
最終候補 5 配列より合成配列を選択
当社にお任せいただくこともできます。
なし
配列デザイン結果を製品添付書にてご提供。
あり
si/shRNA 共通配列解析結果をレポートにてご提供。
ターゲット配列デザイン → 最終候補 5 候補から選択
※合成配列を選択されたい場合は，オプションの解析レポートをご利用ください。
トランスフェク
ション試薬
その他
※配列選択をお任せいただく場合は，ご注文時にお申し付けください。
技術情報
miRNA
プロファイリング
■商品リスト
［メーカー：MIR］
商品名
品番
カスタム shSET-1
組込み用 DNA を納品
SVD19-105
カスタム shSET-3
組込み用 DNA を納品
SVD19-305
カスタム shSET-5
組込み用 DNA を納品
SVD19-505
shCombo1
予備実験用 siRNA を納品
SVAV21-125
shCombo3
予備実験用 siRNA を納品
SVAV21-325
shCombo5
予備実験用 siRNA を納品
SVAV21-525
ホモロジー解析オプション：共通配列の回避（5 種まで）
ホモロジー解析オプション：共通配列からの選択（5 種まで）
解析オプションオフターゲット・レポートサービス
siRNA 発現用 DNA 組込みサービス
DNA 5' リン酸化オプション（1nmol 保証）
包装
2 × 5 nmol
希望販売価格
貯蔵
¥62，
000
凍
○
6 × 5 nmol
¥93，
000
凍
○
10 × 5 nmol
¥122，
000
凍
○
1 × 25 nmol
¥69，
000
凍
○
3 × 25 nmol
¥108，
000
凍
○
5 × 25 nmol
¥150，
000
凍
○
SDSN-A
SDSN-B
SKSV-RPTO
SV-VC
1EACH
1EACH
1EACH
1EACH
¥10，
000
¥10，
000
¥10，
000
¥75，
000
̶
̶
̶
凍
○
SVD5P-1
1 nmol
¥15，
000
凍
○
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
091
shRNA クローンコレクション
miRNA
shRNA クローンコレクション
OmicsLinkTM shRNA クローンコレクション
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
shRNA 発現クローンには，哺乳動物細胞発現ベクター psi-H1TM 及び
psi-U6TM とレンチウイルス発現システム psiLv-H1TM 及び psiLv-U6TM
があり，いずれも一時的または安定的な遺伝子サイレンシング実験でご利用
いただけま す。shRNA を 含 む 発 現 プ ラ ス ミ ド DNA ま た は ウ イ ル ス
粒子はターゲット細胞に取り込まれます。哺乳動物型プロモーター（H1
または U6）は，ステムループ構造をとり，ターゲット配列の転写を行い，
RNAi 機構で働く酵素により siRNA を生成します。RISC-shRNA 複合
体を形成することで，ターゲット遺伝子の mRNA が分解され，遺伝子
特異的サイレンシングが起こります（図 1）
。
特長
●全ての shRNA のターゲット配列は，独自のアルゴリズムで選択して
います。異なる長さ（19 ∼ 29mer）の shRNA は，オフターゲット
効果は最小限で高ノックダウン効率を示します。
●shRNA は，レンチウイルスや哺乳動物ベクターにプロモーターや
レポーター遺伝子とともにクローニングされています。
●ベクタープラスミドのトランスフェクションと，ウイルス感染の導入
効率は，EGFP レポータータンパク質によって確認できます。
●レンチウイルスベクターは，非分裂細胞やトランスフェクションが困難
なセルラインでも効果的に形質導入できます。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
●shRNA クローンのプロモーター，センス／アンチセンスターゲット
配列，ヘアピン，ターミネーター，リンカー配列を含む発現カセットの
塩基配列は全てシーケンス済みです。
過剰発現
（ベクター）
●70％ 以上のノックダウン効率を保証します。
機能検証
●ピューロマイシンで安定細胞株を選択できます＊。
＊ジーンコピア社ではノックダウン効率を検証しておりませんが，4 コンストラクトのうち少なくとも
1 コンストラクトが 70％ 以上のノックダウンを示さない場合には，アドバイス又はリプレース対応を
させていただきます。
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
図 1 H1 または U6 プロモーターを有するレンチウイルスまたは非ウイルス性 shRNA ベースのレンチウイルス発現ベクター
si/shRNA
ライブラリー
［メーカー：GCP］
■商品検索の手順
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
ジーンコピア社ホームページ（http：//www.genecopoeia.com）上の検索欄を開き，
shRNA を選択します。
【キーワード検索】
①ご希望の種を選択します。
②遺伝子名，Accession No.，UniGene ID，Entrez Gene ID，キーワードで検索できます。
その他
【Blast 検索】
①ご希望の種を検索し，シーケンスのタイプ（タンパク質またはヌクレオチド）を選択します。
技術情報
②ご希望の遺伝子のシーケンスを入力します。
右の Search ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
包装は全て 4 種類の shRNA コンストラクト / 1kit です。
miRNA
プロファイリング
希望販売価格はご照会ください。
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
092
shRNA クローンコレクション
shRNA クローンコレクション
miRNA
Lenti-Pac™ レンチウイルスパッケージングキット
miRBase
LNA
OmicsLink™ shRNA のレンチウイルスベクターと併せてお使いいただけます！
抽出 / 精製
GeneCopoeia 社の Lenti-Pac HIV および FIV 発現パッケージング
システムは，レンチウイルスパッケージングプラスミドミックス，eGFP
ポジティプコントロールプラスミド，ウイルス産生用に最適化された新規ト
ランスフェクション試薬の EndoFectin，力価を 5 ∼ 10 倍に増加させ
る 試 薬 の TiterBoost か ら 構 成 さ れ ま す。Genecopoeia 社 の ORF
cDNA，shRNA，miRNA レンチウイルスコンストラクトと併用した場合，
高力価を示し発現量も良好です。
HIV，FIV パッケージングシステムのどちらも，レンチウイルスパッケージ
ングに必須な因子を高発現するため，組換え転写体を効率よく感染性ウイル
ス粒子へとパッケージングするよう，またウイルス配列が自己複製しないよ
うにも設計されています。
構成内容
プロファイリング
Genecopoeia 社の ORF cDNA，shRNA，miRNA レンチウイルスコ
ンストラクトと併用した場合，以下のことが期待されます。
定量
● in vivo ，in vitro 問わず，ほとんどの 哺乳動物細胞に高効率での遺
伝子導入が可能
検出
● 導入遺伝子を高発現（ORF 発現クローン）
● 標的 mRNA に対して高いノックダウン効率（shRNA クローン）
● 高効率な標的遺伝子の翻訳阻害または mRNA 分解（miRNA クローン）
● 自己不活性化機構と，不本意なウイルス複製防止機構
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
構成内容
次世代
シークエンシング
● FIV / HIV パッケージングミックス
● eGFP ポジティブコントロールプラスミド
● EndoFectin レンチトランスフェクション試薬
● TiterBoost ウイルス力価試薬
siRNA
■商品リスト
［メーカー：GCP］
商品名
Lenti-Pac™ FIV Expression Packaging Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
FPK-LVTR-20
20RXN
ご照会
冷
○
Lenti-Pac™ FIV Expression Packaging Kit
FPK-LVTR-40
40RXN
ご照会
冷
○
Lenti-Pac™ HIV Expression Packaging Kit
HPK-LVTR-20
20RXN
ご照会
冷
○
Lenti-Pac™ HIV Expression Packaging Kit
HPK-LVTR-40
40RXN
ご照会
冷
○
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
■関連商品
shRNA クローン
コレクション
Lenti-Pac 293Ta レンチウイルス パッケージング セル ライン
si/shRNA 発現
GeneCopoeia 社は，レンチウイルス由来ベクターの ORF cDNA，shRNA，miRNA コンストラクト用に最適化されたパッケージングプラスミドを用
いることで高力価なウイルス産生が可能な 293Ta パッケージング細胞も提供します。Lenti-Pac 293Ta パッケージング細胞では簡単かつ効率的なトラ
ンスフェクションが可能で，ウイルスタンパク質を高発現させることができます。
■商品リスト
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
［メーカー：GCP］
商品名
293Ta Lentiviral packaging cell line: 1.5 x 106 cells
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
CLV-PK01
1unit
ご照会
凍
□
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
Lenti-Pac™ レンチウイルス 濃縮溶液
Lenti-Pac レンチウイルス濃縮溶液は，迅速かつ簡単にレンチウイルス粒子を濃縮する目的で作られました。本試薬とレンチウイルス培養液を混合し，短
時間のインキュベート後に一般的な遠心分離をすることで，濃縮が完了します。
■商品リスト
その他
［メーカー：GCP］
商品名
Lenti-Pac™ Lentivirus Concentration Solution (6x)
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
LPR-LCS-01
50ml
ご照会
冷
○
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
093
si / shRNA 発現
miRNA
レンチウイルス shRNA コンストラクト カスタム構築サービス
shRNA 発現
miRBase
LNA
Tet 制御可能なベクターもあります，配列設計から shRNA コンストラクト構築までおまかせ！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
使用目的
本 サ ー ビ ス は，お 客 様 の 標 的 遺 伝 子 に つ い て Cellecta（CLT）社 で
shRNA 設計を行い，ご指定頂いたベクターをカスタマイズして配列を組
み込んだ shRNA コンストラクト，およびパッケージング済みウイルス粒
子をご提供するサービスです。単一の遺伝子に対して個別チューブで，ある
いは多数の遺伝子に対してアレイ型 shRNA ライブラリーとして約 2-6
週間でお届けします。1 遺伝子あたり 1 ∼ 100 種程度の shRNA 構築
を行うことができますのでご希望のデザイン数をご指定ください。CLT 社
のレンチウイルスベクターより，蛍光マーカーや抗生物質耐性遺伝子，マー
カー用プロモーターや shRNA 用プロモーター，tet- 制御型もしくは定常
型 shRNA 発現などに応じて，発現ベクターをお選び頂きます。ダブル
マーカーのレンチウイルスベクター構築も可能です。
ご注文方法
下記の内容を，コスモ・バイオ販売支援部（[email protected]）
へご連絡ください。
１）標的遺伝子情報（生物種（哺乳類のみ対応），遺伝子名，RefSeq
アクセッション番号）
２）遺伝子ごとの shRNA 構築数：1 ∼ 100 構築（1 遺伝子あたり
3 種類以上の shRNA 構築を行うことを CLT 社では推奨
３）図 .1 よりクローニングベクターのカスタマイズのご希望
● 選択マーカー：シングルもしくはダブルマーカー (GFP RFP，
Puro ，Bleo など )
● マーカー用プロモーター：UbiC，EF1，PGK，CMV など
● shRNA 用プロモーター：H1，U6
次世代
シークエンシング
● shRNA 発現形態：Tet- 制御，定常発現
● shRNA カセット：バーコード化 shRNA（プール型 shRNA
ライブラリーへコントロールとして加える場合に有用）
siRNA
RSV 5’LTR
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
AmpR
pRSI-U6-(sh)-UbiCRFP-2A-Puro
デザイン済み
siRNA
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ユニークなshRNA特異的bar-code
［bar-dode は三重（triplicate）まで設定可能］
ご要望にあわせてカスタマイズ
RRE
コントロール
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
Cellecta pRSI shRNA 発現
レンチウイルスベクター
gag
U6
U6
BbsI
SV40 PolyA
ノックダウン検証
RFP
マーカー:
RFP
2A
Puro
3’LTR
T6
Gex2
shRNA:
最適化配列デザイン
マーカープロモーター:
hEF1α CMV
hPGK CMV/Ferritin
hUbiC
図 2 shRNA カセット略図
お客様の目的に応じた shRNA を設計が可能です。Illumina 社ハイスループットシークエンサーを用いて
ユニークな shRNA 特異的 bar-code 部分を読み込みます。データの統計的有意性を向上させる為にも，
bar-code を 3 重（triplicate）とすることを Cellecta 社では推奨致しております。
PuroR 2A
・shRNA を定常発現する場合：
次の中から任意でマーカーを
２つ選択 (GFP,RFP,PuroR,
NeoR,BleoR,etc)
si/shRNA
ライブラリー
H1
プロモーター : U6
H1-Tet
U6-Tet
BbsI
UbiC
LTR
UbiC
shRNA
cPPT
SV40 ORI
Gex1
env
~7.5 - 8.5 kb
pUC ORI
致します（左図はデフォルト）
・tet- 抑制型 shRNA 発現の場合：
tet 抑制体 (TetR) および次の中
から任意でマーカーを１つもし
くは２つ選択 (GFP,RFP,PuroR,
NeoR,BleoR,etc)
図 1 レンチウイルス shRNA コンストラクトカスタム構築用ベクター カスタマイズオプション略図
関連試薬
■商品リスト
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
094
［メーカー：CLT］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
Custom Lentiviral Expression Construct--single shRNA,
standard vector (Plasmid only)
CVSHC-PS
1 SERV.
ご照会
室
○
Custom Lentiviral Expression Construct--single shRNA,
standard vector (plasmid and packaged construct)
CVSHC-VS
1 SERV.
ご照会
室
○
si / shRNA 発現
shRNA 発現
HuSH-29 ゲノムワイド shRNA プラスミド（デザイン済）
miRNA
miRBase
LNA
蛍光付きベクターで二重ノックダウンに最適
抽出 / 精製
HuSH-29 は確実なノックダウンが起きるように，ゲノムワイド（ヒト，マウス，ラット）にデザインされた shRNA プラスミドです。
特長
構成内容
●効果的な HuSH-29 のデザイン
21mer よりも効果的な 29mer のショートヘアピン構造の shRNA。
・GC 含量 50％ を基準にし，30 ∼ 70％ 内で作製。
・GC 含量は，3' 末端よりも 5' 末端が高くなるように選択。
・内部に繰り返し配列を含まないように設計。
・locus ID とできるだけ多くの転写開始点が得られるように
ターゲット特異的塩基配列を設計。
●4 種類のレトロウイルスベクターをご用意
・pRS：蛍光なしのベーシックなレトロウイルスベクター
・pGFP-V-RS：トランスフェクションのモニター用
・pGEP-B-RS：pGFP-V-RS と異なる選択マーカー 注 1）
・pRFP-C-RS：二重ノックダウンに理想的。
●70% 以上の遺伝子ノックダウンを保証
プロファイリング
●精製済みプラスミド
目 的 遺 伝 子 shRNA プ ラ ス ミ ド
（4 コンストラクト，各 5μg Readyto-use）
●コントロールプラスミド
次の 2 つのネガティブコントロール
が含まれています。
・s h R N A カ セ ッ ト イ ン サ ー ト を
発現しないプラスミド。
・2 9 m e r ス ク ラ ン ブ ル s h R N A
カセットを持つプラスミド
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
図 1 ベクターマップ
機能検証
次世代
シークエンシング
注 2）
●多彩なアプリケーション
一過性・安定性トランスフェクション，レトロウイルス感染等，幅広い
トランスフェクションに対応可能。
siRNA
注 1）pGEP-B-RS ベクターでのご注文を希望される場合，カスタム作製となりますので，別途お見積もり
が必要になります。 [email protected] までご照会ください。
注 2）オリジンテクノロジー社では全てのコンストラクトのノックダウンを検証しておりませんが，
４コンストラクトのうち少なくとも１コンストラクトが 70% 以上のノックダウンを示さない
場合には，アドバイスまたはリプレース対応をさせていただきます。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
■ベクター比較表
pRS
pGFP-V-RS
pGFP-B-RS 注1）
pRFP-C-RS
なし
アンピシリン
緑
カナマイシン
緑
カナマイシン
赤
特長
蛍光標識
大腸菌の選択マーカー
哺乳細胞の選択マーカー
ピューロマイシン
一過性もしくは安定化トランスフェクション
ピューロマイシン ブラスチシジン
可能
レトロウイルスパッケージング
コントロール
siRNA
クロラムフェニコール
Scrambled shRNA (GFP Vector) shRNA against RFP (GFP Vector)
+
+
Scrambled shRNA (RFP Vector) shRNA against GFP (RFP Vector)
ピューロマイシン
可能
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
図 2 二重ノックダウン実験
［メーカー：ORG］
■商品検索の手順
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
①オリジーン社ホームページ（http：//www.origene.com/shrna/）
上の検索欄にご希望の遺伝子名を入力します（今回は“abca1”を検索し
ます）
。
②右のプルダウンメニューを表示します。
ヒト由来の遺伝子を探す場合は→ Human shRNA
マウス由来の遺伝子を探す場合は→ Mouse shRNA
ラット由来の遺伝子を探す場合は→ Rat shRNA
を選択してください。
③右の Go ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
ノックダウン検証
1
2
3
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
pRS, pGFP-V-RS ベクター商品 : 希望販売価格：￥164,000 / kit
pRFP-C-RS ベクター商品 : 希望販売価格：￥179,000 / kit
pGFP-B-RS ベクター商品 : 希望販売価格：ご照会（カスタムでの作製）
トランスフェク
ション試薬
その他
■関連商品
shRNA コントロールベクター
●ネガティブコントロール
［メーカー：ORG］
商品名
HuSH shRNA Cloning Vector（pRS Vector）
ベクター
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
pRS
TR20003
5μg
¥42，
000
凍
○
HuSH shRNA GFP Cloning Vector（pGFP-B-RS）
HuSH shRNA GFP Cloning Vector（pGFP-V-RS）
pGFP-B-RS
pGFP-V-RS
TR30018
TR30007
5μg
5μg
¥42，
000
¥42，
000
凍
○
凍
○
HuSH shRNA RFP Cloning Vector（pRFP-C-RS）
Non-effective 29-mer scrambled shRNA cassette in pGFP-B-RS Vector
pRFP-C-RS
pGFP-B-RS
TR30014
TR30019
5μg
5μg
¥42，
000
¥42，
000
凍
○
凍
○
Non-effective 29-mer scrambled shRNA cassette in pGFP-V-RS Vector
pGFP-V-RS
TR30013
5μg
¥42，
000
凍
○
Non-effective 29-mer scrambled shRNA cassette in pRFP-C-RS Vector
pRFP-C-RS
TR30015
5μg
¥42，
000
凍
○
pRS
TR30012
5μg
¥42，
000
凍
○
ベクター
品番
包装
希望販売価格
HuSH 29-mer Against Enhanced GFP（pRS）
pRS
TR30001
5μg
¥42，
000
凍
○
HuSH 29-mer Against Luciferase Protein（pRS）
pRS
TR30002
5μg
¥42，
000
凍
○
pRFP-C-RS
TR30016
5μg
¥42，
000
凍
○
pRS
TR30009
5μg
¥42，
000
凍
○
pGFP-V-RS
TR30017
5μg
¥42，
000
凍
○
Non-effective 29-mer scrambled shRNA cassette in pRS Vector
●ポジティブコントロール
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
［メーカー：ORG］
商品名
HuSH 29-mer Against tGFP（pRFP-C-RS）
HuSH 29-mer Against tGFP（pRS）
HuSH 29-mer Against tRFP（pGFP-V-RS）
貯蔵
095
si / shRNA 発現
miRNA
shRNA 発現
miRBase
LNA
shRNA ベクターシステム
（プラスミドベース＆レンチベース）
1 本 ( 種類 ) のオリゴ DNA だけで shRNA クローンを作製できます！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
構成内容
●Ready-to-use：制限酵素処理やベクター精製は必要ありません。
●各ベクター（20μl）
●簡単なクローニング：shRNA をコードした完全な回文にデザインした
一本鎖オリゴ（図 1）は，同じオリゴとアニールして二本鎖となります
（図 2A）
。
●10 × アニーリングバッファー（100μl）
●ネガティブコントロール（20μl）
●シークエンシング・プライマー（10μM）
（30μl）
●高効率，低バックグラウンド：二本鎖オリゴの 5' -AAAA は，ベク
ターの 5' -TTTT にライゲーションします。ベクターの 5' -TTTT
突出は，セルフライゲーションしないため，ライゲーション効率が増加
し，クローニングバックグラウンドが低下します（図 2B）
。
●3 種類の shRNA 発現プロモーターの選択：ヒト H1（H1），ヒト
U6（hU6）
，マウス U6（mU6）プロモーターからお選びください。
図 1 shRNA 配列をコードしたオリゴ DNA の構造
●経済的：1 本のオリゴ DNA を用意するだけで shRNA 発現クロー
ン の 作 製 が 可 能 で す（通 常 2 本（種 類）
）
。ま た，使 用 す る オ リ ゴ
DNA の長さは，他の一般的な shRNA ベクターよりも短いものと
なっています。
プロトコール
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
1.shRNA をコードするオリゴ DNA を設計します。
ステムループ配列：19-21nt のターゲット遺伝子配列，10nt のループ
配列（TTGGATCCAA），そしてアンチセンスターゲット遺伝子配列の，
センス - ループ - アンチセンス配列（48-52nt）を設計，ご用意ください。
このオリゴ DNA は完全な回文となるため，同じオリゴと相補的に
アニールして 2 本鎖オリゴとなり，2 本鎖オリゴの 5' -AAAA 突出
塩基は，ベクターの 5' -TTTT 突出塩基にライゲーションします。
図 2 pRNAi/pLV-RNAi
クローニングシステム
A：2 つの全く同じ一本鎖オ
リゴ DNA をお互いにア
ニールして 5' -AAAA 突
出の二本鎖オリゴを作
製 す る。一 本 鎖 オ リ ゴ は
21nt のターゲット配列
（緑），10nt ル ー プ 配 列
（TTGGATCCAA），タ ー
ゲット配列の 21nt アン
チセンス（赤）をコードして
いる。
B：アニールした二本鎖オリゴ
の 5' -AAAA はベクターの
5' -TTTT とだけライゲー
ションする。
2.shRNA ターゲット配列の選択は，一般的にターゲット遺伝子の発現
において，少なくとも 2 種類の 70% 以上のノックダウン効果を示
す shRNA を同定するためには，１ターゲット遺伝子につき，３−５
のターゲット配列を選択することを推奨しています。
pRNAi ベクターシステム
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
pRNAi ベ ク タ ー シ ス テ ム は，
ステムループ配列をコードする二本鎖
DNA オリゴヌクレオチドのクローニングを簡単で高効率，経済的に行えるシ
ステムです。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
図 3 pRNAi ベクターマップ
図４ リアルタイム PCR とウェスタンブロッティングによるノックダウン効率の測定
■ pRNAi ベクター商品リスト（希望販売価格￥59,000，包装 1kit（20 回分），貯蔵 − 20℃です。）
プロモーター
Pol Ⅲ プロモーター
H1
human U6
mouse U6
［メーカー：BOT］
セレクションマーカー
品名
品番
品名
品番
品名
品番
ピューロマイシン
ハイグロマイシン
ネオマイシン
ブラスチシジン
GFP
pRNAi-H1-puro
SORT-A01
pRNAi-hU6-puro
SORT-A02
pRNAi-mU6-puro
SORT-A03
pRNAi-H1-hyg
SORT-A04
pRNAi-hU6-hyg
SORT-A05
pRNAi-mU6-hyg
SORT-A06
pRNAi-H1-neo
SORT-A07
pRNAi-hU6-neo
SORT-A08
pRNAi-mU6-neo
SORT-A09
pRNAi-H1-bsd
SORT-A10
pRNAi-hU6-bsd
SORT-A11
pRNAi-mU6-bsd
SORT-A12
pRNAi-H1-green
SORT-A13
pRNAi-hU6-green
SORT-A14
pRNAi-mU6-green
SORT-A15
カスタムデザインのご相談も承っております。お問い合わせは [email protected] までお気軽にどうぞ。
096
si / shRNA 発現
pLV-RNAi ベクターシステム
miRNA
pLV-RNAi は，
トランスフェクションが困難なモデル系の場合に，レンチ
ウイルストランスダクションによって細胞に RNAi のデリバリーを効率良
く行うことができます。
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
図 5 pLV-RNAi ベクターマップ
機能検証
図 6 pLV-RNAi ベクターマップを使用した遺伝子抑制のウェスタンブロッティング結果
次世代
シークエンシング
■ pLV-RNAi ベクター商品リスト（包装 1kit（20 回分），貯蔵− 20℃です。）
プロモーター
Pol Ⅲ
プロモーター
Pol Ⅱ
プロモーター
CMV
H1
EF1a
品名
human U6
EF1a
mPGK
EF1a
mPGK
ブラスチシジン
¥74，
000
pLV-H1-CMV-red
-
-
-
-
SORT-B01
SORT-B10
pLV-H1-EF1a-red
品名
品名
SORT-B02
pLV-H1-mPGKgreen
SORT-B03
pLV-hU6-CMVgreen
SORT-B11
pLV-H1-EF1a-puro pLV-H1-EF1a-bsd
GFP- ブラスチシジン RFP- ブラスチシジン RFP- ピューロマイシン
¥93，
000
¥93，
000
¥93，
000
-
-
-
-
-
-
pLV-H1-EF1aGFP-Bsd
pLV-H1-EF1a-RFPBsd
-
SORT-B19
SORT-B22
SORT-B25
SORT-B27
-
pLV-H1-mPGK-red
-
-
-
-
-
SORT-B12
-
-
-
-
-
pLV-hU6-CMV-red
-
-
-
-
-
品番
SORT-B04
SORT-B13
-
-
-
-
-
品名
pLV-hU6-EF1agreen
pLV-hU6-EF1a-red
pLV-hU6-EF1apuro
pLV-hU6-EF1absd
-
-
-
SORT-B20
SORT-B23
-
-
-
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
品番
SORT-B05
SORT-B14
品名
pLV-hU6-mPGKgreen
pLV-hU6-mPGKred
-
-
-
-
-
SORT-B06
pLV-mU6-CMVgreen
SORT-B15
-
-
-
-
-
pLV-mU6-CMV-red
-
-
-
-
-
ノックダウン検証
SORT-B16
pLV-mU6-EF1ared
pLV-mU6-EF1apuro
pLV-mU6-EF1absd
pLV-mU6-EF1aGFP-Bsd
pLV-mU6-EF1aRFP-Bsd
pLV-mU6-EF1aRFP-Puro
si/shRNA
ライブラリー
品名
品番
Mouse U6
ピューロマイシン
¥74，
000
pLV-H1-EF1agreen
品番
CMV
RFP
¥74，
000
品名
品番
CMV
GFP
¥74，
000
pLV-H1-CMVgreen
品番
品番
mPGK
［メーカー：BOT］
セレクションマーカー
品名
SORT-B07
pLV-mU6-EF1agreen
品番
SORT-B08
SORT-B17
SORT-B21
SORT-B24
SORT-B26
SORT-B28
SORT-B32
品名
pLV-mU6-mPGKgreen
pLV-mU6-mPGKred
-
-
-
-
-
品番
SORT-B09
SORT-B18
-
-
-
-
-
si/shRNA 発現
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
097
si / shRNA 発現
miRNA
shRNA 発現
shRNA プラスミド
miRBase
特長
LNA
抽出 / 精製
●サンタクルズ社の shRNA プラスミドは，19 ∼ 25nt（＋ヘアピンループ）のレンチウイルスベクタープラスミドが 3 ∼ 5 種類プールされています。
●shRNA 配列は，サンタクルズ社の siRNA 遺伝子サイレンサー製品と同じものを用いています。
プロファイリング
●発現プロモーターは，H1 プロモーターを使用。
●自己復製能が欠損したレンチウイルスベクターを，使用しております。
定量
●Transfection-Ready のプラスミド DNA は，一時的または長期的なノックダウンが可能です。
※長期的なノックダウンの場合は，ピューロマイシンを選択マーカーとします。
検出
●遺伝子発現ノックダウンのモニターにお使いいただけるコントロール抗体や RT-PCR プライマーもご用意しています。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
●99％ 以上のヒトおよびマウス遺伝子，56% 以上のラット遺伝子に対する shRNA をご用意しています。
●最適な導入効果を得るため，shRNA Plasmid Transfection Reagent（品番：SC-108061）や，shRNA Plasmid Transfection Medium
（品番：SC-108062）をご用意しています。
［メーカー：SCB］
過剰発現
（ベクター）
サンタクルズ社 shRNA プラスミド
機能検証
次世代
シークエンシング
【品番末尾 -SH の商品】希望販売価格：￥97,000 / 20μg
※コスモ・バイオホームページ上「商品検索」に登録がない場合がございます。随時ご照会ください。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
shRNA 発現
shRNA レンチウイルス粒子
特長
●サンタクルズ社の shRNA レンチウイルス粒子は，ターゲット特異的な 19 ∼ 25nt（＋ ヘアピンループ）の発現コンストラクトが 3 ∼ 5 種類プールさ
れています。
●shRNA 配列は，サンタクルズ社の siRNA 遺伝子サイレンサー製品と同じものを用いています。
●発現プロモーターは，H1 プロモーターを使用。
●自己復製能が欠損したレンチウイルスベクターを，使用しております。
●Transfection-Ready のウイルス粒子は，哺乳動物細胞（ヒトやマウス等）での遺伝子サイレンシングを可能にします。
●遺伝子発現ノックダウンのモニターにお使いいただけるコントロール抗体や RT-PCR プライマーもご用意しています。
●99％ 以上のヒトとマウス遺伝子に対する shRNA レンチウイルス粒子をご用意しています。
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
●サンタクルズ社が提供するコントロール shRNA レンチウイルス粒子は，スクランブル配列のため，細胞 mRNA を特異的に分解しません。
この製品は 200μl（1 x 106 IFU）のウイルス粒子としてご用意しています。
［メーカー：SCB］
si/shRNA
ライブラリー
サンタクルズ社 shRNA レンチウイルス粒子
【品番末尾 -V の商品】希望販売価格：￥117,000 / 200μl（1 x 106 IFU）
※コスモ・バイオホームページ上「商品検索」に登録がない場合がございます。随時ご照会ください。
カルタヘナ：本商品群は「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」
（通称カルタヘナ法）の使用規制対象品です。ご使用に際しては，規制に即し適切にお取り扱いください。
関連試薬
siRNA プラスミド DNA
トランスフェク
ション試薬
siRNA 遺伝子サイレンサー
shRNA ࣞࣥࢳ࢘࢖ࣝࢫ⢏Ꮚ
その他
核内に shRNA を転写
shRNA
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
Dicer
Dicer により siRNA
へプロセシング
siRNA
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
RISC
siRNA の巻き戻し
活性化した RISC
ターゲット mRNA と結合
ターゲット mRNA を分解
098
si / shRNA 発現
miRNA
shRNA アデノウイルス粒子
shRNA 発現
miRBase
LNA
ノックダウン効率は，qRT-PCR またはウェスタンブロッティングで確認済！
抽出 / 精製
背景
シリオンバイオテック社の検証済み shRNA アデノウイルス粒子は，
迅速，簡単かつ便利に RNAi アッセイを始めることができます。多数の
重要なターゲットに対する shRNA アデノウイルス粒子をご用意しており，
80% の mRNA 阻害効率を示します。また，アデノウイルスベクターは，大
部分のヒトやげっ歯類細胞等に幅広く形質導入できます。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
構成内容
過剰発現
（オリゴ）
ベクター：E1/E3 deleted adenoviral serotype 5 vector
過剰発現
（ベクター）
発現カセット：shRNA under control of human U6 promoter
図 1 筋芽細胞における Chip ノックダウンのウェスタンブロッティング解析コントロールベクター（レー
ン 1）と Chip mRNA 対する shRNA を発現するアデノウイルスベクター Ad-shChip（レーン
2）を導入した筋芽細胞の溶出液における Chip 発現（矢印）を示すウェスタンブロット。
希望販売価格：ご照会
機能検証
次世代
シークエンシング
包装：1 x 109 IU
■商品リスト
［メーカー：SIR］
siRNA
品名
Ad-sh-AKAP8
遺伝子名
AKAP8
適用種
mouse
Ref.Seq
NM_019774
品番
SB-P-AV-019774-01
Ad-sh-AKT1
Ad-sh-AKT2
AKT1
AKT2
human
human
NM_005163
NM_001626
SB-P-AV-005163-01
SB-P-AV-001626-01
Ad-sh-AKT3
Ad-sh-AurA
AKT3
AurA
human
human
NM_005465
NM_198433
SB-P-AV-005465-01
SB-P-AV-198433-01
Ad-sh-BAK
Ad-sh-BAX
BAK
BAX
human
human
NM_001188
NM_004324
SB-P-AV-001188-01
SB-P-AV-004324-01
Ad-sh-BCL2
Ad-sh-BCL-xL
Ad-sh-BCR
BCL2
BCL-xL
BCR
human
human
human
NM_000657
NM_138578
NM_004327
SB-P-AV-000657-01
SB-P-AV-138578-01
SB-P-AV-004327-01
Ad-sh-BECN1
Ad-sh-BECN1
Ad-sh-BID
BECN1
BECN1 ×
BID
human
mouse
human
NM_003766
NM_003766
NM_197967
SB-P-AV-003766-01
SB-P-AV-003766-01
SB-P-AV-197967-01
Ad-sh-BIRC3
Ad-sh-CASP3
Ad-sh-CASP3
BIRC3
CASP3
CASP3
human
human
Sus scrofa
NM_001165
NM_032991
NM_214131
SB-P-AV-001165-01
SB-P-AV-032991-01
SB-P-AV-214131-01
Ad-sh-CASP6
CASP6
human
NM_001226
SB-P-AV-001226-01
Ad-sh-CASP7
Ad-sh-CASP8
Ad-sh-CASP9
Ad-sh-CAT
Ad-sh-CD31
Ad-sh-CD4
CASP7
CASP8
CASP9
CAT
CD31
CD4
human
human
human
human
human
mouse
NM_033338
NM_001228
NM_001229
NM_001752
NM_000442
NM_013488
SB-P-AV-033338-01
SB-P-AV-001228-01
SB-P-AV-001229-01
SB-P-AV-001752-01
SB-P-AV-000442-01
SB-P-AV-013488-01
si/shRNA
ライブラリー
Ad-sh-CD63
CD63
mouse
NM_007653
SB-P-AV-007653-01
関連試薬
Ad-sh-CDK5
Ad-sh-CDK6
Ad-sh-CDK9
Ad-sh-CEACAM 1
Ad-sh-Chip
Ad-sh-DICER 1
Ad-sh-E-Cadherin
Ad-sh-EGFR
Ad-sh-FADD
Ad-sh-FAIM2
Ad-sh-FGF2
Ad-sh-FOS
Ad-sh-FOS
Ad-sh-GAL1
Ad-sh-GAL3
Ad-sh-GNAS
Ad-sh-GSK3B
Ad-sh-IER3
Ad-sh-IKKa
Ad-sh-IKKb
Ad-sh-IKKg
Ad-sh-JAK1
Ad-sh-LEF1
Ad-sh-LMNA
Ad-sh-LMNA
Ad-sh-MDR1
Ad-sh-MET
Ad-sh-MET
CDK5
CDK6
CDK9
CEACAM 1
Chip
DICER 1
E-Cadherin
EGFR
FADD
FAIM2
FGF2
FOS
FOS
GAL1
GAL3
GNAS
GSK3B
IER3
IKKa
IKKb
IKKg
JAK1
LEF1
LMNA ×
LMNA
MDR1
MET
MET
human
human
human
human
human
human
human
human
human
human
human
human
mouse
human
human
Sus scrofa
human
human
human
human
human
human
human
human
mouse
human
mouse
human
NM_004935
NM_001259
NM_001261
NM_001712
NM_005861
NM_030621
NM_004360
NM_005228
NM_003824
NM_012306
NM_002006
NM_005252
NM_010234
NM_002305
NM_002306
NM_214312
NM_002093
NM_003897
NM_001278
NM_001556
NM_003639
NM_004972
NM_016269
NM_002306
NM_001002011
NM_000927
NM_008591
NM_008591
SB-P-AV-004935-01
SB-P-AV-001259-01
SB-P-AV-001261-01
SB-P-AV-001712-01
SB-P-AV-005861-01
SB-P-AV-030621-01
SB-P-AV-004360-01
SB-P-AV-005228-01
SB-P-AV-003824-01
SB-P-AV-012306-01
SB-P-AV-002006-01
SB-P-AV-005252-01
SB-P-AV-010234-01
SB-P-AV-002305-01
SB-P-AV-002306-01
SB-P-AV-214312-01
SB-P-AV-002093-01
SB-P-AV-003897-01
SB-P-AV-001278-01
SB-P-AV-001556-01
SB-P-AV-003639-01
SB-P-AV-004972-01
SB-P-AV-016269-01
SB-P-AV-002306-01
SB-P-AV-001002011-01
SB-P-AV-000927-01
SB-P-AV-008591-01
SB-P-AV-008591-01
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
099
si / shRNA 発現
品名
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
遺伝子名
Ad-sh-MMP9
Ad-sh-mTOR
適用種
MMP9
mTOR
Ref.Seq
品番
Sus scrofa
human
NM_001038004
NM_004958
SB-P-AV-001038004-01
SB-P-AV-004958-01
Ad-sh-NOTCH 1
NOTCH 1
human
NM_017617
SB-P-AV-017617-01
Ad-sh-P53 (TP53)
P53 (TP53)
human
NM_000546
SB-P-AV-000546-01
Ad-sh-PIK3CA
Ad-sh-PKC-alpha
PIK3CA
PKC-alpha
human
mouse
NM_006218
NM_011101
SB-P-AV-006218-01
SB-P-AV-011101-01
Ad-sh-RB
RB
human
NM_000321
SB-P-AV-000321-01
Ad-sh-SIRT 1
SIRT 1
human
NM_012238
SB-P-AV-012238-01
Ad-sh-SOD1
Ad-sh-STK16
SOD1
STK16
human
human
NM_000454
NM_003691
SB-P-AV-000454-01
SB-P-AV-003691-01
Ad-sh-Survivin
Survivin
human
NM_001168
SB-P-AV-001168-01
Ad-sh-TLR3
TLR3
rat
NM_198791
SB-P-AV-198791-01
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
siRNA 発現用 DNA 組込みサービス
si/shRNA 発現
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
お手持ちのベクターでご希望の si/shRNA を発現するコンストラクトをカスタム構築します
使用目的
特長
本製品はお手持ちの shRNA 発現ベクターにご希望の si/shRNA を
発 現 す る た め の DNA を 組 込 み，コ ン ス ト ラ ク ト を カ ス タ ム 構 築 す る
サービスです。組込み用の DNA 合成や shRNA 配列デザイン（p.83,
p.91 をご参照ください）も承ります。DNA 配列を組込み，シークエンシン
グにより周辺配列の確認を行います。
●他社のベクターでも承ります
納品内容
ご注文方法
●QC データ（シークエンシング）も添付します
●shRNA 配列解析も別途承ります（p.83，p.91 をご参照ください）
①コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）
から購入申込書をダウンロード
●si/shRNA 発現プラスミド
●ベクター，DNA などの残った材料
②購入申込書にベクター情報，shRNA クローニングサイト情報など
必要事項をを明記し当社取扱の代理店にご提出ください。ご希望の
オプションがある場合には合わせてご明記ください。
●QC データ（シークエンシング）
●納品案内書（作業報告）
shRNA クローン
コレクション
■商品リスト
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
100
［メーカー：MIR］
商品名
siRNA 発現用 DNA 組込みサービス
カスタム DNA 70-75 塩基
品番
包装
希望販売価格
SV-VC
1SERV.
¥75，
000
貯蔵
凍
○
SV70-5
5nmolx2
¥20，
000
凍
○
DNA HPLC 精製（1nmol 保証）
SVDHP-1
1nmol
¥12，
000
凍
○
DNA PAGE 精製（1nmol 保証）
SVDPG-1
1nmol
¥13，
000
凍
○
DNA 5' リン酸化オプション（1nmol 保証）
SVD5P-1
1nmol
¥15，
000
凍
○
si / shRNA 発現
miRNA
iLentiTM RNAi 発現システム
siRNA 発現
miRBase
LNA
アプライドバイオロジカルズ社はレンチウイルス発現システムのニーズにお応えします！
背景
抽出 / 精製
特長
組換え型レンチウイルスベクターは，in vivo および in vitro ，分裂細胞
および非分裂細胞，いずれの場合でも，安定的な遺伝子導入を行える強力な
ツールです。レンチウイルスベクターに関する長年の経験を生かし，アプラ
イ ド バ イ オ ロ ジ カ ル ズ 社 で は 独 自 の レ ン チ ウ イ ル ス 発 現 ベ ク タ ー と，
pLenti-combo パッケージングミックスを開発しました。これらにより，
組換え型レンチウイルスベクターの産生を迅速にし，収量も 107IU/ml
まで上げることができます。iLentiTM RNAi 発現システムなら，siRNA
トランスフェクションやレンチウイルス感染といった，いずれのターゲット
で も，高 い 発 現 効 率 が 望 め ま す。こ の シ ス テ ム は，ユ ニ ー ク な 双 方 向
性 プロモーターデザインを用い，一般的なシングルプロモーターのベク
ターで必要な，ヘアピンループ構造を必要とせず，より高いノックダウン効
率をもたらします。
プロファイリング
●安定的なプラスミド；独自にプラスミドを改変
●非常に高いプラスミドの収量
定量
●特別なコンピテントセル
●より高いターゲット遺伝子のノックダウン効率
検出
●安定発現細胞の作製が可能
インヒビター
●自己復製能が欠損した第三世代レンチウイルスベクター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
■商品リスト
［メーカー：APB］
キット 品番 / 希望販売価格
キット構成品名（単品品番）
包装
293T cell line（LV010）
Lenti-GFP（LV011-a）か
Lenti-β-Gal（LV011-b）のいずれか
iLentiTM Sequence Primers（LV012）
LV301-A*
LV301-B*
¥148，
000
●
¥148，
000
25μL
希望販売価格
￥54，
000
25μL
100μg
￥54，
000
￥44，
000
●
●
●
1.0ml
1x106 cells
￥26，
000
￥29，
000
●
●
●
●
10μg
￥46，
000
￥46，
000
●（a）*
●（b）*
●（a）*
●（b）*
100μL
（10μM）
￥15，000
●
●
BbsI Linearized iLentiTM Vector（LV014）
BbsI Linearized iLentiTM GFP Vector（LV016）
Lenti-Packaging Mix（LV003）
LentifectinTM（G074）
LV300-A*
LV300-B*
LV310
LV311
LV098
LV099-A*
LV099-B*
¥86，
000
●
¥86，
000
¥61，
000
¥63，
000
●
●
●
配列解析
サービス
●
●
●
●（a）*
●（b）*
●
siRNA
●
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
※コンポネントとして Lenti-GFP（LV011-a）を希望される場合は，末尾 -A の品番を，Lenti-β-Gal（LV011-b）を希望される場合は，末尾 B の品番をご購入ください。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
iLentiTM Vector
iLentiTM-GFP Vector
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
図 1 哺乳類細胞の，分裂細胞および非分裂細胞のいずれも安定かつ高効率のトランスフェクション
トランスフェク
ション試薬
その他
■関連商品
［メーカー：APB］
選択マーカー
品番
GFP Control
品名
GFP Lentivirus
詳細
ネオマイシン
LV006
包装
10ml
希望販売価格
¥96，
000
貯蔵
β-Gal Control
β-Gal Lentivirus
ネオマイシン
LV007
10ml
¥96，
000
凍
○
iLentiTM GFP Negative Control
Negative Control Lentivirus
ネオマイシン
LV015
500ng
¥19，
000
凍
○
凍
○
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
101
si / shRNA 発現
miRNA
siRNA 発現
iLentiTM siRNA 発現ベクター受託作製サービス
miRBase
LNA
高効率かつ安定なレンチウイルス導入システムを用いた siRNA 発現ベクター受託作製サービス
抽出 / 精製
プロファイリング
１コンストラクト 15,000 円∼ のお手頃価格で
お試しいただけます！
事前のお問い合わせ＆ご注文方法
TM
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
iLenti siRNA システムを用いて調整する複製機能のないレンチウイルス
粒子は，分裂／非分裂哺乳細胞に高効率に安定して導入することができます。
本システムのレンチウイルス発現ベクターは，キットに含まれる pLentiTM
発現ベクターへ目的遺伝子のサブクローニング，DNA 精製を含むウイルス
DNA の生産を簡単に操作できます。特別なコンピテントセルは必要あり
ません。さらに，DH5αにおける非特異的組換えや組換えによる再編成は
ほとんどなく，非常に安定です。本受託サービスは，pLentiTM siRNA ベクター
を用いて，ご希望のターゲット遺伝子に対する siRNA 発現ベクターを
作製致します。
1. 下記の必要事項をご記入のうえお問い合わせください。
＊遺伝子名 ＊由来動物種 ＊ Accession 番号
＊ご氏名 ＊ご所属 ＊メールアドレス ＊電話番号
お問い合わせ先 E-mail:[email protected]
2. お届け可能な配列の種類をご連絡致します。
3. 配列の種類をご確認いただいた後，siRNA のみを発現するベクター
と EGFP と siRNA を発現するベクターがありますので，どちらか
ご希望のベクターを選び，ご注文ください。
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
●ヘアピンループ型の shRNA ベクターを用いずに H1/U6 プロモーター
を使用：シークエンスとプラスミドを非常に簡単に増幅。
●27 ∼ 29bp オリゴ：従来の 21mer よりも高効率です。
●トランスフェクションにもウイルスインフェクションにも使用できます。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
サービス内容
ターゲット遺伝子に対する siRNA をコンストラクトした発現ベクター
を作製致します。デザインする siRNA の配列はターゲット遺伝子により
以下の 2 種類のどちらか一方になります。
1. 文献に 85% 以上のノックダウン効率が報告されている配列
図 1 iLentiTM siRNA のベクターマップ
すでに 20,000 件の文献を確認し 7,000 種以上の遺伝子のデータ
ベースがあります。
2. 自社のアルゴリズムでデザインした配列
75% 以上のノックダウン効率を保証しています。＊
＊全てのコンストラクトのノックダウンを検証しておりませんが，4 コンストラクトのうち少なくとも
1 コンストラクトが 75% 以上のノックダウンを示さない場合には，アドバイスまたはリプレース対
応をさせていただきます。
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
図 2 iLentiTM -EGFP siRNA のベクターマップ
別途，レンチウイルスパッケージング受託サービスもご用意しております。
[email protected] までご紹介ください。
その他
技術情報
■商品リスト
［メーカー：APB］
商品名
miRNA
プロファイリング
Custom iLentiTM siRNA Construct
Custom iLentiTM-EGFP siRNA Construct
miRNA
機能解析
Custom iLentiTM siRNA Construct
プール型 shRNA
ライブラリー
品番
包装
希望販売価格
C043
C043-G
1 serv.[1 Construct]
1 serv.[1 Construct]
¥15，
000
¥15，
000
貯蔵
凍
○
凍
○
C044
1 serv.[4 Construct]
¥49，
000
凍
○
Custom iLentiTM-EGFP siRNA Construct
C044-G
1 serv.[4 Construct]
¥49，
000
凍
○
Negative Control Scramble Vector
LV015
500ng
¥19，
000
凍
○
LV015-G
500ng
¥19，
000
凍
○
Negative Control Scramble Bector (GFP)
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
■関連商品
［メーカー：APB］
商品名
102
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
LentifectinTM
G074
1mL
¥26，
000
293T cell line
LV010
1x106 cells
¥29，
000
凍
○
iLentiTM Sequence Primer
LV012
100μg
¥15，
000
凍
○
pLente-Combo Mix
LV003
200μg
¥61，
000
凍
○
凍
○
ノックダウン検証
miRNA
プライマー PLUS
ノックダウン検証
miRBase
LNA
効果のある siRNA なのに mRNA の減少が見られないのはどうして ···?
→その答えはここにありました！
抽出 / 精製
プロファイリング
使用目的
㑇ఏᏊ A
定量
㑇ఏᏊ%
1.2
1
siRNA 1
0.8
siRNA 2
0.6
siRNA 3
siRNA 4
0.4
control
0.2
relative mRNA level
relative mRNA level
RNAi 効 果 の 確 認 に 用 い る リ ア ル タ イ ム PCR（定 量 的 PCR・
qPCR:Quantitative PCR）用プライマーのカスタムデザインサービスで
す。現在リアルタイム PCR 用にデザインされたプライマーが市販されて
いますが，RNAi 実験に使用する場合には，mRNA の測定に適しているだ
けでは十分ではありません（図 1 参照）。
RNAi の効果を調べる際には，あるプライマーでは効果が高く，別の
プライマーでは効果が低く検出されるということがあることが経験的に
わかってきています。本サービスではこのような問題を考慮し，提供された
ターゲットを基に独自のノウハウにより，RNAi 効果確認実験に用いる
ことを目的としたプライマーをデザインします。
「RNAi 効果の確認に適したデザイン」をする点が市販のプライマーとは
異なります。
1.2
siRNA 1
1
siRNA 2
0.8
siRNA 3
0.6
siRNA 4
0.4
control
0.2
インヒビター
0
0
5'
middle
3'
position of qPCR primer
5'
middle
3'
position of qPCR primer
過剰発現
（オリゴ）
図 1 qPCR プライマー設計位置の違いによる見かけ上の発現抑制効果の違い
遺伝子上の 3 か所について qPCR 用プライマーをデザインしそれらによって検出される発現抑制効果の
違いを比較した。遺伝子 A,B についてそれぞれ 4 種類のターゲット配列による発現抑制効果を qPCR で
定量した。その結果，異なる位置のプライマー（5' ,middle,3'）を用いると RNAi 効果が異なって見え，
みかけ上全く抑制効果が見られなくなる場合もあった（遺伝子 A middle，遺伝子 B 3'）
。
●標的遺伝子に合わせて qPCR 用プライマーをデザイン＋プライマー
3 セットを納品
●「RNAi 効果の確認」に最適なプライマーデザイン
●SYBER Green® で検出
②購入申込書にベクター情報，shRNA クローニングサイト情報など
必要事項をを明記し当社取扱の代理店にご提出ください。ご希望の
オプションがある場合には合わせてご明記ください。
［メーカー：MIR］
商品名
SYBR® は Life Technologies 社の登録商標です。
機能検証
①コスモ・バイオホームページ上（サポート情報→書類ダウンロード）
から購入申込書をダウンロード
■商品リスト
プライマー PLUS
過剰発現
（ベクター）
次世代
シークエンシング
ご注文方法
特長
検出
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
SYPS-S
1SET[15nmole scale X 3 sets,6vials]
¥18，
000
凍
○
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
103
si / shRNA ライブラリー
miRNA
si/shRNA ライブラリー
miRBase
LNA
プール型かつバーコード化された
レンチウイルス shRNA ライブラリー
次世代シークエンス技術を用いた次世代 shRNA ライブラリー登場！ P2 レベルで使用可能 !
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
使用目的
特長
本製品は，レンチウイルスベクターシステムと次世代シークエンスの技術
を合わせた，画期的なハイスループット RNAi 遺伝子スクリーニング ツー
ルです。各 shRNA コンストラクトにあらかじめ導入したバーコード 配列
を次世代シークエンサーで検出することにより，プール型ライブラリーの課
題であった「表現系選抜後の主要調節因子の特定」の正確性が，従来のレン
チウイルスライブラリーと比較して飛躍的に向上しています。ウイルスの自
己複製能を欠損させた安全なシステムですので，P2 レベルの実験施設でご
利用頂けます。
Cellecta（CLT）社では，DECIPHER shRNA ライブラリーを使用した
shRNA ノックダウンのスクリーニング結果のデータベース構築および共
有を目的として本製品を非営利団体向けに無償提供するオープンソースプ
ロジェクト（輸送経費別途）を実施しています。現在，Human，Mouse 合
わせて 5 種類のライブラリーを CLT 社と MTA を締結することで，無償
でプール型 shRNA プラスミドライブラリーを使用することができます。
さらに，次世代シークエンス後の shRNA 配列を同定するためのソフト
ウェアも無料でご利用可能，またとないチャンスです！
非営利団体以外のユーザー様にもご利用頂けます（有償）。また，ご希望
の遺伝子群を標的としたカスタム shRNA ライブラリーを作製（有償）す
ることも可能です。
●プール型レンチウイルス shRNA ライブラリー：低コストかつ少人数
でのゲノムワイド遺伝子探索実験を実現
●検証済み shRNA データベースを整備：機能的 shRNA を独自の in
silico プログラムで予測、shRNA コンストラクトを構築し、一部（50
∼ 100 コンストラクト）を実験的に検証してアルゴリズムを評価済み
●shRNA 構造最適化済み：ノックダウン効果の向上、偽陽性候補の低減
●shRNA 配列決定が簡便化：各 shRNA に特異的な bar-code をシー
クエンスすることにより目的の表現型に関与する shRNA をハイス
ループットかつ効率的に同定
●レンチウイルスシステムの利用：コンプレキシティ（shRNA コンス
トラクトの密度）の高いプール型ライブラリーを効率よく、かつ広範囲
な細胞種に導入可能、宿主ゲノムへ組み込まれるので長期安定発現が期
待でき、細胞分裂の活発な細胞、非分化細胞のいずれにも導入可能
構成内容
● 120 μ g plasmid library, in pRSI9-U6-(sh)-UbiC-TagRFP-2APuro vector; enough to generate virus for approximately 50100 screens
レンチウイルスシステムの特長
● 10 μ g empty library vector, for cloning individual constructs
used to validate hits from your screen
●宿主ゲノムへの組込み：長期安定発現
コントロール
siRNA
●細胞分裂の活発な細胞／非分化細胞いずれにも導入可能
デザイン済み
siRNA
●P2 レベル機関承認実験
● User Manual with Q.C. data
●ウイルスの自己複製能を欠損させた安全なシステム
* User Manual は WEB サイトからもご利用いただけます
* Packaging Plasmid Mix はキットに含まれません
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
原理
si/shRNA 発現
Bar-code໩ shRNA
ࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛᵋ⠇
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
⾪⌟ᆵࢪࢠ࣭ࣛࢼࣤࢡ
ࢸ࣭ࢰゆᯊ
1 - 2 ࣧ᭮
1 - 2 ࣧ᭮
2 - 3 ࣧ᭮
㐿ఎᏄࣛࢪࢹ: ( e.g. druggable genome, apop tosis, cell-specific, genome-wide)
VK51$ᩐ:
1,000 - 200,000 shRNAs
ࢸࢧ࢕ࣤ:
shRNA, Mir30, etc.
shRNA Ⓠ⌟:
ᏽᖏࡵࡊࡂࡢ Tet-ᢒโᆵ
അࢗ࢕ࣜࢪࣈ࣭ࣜᆵ
shRNA ࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛ
ࠈࢰ࣭ࢣࢴࢹ⣵⬂࡫វ᯹
஦㔔࣏࣭࣭࢜: GFP, RFP, PuroR, BleoR, etc.
Agilent Technologies
ࣀ࢕ࢪ࣭ࣜࣈࢴࢹ
࢛ࣛࢥྙᠺ
វ᯹ῥࡲࢰ࣭ࢣࢴࢹ⣵⬂
ࠈฌ⌦
(e.g. ⷾ∸Ț⥲࡝࡜)
ࠈࠈ୹こㄢ⟿ᅄᏄࡡ≁ᏽ
ḗୠ௥ࣀ࢕ࢪ࣭ࣜࣈࢴࢹ
ࢨ࣭ࢠ࢙ࣤࢨࣤࢡ㸝EDUFRGH㸞
Cells treated with TGF-`
shRNA クローン
コレクション
106
105
IlluminaSolexa
104
103
102
101
100
10-1
10-1 100
101
102
103
104
Untreated Cells
࢛ࣛࢥฦ㞫
shRNA
ࢸࢧ࢕ࣤ
T5
shRNA
技術情報
PCR &
ࢠ࣭ࣞࢼࣤࢡ
miRNA
プロファイリング
ࣈࣚࢪ࣐ࢺᆵ
shRNA
ࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛ
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
⤄᭨࠻ࢗ࢕ࣜࢪ
⏐⏍
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
അࢗ࢕ࣜࢪࣈ࣭ࣜᆵ
shRNA ࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛ
図 1
104
ࣃࢴࢹು⿭ࢅ࢓ࣝ࢕ᆵࡵࡊࡂࡢ
ࣈ࣭ࣜᆵࢦࣇࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛ࡞࡙᳠チ
barcode
ฌ⌦ῥࡲ⣵⬂
㐽ᢝ
(e.g. ᠺ㛏ᛮ,
FACS)
┘Ⓩࡡ⾪⌟ᆵࢅ♟ࡌ⣵⬂
shRNA/bar-code㒼าࡡቌᖕ
ࢨࢡࢻࣜ⤊㊨ࢸ࣭ࢰゆᯊ
si / shRNA ライブラリー
RSV 5’LTR
ユニークなshRNA特異的bar-code
miRNA
gag
AmpR
U6
UbiC
Gex1
RFP
RRE
shRNA
U6
BbsI
~7.5 - 8.5 kb
pUC ORI
T6
env
pRSI-U6-(sh)-UbiCRFP-2A-Puro
cPPT
マーカープロモーター:
hEF1α CMV
hPGK CMV/Ferritin
hUbiC
SV40 PolyA
RFP
LTR
・tet- 抑制型 shRNA 発現の場合：
tet 抑制体 (TetR) および次の中
から任意でマーカーを１つもし
くは２つ選択 (GFP,RFP,PuroR,
NeoR,BleoR,etc)
miRBase
LNA
Gex2
抽出 / 精製
最適化配列デザイン
図 3 shRNA 特異的 bar-code
プロファイリング
ユニークな shRNA 特異的 bar-code で主要調節因子（効果のあった shRNA）を特定する。
bar-code は三重（triplicate）まで設定可能。
定量
Library
マーカー:
3’LTR
shRNA:
PuroR 2A
・shRNA を定常発現する場合：
次の中から任意でマーカーを
２つ選択 (GFP,RFP,PuroR,
NeoR,BleoR,etc)
Puro
BbsI
UbiC
SV40 ORI
H1
プロモーター : U6
H1-Tet
U6-Tet
2A
Target Genes
#mRNA
#shRNA
5,043
5,412
27,500
27,500
Human Module 1
Human Module 2
Signaling Pathway
Disease-Associated
Human Module 3
Cell Surface, Extracellular,
DNA Binding
4,922
27,500
Mouse Module 1
Mouse Module 2
Signaling Pathway
Disease-Associated
4,625
4,520
27,500
27,500
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
図 2 pRSI レンチウイルス shRNA 発現ベクターマップ
実験系に合わせてライブラリーに使用するベクターをカスタマイズ致します
* オープンソースプロジェクトで提供されるライブラリーは選択マーカーの変更ができません
（薬剤マーカー：Puro、蛍光マーカー：RFP）
DECIPHER shRNA ライブラリー関連製品
本プロジェクトで無償提供されるプール型レンチウイルス shRNA ライ
ブラリーは、プラスミドの状態で供給されるため、ご自身でレンチウイルス
にパッケージングしてご利用ください。Cellecta 社のパッケージングミッ
クスおよび、293T 細胞よりも高レンチウイルス収率、より早い増殖能を
持つセルバイオラボ社のパッケージングセルラインを推奨しています。
スクリーニング実験後の細胞について次世代シークエンシングを行う受
託解析サービスもご用意しております。
機能検証
DECIPHER Project ご参加の流れ
無料のオープンソース！
（アカデミック OR 非営利研究機関限定）
① http://www.decipherproject.net/ にアクセス
②「Ordering Information」を ク リ ッ ク し、
「DECIPHER Material
Transfer Agreement (MTA)」の内容を確認頂き、フォームに必要
事項を記入
③ 書名欄のみ直筆で記入し、スキャン画像を [email protected]
にメール添付で送信
④ 輸入経費、および通関業務はお客様負担となります。代行については
ご相談ください。
⑤ ご提出頂いた MTA に Cellecta 社が署名したものをコスモ・バイオ
よりご返却
⑥ プロジェクトスタート！実験を行って頂き論文投稿後、スクリーニン
グ結果を DECIPHER Project に報告（期限なし）
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
+1
RNAiࢪࢠ࣭ࣛࢼࣤࢡ⤎ᯕࡻࡽྜྷᏽࡈࡿࡒ
20ು⿭௧୕࠾ࡼ☔ヾࡈࡿࡒshRNA⋙
dsGFP
cPPT CMV
U6-Tet
shRNA
target
target㡷ᇡ
bar-code
%
100
AAAA
dsGFP/target
mRNA
හᅹᛮmRNA
(e.g. p53)
25
shRNA クローン
コレクション
20
si/shRNA 発現
15
ノックダウン検証
70
60
50
10
40
si/shRNA
ライブラリー
30
AAAA
DICER፳௒ฦゆ
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
90
80
AAAA
RNAiࢪࢠ࣭ࣛࢼࣤࢡ⤎ᯕ࠾ࡼྜྷᏽࡈࡿࡒ
᪜▩ࡡࢨࢡࢻࣜ⤊㊨࠽ࡻࡦ
࢓࣎ࢹ࣭ࢨࢪ㛭㏻㐿ఎᏄᩐ
AAAA
5
20
10
Cellecta
25K shRNA
Library
100%
% mRNA level
(relative to control)
0
0
qPCR
90%
endogenous p53 mRNA
80%
dsGFP/target mRNA
❿ྙ௙♣ #1 ❿ྙ௙♣ #2
㟸᳠チࡡᕰ㈅ࡡ
shRNAࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛ
Cellecta
25K shRNA
Library
❿ྙ௙♣ #1 ࠈ❿ྙ௙♣ #2
㟸᳠チࡡᕰ㈅ࡡ
shRNAࣚ࢕ࣇ࣭ࣚࣛ
関連試薬
70%
60%
dsGFP / target࠽ࡻࡦහᅹᛮp53 mRNA
㔖ࡡࢿࢴࢠࢱࢗࣤẒ㍉
50%
40%
30%
20%
10%
0%
#1
#2
#3
#4
#5
#7
#8
p53 shRNAs
図 4 GFP-target レポーターのノックダウン機構
ゲノム DNA 上に統合された shRNA-target レンチウイルスレポーターコンストラクトの略図および
GFP-target レポーターのノックダウン機構。
機能的 shRNA を発現する細胞は低レベルの GFP mRNA 発現を，非機能的 shRNA を発現する細胞は
高レベルの GFP mRNA 発現が確認できた。
図 5 ハイスループット RNAi TGF-βスクリーニングデータ比較
手法：Cellecta 社 25K shRNA library/6.5K target Validated library，競 合 他 社 #1 human 25K
lentiviral shRNA library，競 合 他 社 #2 human 200K lentiviral shRNA library を 同 一 条 件 下
（MOI ＝ 0.5）かつ各ライブラリーコンプレキシティの 50 - 100 倍の多重度にて Hep3B 細胞へ
トランスダクションした。細胞は低密度に播種し，TGF-β（1ng/mL）処理を 3 週間行った。
TGF-βアポトーシスを抑制する shRNA 候補を TGF-β耐性細胞のゲノム DNA から増幅し，
シークエンシング（競合他社ライブラリー＃ 1），Affymetrix U133+2 array へのハイブリ
ダイゼーション（競合他社ライブラリー＃２）
，Illumina-Solexa Genome Analyzer を用いた次世代
シークエンシング（Cellecta 社ライブラリー）により同定した。各 TGF-βゲノムスクリーニングは
２回繰り返して行い，同定された既知 TGF-βエフェクターをまとめた。
結果：競合他社ライブラリー＃ 1 からは TGF-β受容体タイプ 1 のみ同定された。競合他社ライブラリー
＃ 2 からは TGF-βシグナル経路への関与が知られているものとしては SMAD4 のみが同定され
他方は本経路への関与が未知の遺伝子であった。個々の shRNA コンストラクトを用いた確認実験よ
り，競合 2 社のライブラリーを用いた 1 次スクリーニング結果には高確立（90 - 95％）で偽陽性シ
グナルが含まれることが示唆された。
これに対し，Cellecta 社 25K ライブラリーの 1 次スクリーニングでは，TGF-βシグナル経路に
関与する既知および新規遺伝子が 100 種類以上同定された。繰り返し実験で再現性がみられた
（∼ 80%）と同時に，確認実験でも同様の結果が得られた（∼ 95％）
。TGF-βシグナル経路に関与
する既知因子（SMAD4, type I and type II TGF-β receptors, WNT5A 等）が同定されたことに
加え，PI3K/NF-kB シグナル経路に関与する因子が数多く同定されたことから，Hep 3B において
本経路が TGF-βの介するアポトーシスに重要な役割を担うことが示唆された。
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
105
si / shRNA ライブラリー
miRNA
■商品リスト
LNA
DECIPHER ライブラリー
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
カスタムライブラリー
（合成＆デザイン）
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
カスタムライブラリー
（構築）
siRNA
配列解析
サービス
商品名
DECIPHER Human Module 1, Pathway Targets (5,043 targets, 27,500
shRNAs, plasmid)
miRBase
検出
［メーカー：CLT］
カテゴリー
1.5K shRNA Library Design and Synthesis to target 50-250 genes (must
order 4 libraries together)
3K shRNA Library Design and Synthesis to target 250-500 genes (must
order 2 libraries together)
6.5K shRNA Library Design and Synthesis to target 100-1000 genes
DHPAC-M1-P
DHDAC-M2-P
DHCSC-M3-P
DMPAC-M1-P
包装
1 each
1 each
1 each
1 each
希望販売価格
貯蔵
無償提供
注
凍
○
無償提供
注
凍
○
無償提供
注
凍
○
無償提供
注
凍
○
注
凍
○
DMDAC-M2-P
1 each
無償提供
CPLVSHL-1K4-O
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-3K2-O
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-6K-O
1 serv
ご照会
凍
○
13K shRNA Library Design and Synthesis to target 1000-2500 genes
CPLVSHL-13K-O
1 serv
ご照会
凍
○
27K shRNA Library Design and Synthesis to target 2500-5000 genes
CPLVSHL-27K-O
1 serv
ご照会
凍
○
55K shRNA Library Design and Synthesis to target 5000-10000 genes
CPLVSHL-55K-O
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-1K4-P
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-3K2-P
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-6K-P
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-13K-P
1 serv
ご照会
凍
○
CPLVSHL-27K-P
1 serv
ご照会
凍
○
1.5K shRNA Library Construction to target 50-250 genes (must order 4
libraries together, order with Library Design and Synthesis, CPLVSHL-1K4-O)
3K shRNA Library Construction to target 250-500 genes (must order 2
libraries together, order with Library Design and Synthesis, CPLVSHL-3K2-O)
6.5K shRNA Library Construction to target 100-1000 genes (order with
Library Synthesis, CPLVSHL-6K-O)
13K shRNA Library Construction to target 1000-2500 genes (order with
Library Synthesis, CPLVSHL-13K-O)
27K shRNA Library Construction to target 2500-5000 genes (must also
order Library Synthesis, CPLVSHL-27K-O)
55K shRNA Library Construction to target 5000-10000 genes (must also
order Library Synthesis, CPLVSHL-55K-O)
CPLVSHL-55K-P
1 serv
ご照会
凍
○
Lentiviral Packaging Service of single construct
Lentiviral Packaging Service of single construct 2 ml (1 x 10^8 ifu/ml)
CLVP-5108
CLVP-1108
1 serv
1 serv
ご照会
ご照会
凍
○
凍
○
Lentiviral Packaging Service of single construct 2 ml (1 x 10^9 ifu/ml)
CLVP-1109
1 serv
ご照会
凍
○
Lentiviral Packaging Service for 1.5K libraries
CLVP-1K
1 serv
ご照会
凍
○
Lentiviral Packaging Service for 3K libraries
CLVP-3K
1 serv
ご照会
凍
○
カスタム合成
サービス
Lentiviral Packaging Service for 6.5K and 13K libraries
CLVP-6K
1 serv
ご照会
凍
○
Lentiviral Packaging Service for 27K and 55K libraries
CLVP-27K
1 serv
ご照会
凍
○
コントロール
siRNA
Ready-to-Use Packaging Plasmid Mix, 250 μ g
CPCP-K2A
1 EACH
¥68,000
凍
○
293 LTV Cell Line ( メーカー：CBL)
LTV-100
1 VIAL
¥81,000
室
○
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
106
パッケージング
DECIPHER Human Module 2, Disease Targets (5,412 targets, 27,500
shRNAs, plasmid)
DECIPHER Human Module 3 Cell Surface, Extracellular, and DNA Binding
Targets (4,922 targets, 27,500 shRNAs, plasmid)
DECIPHER Mouse Module 1, Pathway Targets (4,625 targets, 27,500
shRNAs, plasmid)
DECIPHER Mouse Module 2, Disease Targets (4,520 targets, 27,500
shRNAs, plasmid)
品番
注：アカデミック・非営利団体のみに無償提供。ベクターの選択はできません。詳細はお問合わせ下さい。ご利用にあたり Cellecta 社との MTA が必要になります。
また，輸入経費は別途ご負担頂きますことをあらかじめご了承ください。
si / shRNA ライブラリー
si/shRNA ライブラリー
ハイスループット RNAi 遺伝子スクリーニング
（次世代シークエンシング）受託解析サービス
miRNA
miRBase
LNA
ゲノムワイドの標的遺伝子スクリーニングをラクラク受託解析サービスで！
抽出 / 精製
使用目的
本サービスは、Cellecta（CLT）社のカスタムプール型レンチウイルスバーコード化 shRNA ライブラリーを用いたハイスループット RNAi 遺伝子スク
リーニングサービスです。お客様のニーズに合わせて、実験ステップの一部（品番：CANA-SQ）もしくは全て（品番：CRGS-X）を同社にて行うものです。
前頁のカスタムプール型 shRNA ライブラリーはもとより、ライブラリー導入細胞、サブライブラリー設計および構築、個別のベクター構築、生データ、バ
イオインフォマティックスを駆使した解析やシグナル経路解析など、さまざまなサービスを必要な部分のみを組合わせてご利用いただくことができます。ハ
イスループット RNAi スクリーニングの一例として、TGF- βならびに FAS 誘導型 HeLa 細胞の実験データを p,136 ∼ p,138 に技術情報としてご紹
介しています。
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
HT Bar-Code Sequencing of Cell Pellets from Genetic Screen（品番： CANA-SQ）
過剰発現
（ベクター）
本サービスは、CLT 社ライブラリーを使用して調整した各サンプルの凍結ペレット（細胞・組織）をご提供頂き、CLT 社にて DNA 抽出・増幅、次世代シー
クエンシングデータ取得・解析を行い、shRNA 配列のリストをご提供するものです。サンプルは、フェノール - クロロホルム耐性の 15-mL サイズのポ
リプロピレン遠心用チューブに保管し、黒色または青色のアルコール耐性マーカーで各チューブにサンプル名をご記入頂き、チューブラベルとサンプル詳細
とを記載したリストと共にドライアイス便でご発送ください。
機能検証
次世代
シークエンシング
受託サービスの流れ
① お申込書類記載
② CLT 社へ細胞・組織ペレットの送付
③ CLT 社にて実験・解析作業
1．各サンプルからゲノム DNA 抽出する
2．抽出したゲノム DNA のバーコードを増幅後、ハイスループットシークエンシング調整する
3．各サンプルの増幅されたバーコードをシークエンス（＞ 20 x 106 リード）
4．各バーコードを shRNA 配列と照合させ、解析する
( ア ) 各 shRNA 配列の相対存在量の算出（バーコード /shRNA 数）
( イ ) サンプル間の差異計算（お客様より何れのサンプル間を比較するという情報を頂いた場合に限ります）
5. 報告書を作成
④ コスモ・バイオより報告書（電子データ）を納品
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
RNAi Functional Genetic Screens with Pooled shRNA Libraries（品番： CRGS-X）
ノックダウン検証
本サービスは、CLT 社がプール型バーコード化 shRNA ライブラリーを使用したスクリーニングの全作業を実施するサービスです。必要な作業のみを受
託することも可能ですのでお問合せください。
si/shRNA
ライブラリー
受託サービスの流れ
① お申込書類記載
② 実験内容の打合せ
③ お客様のご希望の遺伝子リストにてカスタムプール型レンチウイルス shRNA ライブラリーをデザインし構築（2 - 3 ヶ月）、デザイン済み shRNA
ライブラリーを指定（前頁参照）
④ 必要に応じてお客様独自の RNAi スクリーニング実験に適したレポーター細胞株を構築します。
（3 - 4 ヶ月、③の作業と並行作製）
⑤ お客様のターゲット細胞へプール型 shRNA ライブラリーをトランスダクション、特異的な表現型や細胞応答性をもとに機能テストを実施（1- 2 ヶ月）
⑥ スクリーニングデータ解析：CLT 社にて下記作業を行います。
（1- 2 ヶ月）
・ ゲノム DNA 抽出
・ shRNA 特異的バーコード配列の増幅
・ ハイスループット（次世代）シークエンシングおよび統計解析
・ 報告書作成
⑦ コスモ・バイオより報告書（電子データ）を納品
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
■商品リスト
［メーカー：CLT］
商品名
HT Bar-Code Sequencing of Cell Pellets from Genetic Screen
(screening done with Cellecta Library)
RNAi Functional Genetic Screens with Pooled shRNA Libraries
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
CANA-SQ
1 EACH
ご照会
室
○
CRGS-X
1 EACH
ご照会
室
○
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
107
si / shRNA ライブラリー
miRNA
si/shRNA ライブラリー
Hush-29 shRNA キナーゼコレクション
miRBase
LNA
512 遺伝子をターゲットにした shRNA キナーゼコレクション
抽出 / 精製
プロファイリング
特長
●ヒト遺伝子に対する shRNA キナーゼコレクションです。
●512 遺伝子ターゲットをプレートに個々にスポットしたものと，ハイスループット用のプール品がございます。
定量
個々品：22 プレート（2μg/well, in 96-well plate）
プール品：6 プレート（2μg/well, 1 コンストラクトにつき 0.5μg，in 96-well plate）
検出
●1 遺伝子ターゲットごとに 4 shRNA コンストラクトをご用意。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
●pRFP-C-RS ベクターを使用
●Hush-29 shRNA につきましては，p.95 ページをご参照ください。
■商品リスト
［メーカー：ORG］
遺伝子数
品番
希望販売価格
貯蔵
HuSH shRNA キナーゼコレクション（個々品）
512 遺伝子ターゲット
TR100001
ご照会
冷
○
次世代
シークエンシング
HuSH shRNA キナーゼコレクション（プール品）
512 遺伝子ターゲット
TR100002
ご照会
冷
○
siRNA
si/shRNA ライブラリー
機能検証
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
商品名
検証済みヒトキノーム shRNA クローン
特長
●350 種類のヒトキノームの shRNA クローンを提供致します。
●全ての shRNA（19mer）はオフターゲット効果が低く，高ノックダウン
効率を誇ります。
●shRNA のターゲット配列は，哺乳動物性発現ベクター“psi-sH1”
に組み込まれます。Super H1 は，shRNA 発現を導入するのに用い
られます。psi-sH1 ベクターは，トランスフェクション効率を確認
するために，CMV プロモーターによって発現する EGFP 遺伝子が
含まれています。
●ヒトキノーム shRNA のノックダウン効率は，レポーター機能アッセイで
有効です（図 1）
。psiCheck-AP ベクターで発現クローンが構築され，
キメラ mRNA が転写されます。このキメラ mRNA は，ターゲット
遺伝子とアルカリホスファターゼ（AP）を分泌するレポーター遺伝子
が含まれていますので，ターゲット遺伝子の転写レベルは，AP の酵素
活性で測定できます。shRNA クローンと psiCheck-AP 発現クローン
が 共 ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン さ れ，タ ー ゲ ッ ト mRNA が RISCshRNA 複合体によって分解されると AP 遺伝子が分解されます。
ノックダウン効率は，比色 AP アッセイで確認できます。
関連試薬
図 1
A：shRNA を含まない。AP が発現し，比色アッセイによって定量できる。B：shRNA と AP-ORF 発現
クローンの共トランスフェクション。AP-ORF に対するキメラ mRNA は分解され，AP の翻訳が停止し，
失活する。
トランスフェク
ション試薬
［メーカー：GCP］
その他
■商品検索の手順
ジーンコピア社ホームページ（http：//www.genecopoeia.com）上の検索欄を開き，
shRNA を選択します。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
【キーワード検索】
①ご希望の種を選択します。
②遺伝子名，Accession No.，UniGene ID，Entrez Gene ID，キーワードで検索できます。
【Blast 検索】
①ご希望の種を検索し，シーケンスのタイプ（タンパク質またはヌクレオチド）を選択します。
②ご希望の遺伝子のシーケンスを入力します。
Search ボタンを押すと検索が開始され，品番が表示されます。
右の 包装は全て 4 種類の shRNA コンストラクト /1kit です。
希望販売価格はご照会ください。
108
トランスフェクション試薬
miRNA
トランスフェクション試薬
GeneSilencer siRNA トランスフェクション試薬
miRBase
LNA
サンプル
あります！
哺乳動物細胞に siRNA を効果的に導入します。実績多数 !!
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
特長
構成内容
●様々な細胞種に高い siRNA 導入効率
●GeneSilencer Transfection Reagent
●siRNA 導入後に機能的遺伝子サイレンシング
●siRNA Diluent
●血清の有無に関わらず様々な条件下で使用可。
●低細胞毒性
検出
●接着細胞でも浮遊細胞でも簡単プロトコル
インヒビター
●陽イオン脂質ベース
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
細胞株
血清
細胞株
血清
HeLa or HeLa-S3
COS-1
無
有
B15-FO
293
有
有
COS-7
有
BHK-21
有
Hep-G2
有
CHO-K1
無
NIH-3T3
MDCK
有
無
PC-12
P19
有
有
K-562
無
MCF-7
無
CV-1
Jurkat
有
無
Neuro2a
HUVEC-C
無
有
表 1 GeneSilencer でのトランスフェクション成功細胞株例
図 1
GeneSilencer® と他社トランスフェクション試薬で HEK293 細胞に 30，50 nM の Silencer® FAM
Labeled GAPDH siRNA をトランスフェクトし，比較した。
（緑）GAPDH siRNA，
（赤）アクチン，
（青）核
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
使用実績
細胞
3T3-L1
A549
A7
AGS
ASM Transformed
B16-F1
BEL7404
Bronchial
C166
C2C12
C6R
CHO-K1
DC2.4
GS-KB-3-1
H22
H441
H460
H9c2
hCMEC/D3
HCP40
HCT-116
HEK-293
HeLa
HepG2
HL-60
HMEC-1
HPAEC
HT29
HUT-78
JAR
Jurkat
KATOIII
L/Stab-2
LNCaP
M2
McA-RH 7777
MCF-7
MDA MB-231
MDA-MB-435
MDA-MB-468
MG63
MKN 28
MKN 45
MV-4-11
Neuro2a
細胞タイプ
Embryo
Lung Carcinoma
Melanoma
Gastric Epithelium
Airway Smooth Muscle Cells
Melanoma
Hepatoma
Smooth Muscle
Yolk Sack Endothelium
Myoblast
Glioma
Ovary
Bone Marrow
Epidermoid Adenocarcinoma
Hepatoma
Lung Adenocarcinoma
Lung Cancer
Myoblast
Brain Microvascular Endothelia
Colon adenocarcinoma
Colon Adenocarcinoma
Embryonic Kidney
Cervical Carcinoma
Hepatocellular Carcinoma
Peripheral Blood Promyelocytic
Leukemia
Human Microvascular Endothelial Cells
Pulmonary Artery Endothelium
Colon Adenocarcinoma
T Cells
Choriocarcinoma
T-Cell Lymphoma
Gastric Epithelium
Fibroblast
Prostate Cancer
Melanoma
Hepatoma
Breast Adenocarcinoma
Breast Cancer
Melanoma
Breast Carcinoma
Osteosarcoma
Gastric Epithelium
Gastric Epithelium
Biophenotypic B Myelomonocytic
Leukemia
Neuroblastoma
種
Swiss Mouse
Human
Human
Human
Human
Mouse
Human
Human
Mouse
Mouse
Rat
Chinese Hamster
Mouse
Human
Mouse
Human
Human
Rat
Human
null
Human
Human
Human
Human
細胞
NIH-3T3
OK
PC-12
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary
Primary HPAEC
RAW 264.7
Renca
SaOs2
SCCH196
SNB19
SW480
U20S
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Mouse
Human
Human
Rat
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Human
Mouse
細胞タイプ
Fibroblast
Kidney
Pheochromocytoma
Cortical Neurons
Cortical Neurons
Hippocampal Neurons
Macrophage
Pulmonary Artery Endothelium
Cortical Neurons
Dendritic Cells (Bone Marrow)
Cortical Neurons
Coronary Artery Endothelial
Peritoneal Macrophage
Dorsal Root Ganglion Neurons
Retinal Ganglion
Dorsal Root Ganglion
Schwann Cells
Cardiac Fibroblast
Cardiac Myocytes (Neonatal)
Lung Microvascular Endothelial Cells
Aortic Muscle Cells
Dendritic Cells
Dendritic Cells
Dendritic Cells
Cerebellar Neurons
Osteoblast
HMVEC
Cardiac Myocytes
T-Cells (CD3+)
Cortical Neurons
Dendritic Cells
Cortical Neurons
Aveolar Type II Cells
Macrophage
Dorsal Root Ganglion
Lacrimal Gland Acinar Cells
Bone Marrow
Dendritic Cells
Pulmonary Artery Endothelium
Pulmonary Artery Endothelium
Macrophage
Renal Cell Carcinoma
Osteosarcoma
Sarcoma
Glioblastoma
Colon Adenocarcinoma
Osteosarcoma
種
Mouse
Opossum
Rat
Mouse
Mouse
Rat
Human
Human
Mouse
Mouse
Mouse
Human HCAEC
Mouse
Mouse
Rat
Rat
Mouse
Mouse
Rat
Human
Rat
Mouse
Mouse
Mouse
Rat
Mouse
Human
Feline
Human
Mouse
Human
Mouse
Mouse
Mouse
Rat
Rabbit
Mouse
Mouse
Human
Human
Mouse
Mouse
Human
Human
Human
Human
Human
表 2 上記細胞での使用文献が出ています！
■商品リスト
［メーカー：GEN］
商品名
GeneSilencer siRNA Transfection Reagent
GeneSilencer siRNA Transfection Reagent
GeneSilencer siRNA Transfection Reagent
＊ 無償サンプル（10rxn）をご用意しております。お気軽にご照会ください。
110
品番
包装
希望販売価格
T500020
T500750
T505750
50 RXN
200 RXN [0.75mL]
5*200 RXN [5 x 0.75mL]
¥18，
000
¥50，
000
¥241，
000
トランスフェクション試薬
miRNA
i-FectTM トランスフェクション試薬
トランスフェクション試薬
miRBase
LNA
In vitro および in vivo に使える siRNA トランスフェクション試薬
抽出 / 精製
特長
プロファイリング
●siRNA を効率良く導入
●siRNA デリバリー
定量
●多様な培養条件で適合（血清の有無に関わらず）
●接着細胞にも浮遊細胞にも OK
検出
●幅広い哺乳類細胞に対応
図 1
インヒビター
シ ュ ワ ン 細 胞 に お け る siRNA に よ る
ターゲット遺伝子の発現抑制。
（A）siNeg- と siGly1- をトラランスフェクト
したシュワン細胞の界面活性剤抽出物を
ヘ パ リ チ ナ ー ゼ で 消 化 し，未 消 化 部 分 を
グリピカン 1 抗体でイムノブロットした
（上）同様にアクチン抗体でもイムノブロット
した（下）。
構成内容
●Hydrated i-FectTM Lipid
●siRNA Diluent
（B）siNeg と siGly1 を ト ラ ラ ン ス フ ェ ク ト
し，48 時間後にグリピカン 1 の細胞表面発
（緑）グリピカン 1 抗
現を蛍光免疫染色した。
（青）DAPI による核染色。
体，
（C）siNeg と siα4（V）を シ ュ ワ ン 細 胞
にトランスフェクトし 48 時間培養後（左）
および，6，7 日後（右），培養上清（上），
細胞ライセート（下）をα4（V）コラーゲン
抗体（上）およびアクチン抗体でイムノブロット
した。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
■商品リスト
［メーカー：NUR］
商品名
i-FectTM transfection kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
NI35150
1kit（75-300 回分）
¥105，
000
冷
○
NI35750
1kit（5set）
¥455，
000
冷
○
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
EndoFectinTM トランスフェクション試薬
トランスフェクション試薬
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
特定の細胞タイプに最適化＆検証済。細胞タイプにあわせて商品をお選びください。
特長
Control
EndoFectinTM
-Plus
ノックダウン検証
他社 A
si/shRNA
ライブラリー
他社 B
●高いトランスフェクション効率とタンパク質発現
●簡単かつ時間を節約可能
緑色蛍光
●非常に低細胞毒性
A
●経済的
関連試薬
可視光
トランスフェク
ション試薬
TM
Relative Transfection Efficiency
EndoFectin -Plus
他社 A
他社 B
その他
緑色蛍光
100%
B
80%
可視光
60%
図 1
40%
20%
0%
3T
93
2
EK
H
9
K2
HE
La
He
G
ep
2
H
-7
S
CO
K1
C
HO
3
3T
IH/
N
EGFP 発 現 プ ラ ス ミ ド を，3 種 類 の
ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 試 薬 を 用 い て，
様々な細胞株にトランスフェクション
し た。ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン 効 率 は，
EGFP 発現細胞の割合を測定して評価
（EndoFectin Plus に よ る 結 果 に 対 し
て正規化）
。
miRNA
プロファイリング
図 2
HEK293T 細胞に，様々なトランスフェクション試薬を用いて EGFP 発現
プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションしてから
20 時間後に細胞を倒立蛍光顕微鏡で観察した。HEK293T 細胞は，血清の
非存在下（A）または，10% 血清の存在下（B）のいずれかでトランスフェクション
した。
■商品リスト
［メーカー：GCP］
商品名
アプリケーション
EndoFectinTM CHO transfection reagent
CHO 細胞にプラスミド DNA をトランスフェクションに最適
EndoFectinTM Lenti transfection reagent
レンチウイルス発現コンストラクトとプラスミドをパッケージング細胞に高力価のレンチウ
イルス粒子をデリバーするためにコトランスフェクションするのに最適
EndoFectinTM Max transfection reagent
接着＆浮遊細胞株に効果的
EndoFectinTM Plus transfection reagent
幅広くルーチンに使用される哺乳類細胞（HEK293，CHO，COS，NIH/3T3 細胞など）
に効果的
技術情報
品番
包装
希望販売価格
EFC1002-01
EFC1002-02
1 ml
5 ml
ご照会
ご照会
EFL1001-01
EFL1001-02
EFM1004-01
EFM1004-02
EFP1003-01
EFP1003-02
1
5
1
5
1
5
ご照会
ご照会
ご照会
ご照会
ご照会
ご照会
ml
ml
ml
ml
ml
ml
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
111
トランスフェクション試薬
miRNA
トランスフェクション試薬
NeuroAim™ / MyeloAim™ トランスダクション試薬
miRBase
LNA
In vitro / in vivo 用標的細胞特異的 RNAi 試薬デリバリーツール
抽出 / 精製
プロファイリング
NeuroAim™ トランスダクション試薬
MyeloAim™ トランスダクション試薬
特長
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
特長
●血液脳関門 (BBB) を通過して siRNA、miRNA、その他の RNAi 試薬
を確実にデリバリーします。
●マウス、ラット、ヒト単球、マクロファージ、樹状細胞、細胞株を含んだ
骨髄細胞系列の細胞 ( プライマリー細胞、細胞株 ) に適しています。
●マウス、ラットプライマリー神経細胞 ( ミクログリアやアストロサイト
を含む )、細胞株に適しています。
●In vivo / in vitro の両方に適応しています。
●In vivo / in vitro の両方に適応しています。
●HIV やマクロファージや樹状細胞に影響する疾患、腫瘍研究に。
●効果的で特異的な遺伝子ノックダウンが可能です。
●樹状細胞の免疫応答研究に。
●アルツハイマー病、パーキンソン氏病、多発性硬化症 (MLS)、筋萎縮性
側索硬化症 (ALS) などの神経疾患の研究に。
●効果的で特異的な遺伝子ノックダウンが可能です。
構成内容
次世代
シークエンシング
●各トランスダクション試薬
● RNase-Free Sterile 1X PBS
■商品リスト
［メーカー：BIO］
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
商品名
NeuroAim™ In Vitro Transduction Reagent
NeuroAim™ In Vivo Transduction Reagent
MyeloAim™ In Vitro Transduction Reagent
NeuroAim™ In Vivo Transduction Reagent
品番
包装
希望販売価格
515201
0.4 ml
¥35，
000
貯蔵
515202
1 ml
¥73，
000
冷
○
515203
20 RXN
¥145，
000
冷
○
515301
0.4 ml
¥35，
000
冷
○
515302
1 ml
¥73，
000
冷
○
515303
20 RXN
¥145，
000
冷
○
冷
○
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
トランスフェクション試薬
SAINT-MIXTM 遺伝子デリバリーシステム
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
siRNA を効率よく導入可能！無毒かつ高い導入効率を持つデリバリー試薬
SAINT-MIXTM は両親媒性のカチオン性ピリジニウムの合成デリバリー
試薬です。このピリジニウム界面活性剤は，111kb までの DNA（直鎖状，
プラスミド），RNA，アンチセンスオリゴヌクレオチドを無毒な状態で
デリバリーします。血清の有無にかかわらず簡単にトランスフェクション
できます。
miRNA
プロファイリング
− SAINT-MIXTM / siRNA 複合体の調製（6 ウェルの場合）−
●非常に安定：“Ready-to-use”溶液として供給致します。また，バイアル
のキャップをきちんと閉めておけば，実験の度に開閉を繰り返しても
その安定性は変わりません。
●様々な哺乳類細胞で使用可能：SAINT-MIXTM は，プライマリー内皮細胞
（HUVEC，HUVEC，H5V）のような導入が困難なセルラインでも導入
が可能です。
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
SAINT-MIX TM は，SAINT18 TM （1-methyl-4-（sis-9-dioleyl）
methylpyridinium-chlorid）と DOPE（Dioleylphosphatidylehanolamine）
が，1：1 の 割 合 で 含 ま れ て い ま す。DNA1μg に 対 し て，15nmol の
SAINT-MIXTM が必要です。
【siRNA/RNAi 用 SAINT-MIXTM 調製方法】
特長
●siRNA を効率よく導入可能：1mg 以下の siRNA を無数の細胞に
導入できます。簡単なプロトコールもご用意しております。
技術情報
プロトコール
① SAINT-MIXTM（20μL / 1μg）の必要量を取り，キット中に含まれ
ている HBS，HBSS または OptiMEM を加えて総量 100μL に
します。
②別のチューブに 0.5 ∼ 2μg の siRNA を加え，キット中の HBS，
HBSS または OptiMEM を加えて 100μL にします。5 分間放置
（インキュベート）します。
③ SAINT-MIX TM 溶 液 に siRNA を ピ ペ ッ テ ィ ン グ し，細 胞 に 直 接
もしくは少なくとも 15 分以内に SAINT-MIXTM / siRNA 複合体を
加えます（複合体をボルテックスしないでください）。
④培地を加えて総量 1mL にします。
■成功した細胞例
CHO
HeLa
Jurkat
AtT-20
⑤細胞にアプライします。
COS-7
3T3
B16
SiHa
CV-1
BHK
HepG2
GLC-1
SW948
NCI-H358
ヒト初代培養細胞等
■商品リスト
112
［メーカー：SAB］
商品名
種類
SAINT-MIXTM, DNA transfection reagent
両親媒性カチオン性ピリジニウム
構成内容
● SAINT-MIXTM 1mL
● Hepes Buffered Salt pH7.4 12mL
品番
包装
希望販売価格
貯 蔵
SM-1001-01
1 kit
￥30，
000
冷
○
トランスフェクション試薬
miRNA
siMPLETM siRNA デリバリー試薬
トランスフェクション試薬
miRBase
LNA
ペプチドベースのシステムが神経細胞や樹状細胞へのトランスフェクションを可能にします。
抽出 / 精製
120
% GAPDH Expression
siMPLETM はナノ粒子 siRNA トランスフェクション試薬で siRNA，
ペプチド，オリゴヌクレオチドなどの小分子を細胞内へ取り込むための
ペプチドを有します。
Knockdown of GAPDH in HUVEC Cells
100
プロファイリング
80
定量
60
40
特長
検出
20
●低細胞毒性
0
A
A
●初代培養細胞，神経細胞，樹状細胞に使用可
+D
NA
nM
●リバーストランスフェクションも可能
40
siR
nM
NA
siR
20
nM
10
A
A
+D
+D
NA
siR
M
5n
NA
siR
M
1n
)
A
+D
+D
NA
siR
nM
40
ly (
n
Ao
インヒビター
nly
ls o
cel
過剰発現
（オリゴ）
N
siR
図 1 HUVEC 細胞での GAPDH のノックダウン効率
過剰発現
（ベクター）
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
siMPLETM siRNA Delivery Agent
品番
包装
希望販売価格
341008-01
1mg
¥47，
000
貯蔵
凍
○
341008-02
5mg
¥188，
000
凍
○
次世代
シークエンシング
MaxSuppressorTM In Vivo RNA-LANCEr Ⅱ
トランスフェクション試薬
機能検証
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
In vivo 用 RNAi 試薬の 新規デリバリーツール。Small RNA のトランスフェクションに！
コントロール
siRNA
е჆ጸᎥ౫ᓨ
デザイン済み
siRNA
ELISA
Scrambled
RNAi agent
100
ʗɶʐɭʠ
‫ޓޓޓ‬
ɽʽʒʷ˂ʵ
% remaining
MaxSuppressorTM In Vivo RNA-LANCEr Ⅱは，中性脂質，非イオン性
の界面活性剤，油脂および低分子で構成された独自の試薬で，動物に RNAi
試薬をデリバリーします。この画期的な商品は，他の試薬に比べ，浸潤性の
組織・器官に効果的です。
RNAi 試薬のリン脂質 - 油脂 乳化剤へのパッケージングは 1 時間以内
に 行 え ま す。本 商 品 の 使 用 方 法 は，100μg の RNAi 試 薬 に 対 し て，
本 商 品 を 総 量 が 300μl 以 下 に な る よ う に 加 え，Lipid Extruder
（品番：341007）と付属の 100nm ポアサイズのフィルターを使うか
またはソニケートし，動物に直接投与します。
80
shRNA クローン
コレクション
60
40
si/shRNA 発現
20
GAPDH
RNAi agent
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
0
GAPDH
ࡀࠟ࠹ࠖࡉ
ࠦࡦ࠻ࡠ࡯࡞
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
図 1
TM
GAPDH siRNA を含む MaxSuppressor In Vivo RNA-Lancer Ⅱをマウスの心臓に注射し，それぞれ
の発現を免疫組織染色および ELISA によって比較した。
構成内容
●RNA-LANCEr Ⅱ
●シリンジ
●滅菌済 RNase-Free 水
●ホモジナイザー
●滅菌済 RNase-Free 10X PBS
トランスフェク
ション試薬
その他
50
40
30
20
10
0
技術情報
he
ar
t
he
ar
t
he
ar
t
he
ar
t
he
ar
t
he
ar
t
he
ar
t
he
ar
t
li v
er
sp
le
en
RNAi ⹜⮎ ‫ޔ‬PBS‫ޔ‬᳓ɥ
MaxSuppressor™ In Vivo RNA-LANCEr IIȾ
ӏțǾຉնȪɑȬǿ
関連試薬
100
90
80
70
60
Organ tested
ʟɭʵʉ˂ѿျɑȲɂ
lipid
ʇʕɻ˂ʁʱʽȪɑȬǿ
ʗ
ɽ ɶ
ʽ ʐ
ʒ ɭ
ʷ ʠ
˂
ʵ
Relative GAPDH protein level
Lipid Extruder（品番：341007）
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
Oil
図 2
RNAi
Agent
GAPDH siRNA を含む MaxSuppressorTM In Vivo RNA-Lancer II をマウスの組織に注射し，それぞれ
の発現を比較した。
ᵈ኿
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
ᑥ᠎ȾɛɝᛷɢɟȲRNAi ⹜⮎
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
MaxSuppressorTM In Vivo RNA-LANCEr Ⅱ
Lipid Extruder
品番
包装
希望販売価格
3410-01S
10 test
¥47，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
貯蔵
3410-01
20 test
¥94，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
341007
1 each
¥134，
000
室
○
113
トランスフェクション試薬
miRNA
トランスフェクション試薬
T3TM Conjugation Kit
miRBase
LNA
抗体を用いた in vivo / in vitro への RNAi 試薬の新規デリバリーツール
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
Bioo 社 独 自 の Targeted Transport Technology を 用 い た T3TM
Conjugation Kit は，in vivo および in vitro モデルに抗体を用いて RNAi
試薬をデリバリーするキットです。
本キットは，T3 キャリアーをターゲットとなる細胞や組織のレセプター
や細胞外ドメインに特異的な抗体にコンジュゲートします。その後に，
siRNA をはじめとする RNAi 試薬を T3 コンジュゲートに取り込んで使用
します。T3 コンジュゲートは，細胞へのトランスフェクションもしくは
in vivo への投与後，ターゲットとなる細胞および組織に取り込まれ，
エンドソームから分離され，取り込まれた RNAi 試薬を解離します。この工程は，
抗体および RNAi 試薬の前処理を必要とせず，簡単な操作で行えます。
使用方法
1，目的のセルラインに特異的かつレセプターに特異的な抗体を同定します。
2，抗体を T3 キャリアーにコンジュゲートします。
3，T3 コンジュゲートと siRNA または miRNA を混合します。
4，動物モデルに投与 / 細胞にトランスフェクトします。
5，T3 コンジュゲートをターゲット細胞に取り込ませます。
6，siRNA または miRNA がターゲット細胞からリリースされます。
■コンジュゲートの手順
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
੷Ͷ ¯ ɽʽʒʷ˂ʵ੷Ͷ
ِްႊɬʉʍʋʫʽʒ Á ɥӏțǾ
´ ஽ᩖɮʽɷʯʣ˂ʒȪɑȬǿ
適用
抗体が特異的に認識するエピトープを含む細胞および in vivo モデルに
RNAi 試薬 をダイレクトにデリバリーします。
Ô³ ɷʭʴɬ˂ ¯ ɽʽʒʷ˂ʵ
ِްႊɬʉʍʋʫʽʒ Â ɥӏțǾ
² ஽ᩖɮʽɷʯʣ˂ʒȪɑȬǿ
Ô³ ɷʭʴɬ˂
Ɂᑱ‫ں‬
੷ͶɁᑱ‫ں‬
特長
siRNA
●RNAi を効かせたい場所へデリバリー
ɽʽʂʯɼ˂ʁʱʽ
●ほとんどの細胞および組織で使用可能
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
●フレキシブル：RNAi 試薬を複数のルートでデリバリー
●少量の siRNA でも可。
ᑱ‫ں‬ȪȲ੷ͶȻ Ô³ ɷʭʴɬ˂ɥຉնȪɑȬᴥɽʽʒʷ˂ʵɕպറᴦǿ
●オフターゲット効果を減少
ɴ˂ʚ˂ʔɮʒȺɮʽɷʯʣ˂ʒȪɑȬǿ
●非毒性
Centriprep® ɥᚐȗǾ
構成内容
Օख़ɥϦඨȪɑȬǿ
本キットには，目的の RNAi 試薬 を抗体にコンジュゲートするのに必要
な試薬が全て含まれています。75kDa 以下および 75kDa 以上の抗体用
のキットがあります。
●T3 キャリアー
ɽʽʂʯɼ˂ʒɁӛလɥ
SDS-PAGE ȺᆬᝓȪɑȬǿ
●固定用アタッチメント A
●固定用アタッチメント B
●Bovine IgG コントロール
●T3 キャリアーコントロール
●1x 修飾用バッファー
●10x コンジュゲーションバッファー
●脱塩用カラム
●Centriprep® カラム
●コントロール ‒ 脱塩 カラム
■デリバリールート
Intradermal / Intramuscular
ᄠ˩ ¯ ኅᐼю
Intrathecal / intracerebellar
ߴᑲю ¯ ᯕᑻю
Tail Vain Injection
ࠆ᫽ᑩาߪ
<< 本商品以外に必要なもの >>
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
・RNase-free の一次抗体
・RNAi 試薬（非修飾または修飾された siRNA，miRNA，anti-sense
oligo）など
Inhalation
֋о
intraperitoneal
ᒆᑻю
※通常のサイズには，抗体 3mg をコンジュゲート
その他
全身へのデリバリールート
●静脈注射（IV）/Intravenous
●皮下注射（Sub-Q）/Subcutaneous
●低圧尾静脈（LPTV）/Low Pressure Tail Vein
部分的なデリバリールート
●腹腔内（IP）/Intraperitoneal
●吸入 /Inhalation
●髄腔内 /Intrathecal（Spinal canal）
■商品リスト
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
［メーカー：BIO］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
T3TM Conjugation Kit for Ab < 75 kDa
5150
1 kit（15 - 20 回分）
¥280，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
T3TM Conjugation Kit for Ab > 75 kDa
5151
1 kit（15 - 20 回分）
¥280，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
■関連商品
MAX CARRIERTM HER2 Antibody conjugate
キャリアーコンジュゲート済の HER2 です。混合するだけで，HER2
受容体発現細胞に RNAi 試薬を直接デリバリーすることができます。
構成内容
●コンジュゲート済 HER2 抗体 ●RNase-free 滅菌済 1 X PBS
●注射用シリンジ
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
MaxCarrierTM Conjugated Her-2 Antibody
114
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
360101
1 mg
¥159，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
360102
2 mg
¥291，
000
室 ○
冷 ○
凍
○
その他
miRNA
ALL-TAILTM Kit
その他
miRBase
LNA
高感度かつ正確に 3' UTR 配列と poly（A）tail の変化を測定
AAAAAAAAAAAAAAA
5’
背景
TM
3' RACE 用 の ALL-TAIL キ ッ ト は 成 長，分 化，癌 に お い て，様 々 な
poly（A）tail 付加部位の選択によって生じる 3' UTR の変化と共に，
遺伝子発現中に行われる poly（A）tail の長さの変化の研究に利用できます。
本製品は，RNA 転写物の 3' UTR を同定するほか，3' poly（A）tail の長
さ を 正 確 に 測 定 し ま す。ま た，リ ン カ ー ラ イ ゲ ー シ ョ ン 技 術 を 用 い た
miRNA の検出に使用できます。
rApp
ddC
プロファイリング
Step 1: Ligation
ddC
AAAAAAAAAAAAAAA
5’
Step 2: Reverse
Transcriptase
5’
使用目的
ddC 3’
5’
5’
ddC 3’
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTT
3’
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
Step 3: PCR
本製品は，あらゆる種の RNA の poly（A）tail の長さと，3' UTR 配
列を，高感度に，高い正確性と，高い再現性で測定します。はじめに，AIRTM
リガーゼ（Truncated T4 RNA リガーゼ 2）によって，効率的にアデニ
ル化アダプターオリゴヌクレオチドとトータル RNA の 3' 末端を連結さ
せます。次に，アデニル化アダプターに特異的なプライマーを使用して逆転
写し，cDNA 合成を開始します。そして，ターゲットの転写物の 3' 末端近
く に 設 計 し た プ ラ イ マ ー と，ア デ ニ ル 化 ア ダ プ タ ー に 特 異 的 な プライ
マーと共に，poly（A）tail と 3' UTR の短い広がりを PCR 増幅します。
定量
検出
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTT
3’
抽出 / 精製
過剰発現
（ベクター）
5’
機能検証
次世代
シークエンシング
Run on non-denaturing gel
図１ アッセイ原理
●RNA の poly（A）tail の長さと 3' UTR を正確に測定
A549
●迅速：3 時間以下で様々な RNA の poly（A）tail の長さを解析
●簡単：放射性同位体は不要
配列解析
サービス
LADDER
特長
A549 + Oligo dT
and RNase H
siRNA
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
構成内容
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
本 キ ッ ト に は ラ イ ゲ ー シ ョ ン は 20 回 分，逆 転 写 反 応 と PCR 反 応 は
30 回分含まれます。
●AIRTM アデニル化リンカー C
A100 bp
●AIRTM リガーゼ
●10X AIR
TM
250bp
200bp
150bp
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
100bp
リガーゼバッファー
●PEG 溶液
●コントロール A549 トータル RNA
75bp
ノックダウン検証
50bp
si/shRNA
ライブラリー
●M-MuLV Reverse Transcriptase
A0 bp
●10X M-MuLV バッファー
●20 mM dNTP mix
●リンカー C Universal RT-PCR プライマー
25bp
関連試薬
●DuroTaqTM 5X マスターミックス
●GAPDH tail PCR プライマー
図 2
●RNase-free H2O
oligo（dT）と RNase H で処理した A549 細胞から生成したトータル RNA の PCR 産物を矢印で示
した。これは正確な poly（A）tail の長さを決定する。A549 トータル RNA は GAPDH mRNA の tail
鎖を測定するために使用した。Poly（A）tail（or 3' -end）のサイズは非変性 10％ ポリアクリルアミド
ゲルで分析した。10-1000bp の DNA フラグメントを含むラダー（BIO 社，品番：371001）と一緒に
サンプルを泳動した。
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
ALL-TAILTM Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
5205
1Kit
¥80，
000
凍□
凍
○
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
115
その他
miRNA
RNA Save 安定化保存液
その他
miRBase
LNA
RNA を凍結しなくても保護かつ安定化できる便利な保存液です！
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
背景
1.5% Agarose gel
RNA Save は，RNA サンプルの収集を簡便化できる溶液です。組織や
細胞中の RNA を凍結することなく保護かつ安定化できますので，輸送や
貯蔵が簡単です。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
特長
●安価！
●簡便：使用するのは 1 種類の溶液のみです。
●簡単操作：
① サンプル収集
② RNA Save（1 溶液のみ）中で 4℃，一晩処理
③ 処理サンプルを保存
の 3 ステップです。
●様々なサンプルに適用：動植物組織・細胞，酵母，細菌
＊ただし，蝋化植物（waxy plant）や骨組織では RNA Save の浸透が不十分で RNA の
安定化が困難な場合があるため，使用には適しません。
siRNA
●有効保存期間：RNA save で処理したサンプルは，4℃ で最大 1 ヶ月，
- 20℃ ∼ - 80℃で長期間保存可能です。
配列解析
サービス
図 1 品質管理試験の結果
カスタム合成
サービス
4 ∼ 15 個のハイブリドーマ細胞から単離した RNA を RNA Save 溶液中で 4 日間，それぞれ液体窒素
（-196℃），-20℃，4℃，室温（15 ∼ 25℃）で保存し，電気泳動で確認した。レーン 1：マーカー，
レーン 2：液体窒素，レーン 3：-20℃，レーン 4：4℃，レーン 5：室温。
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
■商品リスト
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
［メーカー：BLG］
商品名
品番
RNA Save
包装
希望販売価格
貯蔵
01-891-1A
500ml
¥28，
000
室
○
01-891-1B
100ml
¥7，
000
室
○
01-891-1C
20ml
¥2，
000
室
○
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
その他
siRNA/miRNA 用 RNAi エンハンサー試薬
使用目的
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
RNA 干渉（RNAi）は siRNA または mature miRNA のどちらかの存在によって起こります。この RNAi エンハンサー試薬は siRNA の存在下
RNA 干渉を増強することができます。
また，この試薬は pre-miRNA から mature mi-RNA への変換割合も増加させることができます。
特長
構成内容
●siRNA の使用濃度を減らしても同じ RNAi 効率
● RNAi BoostTM Reagent A（100x）
●miRNA 前駆体のプロセシングを促進
● RNAi BoostTM Reagent B（100x）
●非毒性
技術情報
●接着細胞にも浮遊細胞にも使用可能
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
116
■商品リスト
［メーカー：CBL］
商品名
RNAi Boost™ Reagent Kit
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
RNAI-200
20 回分
￥50，
000
凍
○
RNAI-201
100 回分
￥125，
000
凍
○
その他
miRNA
In vivo & In vitro 細胞毒性アッセイキット
その他
miRBase
LNA
siRNA やプラスミド DNA 導入による細胞毒性を検出できるプレートベースの解析キット
抽出 / 精製
In vitro 細胞毒性アッセイキット
TM
MaxDiscovery 細胞毒性アッセイキットは，培養細胞上清中のラクテイト
デヒドロゲナーゼやアスパレイトトランスアミナーゼ（AST）をダイレクト
に定量するプレートアッセイです。このキットによって様々な細胞株の
培養上清における酵素レベルを定量できます。
プロファイリング
使用目的
定量
●細胞媒介性細胞毒性の定量
検出
●細胞溶解を誘導する因子の同定
●化合物における毒性を生じる可能性の決定
インヒビター
●バイオリアクター中の死細胞の検出
過剰発現
（オリゴ）
特長
●高感度
過剰発現
（ベクター）
構成内容
●高価な機器は不要
【品番：3460-12（in vitro ）】
●高い再現性
機能検証
●透明なマイクロタイタープレート（2 × 96well）
●わかりやすいマニュアル
次世代
シークエンシング
●不透明なプレート（2 × 96well）
●培養細胞パラメーターに簡単に溶解
●LDH Reagent Mix（2bottle）
●エンザイムベースアッセイ
●BIOO Booster Reagent（1tube）
●様々な細胞株にご使用いただけます。
●スタンダード（1vial）
●高濃度の血清でも使用できます。
●BIOO Booster によってシグナルが著しく改善
●スタンダード希釈用バッファー（7mL）
siRNA
配列解析
サービス
■商品リスト
［メーカー：BIO］
商品名
品番
包装
希望販売価格
貯蔵
MaxDiscoveryTM Aspartate Transaminase（AST）Cytotoxicity Kit
3460-11
192 回分
￥52，
000
冷
○
MaxDiscoveryTM Lactate Dehydrogenase（LDH）Cytotoxicity Assay Kit
3460-12
192 回分
￥38，
000
冷 ○
凍
○
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
In vivo 細胞毒性アッセイキット
shRNA クローン
コレクション
TM
MaxDiscovery アッセイキットは，血清中の肝臓と心臓の機能マーカー
を測定することによって in vivo での毒性のモニターを行うキット（9 種類）
です。比色分析によって，簡便，迅速に検出します。このキットは，siRNA，
DNA プラスミド，トランスフェクション試薬，あるいは臨床前段階での
薬剤等によって生じる毒性効果のモニターに適しています。
MaxDiscoveryTM 製品ラインは肝臓特異的と心臓特異的なキットがあり
ます。このアッセイはマウス，ラットを含む広範囲な哺乳類で使用でき，
創薬研究における強力なツールとなります。
MaxDiscoveryTM アッセイキットは，1 個体から経時的にサンプルの
採取が可能です。
プロトコール
si/shRNA 発現
【品番：3460-01 のプロトコール】
①マイクロプレートにサンプルを 10μL ずつ添加します。
ノックダウン検証
②Reagent Mix 試薬を 240μL ずつ添加します（マルチチャンネル
ピペットか反復ピペットをおすすめします）。
si/shRNA
ライブラリー
③すぐに 340nm でサンプルの吸光度を測定し，5 分後に再度測定
します。
500 mg/kg
関連試薬
0.5
トランスフェク
ション試薬
0.45
特長
0.4
0.35
●高感度
その他
0.3
●可視光あるいは UV 照射下で検出可能
0.25
0.2
●高い再現性
150 mg/kg
0.15
●簡便，比色分析，エンドポイントアッセイ
PBS
0.1
●サンプル量は 10μL 以下
0.05
技術情報
0
●高価な機器は必要ありません。
0 hr
4 hr
0 hr
2 hr
4 hr
0 hr
2 hr
4 hr
図 1 マウス血清中でのアセタミノフェン投与によるアラニントランスアミナーゼ（ALT）レベルの上昇（品
番：3460-01）
■商品リスト
［メーカー：BIO］
品番
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希望販売価格
貯蔵
MaxDiscoveryTM Alanine Transaminase ＊ 1 Color Endpoint Assay Kit
商品名
3460-08
1 kit（96 well）
¥47，
000
冷
○
MaxDiscoveryTM Alanine Transaminase（ALT）＊ 1 Enzymatic Assay Kit
3460-01
1 kit（96 well）
¥47，
000
冷
○
MaxDiscoveryTM Alkaline Phosphatase（AP）＊ 1 Color Endpoint Assay Kit
MaxDiscoveryTM Alkaline Phosphatase（AP）＊ 1 Enzymatic Assay Kit
3460-09
3460-03
1 kit（96 well）
1 kit（96 well）
¥47，
000
¥47，
000
冷
○
冷
○
MaxDiscoveryTM Aspartate Transaminase（AST）＊ 1 Enzymatic Assay Kit
3460-02
1 kit（96 well）
¥47，
000
冷
○
MaxDiscoveryTM Creatine Kinase（CK）＊ 2 Enzymatic Assay Kit
3460-07
1 kit（96 well）
¥68，
000
冷
○
TM
MaxDiscovery
＊ 1
γ -Glutamyl Transferase（GGT）
Enzymatic Assay Kit
MaxDiscoveryTM Lactate Dehydrogenase（LDH）＊ 1 Enzymatic Assay Kit
TM
MaxDiscovery
Total Bilirubin
＊ 1
Enzymatic Assay Kit
5601-01
1 kit（96 well）
¥47，
000
冷
○
3460-04
1 kit（96 well）
¥47，
000
冷
○
3460-10
1 kit（96 well）
¥47，
000
冷
○
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
＊ 1 肝臓特異的マーカー，＊ 2 心臓特異的マーカー
117
技術情報
miRNA
miRNA プロファイリング
miRCURY LNATM Array FAQ
miRBase
●どの動物種に使えますか？
LNA
抽出 / 精製
→全ヒト，マウス，ラットを始め，miRBase 登録の多種の生物種に対応
（詳細は弊社 WEB サイトよりご覧下さい）
。
プロファイリング
定量
●RNA サンプルの調整方法は？
→miRCURYTM RNA Isolation Kit (EXIQON)，miRNeasy (QIAGEN)
など（Phenol/Chloroform を使用しない）
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
→Phenol/Chloroform 抽出などにより total RNA を抽出後，カラム
精製などで溶媒を除去（残余した溶媒によりラベリング反応が阻害
される可能性あり）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
●サンプルのラベリング種類は？
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
→一般的に知られている Cy3，Cy5 と同様 Emission は，Hy3
（A 556nm），Hy5（A 656nm）
→Hy3 と Hy5 でカップリング効果に差は認められていません。
si/shRNA
ライブラリー
→２種類のサンプルがあり，この 2 種間での miRNA 発現レベルの
違いを比較したい場合
アレイ
１
Hy3
A
Hy5
vs
B
◆２色法・２比較（Dye swap 法）
関連試薬
アレイ
Hy3
トランスフェク
ション試薬
１
A
vs
B
その他
２
B
vs
A
Hy5
◆２色法・２比較（Universal レファレンスの利用）
miRNA
プロファイリング
●例）サ ン プ ル に Hy3，サ ン プ ル を 等 量 混 合 し て 作 製 し た
「Universal レファレンス」に Hy5 をラベリングし，各
アレイにハイブリダイズさせる。Universal レファレンスを
用いてアレイ間誤差を補正（アレイ合計２枚使用）。
miRNA
機能解析
→Universal レファレンスを使用した実験デザインでは，
各サンプルと同じ Dye にて標識された同じ Universal
レファレンスと比較される為，Dye Swap が必要ない
プール型 shRNA
ライブラリー
→実験結果を確固たるものにする為，2 - 3 の繰り返し実験
（replicate）がある条件を検討するのが良い
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
120
Hy5
１
A
vs
２
B
vs
Universal レファレンス（A+B+C）
3
C
vs
Universal レファレンス（A+B+C）
Universal レファレンス（A+B+C）
◆１色法・インターナルコントロールの利用
●例）アレイ上に配置されているコントロール（インターナル
コントロール）を利用してアレイ間誤差の補正，サンプル比較。
●例）サ ン プ ル お よ び サ ン プ ル を 等 量 混 合 し て 作 成 し た
「Universal レファレンス」に Hy3 もしくは Hy5 をラ
ベリング後，各々を別個のアレイにハイブリダイズさせ比較
する。
◆２色法・１比較
●例）サンプルそれぞれに Hy3 もしくは Hy5 をラベリング後，
アレイへハイブリダイズさせ，違いを比較。
●例）各サンプルに Hy3 および Hy5 をそれぞれラベリングし，
アレイにハイブリダイズさせる（アレイ合計 2 枚使用）。
技術情報
Hy3
◆１色法・Universal レファレンスの利用
●アレイ解析デザイン例
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
アレイ
◆２色法・ループデザイン
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
3 種類のサンプルがある場合，サンプルに Hy3，サンプルを等
量混合して作製した「Universal レファレンス」に Hy5 をラベリ
ングし，各アレイにハイブリダイズさせる。Universal レファレン
スを用いて（Hy3 / Hy5）アレイ間誤差を補正する方法（アレイ
合計 3 枚使用）
。2 色の Dye のラベリング効率の差を検討する必
要がないこともメリット。
●例）3 種類のサンプルがある場合。マイクロアレイでは２つの
サンプルしか同時に比較できないので，3 サンプルある場合，
サンプル A vs B，B vs C，C vs A にて実験を行い，各３つ
を比較する手法。基本的に 3 サンプル以上ある場合に使用
される方法。
→Hy3 または Hy5
●Hy3，Hy5 とは？
siRNA
→複数のサンプルがあり，全てを並列に比較したい場合
◆２色法・Universal レファレンスの利用
アレイ
Hy3
Hy5
１
A
vs
Universal レファレンス（A+B）
２
B
vs
Universal レファレンス（A+B）
アレイ
Hy3
１
A
２
B
３
C
４
D
５
Universal レファレンス（A ∼ D）
技術情報
miRNA プロファイリング
qPCR による microRNA 発現解析の落とし穴と
qPCR ガイドライン
qPCR（リアルタイム PCR，定量 PCR）は，ここ数年で miRNA 研究に最も繁用される手法となりました。迅速かつ高感度であり，数オーダーのダイナ
ミックレンジで比例した検出が可能であるためといえます。EXIQON 社の miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system は，パネルを用い
て miRNA の発現様式をわずか 3 時間で確認でき，検出域は７オーダーです。LNA™ および 2 種類の miRNA 特異的プライマーを用いて巧みにデザイ
ンされたシステムのため，わずか 1 pg の total RNA で各 miRNA を正確に定量できます。高感度であることから，FFPE，LCM，血清，血漿や尿をはじ
めとする体液など扱いにくいサンプルの miRNA 発現様式解析が可能となりました。一方で，生物学的に信頼性のある結果を得るためには qPCR 実験の
セットアップを正しく行うことも重要です。
異なる疾患段階を比較する場合などでは，たとえ miRNA 発現レベル変化がわずかであったとしても生物学的には有意な場合もあります。もちろん，十分
なサンプル数と適したノーマライゼーションによる統計的有意性を示す必要があります。繰返し実験数が十分でない場合，わずかながらも重要な相違が不明瞭
となります。ノーマライゼーションが最適でない場合，例えば発現様式変化を検討する上で制御レベルやフォールドチェンジの正負さえをも誤って結論づける
可能性もあります。miRNA 発現様式変化を検討する上で，適した実験デザインと信頼性のあるノーマライゼーションを行うことが非常に重要となります。
ここでは，qPCR 実験をセットアップする上で必要な各段階を再確認し，研究事例を用いて実験デザインやノーマライゼーションの重点，解析の進め方を
わかりやすくご説明します。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
実験のセットアップ
qPCR 実験をセットアップする際，正しいデータを得るために考慮すべき重要なパラメータがあります。本項では，サンプルサイズ，繰返し数，コント
ロールといった重要なパラメータに関して考察します。
機能検証
次世代
シークエンシング
最適なサンプルサイズ
サンプルは，サンプル間の分散や対象実験において得られるであろう結果の幅に基づいて，統計的に意味のある結果を得るに足る数を使用する必要があり
ます。生物学的なバラツキの少ない均一なサンプル群における突出した相違を検出することを目的としているのであれば，多量のサンプルを使用しなくても
生物学的関連性や統計的有意性を示すことができるでしょう（例えば，処理または未処理細胞培養間での 10 倍の発現差を検出するなど）。一方で，生物学
的なバラツキが大きい不均一なサンプルにおけるわずかな相違を検出することが目的であれば，統計的有意性に基づいて生物学的意味を示すためサンプル群
ごとに膨大なサンプル数を使用する必要があるでしょう（例えば，広範なヒト集団における複雑な細胞組成の組織を生検し疾患段階における 2 倍の発現差
を検出するなど ）
。統計的検出解析は必要サンプル数の評価に有用なツールですが，EXIQON 社 GenEx qPCR analysis software（p.32）により簡単に
実行できます。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
実験例
ここでは，EXIQON 社での実験事例を用いて実験デザインやノーマライ
ゼーションの重点をよりわかりやすく紹介します。
本実験例では，遺伝子組替えマウスモデルにおける週齢依存性疾患進行の
検討を目的として各時期における正常マウスとの比較を行いました。ここで
は 6 つの生物群の比較となります（6 種の遺伝子型とそれぞれ 3 点のタ
イムポイント）
。これまでの検討より差次的発現が見られる 18 種類の
miRNA に対して EXIQON 社 Pick & Mix plate (p.28) をデザインしま
した。本項で考察する通り，適切な数および種類のコントロール遺伝子を選
択することが非常に重要であり，得られる結果に多大な影響を及ぼします。
実験例では，様々なサンプルタイプにおいて比較的定常発現している，と
いった経験値をもとに 6 種の small RNA をリファレンス遺伝子候補と
して選択しました（ここでは 3 種類の miRNA および 3 種類の noncoding RNA を選択）。実験デザインは図 . 1 に示しています。
siRNA
U
FEBR
ARY
FEBR UARY
FE BRUA
RY
05 10 15
使用サンプル：2 種類の遺伝子型
（野生型とノックアウト病体モデル）
3 点のタイムポイント：疾患進行によるマウス週齢
↓
各群より 5 検体
↓
各サンプルに対して RT 反応 2 回繰り返し
↓
18 種類の microRNA を対象，6 種類のリファレ
ンス遺伝子候補
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
図 1 実験事例のセットアップ
2 種類の遺伝子系統を用いて 3 点のタイムポイント
において検討した。各群とも 5 検体使用し，EXIGON
Pick & Mix panel を使用してサンプルごとに RT お
よび qPCR 反応を 2 回繰返しで行った。
トランスフェク
ション試薬
その他
各実験ステップにおける繰返し数の決定
繰返し実験を行う目的は，生物学的または実験手技により生ずるバラツキといったノイズを除去し，統計的信頼区間を算出することです。生物学的および
手技的な繰返し数を考慮する必要があります。
繰返しは，バラツキが最も生ずると考えられるステップで行います。例えば，サンプルサイズに対する生物学的繰返しや RNA 抽出，RT，および PCR ス
テップにおける手技的繰返しなどです。繰返し数はバラツキの程度にもよりますが，最低 3 回は必要です。2 回のみの繰返しを行って高い相違が見られた
場合，何れが異常値か判断がつきませんが，3 回繰返しであれば異常値特定の参考になります。
生物学的バラツキの低減
生物学的バラツキは主に個体差によるものです。実験目的の多くは 2 種の生物群における相違を同定することにあります。もし研究対象のサンプル群が
遺伝学的かつ環境的に均一であれば，生物学的バラツキは少ない可能性があります。例えば，近交系の動物系統や特定の島，山または種族集団など周辺環境よ
り隔離された閉鎖集団などです。検体が培養細胞の場合，バラツキは無視できる程度である可能性もあります。一方で，不均一な集団を対象とする場合，集団
における生物学的バラツキが非常に大きく，多量の生物学的繰返し数が必要となる可能性があります。不均一な集団として，人種が混在した集団から採取し
たサンプルなどがあります。したがって，miRNA バイオマーカーの開発などに利用される臨床サンプルは，不均一集団といえます。
上記より，非常に均一な生物集団を用いた実験をデザインする場合，生物学的バラツキが少ないことから，少ないサンプル数であっても相違が少ないと考えら
れます。もちろん，サンプル数を少なくすることで，大集団においてのみ検出可能であろう重要な生物学的相違を見逃す可能性もあります。これに対し，不均一集
団を対象として実験する場合，集団間における重要な相違を同定する可能性が高くなりますが，膨大なバラツキにより，有意な相違を抽出するために現実的でな
い膨大なサンプル数を必要とする可能性があります。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
121
技術情報
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
手技によるバラツキの回避
人の手によりサンプル調製を行う場合，毎回全く同一なものにすることは不可能です。そのため，実験の各ステップにおいてある程度のバラツキが生ずることにな
ります。この問題を最小限に抑えるために繰返し実験を行います。一般に，qPCR 実験には複数のステップがあるため，この各段階で実験的バラツキがでる可能性が
あり，miRNA qPCR 実験でも同様です。実験手技に左右されない安定した qPCR システムを利用することで問題を最小限に抑えることができます。
図 . 2 に miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR platform の結果を示していますが，別々の日に行った実験結果でも手技のバラツキが最小限に抑えら
れ，日間差が生じにくい，再現性の高いシステムといえます。どのステップにおいて繰返しを行うかは，各ステップで導入されるであろうバラツキによって決めます。
例えば，サンプル抽出で手技によるバラツキが多くみられる一方で PCR ステップでは再現性が高い場合，PCR の繰返しを行ってもあまり有効とは思えません。こ
の場合，サンプル抽出を複数回行うことで多大なノイズが除去でき，生物学的相違を統計的に示すことが可能となるかもしれません。
サンプリングは手技が介入するステップでありながら，見落とされがちです。実際には，手技によるバラツキを生ずる可能性の高いステップでもあります
（時には，生物学的バラツキと捉えてしまうことさえあります）
。もし種々の異なる組成や細胞種から構成された複雑な組織（例えば腎臓など）から採取した生
体試料である場合，同一個体から 3 サンプル採取したとしても結果は大きく異なる可能性があります。一方で，同一個体から連続で 3 サンプル採取した血
液であれば非常に類似していると考えられ，この場合，別々の時間にサンプリングしたものを試料とする方がよいかもしれません。
その他のポイントとして，RNA 抽出方法があります。抽出方法が異なれば，それぞれ異なったバラツキを誘導する可能性があり，繰返しを行う必要がありま
す。特に，血清 / 血漿，尿または脳脊髄液などの体液を用いて miRNA 発現解析を行う場合は，非常に重要な問題になります。多くのサンプルタイプにおいて，
mRNA, tRNA および rRNA といった比較的長鎖の RNA が主な RNA として含まれています。しかし，実質無細胞の体液をサンプルとする場合，たとえ解析
を行うことができるだけの miRNA が発現していたとしても全 RNA 数自体が非常に低い可能性があります。RNA を 100% 回収することは不可能ですの
で，最初の total RNA レベルが低い場合は抽出段階で顕著な miRNA 損失を生ずることがあり，qPCR 実験を行った際に感度が低くバラツキが大きくなる可
能性があります。
この場合，バクテリオファージ MS2 total RNA や酵母 tRNA など microRNA を含まない RNA キャリアを添加することで改善することがあります（Tip
box 参照）
。血清 / 血漿を使用する場合のガイドラインは，後述の「血漿・血漿中の microRNA プロファイリング」をご参照ください。
EXIQON 社の実験例では，最もバラツキを誘導する要因はマウスの個体差であったため，各グループにおいて 5 個体を使用しました。手技レベルでは
RT/PCR における異常値除去を目指したため，RT において繰返しを行いました。本事例は比較的バラツキが少ないものといえます。多くの場合，より大ス
ケールでの実験が必要となるため繰返し数を最小限に止めることが好まれるものの，データセットへの影響を鑑みて実施されています。大容量で高価格かつ
時間を要する実験を計画する前に，バラツキのレベルや所在を確認するための小規模の予備試験を行い，期待するレベルの相違を検出するためにはグループ
ごとに何検体必要であるか確認することが得策ともいえます。これは，バラツキを生ずるであろう各ステップで 3 回繰返しを行う枝分かれ配置（nested
design）と nested ANOVA（Tichobad et al. 2009）を利用して確認できます（図 . 3 参照）。GenEx をご利用の場合，枝分かれ配置実験デザインや
解析方法に関する参考情報がございますのでご確認ください。
より詳細な情報は www.qPCRforum.com をご参照ください。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
40
コントロール
siRNA
35
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
Subjects
Raw Cq values RT2
デザイン済み
siRNA
Group B
Group A
30
Tissue
samples
R 2= 0.99
25
Reverse
transcrip tase
20
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
15
15
20
25
30
Raw Cq values RT1
35
40
qPCR
図 2 miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system による日間の再現性
図 3 実験セットアップ例
心 臓 お よ び 肝 臓 か ら 抽 出 し た 40ng total RNA の microRNA 発 現 様 式 を Readyto-Use PCR
human panel I および panel II を用いて複数日にわたり実施した。
全 microRNA のうち Cq 値が 35 未満のものに関して，生 Cq 値の相関関係を図示した（297 データ
ポイント）
手技や生物学的レベルによるバラツキがどの程度か確認するテスト実験例を示した。この実験では各レベル
で 3 回の繰返しを行い，nested ANOVA により解析する。
トランスフェク
ション試薬
キャリア RNA
その他
サンプル内の total RNA 量および RNA コンプレキシティを増大させるためにキャリア RNA を添加します。
RNA 濃度の上昇にともないプラスチックや抽出フィルターへの吸着による RNA 損失が最小化できます。特に血清 / 血漿や合成 RNA といった total RNA 濃度の低いサンプルにおい
て有用です。コンプレキシティが増大すると低エネルギーの DNA の二本鎖形成が増え，プライマーダイマー形成などの期待しない非特異的結合と競合します。miRNA を含まないキャリア
RNA として，MS2 バクテリオファージ total RNA や酵母 tRNA が挙げられます。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
至適データ検証のためのコントロール
実験が問題なく行われているかを確認し，トラブルシューティングに備えるため，複数のコントロールを同時に使用します。いくつ使用するか，何を使用す
ればよいかは実験の種類，およびその実験において考えら得るリスクによります。実験のコントロールにはネガティブコントロールとポジティブコントロー
ルがあります。
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
適切なネガティブコントロールの選択
ネガティブコントロールには，汚染の確認と各アッセイのバックグランド
レベルの確認といった 2 つの大きな目的があります。バックグラウンドは汚
染，プライマーダイマー形成，または非特異的増幅などにより高くなり，
SYBR® Geen Assay では Cq 値の高い増幅曲線となる可能性があります。
ネガティブコントロールの種類によりそれぞれ異なった課題があります。
122
Cq 値
qPCR 機器の種類によって異なった数量化基準が使用されます（Ct，Cp，TOP）
。ここ
では，MIQE ガイドライン（Bustin et al, 2009）に準じ，一般の用語をカバーする標
準的な命名の数量化サイクル（Cq）を使用しています。
技術情報
ネガティブコントロールとして考慮すべきこと
1. 酵素なしコントロール
RNA テンプレートは加えるが，酵素は加えずに行う RT 反応です。RNA サンプルにゲノム DNA や以前の実験からの DNA などが混入していたか
が明確になります。また，RNA がキャリアとなりプライマーダイマー形成を防ぎますので，プライマーダイマーの形成率は通常サンプルと同程度となります。
2. テンプレートなしコントロール（NTC）
テンプレートの代わりに水やバッファーを添加して行う PCR 反応で，水やマスターミックスに汚染などの問題がないか確認できます。RT 反応における
NTC でも RT 試薬が汚染されていなかったか確認できますが，RT 試薬と PCR 試薬の何れに問題があったのか判断するのは困難です。何れの場合もプラ
イマーダイマー形成の確認が可能です。ただし，NTC の場合，反応液中の全核酸に占めるプライマー比率が高いため，テンプレートが存在する場合に比べてプ
ライマーダイマーが形成される傾向にあります。これはテンプレートが存在する場合は非特異的な弱い結合が低エネルギーのプライマーダイマー形成と競合す
ると考えられるためです。
3. Mock RT 反応
キャリア RNA のみを用いて行う RT 反応で，非特異的増幅を生ずる可能性があります。本反応を行う場合は，バクテリオファージ MS2 total RNA
や酵母 tRNA など microRNA を含まないキャリア RNA を使用します。RNA 抽出でキャリア RNA を使用した場合，キャリアによりバックグラウ
ンドが高くなることがあるため，本コントロールをとることが重要になります。キャリア RNA のみを抽出に使用して mock 抽出を行い RT 反応のテン
プレートとする方が，抽出段階での汚染等も明らかとなり、よりよい手法といえます。表 1 に MS2 RNA の mock RT をどのように使用して
microRNA 解析においてバックグラウンドの問題がないことを識別したか示しました。small non-coding RNA を用いた実験ではプライマーダイマー
による多少のバックグラウンドがみられますが，非特異的増幅は比較的反応後期で生ずるため，EXIQON 社のマウスサンプルにおいては特異的増幅への影
響はみられませんでした。
ネガティブコントロールは，データの前処理のカットオフ設定でも使用します。多くのアッセイではバックグラウンドは無視できる程度ですが，場合に
よってはプライマーダイマー形成によりサイクリングプロトコールの増幅曲線に遅延が生じます。そのため，特異的増幅によるシグナルやバックグラウン
ドシグナルのカットオフはネガティブコントロールの結果をもとに設定する必要があります。
一般に，バックグラウンド値は特異的なシグナル値に比べてバラツキが大きいのが特徴です。サンプル中の低コピー数の microRNA から得られる特異
的シグナルのレベルを含めつつ非特異的増幅によるシグナルを除去できるカットオフを設定することが望まれます。検出したバックグラウンドより 2 - 3
Cq 値を引き算する程度が適切な場合が多いようです。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
Roche-LightCycler
480 (Cp-values)
let-7a
miR-378
miR-145
配列解析
サービス
RNU5g
カスタム合成
サービス
MS2 (mock neg control 1)
no amp
no amp
no amp
35.18
MS2 (mock neg control 2)
no amp
no amp
no amp
no amp
Sample 1 (wt), 6 weeks
30.13
25.46
23.84
21.62
Sample 1 (wt), 6 weeks
28.23
25.28
23.6
21.5
Sample 2 (wt), 6 weeks
28.37
24.15
22.53
20.49
Sample 2 (wt), 6 weeks
27.19
23.84
22.13
20.13
Sample 4 (ko), 6 weeks
32.2
27.69
26.81
23.24
表 1 mock RT ネガティブコントロールの例
サンプルに MS2 バクテリオファージ total RNA を添加し RT 反応を行った。
PCR 反応のカットオフは 40 サイクルとし，40 サイクル以降で検出されたもの
は「no amp」と表記した。本 microRNA 解析では顕著なバックグラウンドは検
出されなかった。RNU5g では若干のバックグラウンドがみられたものの，他のポ
イントに比べて Cp 値が高いため問題ないと考える。
Sample 4 (ko), 6 weeks
31.97
27.61
26.48
22.96
Sample 5 (ko), 6 weeks
30.71
27.45
25.06
21.9
Sample 5 (ko), 6 weeks
30.07
26.62
24.77
21.6
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
ポジティブコントロールの目的と使用例
ポジティブコントロールを使用する主な目的はサンプルや反応の精度を保証し，疑わしい結果が出た場合のトラブルシューティングに利用することです。
有用なポジティブコントロールにはいくつかの選択肢があります。
RT 反応に合成 RNA をスパイクインして cDNA 合成に問題がなかったことを確認するのは有用な方法といえます。さらに，RT または PCR 反応に阻
害物質が含まれていなかったかどうか推察することもできます。もちろん，反応ごとに阻害剤に対する感受性は異なるため，阻害剤によっては混入の有無を
スパイクインでは検出できない可能性もあります。
「SYBR® Green 使用に際する品質管理」の項に記述したように，アッセイ毎にその効率をモニターする
ことをお奨めしています。
スパイクイン RNA テンプレートは，RNA 抽出段階での均一性や効率のモニターにも使えます。この場合，RNA 分解を避けるために可溶化バッファー
を添加直後のサンプル可溶化液にスパイクインします。ただし，この方法では PCR 反応の失敗が RNA 抽出によるものか RT 反応によるものか区別でき
ません。
EXIQON 社の cDNA synthesis kit には RNA スパイクインが付属しています。スパイクイン RNA より生成した cDNA の増幅用プライマーは
SYBR® Green master mix kit やデザイン済みパネルに付属していますが，カスタムデザイン Pick&Mix プレート（p.28）ではご希望により追加して頂
けます。
qPCR 反応で増幅シグナルが確認できない場合，真の陰性（対象 miRNA の存在量が検出限度未満）か反応自体に問題があったのかを識別するためにト
ラブルシューティング行います。注意点は，特に確認実験とスクリーニングで異なった手法を使用した場合などで，異なった結果を得る場合があることです。
真の陰性と偽の陰性の識別にはポジティブコントロール RNA の利用が有効となる場合があります。もし，標的 miRNA が特定の組織や細胞株で高発現す
ることが知られている場合，市販の高品質の RNA サンプルをポジティブコントロールとして使用する方法もあります。ここで示した事例では，全ての対象
miRNA が使用サンプル内で発現していることを事前に確認しています。一方，全 miRNA が全ての細胞や組織に発現しているわけではないため，ポジティ
ブコントロールとして使用可能な生体サンプルをみつけるのは難しいかもしれません。この場合，合成 RNA テンプレートを使用します。各 LNA™
microRNA PCR primer set の標的配列は，下記の WEB ページをご参照ください。
www.exiqon.com/miRNA-pcr-primer
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
123
技術情報
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
SYBR® Green 使用に際する品質管理
ネガティブおよびポジティブコントロールに加えて，増幅物の融解温度
（Tm）といったアッセイ特徴やアッセイ効率も品質管理に利用できます。
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system で の 検 出 に
SYBR® Green を使用することで融解曲線を描くことができ，特異的増幅
物の Tm 値の再現性が反応間でとれているか確認することができます。こ
のように，Tm 値をもとに得られた増幅物がサンプル間で同一であるかどう
か判断できます。融解曲線のピークが 1 本であることにご留意ください。
図 .4 にはここで取り上げた事例 4 プレートのうちの１プレートにおける
mmu-miR-429 の融解曲線を示しました。
融解曲線はよいコントロールである一方，qPCR 機器によって温度較正
が異なる場合があり，使用する機器によって得られる Tm 値が異なる可能
性があります。そのため，各増幅物の期待される Tm 値はポジティブコン
トロール使用のもとに，実験に使用する機器を用いて決定することが重要で
す。アッセイ効率は LinRegPCR（www.hartfaalcentrum.nl ページから
ダウンロード可能）といった増幅曲線を元に算出できます。アッセイ効率が，
信頼できるポジティブコントロールの結果から期待された値より低い場合，
サンプルに阻害物質が混入している可能性が考えられます。
アッセイ効率は実験に使用する増幅機器を用いて決定する必要がありま
すが，EXIQON 社の LNA™ microRNA PCR primer set は全て検証済み
で，その効率は 1.80 ∼ 2.10 です。アッセイによっては他のものに比べ
て阻害剤により感受性を示しますので同一サンプルを使用した miRNA 検
出であってもアッセイによって阻害が見られる場合があります。
mmu-miR-429 Melting Peaks
5.165
-(d/dT) Fluo rescence (483-533)
miRNA
4.665
4.165
3.665
3.165
2.665
2.165
1.665
1.165
0.665
0.165
60
62
64
66
68
70
72
74
Temperature (°C)
76
78
80
82
図 4 アッセイの品質管理には融解曲線分析が有用
種 々 の サ ン プ ル を 用 い て miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR に よ り mmu-miR-429
の発現解析をテスト解析した際の融解曲線を図示した。曲線の形状と Tm（最大融解温度）を品質管理
に使用できる。融解曲線は増幅産物の Tm 値に相当する主要な Tm ピークが 1 つのみ確認でき，mmumiR-429 の特異的増幅が示唆された。
検出限界
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system でご提供するプライマーセットは，その 95% 以上が PCR 反応中の 10 RNA コピー程
度を検出できる感受性があり，全てのプライマーが最低 1000 コピーを検出可能です（図 . 5 参照）。
特定のサンプルを用いたアッセイにおける検出限界を決定する場合，希釈段階系列を用いてアッセイを行います。この方法は効率算出において一般的です
（LinRegPCR で代用可能）。絶対的な miRNA 定量を行う場合にも希釈段階系列をとる必要があります。
この実験を行う前に，cDNA 希釈系列が十分か，RNA 希釈系列の方が適しているかを決定します。cDNA 希釈を行う場合は RT 反応が 1 回で済むた
め簡単で安価です。RNA 希釈段階系列をとる場合は，複数の RT 反応を行う必要があると同時に RNA サンプル希釈，RT での検出限界，RT 反応に混入
した阻害剤などによる RT 効率低下を考慮する必要があります。これらの情報は，cDNA 希釈系列では得られません。RNA サンプルを希釈する場合は，
バクテリオファージ MS2 totalRNA といったキャリア RNA を添加してプラスチックへの吸着を始めとする RNA 損失を防ぐことをお勧めします。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
hsa-let-7a
40
shRNA クローン
コレクション
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
Cq values
si/shRNA 発現
Detection limit 10 miR copies
30
検出限界は感受性の真の指標
20
qPCR 反応における低 Cq 値は高い感受性を示すといった誤った概念がありますが，
Cq 値は他のサンプル中の Cq 値と比較して相対的な発現量を算出したり，既知量の標的
を解析するのに使用した標準曲線と比較して絶対的定量を行ったりするものです。
10
qPCR 反応の真の感受性を確認するには，テンプレートを含まないネガティブサンプル
とともに既知量のテンプレートを用いた希釈段階系列を用いて実験する必要があります。
0
0
10
100
1,000 10,000 100,000 1.000,000
microRNA copies in PCR
検出限界は比例関係が維持できている直線上の最終点の値を用いて決定します（直線回
帰から外れたポイントは除外）
。
関連試薬
図 5 EXIQON 社 LNA™ microRNA PCR primer では 10 コピー程度の miRNA が検出可能
トランスフェク
ション試薬
hsa-let-7a の合成 microRNA の希釈段階系列（108 ∼ 1000 コピー）を用いて cDNA 合成および
リアルタイム PCR 反応を行った結果を示した。
その他
低発現 microRNA の検出
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
対象の miRNA の発現量が非常に低い場合，qPCR 反応の検出限界以下となる可能性がありますが，使用する RNA テンプレート量を増やすことで回避
できることもあります。EXIQON 社の経験では，RNA サンプルの品質がよい場合，テンプレート量を 10 倍程度増やしても阻害物質の影響がみられないこ
とがあります。
しかし，サンプルに例え少量であっても阻害物質が含まれる場合は，RNA テンプレート量を増やすことで反応に問題が生ずる可能性があります。miRNA
含量が低くかつ阻害物質が存在する血清や血漿と行った複雑なサンプルでは，しばしば，高い Cq 値が得られることがあります（30 - 35 程度）。シグナル
がバックグラウンドと識別可能であれば全く問題ありませんので，サンプル量を増やして阻害剤のリスクを負って再試するよりも，得られた Cq 値を信用す
る方が妥当と考えます。 PCR 反応で cDNA テンプレート量を増やす（希釈率を低くする）場合は注意が必要です。これは，RT バッファーは高濃度で
PCR 反応の阻害物質となりうるものが含まれるためです。EXIQON 社の経験では，このような複雑なサンプルを使用する場合は qPCR に使用する
cDNA の希釈率を 40 倍以下にしない方がよいようです（推奨希釈率は 100 倍）
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
血清 / 血漿サンプル
血清 / 血漿サンプルを用いた miRNA プロファイリングについては 後項をご参照ください。
124
技術情報
miRNA プロファイリング
ノーマライゼーションとデータ解析
microRNA qPCR 実験では，多くの場合生物学的相違を検出することが目的とされます。問題は，手技のバラツキにより結果が判然としない場合があること
です。ノーマライゼーションの目的は，こういった手技バラツキを除外し，生物学的相違をより明白にすることです。前述の通り，手技バラツキはサンプル採取お
よび取扱い，RNA 抽出段階および RNA の品質などから生じます。
こういった生物学的相違や手技バラツキによる影響は，グローバル平均値や１つないし複数の内在性コントロール遺伝子を用いた qPCR データのノーマライ
ゼーションにより低減することができ，より正確な miRNA レベルの定量が可能になります。内在性コントロール遺伝子の選択は未だ慣例的になっていません
が，よりよいコントロールを選択する指標をご紹介します。
プレート間較正
Roche LC480 を始めとするいくつかの qPCR 機器では Cq 算出に二次微分法を使用するため，PCR 実験間で高い再現性がみられます。EXIQON 社
の経験では，LC480 を使用する場合はプレート間較正の必要はありません。一方で，多くの qPCR 機器では実行ごとに手技バラツキの影響がシグナルと
して現れ，特にベースラインや閾値算出が Cq に基づいている場合に顕著です。そのため，1 つの遺伝子に対して全ての繰返しやサンプルを同一プレート内
で試行することをお奨めします。一方，EXIQON 社のデザイン済 human または Mouse / Rat パネルのように数々のサンプルを使用して，多くの標的
miRNA に対してラージスケールの実験を行う場合，この方法は現実的ではありません。代わりにプレート間較正を利用し，各プレート全般の Cq 値を各プ
レートで同等の発現を示すリファレンスに対して較正します。デザイン済 パネル (p.26 ∼ p.27) やカスタムデザイン Pick & Mix パネル (p.28) を始め
とした全ての EXIQON 社 ready-to-use panel には，プレート間標準物質（IPC）が 3 回繰返しで搭載してあります。
各 IPC ウェルには検出プライマーセットと DNA テンプレートが含まれ，サンプル増幅非依存性です。3 回繰返しで搭載しているのは，ピペッティング
の際に IPC のウェルでミスをして，プレート全体が無効になるのを防ぐためです。また，各プレートによって IPC の配置が決まっており，IPC パターンに
応じてプレートの識別が可能です。プレート間較正は下記に示した公式を利用して行うことができます。EXIQON 社 GenEx qPCR analysis software
(p.32) をご利用の場合は，プレート間較正は前処理に組込まれています。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
適切なリファレンス遺伝子の選択
定量的 miRNA 解析のノーマライゼーション用に最適なリファレンス遺伝子または適切なリファレンス遺伝子群を選択するのは非常に難しく，単純作業
とはいきません。もし数百種類の miRNA を対象としたスクリーニングを行うのであれば，全発現 miRNA のグローバル平均値を用いたノーマライゼー
ション方法が挙げられます（Mestdagh et al. 2009）
。小規模実験では 1 つないし，複数の定常発現した内在性遺伝子をコントロールとして利用できます。
このコントロール遺伝子は，スクリーニング実験において定常発現を示すと同時にグローバル平均値と同程度の動向を示すものを選択します（Mestdagh
et al. 2009, Chang et al. 2010）。もしこのスクリーニングを行わない場合，既報を参考にして選択します（Meyer et al, 2010 には概略が記載されて
います）
。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
miRNA 定量においてノーマライゼーション用内在性コントロール遺伝子として使用される遺伝子の特徴を以下に示しました。
●
対象 miRNA と発現レベルが同程度
●
実験に使用する全サンプルにおいて発現レベルに変動がみられない
関連試薬
（実験条件による発現制御がみられない）
●
miRNA と同程度の短鎖である（安定性，抽出および定量効率が同程度）
リファレンス遺伝子は研究ごとに，実験的に検証する必要があります。さまざまな組織や細胞種に対して 1 つのリファレンス遺伝子のみを使用することは
お奨めできません。mRNA 発現解析で多用されるβ -actin や GAPDH のような一般に多用されるリファレンス遺伝子であっても，サンプル間で発現レベ
ルのバラツキがみられることが知られています（De Kok et al, 2005）
。
通常，miRNA 発現解析を行う場合，miRNA より長鎖の snoRNA, snRNA または U6 などではなく，定常発現している miRNA を内在性リファレン
ス遺伝子として利用することをお奨めしています。
miRNA は非常に短鎖のため，抽出や RT 反応においてより長鎖の RNA とは異なる動向を示す可能性があるためです（Vandesompele et al., 2002）
。
使用するサンプルによっては，しばしば用いられるリファレンス miRNA がありますのでご紹介します（Bargaje et al, 2010; Chang et al, 2010;
Liang et al, 2007; Peltier and Latham, 2008）
●
hsa-miR-103
●
hsa-miR-423-3p
●
hsa-miR-191
●
hsa-miR-16
●
hsa-miR-423-5p
●
hsa-let-7a
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
後述の血清 / 血漿サンプルを用いた microRNA qPCR 実験ガイドラインでは，血清や血漿サンプルの使用に際してリファレンス miRNA となり得る
ものをご紹介しています。
もし定常発現している miRNA が見つからない場合，他の短鎖 non-coding RNA を使用しますが，100nt 以上の長鎖である可能性があることに留意
125
技術情報
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
する必要があります。U6（107nt）や 5S rRNA（121nt）がしばしばリファレンス遺伝子として利用されてきましたが，最適な選択とはいえません。
これらは miRNA と比べ細胞内での発現レベルが非常に高く，一方で無細胞性の体液中では顕著な発現が見られないこと，さらに miRNA に比べて長鎖で
あるためです。
体液をサンプルに利用する場合は miRNA がエキソソームや微小胞といった細胞外に存在する可能性があるため，リファレンス遺伝子の選択には特別な
注意が必要です。これらのサンプルは実質的に無細胞であるため，細胞内でのみ発現する RNA や分解産物として放出される U6, 5S rRNA, snoRNA な
どはリファレンス遺伝子として適当ではありません。これらのサンプルでは miRNA を用いたノーマライゼーションが強く望まれます。一般に，各 miRNA
定量実験において最も適切な候補を見つけるため複数のコントロールを評価することが必要です。判断基準になる過去のデータを持ち合わせていない場合，
5 - 6 種類の候補をテストすることをお奨めします。この結果より，2 - 3 種類の安定発現している遺伝子（できれば miRNA）に対してノーマライゼーショ
ンを行うと，良好な結果を得られる場合が多いようです。
EXIQON 社 の 事 例 で は，3 種 類 の miRNA と 3 種 類 の non-coding RNA を リ フ ァ レ ン ス 遺 伝 子 候 補 と し て 選 択 し ま し た。GenEx software
package (p.32) に含まれる Normfinder を用いてこれらの安定性を解析し，グループ内バラツキを考慮した場合としなかった場合を比較しました
（図.6）
。全サンプルの全般的な発現レベルを確認した場合，miR-423-3p, RNU1A, miR-191 の標準偏差が 0.5 未満でした。
リファレンス遺伝子候補が遺伝子型や疾患段階でバラツキを示す危険性を考慮し，グループ内バラツキを加えた場合であっても同じ 3 遺伝子があがってき
ました。Let-7a はグループ内検討ではバラツキが低いものの，サンプル間バラツキが大きいため除外しました。
インヒビター
Intra-group variation considered
Groups ignored
過剰発現
（オリゴ）
0.75
過剰発現
（ベクター）
0.65
0.50
0.70
0.45
0.60
SNORD68
0.35
miR-191
0.50
Variability
RNU1A
0.45
0.40
SD
次世代
シークエンシング
0.35
miR-423-3p
0.30
0.25
0.10
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
RNU1 A
0.20
miR-423-3p
Control genes
Control genes
図 6 テストした候補群より最適なリファレンス遺伝子を選択する方法例
EXIQON 社の GenEx software を使用して実験事例におけるリファレンス遺伝子を評価し，決定した。NormFinder test を除去群（ignored）および対象群に対して試行し
た。双方のテストより miR-423-5p, miR-191 および RUN1A の定常発現が同定でき，let-7a は一方のテストでのみ定常であった。これにより，miR-423-5p, miR-191 お
よび RNU1A をリファレンス遺伝子として選択した。最適なリファレンス遺伝子を赤で示し，適切なリファレンス遺伝子群を黄色で示した。
コントロール
siRNA
shRNA クローン
コレクション
let-7a
0
0
カスタム合成
サービス
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
miR-191
0.05
0.05
デザイン済み
siRNA
0.25
0.10
0.15
配列解析
サービス
0.30
0.15
0.20
siRNA
SNORD68
0.40
RNU5g
0.55
機能検証
RNU5g
let-7a
結果の提示
qPCR 実験後，適切にデータ前処理を行えば，EXIQON 社 GenEx qPCR software（p.32）などのデータ解析ソフトを利用することで比較的容易に結
果を得ることができます。この qPCR ソフトパッケージを利用すれば論文投稿などに使用可能な図表を作成できます。統計処理はいくつかの選択項目をク
リックするだけで実行できますので，生物統計学の知識は必要ありません。
EXIQON 社の事例では，EXIQON 社 GenEx qPCR software を使って容易に主成分分析（PCA）を行い，野生型では 3 点のタイムポイント間で差が
ないこと，また疾患モデルのうち最初のタイムポイントでは野生型と差がないことが示唆されました。一方，疾患の進行にともない，サンプルグループは野生
型のものに比べ顕著な差を示しました（図.7）
。ヒートマップでもこのパターンが確認でき，さらにどの miRNA が疾患マーカーの可能性があるかといった
指標が明らかになりました（図 .7B）
。EXIQON 社 GenEx qPCR software では ANOVA や t-test を始めさまざまなテストが簡単に試行できます。
A
B
PC
3
Principal component analysis
2
1
0
PC2
トランスフェク
ション試薬
その他
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-16 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
-4 -3 -2
miR-182
miR-183
miR-200a
mmu-miR-429
miR-141
miR-18a
miR-146b-5p
miR-31
miR-200b
miR-130a
miR-143
miR-126
miR-145
miR-10b
miR-378
miR-100
miR-21
RNU5g
let-7a
SNORD68
miR-20a
t6
_1
w
t6
_3
w
t6
_
ko 4
6_
2
ko
6
w _3
t9
,5
w _1
t9
,5
w _3
t9
,5
_
ko 2
6_
1
ko
6_
w 4
t1
3_
w 4
t6
_5
w
t1
3_
w 2
t1
3_
w 3
t1
3
w _5
t9
,5
_
w 4
t1
3_
1
w
t6
_
ko 2
6_
ko 5
9,5
_
ko 2
9,5
ko _4
9,5
_
ko 3
9,5
ko _5
9,5
_
ko 1
13
_
ko 2
13
_
ko 5
13
_
ko 1
13
ko _4
13
_3
関連試薬
8.0
7.8
7.6
7.4
7.2
7.0
6.8
6.6
6.4
6.2
6.0
5.8
5.6
5.4
5.2
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
w
3
PC1
技術情報
図 7 qPCR 実験による PCA 結果およびヒートマップ
EXIQON 社の GenEx qPCR software を用いることで qPCR 実験結果を以下に容易に提示できるか示した。主成分分析（A）により 2 グループ（陰のついた赤色）が同一集
団として分類され，他の 4 グループと大きく異なることが示された（赤色および陰のついた青色）
。ヒートマップ（B）により上記分類が適切であることが確認でき，さらに同時
制御されると思われる miRNA 群や制御に大きく関与すると思われる miRNA 群が予想できた。
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
126
おわりに
qPCR 実験を問題なく行うためには適切なセットアップが非常に重要です。本稿でご紹
介したように，qPCR 実験を適切に行うためには qPCR 技術や実験目的を十分に理解する
と同時にサンプルサイズ，繰返し数，ノーマライゼーションといった各実験ステップを慎重
に考慮することが大切です。qPCR は適切に利用すれば非常に有力な技術となります。こ
こでご紹介した実験事例では，miRNA バイオマーカー候補が同定でき，現在も EXIQON
社にて詳細を検討しています。
ここでご紹介したガイドラインに準ずることで，ご自身の miRNA qPCR 実験を適切に
セットアップし，正しいデータを得る基礎ができることを願っています。実験条件設定を賢
明に行い，microRNA 分野の大きな飛躍への第一歩を踏み出しましょう。
[ リファレンス ]
Bargaje, R. et al. (2010), RNA 16, 16-25
Bustin, S.A. et al.(2009), Clin. Chem., 55, 611-22
Chang, K.H. et al. (2010), BMC Cancer, 10, 173
De Kok, J.B. et al. (2005), Lab Invest., 85, 154-9
Liang, H. et al. (2007), BMC 8, 166
Mestdagh, P. et al. (2009), Genome Biol, 10, R64
Meyer, S.U. et al. (2010), Biotechnol Lett., 32, 1777-88
Peltier, H.J. and Latham, G.J. (2008), RNA, 14, 844-52
Tichopad, A. et al. (2009), Clin Chem., 55, 1816-23
技術情報
miRNA プロファイリング
miRNA
血清・血漿中の microRNA プロファイリング
miRBase
血清および血漿サンプルの microRNA (miRNA) 発現プロファイリングは，広範な疾患や生物学的プロセスにおける新規バイオマーカー探索を行う上で他と
は一線を画す非常に有用なものです。一方で，これらのサンプルを使用した miRNA 発現プロファイリングが困難であることも事実です。
EXIQON 社の miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR System (p.24 ∼ p.35) では，血清や血漿サンプルを用いた高感度かつ特異的な miRNA
発現プロファイリングが可能です（図 1）
。本稿では，血清や血漿を用いた miRNA 発現プロファイリングを行う際のガイドラインや，EXIQON 社製品を用いた
miRNA 定量実験が問題なく行えるよう種々の情報をご紹介します。
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
血清 / 血漿中の miRNA プロファイリング
検出
血清および血漿サンプルにおける miRNA 発現プロファイリングは非常に有用な情報が得られる一方で，実験を進める上でさまざまな課題があります。
まず，血清や血漿は RNA 量の少ない無細胞サンプルであるため，バイオアナライザーや OD 測定といった一般的な RNA 純度測定が困難です。次に，血
清や血漿から抽出した RNA は，たとえ高純度のものであっても qPCR で使用する逆転写酵素や Taq ポリメラーゼの阻害物質を含んでいます。さらに，
ノーマライゼーションコントロールなどを選択する際は細心の注意を払う必要があります。ここでは，これらの課題を打破する方法をご紹介します。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
血清と血漿のどちらを選ぶか
20
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR System (p.24 ∼ p.35) で は，血 清
または血漿の何れから抽出した total RNA を用いても精度よく解析することができます。ど
ちらをサンプルとするかは状況により異なりますが，血漿サンプリングの方がコントロールで
きる面が多いため，血漿を選択する場合があります。また，血清サンプルよりも血漿サンプル
の Cq 値（quantification cycle）の方が低いことが多く，miRNA が多く含まれると考え
られます。クエン酸や EDTA といった抗凝固薬を用いて調製した血漿の方が miRNA 発現
プロファイリングで比較的よい結果が得られます。ただし，ヘパリンは逆転写および PCR に
おける酵素反応を阻害することが知られているため，ヘパリンを用いた血漿の使用はお薦めで
きません。血清と血漿では全く同一の miRNA 発現プロファイル結果が得られないものの，
何れのサンプルにおいても循環 miRNA 発現様式は結果に反映されます。
22
機能検証
miR-16
次世代
シークエンシング
Expression level (Cq)
24
26
miR-126
28
30
32
miR-451
let-7a
siRNA
34
配列解析
サービス
36
38
miR-337-3p
40
Serum/plasma microRNAs
図 1 血清中の全 microRNA プロファイリング
EXIQON 社 の Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel は 一 般 的 に
血清や血漿でみられる 175 種のヒト microRNA プロファイリング用にデザ
インしてある。500 種以上の血清サンプルより抽出した total RNA を，3 回
繰 返 し で RT 反 応 を 行 い，Serum/plasma Focus microRNA panel を 用 い
てリアルタイム PCR によりプロファイリングを行った。miRNA 群の Cq 値
（quantification cycle value）による平均発現レベルを図示した。血清 / 血漿
中での高発現で知られる hsa-miR-16 および miR-451 は血清 / 血漿系にお
ける溶血 / 血液細胞汚染の指標である（橙色）。その他の興味深い血漿 miRNA
群を赤色で示した。
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
適切な血清や血漿の採取および調製
血清や血漿調製の第１段階は全血採取ですが，この過程での主な課題は in vitro において細胞の RNA が不安定なことです。さまざまな報告から，全血で
の個々の RNA 種（例えば mRNA など）におけるコピー数は，室温での保存や移送等によって 1000 倍以上異なる場合があるといわれています 1)。これ
は急速な RNA 分解や血液採取後に，ある特定遺伝子群の発現が上昇することによります。このような変動が生ずることから，全血を用いて信頼度の高い
miRNA 発現プロファイリングを行うことはほぼ不可能と考えられています。血清や血漿に含まれる RNA 種は，特定遺伝子群の発現上昇による影響を受け
にくいものの，RNase による分解といった影響を受けます。したがって，全血採取時，および採取後の保存方法が精度の高い解析結果を得る上で重要となり
ます。一般に，全血採取直後に血清または血漿の調製を行うことが推奨されます。全血処理時の各ステップで細胞溶解防止の処置をする必要があります。これ
を怠ると，血清や血漿分画が無処理細胞の RNA によって汚染される可能性があり，無処理細胞からの RNA が miRNA 発現の微細な変化の検出を遮蔽した
り妨害したりする可能性があります。サンプル調製時は，確立されたプロトコールに準じてサンプル採取等を行うことで，手技による最終結果への影響を低く
抑えることができます。さらに，サンプルは同様の条件下で採取し，可能であれば同時刻に採取します。血漿調製時に使用される抗凝固薬のうち，EDTA やク
エン酸はその後の実験に影響を与えませんが，ヘパリンはその後の cDNA 合成や PCR における酵素反応を阻害することがわかっています（図 2 と 3）
。
現在のところ，血清 / 血漿サンプルや RNA サンプルからヘパリンを除去する方法は確立されていないため，全血処理時にヘパリンを使用しないことをお
奨めします。調製後の血清や血漿は，RNase-free チューブ（Cryo tube など）に入れ，- 80℃ で保存することができますし，引き続き RNA 抽出を行っ
てもよいでしょう。血清や血漿中の RNA は - 80℃ より高い温度でも比較的安定なことが知られていますが，miRNA の安定性はわかっていません。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
20
25
EXD
si/shRNA
ライブラリー
miRNA
プロファイリング
30
miRNA
機能解析
35
40
図 2 miRNA PCR 解析における血液調製方法の適性度
45
Plasma
EDTA
Plasma Plasma Serum
Citrate Heparin
Plasma Plasma Plasma Serum
EDTA Citrate Heparin
EDTA- 血漿，クエン酸 - 血漿，ヘパリン - 血漿，および血清より抽出した Total
RNA を用いて，miR-103 と miR-21 に対する逆転写反応を 3 回繰返しで行い，
qPCR をした。各サンプルにおける平均 Cq 値を図示した。ヘパリン - 血漿サンプ
ルを除き，何れのサンプルにおいても良好な miRNA 増幅が行うことができた。
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
1. Rainen et al. (2002), Clin Chem., 48, 1883
127
技術情報
B) Stability of miRNAs in plasma subjected to multiple freeze thaw cycles prior to extraction
A) Stability of miRNAs in plasma stored at room temperature before extraction
miRNA
35
30
30
20
10
1h
5h
24h
48h
定量
検出
10 min 30 min
1h
5h
1h
5h
24h
48h
24h
48h
35
30
25
20
15
10
5
0
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
1x 2x 3x 4x 5x 6x
1x 2x 3x 4x 5x 6x
1x 2x 3x 4x 5x 6x
1x 2x 3x 4x 5x 6x
miR-16
miR-93
miR-103
miR-192
1x 2x 3x 4x 5x 6x
miR-451
図 3 EDTA- 血漿サンプルは miRNA の安定性が高い
A) EDTA- 血漿より抽出した Total RNA を用いて 3 回繰返しで逆転写反応を行い，4 種の miRNA に
対して qPCR を行った。血漿は RNA 抽出ステップの前に図中に示した時間だけ室温放置した。血漿中の
miRNA 崩壊は 48 時間にわたり室温放置した場合でもみられなかった。
10 min 30 min
1h
5h
24h
48h
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
15
0
miR-451
Cq
Cq
プロファイリング
20
5
10 min 30 min
miR-103
35
30
25
20
15
10
5
0
25
10
0
10 min 30 min
抽出 / 精製
40
Cq values
LNA
35
30
25
20
15
10
5
0
Cq
Cq
miRBase
40
miR-93
miR-16
B) EDTA- 血漿より抽出した Total RNA を用いて 3 回繰返しで逆転写反応を行い，5 種の miRNA に対
して qPCR を行った。血漿サンプルには事前に 1 ∼ 6 回の凍結融解処理を行ったが，miRNA 増幅への影
響はみられなかった。血漿中の miRNA は，数回の凍結融解に対して比較的安定であることが示唆された。
最適な Total RNA 抽出方法
RNA を取り扱う際には，試薬に RNase が混入し，サンプル RNA が分解しないよう特別な注意が必要です。PCR 実験を良好に進める上での操作ガイ
ドラインを以下に記しました。
前述の通り，血清や血漿中には RNA があまり含まれていないため，RNA 抽出時にその多くを損失する可能性があります。そこで，RNA 抽出時にキャリ
ア RNA を添加することをお奨めします。その場合，RNA 濃度自体ではなく初期容量から換算した容量でその後の実験を行います。キャリア RNA を使う
ことで高収量かつ一貫した RNA 回収が期待できます。キャリアには miRNA を含まないものを選ぶ必要があります。EXIQON 社ではバクテリオファージ
MS2（Roche Applied Science 社，cat# 10165948001) を使用しています。
また，EXIQON 社ではヒトやマウスの血清 / 血漿 RNA 抽出プロトコールを確立しており，以下に簡単にご紹介します。
詳細は以下の WEB ページをご参照ください。
http:// www .exiqon .com/serum-plasma-RNA-isolation
RNA の取扱いおよび保存に関するガイドライン
ー サンプルや試薬への RNase 混入や RNA 分解を防ぐための注意 ー
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
ヒトまたはマウス血清 / 血漿からの RNA 抽出の概説
●
ヒト血清は 200 μ L，マウス血清は 50 μ L を使用上限とする
●
使い捨て手袋の着用し，ヌクレアーゼを排除した環境下で操作する
●
MS2 キャリア RNA を使用するなど，上述の RNA 抽出注意点に準拠
●
ヌクレアーゼフリーで核酸結合性の低いプラスチック容器を使用し，フィルターのつい
たピペットチップを使用する
●
miRNA の網羅解析にはプレートあたり，最低 35 μ L の血清 / 血漿を使用
●
できるだけチューブ（容器）のふたを閉めておき，容器を開ける前には少し遠心する
●
RNA を長期保存する場合は − 80℃ で保存し，凍結融解を繰り返さない
カラムメンブレンに結合した RNA 溶出の際は，50 μ L 程度の比較的大量の溶出液を
使用（再現性向上のため）
●
●
RNA の取扱いおよび保存に関するガイドラインに準拠
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
Total RNA および RNA spike-in
RNA 抽出効率の確認には，RNA spike-in（合成 RNA コントロール）を加える方法があり，EXIQON 社 Universal cDNA synthesis kit に付属して
います。添加した RNA spike-in は，RT-PCR で逆転写されて cDNA となり，EXIQON 社の SYBR® Green master mix や microRNA
Ready-to-Use PCR Panel に付属のプライマーで検出することができます。再懸濁した 1 μ L の RNA spike-in（106 コピー / μ L）を 200μ L のヒト
血清に添加して使用します。操作の流れとして，サンプルに QIAzol および MS2 キャリア RNA を添加した直後に spike-in を添加します（RNA 抽出
プロトコールのステップ 6 参照）
。
あるいは，RNA spike-in を cDNA 合成ステップの確認に使用することもできます。cDNA 合成や PCR 酵素反応を阻害する可能性のある物質が
RNA サンプルに残留しているかどうかの確認にもなります。cDNA 合成ステップの効率を確認するには，cDNA 合成反応カクテルに RNA spike-in を
加えます。詳細は下記の WEB ページの "miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Instruction manual" をご参照ください。
http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Universal-RTmicroRNA-PCR-manual.pdf
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
サンプル RNA の品質管理
一般的な RNA 収量の測定方法は，血清や血漿サンプルには適しません。抽出時に添加する RNA キャリアのシグナルが他の RNA 群よりはるかに高く
なり，OD260 やバイオアナライザーによる測定は意味を成さないのです。抽出時にキャリアを添加しない場合でも，カラムから溶出した RNA 濃度が低す
ぎるため，NanoDrop をはじめとする吸光度計を用いた OD260 測定では信頼できる数値が得られません。そのため，qPCR などに使用するサンプル量
を決定する代替法が必要です。EXIQON 社では，抽出した RNA の初期濃度を利用して qRT-PCR を行うことをお奨めしています（後述の「cDNA 合成」
の項をご参照ください）
。
無細胞の血清や血漿から抽出した total RNA の品質を評価する場合，主に下記の 3 点を考慮します。
1. 典型的な血清や血漿 miRNA が存在すること
miRNA
プロファイリング
2. 細胞の RNA が存在しないこと。これらの混入により血清や血漿の
miRNA
機能解析
3. cDNA 合成や PCR 酵素への阻害効果を示す物質が混入していないこと
プール型 shRNA
ライブラリー
パラメーター１：典型的な血清や血漿 miRNA の存在確認
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
miRNA プロファイリング結果に影響を与える可能性があるため。
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR system を利用して，血漿や血清 miRNA としてよく知られている miRNA の存在を確認すること
ができます。これらの miRNA が検出されれば，RNA 抽出が良好であったことの１つの指標となります。
血漿や血清から一定レベルで検出されることで知られる miRNA をいくつかご紹介します。
●
hsa-miR-103 ● hsa-miR-191 ● miR-423-3p ● hsa-miR-451
hsa-miR-451 の発現レベルはサンプル調製方法により大きく異なることが示されています。しかし，複数サンプルに対して同一の RNA 抽出プロト
コールを用いた場合であれば，RNA 抽出の品質評価にこの miRNA を使用することは問題ないと考えられます。これらの miRNA は，実験データのノー
マライゼーションにも使用できることが多いのですが，使用するサンプルにおいてどの程度安定発現しているか確認が必要です。
128
技術情報
4 種類の miRNA 解析データからサンプルの異常値を決定することはできますが，サンプル使用量のノーマライゼーションや他のサンプルの cDNA 合
成に用いる RNA 使用量調整への使用はお奨めできません。上述の通り，cDNA 合成に用いる RNA 量は ，RNA 抽出時に使用した血清 / 血漿量に準じ
て調整し，均一化する必要があります。さらに，各サンプルを同等に取り扱うために各種の測定を行うことも重要です。これは細胞を始めとした他の試料を用
いる場合でも同様で（例えば，FFPE からの LCM サンプルや FACS でソートした微量の細胞など），この場合，RNA 抽出時に一定量の細胞を用いること
で調整します。
miRNA
miRBase
LNA
パラメーター 2：血清 / 血漿 miRNA プロファイリング結果に影響を与える可能性のある細胞性 RNA が混入していないことを確認
抽出 / 精製
白血球，赤血球または他の細胞種のみに存在する RNA 種が検出された場合は，RNA 抽出の前段階で細胞溶解が生じていることが示唆されます。細胞性の
RNA 種が混入している場合，血清 / 血漿 miRNA のプロファイリングに影響を及ぼすことが考えられ，信頼性が低く再現困難な結果となり得ます。
EXIQON 社では白血球および赤血球に高発現している miRNA（例：hsa-miR-16 および hsa-miR-4512）の発現量を一般に発現している miRNA の全
体平均と比べることを推奨しております。この比較で細胞量が異なる外れ値のサンプルを除外することが可能になります。
プロファイリング
定量
検出
パラメーター 3：qPCR 阻害物質が混入していないことを確認
インヒビター
血漿や血清を使用する場合の課題のひとつに，RT や PCR 阻害物質の混入が挙げられます。阻害物質が含まれると，精度の高い解析を行うためにより多
くのサンプルを使用する必要があり，実質的には使用不可能です。使用する RNA 抽出方法によって RNA 抽出後に残余する阻害物質の量は大きく異なり
ますし，サンプル間でも大きな差があります。したがって，さまざまな Total RNA 量を用いて複数の cDNA 合成反応を別々に行い（例えば，40μL の逆
転写反応にそれぞれ 0.5μL, 1.0μL, 2.0μL, 4.0μL, 10 μ L 使用する）
，使用する血清 / 血漿サンプル中の miRNA レベルや阻害物質混入の有無を確
認することをお奨めします。
パラメーター 1 で述べた種々のアッセイも阻害物質混入の確認にご利用頂けます。サンプル調製時期やサンプル調製操作での種々の試みに関係なく，阻
害物質の混入はサンプルごとに大きく異なりますので，この確認実験には複数サンプル（ >5 ）を使用します。
2 McDonald et al. (2011), Clin Chem. J 57, 833
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
RNA 抽出やテンプレート調製
ヒト / マウスの血清 / 血漿からの RNA 抽出プロトコールは下記の WEB ページをご参照ください。
http:// www .exiqon .com/serum- plasma-RNA-isolation
また，一般的な注意点や手順に沿って作業することが大切です。miRNA 発現プロファイリングを意味のあるものとするためには，まず，生物サンプルから small RNA（<200nt）を含む
Total RNA を抽出し，調製することが課題となります。そのため，どのプロトコールに準ずるか，が重要なポイントとなります。実験を始める前に，下記の点を熟考することが大切です。
●
市販の精製済み RNA を使用する場合，small RNA を含んでいることが保証されており，生物 / 組織における miRNA の存在量などのバランスが抽出操作などによって崩れていないこと。
●
異なる RNA 抽出方法を使用したサンプル RNA 同士の比較はお奨めしません。
●
増幅サンプルの混入などを避けるため，qPCR の前段階となる RNA 抽出および cDNA 合成は，qPCR とは異なる実験室で操作します。
cDNA 合成
Real-Time PCR
miRCURY™ LNA Universal RT microRNA PCR では，cDNA 合成後
の溶液を希釈して PCR 反応に使用します。血清や血漿サンプルでは逆転
写反応容量が多いため，一般的なサンプルに比べて希釈率は小さくなります。
●
●
容量［μ L］
4
9
RNA spike-in
Enzyme mix
1
2
カスタム合成
サービス
総量 (base mix)
最終濃度
1×
1×
16
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
＊ 複数サンプルに対して cDNA 合成反応を行う場合，調製時のピペッティングによる損失を考慮し
て 10% 多めに base mix を調製すること。
ノックダウン検証
最終 cDNA 合成ミックス
試 薬
si/shRNA
ライブラリー
容量［μ L］
base mix
血清または血漿から抽出した RNA
総量
16
4
20
関連試薬
40
トランスフェク
ション試薬
35
その他
R 2= 0.96
30
25
技術情報
384-well プレート用には，20μ L の cDNA 反応溶液に 980 μ L
のヌクレアーゼフリー水を加えて 50 倍希釈します。
20
個々のアッセイでは，2.2 μ L の cDNA 反応溶液に 85.8 μ L の水
を加えて総量 88μL（40 倍希釈）とします。20μ L 容量の PCR
反応を 10 回程度行うことができます。
15
15
上記の条件で，血清 Total RNA を用いて再現性の高い RT 反応が行え
ることを示す結果を図 4 に示しました。手技や PCR 条件などに関する詳
細は製品マニュアルをご参照ください。
配列解析
サービス
コントロール
siRNA
8 μ L の 5 × reaction buffer を混合
ヌクレアーゼフリー水
Raw Cq values RT2
上述した Total RNA の品質管理を行うことで RNA サンプルに阻害物
質が混入しているか予測できます。各サンプルに含まれる阻害物質量が比較
実験に与える影響を軽減するため，cDNA 合成反応を大きめのスケールで
行うことをお奨めします（www.exiqon.com/mirna-pcr に掲載している
miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR の マ ニ ュ ア ル を ご 参
照ください）。EXIQON 社の経験では，40 μL の RT 反応に 8μ L のヒ
ト血清 / 血漿 RNA または 1μL のマウス RNA 溶液を使用すること
で，各サンプルの 100 種以上の miRNA において十分なシグナルを得る
ことができます（Cq 値 35 未満）。この値は，EXIQON 社のプロトコール
に準じて抽出した RNA に対するものです。40 μL の逆転写反応カクテ
ルで，384-well プレート 1 回分の cDNA が得られます。
下記のプロトコールは，ヒト血清 total RNA を用いた cDNA 合成反
応で，384-well プレートに相当分が得られます。
プロトコールの詳細は miRCURY™ LNA Universal RT microRNA PCR
をご参照ください。200 μ L の血清を使用して RNA 抽出を行い，50 μ L
の溶出液を使用して，カラムから RNA を溶出した場合を前提として，血
清 / 血漿の初期容量 32μ L と同等量をプレートごとに使用しています。
試 薬
siRNA
miRNA
プロファイリング
20
25
30
Raw Cq values RT1
35
40
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
図 4 血清 total RNA を用いた RT 反応で得られた高い再現性
65μ L の血清より抽出した total RNA を用いて 2 回繰り返しで RT 反応を行った（RT1, RT2）とこ
ろ，低い Cq 値が得られた。全 730 種類の miRNA に関して発現プロファイルを確認し，Cq 値が 35
未満のものについてのみ図示した（133 データポイント）
ROX
ABI 社機器
miRCURY™ LNA Universal RT microRNA PCR, SYBR® Green
master mix には ROX passive reference dye は含まれません。
ご利用の機器によっては必要な場合があります。
マニュアルのベースラインおよび閾値設定をご利用ください。
SDS テンプレートファイルと前定義されたプレートレイアウトは
www.exiqon.com/sds よりダウンロードして頂けます。
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
129
技術情報
1. 安定発現しているリファレンス遺伝子の同定および利用
プロファイリング
2. 使用サンプルにおいて発現している全 microRNA の発現値の平均
（mean）をノーマライゼーションファクターとして使用 3)。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
EXIQON 社の GenEx software では上記 2 つの手法何れもご利用頂け
ますが，ご自身のデータではどちらの手法が適当か確認する必要があります。
通常，血清や血漿サンプルには，ノーマライゼーション目的で汎用され
る比較的長鎖の RNA 種（例えば 5S, U6, snoRNAs など）が含まれ
ていません。また，他のサンプルに比べて血清 / 血漿サンプルでは検出で
きる miRNA 数が少ないことも特徴です。ノーマライゼーションに発現量
の平均値を使用する場合，多数の miRNA が発現し，検出可能であること
が必要条件といえます。そのため，一般的なガイドラインとして，もし発現
している miRNA 数が 80 - 100 種より少ない場合，安定的に発現して
いるリファレンス遺伝子を同定し，ノーマライゼーションに使用すること
を考慮します。安定発現しているリファレンス遺伝子をノーマライゼー
ションに使用する際は，miRNA 発現の本解析を行う前に，いくつかのリ
ファレンス遺伝子候補を用いた確認実験を行うことをお奨めします。リ
ファレンス遺伝子候補には，対象とする種々のサンプル全てにおいて定常
発現するものを選びます。血清や血漿をサンプルとする場合，既報やお手
持ちの実験データ（qPCR パネルスクリーニング実験など）から定常発
現する miRNA 候補を選択します。
8
6
Reference
genes
4
2
• Serum samp le 1
• Serum samp le 2
0
-1
hs
am
iR
-1
hs
03
am
iR
10
hs
b
am
iR
-2
6
hs
a
am
iR
9
hs
3
am
iR
hs
21
am
iR
-1
hs
6
am
iR
-2
0a
抽出 / 精製
Normalized expression ( ΔCq)
LNA
10
ノーマライゼーションの目的は，検討中の生物学的な変化によるもので
はなく，手技などによる変動をデータから除去することです。
qPCR 実験結果を正しく解析し解釈するためには，適切なノーマライゼー
ションを行うことが必須です（図 5）
。汎用されているノーマライゼーショ
ン手法をご紹介します。
t-7
a
miRBase
ノーマライゼーション
hs
ale
miRNA
図 5 血清サンプル間の microRNA 発現レベル差
2 種類の血清サンプルにおけるノーマライズ後の 8 種の miRNA 発現レベルを示した。Total RNA は
それぞれ 8μ L 相当の血清より抽出し，RT 反応に使用した。ノーマライゼーションのリファレンス遺伝子
として hsa-let-7a と hsa-miR-103 を使用した。
GenEx Software
迅速かつ簡便なデータ解析用ソフト
http://www.cosmobio.co.jp/product/bunshiseibutsu/mirna/
mirna_4/exq_20101005.asp?entry_id=6507
3. Mestdagh et al(2009), Genome Biol, 10, R64.
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
miRNA プロファイリング
幹細胞の microRNA
si/shRNA 発現
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
130
幹細胞は，自己再生やさまざまな細胞型への分化の可能性があることか
ら，近年幹細胞研究が注目を集めており，その研究内容は疾患の解明，バイ
オマーカー探索，薬物スクリーニングなど多岐に渡ります。
約 10 年前，幹細胞の発生が miRNA により調節されることがわかっ
て以来，miRNA が幹細胞の分化や恒常性に重要な役割を担うことが明ら
かとなってきました。miRNA による調節機構を明らかにすることは，発
生機序の理解につながるとともに幹細胞を利用した治療の可能性も期待で
きます。
胚性幹細胞と成体幹細胞における miRNA 発現様式は非常に異なりま
す。そのため，EXIQON 社では 幹細胞発生や恒常性において異なった調節
を受けたり，その機能が関与したりすると考えられる miRNA の研究や，
特定幹細胞または幹細胞分化過程におけるバイオマーカーや分子署名
（molecular signature）の同定といった胚性幹細胞研究に関連すると考
えられる全 miRNA を網羅した，多能性幹細胞に焦点をあてた幹細胞関連
miRNA 定量 PCR パネル（Stem Cell Focus microRNA PCR Panel）
を デ ザ イ ン し て い ま す（p.27 参 照）。こ の PCR パ ネ ル は，ヒ ト 胎 児
（hESC）および人工多能性幹細胞（iPSC）由来の幹細胞において発現す
る miRNA 群を対象としています。iPSC は ESC と類似した表現型を
示すものの，体細胞で導入遺伝子を強制発現して構築されます。近年開発
され，その発生には体細胞の再プログラムが関与することから非常に注目
されています。
iPSC と hESC は in vitro で培養し維持することができ，適切な刺激
を与えることで特定の細胞へと分化します。成体幹細胞には中胚葉，内胚
葉，外胚葉といった 3 種類の主要経路があります。中胚葉は骨格筋，骨，
血液細胞へと発達するのに対し，内胚葉はこれと異なる器官へと発達し，
外胚葉は皮膚，歯，神経システムへと発達します（図. 1）。EXIQON 社
Stem Cell Focus microRNA Panel を使用して，hESC と完全に分化
した繊維芽細胞における miRNA 発現比較を行なった結果を図 . 2 に示
しました。
図 1 幹細胞分化
20
H9 Stem Cells [Cp-values]
ノックダウン検証
25
hESC subpanel
Let-7 family
30
miR-302-367 family
35
40
40
35
30
25
20
Fibroblasts [Cp-values]
図 2 hESC と完全に分化した細胞（繊維芽細胞）における miRNA 発現比較
Pluripotent Stem Cell Focus microRNA PCR Panel を用いて H9 胚性幹細胞と繊維芽細胞における
microRNA 発現様式比較を行った。予測通り，miR-302-367 ファミリーは胚性幹細胞において高発現が
みられた（低い Cp 値）
。一方，let-7 ファミリーでは，胚性幹細胞では低発現であるのに対して成体繊維芽
細胞では発現亢進が確認できた。
技術情報
miRNA（microRNA）ノックダウン実験による機能解析
＜ miRCURY LNATM microRNA Inhibitor の利用＞
miRNA 機能解析
およそ 20 年前に microRNA（miRNA）が発見されて以来，その研究は大きく発展してきました。近年では，発生や細胞分化といった種々の重要な生物
学的プロセスや，がんや心臓病といったいくつもの主要な疾患との miRNA の関連性が知られています。さらに，miRNA は単細胞藻類，植物，脊椎動物お
よび関連ウイルスを始めとするさまざまな生物に存在することがわかっています。
一方で，miRBase（v18 現在）では 18,000 種もの miRNA がアノテートされているものの，生物学的機能がわかっているものはごくわずかで，
miRNA の機能解析を行い，標的 miRNA を同定するのに多大な労力を要するであろうことは明白です。
miRNA の機能解析に際し，最も有力かつ直接的な方法のひとつがノックダウン実験です。ここではアンチセンスオリゴを導入した細胞における表現型変
化を観察し，標的となった miRNA の生物学的機能を解明する手法を紹介します。機能が未知な miRNA の場合，ノックダウン実験を行うことでバイオイ
ンフォマティクスにより予測された標的 mRNA の検証も可能です。
miRNA ノックダウンは非常に有用な手法である一方，信頼性の高い実験データを得るにはいくつもの手技上の課題を克服する必要があります。まず，
ノックダウン実験が生理的条件下で有効なことが重要となります。次に，至適条件下でオリゴを細胞に導入する必要があると同時に，効果的なノックダウン
効果の確認手法を用いることが大切です。ここでは，これらの課題，および EXIQON 社 miRCURY LNA™ microRNA Inhibitor Probe (p.46 ∼ p51) を
用いた miRNA ノックダウン実験デザインのガイドラインについて議論します。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
実験デザイン
Fold Up-Regulation FL[RLU] / RL[RLU]
miRNA ノックダウン実験計画をたてる初期段階で，使用細胞において対象 miRNA が発現していることを確認することが重要です。もし内在性
miRNA が発現していない場合，対象 miRNA ノックダウンによる効果が見られない可能性が高くなってしまいます。また，少数の miRNA のみをノック
ダウンするか，ハイスループットスクリーニングを行うかを決定する必要があります。EXIQON 社では，ハイスループットスクリーニング用に 900 以上
もの miRNA ノックダウンオリゴをコレクションした，miRCURY LNA™ microRNA Inhibitor Library (p.51) をご提供しています。その他，アンチセン
スインヒビターの導入方法やノックダウン効果の評価方法なども検討する必要があり，これらに関しては後述します。
何れのノックダウン実験においても重要なことは，適切なコントロールを使用することです。ネガティブコントロール（スクランブル）LNA™ ノックダ
ウンオリゴ導入時には，対象 miRNA インヒビターオリゴ導入時と同じような表現型が見られないことを確認することが重要となります。miRNA ノック
ダウンの特異性評価にはカスタムデザインのミスマッチコントロール LNA™ ノックダウンオリゴを使う方法もあります（図 1）
。
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
18
16
カスタム合成
サービス
14
12
コントロール
siRNA
10
5 nM
20 nM
100 nM
8
6
4
M
M
4M
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
RY
TM
TM
2M
1M
CU
FL: firefly luciferase signal
RL: Renilla luciferase signal
RLU: relative light units
m
iR
CU
iR
m
iR
CU
RY
RY
iR
TM
CU
RY
M
TM
0
m
図 1 miRCURY LNA™ microRNA Knockdown Probes によるミスマッチ識別
hsa-mir-21 を標的とするパーフェクトマッチおよびミスマッチ（MM）アンチセンスインヒビターを
HeLa 細胞に導入したところ，オリゴを導入しないコントロールに比べて pMIR-21 ルシフェラーゼレ
ポーターの上方制御がみられた。ルシフェラーゼ発現レベルは，パーフェクトマッチノックダウンオリゴと
１塩基または２塩基ミスマッチ（それぞれ 1MM, 2MM）のものでは大きく異なり，miRCURY LNA™
microRNA Knockdown Probes が非常に特異的かつ１塩基差をも識別できることが示唆された。ルシ
フェラーゼ発現レベルは導入 24 時間後に Dual-Glo を用いて測定した。
2
m
デザイン済み
siRNA
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
高いノックダウン効果を示すオリゴデザイン
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
50
40
miRNA
プロファイリング
30
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
1 nM
5 nM
20 nM
20
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
10
図 2
TM
e
LN
A
UR
Y
m
iR
C
2’
-0
-M
tB
Pr
od
uc
ct
A
0
Pr
od
u
Fold Up-Regulation of microRNA reporter gene expression
miRNA ノックダウンオリゴをデザインする場合，いくつかの課題を克服する必要があります。まず，mature microRNA はわずか 20 塩基程度と短鎖
であるため，2'-O-Me などの従来型アンチセンスインヒビターでは，例え全長を使用したとしても標的 miRNA に対する親和性が十分ではありません。特
に標的配列が AT リッチな場合，標的との 2 本鎖における融解温度が比較的低く，問題となります。miRNA の多くは，その末端配列が自己相補性をもつ
ことから，全長を使用したノックダウンオリゴはセルフアニーリングをおこす可能性があり，注意が必要です。
ノックダウンオリゴに Locked Nucleic Acid (LNA™) を組込むことで，標的 miRNA へのインヒビターの親和性が増大するとともに，酵素による崩壊
への耐性が改善します。そのため，より短鎖のノックダウンプローブをデザインすることができ，全長配列を使用することによる問題を避けることが可能と
なります。
EXIQON 社では，オリゴ鎖長や オリゴへの LNA™ 組込みパターンを調整し，最も効果的なインヒビターを算出するための洗練された新規ノックダウン
アルゴリズムを開発しました。これを用いて Tm 値をノーマライズし，自己相補性の問題を最小限に止めた，均一かつ非常に効率の高い次世代型アンチセン
スインヒビターをデザインしています（図 2）。EXIQON 社のノックダウンオリゴは全て低濃度であっても高いノックダウン効果を得られるため，期待しな
い二次的効果を低減することが可能です。
microRNA knockdown oligouncleotide
miRCURY LNA™ microRNA Knockdown oligonucleotides は競合する何れの手法よりも microRNA
阻害効果が高い。MCF7 細胞に hsa-mir-21 に対するアンチセンスインヒビターを導入したところ，
オリゴを導入しなかったものに比べて miR-21 ルシフェラーゼレポーター発現レベルの上昇がみられ
た。こ の 効 果 は DNA（Product A, Product B）や 2'-O-Me オ リ ゴ を 導 入 し た 細 胞 に 比 べ，LNA™
oligonucleotide を導入した細胞において最も顕著であった。測定はトランスフェクションの 60 時間後
に行った。
131
技術情報
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
miRCURY LNA™ microRNA Knockdown oligonucleotide（Inhibitor,Power Inhibitor, in vivo 用 Inhibitor）の導入
miRCURY LNA™ microRNA Knockdown oligonucleotide (p.46 ∼ p51) は，siRNA を始めとする small RNA 導入に適した種々の手法を用いて
さまざまな細胞に効率よく導入できます。例えば，脂質やアミンを含有したトランスフェクション試薬による化学的トランスフェクションやエレクトロポ
レーションが可能です。
どのトランスフェクション手法を用いるかは，細胞株によって異なるため個々に実験的な検討が必要となります。表 1 に，miRCURY LNA™ microRNA
Knockdown Probe 導入に問題のなかったトランスフェクション試薬と細胞株の一例を示しました。トランスフェクションを最適化する際は，各細胞株に
おいて高い効率を示すトランスフェクション試薬をみつけ，下記条件を調整します。
使用するトランスフェクション試薬量
使用するノックダウンプローブ量
● トランスフェクション時の細胞密度
● トランスフェクションの順序：トランスフェクション前に細胞播種，
またはトランスフェクション時に細胞播種）
● トランスフェクション試薬 / オリゴ複合体への細胞の曝露時間
●
●
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
多くのプロトコールでは，培養する動物細胞の生存率を上げるために新鮮な培地に交換して，24 時間インキュベートすることを推奨しています。通常，
miRCURY LNA™ microRNA Knockdown Probe は最終濃度 1 ∼ 25nM において最大活性を示しますが，最適化を行う際は 1 ∼ 100nM の範囲で濃
度をふって検討してください。
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
Cell type
Transfection reagent
Reference
A172
Lipofectamine 2000
2.3
CTC12
Lipofectamine 2000
4
H19
Lipofectamine
5
HCT116
Lipofectamine 2000
6
HEK293
Lipofectamine 2000
3.7
HeLa
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
HeLa53
Jurkat cells
X-tremeGENE
8
Lipofectamine 2000
1
Nucleofector II Device
9
LN229
Lipofectamine 2000
2
LN308
Lipofectamine 2000
2
MCF-7
Lipofectamine 2000
7
MDA-MB-4355
Lipofectamine 2000
10
コントロール
siRNA
MEL
X-tremeGENE
11
Myoblast C2C12
Lipofectamine
1.5
デザイン済み
siRNA
NB4
Lipofectamine 2000
12
NPC C17.2
Lipofectamine 2000
3
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
PC3
Lipofectamine 2000
13
U87
Lipofectamine 2000
2.3
表 1 miRCURY LNA™ microRNA Knockdown Probes の導入に使用した
細胞株とトランスフェクション試薬の一例
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
トランスフェクション効率の測定
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
132
細胞にトランスフェクションした後は，その効率を確認することが大切です。トランスフェクション効率確認方法を決定するにあたり，EXIQON 社ノック
ダウンオリゴの作用機序を理解する必要があります。EXIQON 社のノックダウンオリゴは標的 miRNA の酵素崩壊を誘導せず，標的 miRNA を固く，安定
した複合体として捕捉することでその機能を阻害します 14)。通常，以下に示す手法の何れかを用いてトランスフェクション効率を確認します。
1. リアルタイム PCR とノーザンブロット法
一般に，ノックダウンオリゴのトランスフェクション効率測定には定量的リアルタイム PCR とノーザンブロットが用いられます。しかし，アンチセ
ンスインヒビターと複合体を形成した miRNA は，リアルタイム PCR では検出できません。特に，逆転写反応において miRNA テンプレートを標
的するアンチセンス化合物との感受性が高いためです。同様に，miRCURY LNA™ Inhibitor (Power Inhibitor, in vivo Inhibitor) と miRNA の強
力な複合体は，高度の変性ゲルでも解離しません 15)。ノーザンブロットであれば，結合していない mature microRNA に比べて高分子量位置に遊走
するバンドとして，これら複合体を確認することができます。しかしながら，この手法をトランスフェクション効率確認に利用することは推奨できませ
ん。トランスフェクション効率が悪い場合，ノックダウンオリゴが細胞膜の外側に保持されたり内部小胞に捕捉されたりして，細胞質内で物理的に標的
miRNA と隔離されている場合が多々あるためです。細胞融解の際にはこれらのオリゴが放出され，可溶化液中で miRNA と作用することがありま
す。つまり，リアルタイム PCR やノーザンブロットでは，オリゴが導入細胞の細胞質内で複合体を形成した生物学的に意味のあるものなのか，細胞融
解時に複合体を形成したものなのかを識別できないのです。
2. ウェスタンブロット法
miRNA およびその標的 mRNA の機能解析がよく行われているものに関しては，標的 mRNA がコードするタンパク質発現レベルをウェスタンブ
ロットにより測定し，トランスフェクション効率を確認することを推奨します。
3. miRNA レポーターアッセイ
もし適切な抗体がない場合には，miRNA レポーターアッセイを推奨します。例えば，Renilla luciferase 遺伝子をコードするレポータープラスミド
を利用し，対象 miRNA に相補する標的配列をレポーター遺伝子の 3' UTR 領域に配置します。もし対象 miRNA が細胞内に存在する場合，このル
シフェラーゼタンパク質の発現レベルが低下するはずです。アンチセンス配列をもつインヒビターにより miRNA が阻害された場合，レポーター活性
の抑制が解除され，ルシフェラーゼ発現レベルが上がります。この方法では各 miRNA に対してレポーターシステムを構築する必要がありますが，
miRNA 相補鎖組込み済のコンストラクトも販売されていますので，コスモ・バイオ WEB サイトをご参照ください。また，レポーターの発現レベルは
内在性 miRNA の発現レベルに左右されることが知られています。
トランスフェクション効率の確認には，miRNA レポーターベクターの他に，firefly luciferase や β - ガラクトシダーゼなど異なるレポーター遺伝子
を定常発現するコントロールベクターを使用してノーマライゼーションを行うこともあります。
技術情報
4. 蛍光標識付きノックダウンオリゴ
トランスフェクション効率を測定する簡便な方法として，蛍光標識付き miRCURY LNA™ microRNA Knockdown oligonucleotide（Inhibitor,
Power Inhibitor, p.46 ∼ p51）の使用があります。このオリゴを細胞にトランスフェクトし，フローサイトメトリーにより細胞を選別します。細胞内
の LNA™ Knockdown oligonucleotide を直接可視化できる点では便利な手法であるものの，シグナルが細胞質内で散在分布していることを確認す
る必要があります。もし細胞質内で顆粒分布したり，シグナルが細胞表面に凝集したりしている場合，前者ではオリゴが小胞捕捉されており，後者では
細胞膜に捕捉されていることが考えられます。そのため，この手法は共焦点顕微鏡観察に長けた研究者に推奨されます。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
microRNA ノックダウン効果の観測
プロファイリング
miRNA ノックダウン効果の観測方法はいくつか考えらます。どの手法を用いるかは，対象 miRNA，その標的遺伝子，および影響を受けた細胞が示す表
現型がどの程度研究され，理解されているかによります。
miRNA ノックダウンによる細胞集団の変化をモニターする場合，細胞増殖，細胞分化，およびアポトーシス（caspase）アッセイといった表現型アッセ
イを推奨します。どのアッセイを行うかは研究対象の生物学的プロセスにより異なります。レポーターベクターは，トランスフェクション効率確認目的だけ
でなく，miRNA と予測されるその標的部位との相互作用の実証にも使用することができます。予測された miRNA 結合部位，または全 3' UTR 配列をル
シフェラーゼレポーター遺伝子の下流にクローニングして使用します。
miRNA は，一般に翻訳抑制を行いますが，mRNA 分解を誘引するものもあり，miRNA ノックダウンによる既知または予測された標的遺伝子への影響
は，mRNA またはタンパク質レベルの変化で測定することができます。多くの miRNA はその標的遺伝子が同定されていないため，数々の miRNA 標的
予測アルゴリズムが開発されており（表 2）
，これらのツールは新規の miRNA 標的検証に役立っています。
miRNA ノックダウンが与える網羅的な miRNA レベルの変化は，マイクロアレイ解析にて観測できます。この手法ではノックダウンによる一時的効果
であるか，二次的効果であるかの識別が困難であるものの，この問題は mRNA レベルを経時的に観測することで軽減することができます。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
Method
Type of Method
Reference
Method
Availability
Data
Availability
Stark et al.
Complementary
miRanda
[Stark et at .,
2003]
Online search
Yes
http://www.russell.embl.de/
microRNAs
Complementary
[John et at .,
2004]
Download
Yes
http://www.microrna.org
Lipofectamine Complementary
[Enright et at .,
2003]
Online search
Yes
http://microrna.sanger.ac.uk
Target Scan
Seed Complementary
[Lewis et at .,
2005]
Online search
Yes
http://www.targetscan.org
コントロール
siRNA
DIANA microT
Thermodynamics
[Kirakidou et at ., 2004]
Download
Yes
http://diana.cslab.ece.ntua.gr/
デザイン済み
siRNA
PicTar
Thermodynamics
[Krek et at .,
2005]
N/A
Yes
http://pictar.mdc-berlin.de/
RNAHybrid
Thermodynamics &
Statistical model
[Rehmsmeier
et at ., 2004]
Download
Yes
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.
de/rnahybrid
shRNA クローン
コレクション
miRGen++
Bayesian Inference
[Huang et at .,
2004]
Mathlab Code
Yes
http://www.psi.toronto.edu/genmir
si/shRNA 発現
MiTarget
Support Vector Machine
[Kim et at .,
2006]
Online search
Yes
http://cbit.snu.c.kr/-miTarget
ノックダウン検証
MiTarget2
Support Vector Machine
[Wang and El
Naqa, 2008]
Online search
Yes
http://mirdb.org
si/shRNA
ライブラリー
TarBase
Experimentally Validated
Targets
[Sethupathy et at ., 2006]
N/A
Yes
http://diana.cslab.ece.ntua.gr/
tarbase/
miRanda
MiRBase
Resource
表 2 数々の miRNA 標的予測アルゴリズム
おわりに
miRNA は，複数の標的遺伝子や全経路を抑制する可能性を秘めているため，アンチセンスインヒビター (Inhibitor, Power Inhibitor, in vivo Inhibitor,
p.46 ∼ p51) を用いた研究は非常に興味深いものです。
miRCURY LNA™ microRNA Inhibitor Probe により簡便かつ効果的な miRNA ノックダウンおよびその機能解析が可能となります。単一 miRNA の
ノックダウンを目的とする場合であろうと，miRCURY LNA™ microRNA Inhibitor Library (p.51) を用いたハイスループットスクリーニングを目的とす
る場合であろうと，何れの場合も慎重に実験条件設定を行うことが重要です。
また，複数の異なる miRNA が協調して各 mRNA の翻訳抑制を行う可能性があることにも留意が必要です。生物学的な表現型を得るには，複数の
miRNA を同時に阻害しなくてはならない可能性もあります。これらを検証するには複数のアンチセンスインヒビター (Inhibitor, Power Inhibitor, in vivo
Inhibitor) を細胞毒性が生じない低濃度で一度にトランスフェクションするか，複数の miRNA を標的するアンチセンスインヒビターをデザイン (Family
Inhibitor, p.49) する必要があり，そのためには高い抑制効果が期待できるオリゴを使用することが重要です。現在，これらを実現できるのは，EXIQON 社
miRCURY LNA™ microRNA Inhibitor Probe (p.46 ∼ p.51) のみです。
「共著」
Anna Karina Busch, Niels M. Frandsen, Hazel Pinheiro, Johan Wahlin, Exiqon A/S, Vedbæk, Denmark.
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
133
技術情報
「引用文献」
miRNA
miRBase
1. The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-A11 during mammalian myoblast differentiation. Naguibneva et al . Nat.
Cell Biol. 2006, 8: 278-84.
2. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Chan et al . Cancer Res. 2005, 65: 6029-33.
LNA
3. MicroRNA-21 knockdown disrupts glioma growth in vivo and displays synergistic cytotoxicity with neural precursor cell delivered
S-TRAIL in human gliomas. Corsten et al . Cancer Res. 2007, 67: 8994-9000.
抽出 / 精製
プロファイリング
4. MicroRNAs regulate the expression of the alternative splicing factor nPTB during muscle development. Boutz et al . Genes Dev.
2007, 21: 71-84.
5. An LNATM-based loss-of-function assay for microRNAs. Naguibneva et al . Biomed. Pharmacother. 2006, 60: 633-8.
定量
6. Transcripts targeted by the microRNA-16 family cooperatively regulate cell cycle progression. Linsley et al . Mol. Cell Biol. 2007,
27: 2240-52.
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
7. Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. Frankel et al .
2008, 283: 1026-33.
8. X-tremeGene siRNA transfection reagent: A powerful tool for antisense inhibition of microRNA in human cells with miRCURY
LNATM Knockdown Probes. Watzele et al . Biochemica, 2006, 2: 28-30.
9. Suppression of microRNA-silencing pathway by HIV-1 during virus replication. Triboulet et al . Science, 2007, 315: 1579-82.
10. miR-200b mediates post-transcriptional repression of ZFHX1B. Christoffersen et al . RNA, 2007, 13: 1172 ‒ 1178.
機能検証
11. MicroRNA expression dynamics during murine and human erythroid differentiation. Zhan et al . Exp. Hematol. 2007, 35: 1015-25.
次世代
シークエンシング
12. A minicircuitry comprised of microRNA-223 and transcription factors NFI-A and C/EBPalpha regulates human granulopoiesis.
Fazi et al . Cell, 2005, 123: 819-31.
13. miR-221 and miR-222 expression affects the proliferation potential of human prostate carcinoma cell lines by targeting p27Kip1.
Galardi et al . J. Biol. Chem. 2007, 282:23716-24.
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
14. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted
target mRNAs in the liver. Elmén et al . Nucleic Acids Res. 2008, 306: 1153-62.
15. miR-122 targeting with LNA/2’
-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates.
Fabani & Gait. RNA. 2008, 14: 336-46.
Cosmo Bio would like to acknowledge and thank EXIQON A/S for providing microRNA information presented here.
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
miRNA 機能解析
ハイスループット microRNA 標的スクリーニング：
miR-122 を用いた事例研究
miRNA は，遺伝子発現において重要な調節因子であり，細胞のシグナル伝達 1），細胞分化，生長，発生，およびアポトーシス 2）など様々な生物学的プロ
セスにおいて重要な役割を担うことが示されています。miRNA の変異や不適切な調節と，がんや心疾患といった種々の生理的疾患との関連が示唆されてい
ます ３）。一般に，miRNA は動物において特定遺伝子の 3' UTR に１つ以上の相補領域をもちます。近年の計算モデルによる miRNA-UTR 標的予測は
miRNA の実験的検証を行う上で重要なガイドラインを提示してきたものの，その標的予測アルゴリズムを修練するための機能的なデータはほとんどありま
せん。ゲノムワイドトランスクリプト解析では標的トランスクリプト候補の同定はできるものの，miRNA によるトランスクリプトの安定性や翻訳効率の変
化を同時に測定することは不可能です。SwitchGear（SGG）社では，ハイスループットで miRNA 標的スクリーニングが可能なゲノムワイドのヒト 3' UTR
ルシフェラーゼレポーターライブラリーを構築しました。このシステムを用いて，肝臓におけるコレステロールや脂肪酸代謝の重要な調節因子であり，代謝
疾患の治療標的として期待される miR-122 の新規標的遺伝子探索を行った事例を紹介します）。
試薬および手法
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
SGG 社では，ヒト 3' 非翻訳領域（3' UTR）を体系的に同定し，ゲノムワイドの 3' UTR クローンベクターコンストラクトを構築しました (p.66 ∼
p.68)。本コンストラクトは，SGG 社独自の RenSP（ウミシイタケルシフェラーゼ）レポーターカセット（GoClone）を LightSwitch Luciferase
Assay System に組込んだ，最適化済みルシフェラーゼレポーターベクターシステムに 3'UTR 領域をクローニングしたものです。RenSP レポーターに
は PEST タンパク質分解配列が組込まれているため，不安定化されたルシフェラーゼタンパク質の半減期は約 1 時間（天然の場合は ∼ 3 時間程度）
，CAT
レポータータンパク質では ∼ 50 時間，GFP では約 25 時間です。この改変型ルシフェラーゼを用いることで動力学的研究が亢進する上，特にレポーター
タンパク質の蓄積が問題となる抑制に焦点を当てた研究において有用です。
細胞培養
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
HT-1080 細胞は ATCC の推奨に準じて培養，トランスフェクションの前日に細胞を 96-well プレートに播種し，トランスフェクション時に
80 - 100% コンフルエントとなるよう調整しました。
3'UTR レポーター GoClone コンストラクトの調製およびトランスフェクション
SGG 社 推 奨 プ ロ ト コ ー ル（図１）に 準 じ，HT-1080 細 胞 に 100ng の 各 3' UTRluciferase GoClone レポータープラスミド (p.66) と，20nM の合成 miR-122 またはノ
ンターゲットコントロールを同時導入しました。トランスフェクションには，DharmaFECT
Duo Transfection Reagent（Thermo Scientific, T-2010）を使用しています。
図 1 miR-122 機能解析スクリーニングの実験デザイン
134
技術情報
ルシフェラーゼ活性測定およびコントロールの測定
トランスフェクションの 24 時間後に 100uL のルシフェラーゼ試薬を各ウェルに添加し，暗所で 30 分培養した後，Lmaxll-384 plate luminometer
（Molecular Devices 社）により発光測定しました。各コンストラクトにおける活性低下（miRNA と 3' UTR の相互作用）は，miR-122 存在下とノンター
ゲットコントロール存在下でのルシフェラーゼシグナル比より算出しましたた（発光 = 特定 miRNA/ ノンターゲットコントロール）
。本アッセイでは，
UTR 非特異的効果を調節するため，SGG 社のハウスキーピング，ランダム，およびベクターのみの GoClone コンストラクト (p.66) を使用しました。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
結果
log2 ratio of targeting/non-targeting miRNA
luciferase actvity
HT1080 細胞へのトランスフェクション後，miR-122 またはノンターゲットコントロール存在下の各 UTR レポーターにおける発光の log2 比を算
出しました（図 2）
。miR-122 を導入したものでは，予測した全 148 標的のうち 58 標的（40.8%）において，ネガコンに比べて発光の変化が顕著で
した（t-test における P<0.05）
。さらに，この 58 標的中 25 ヶ所（43.1 %）では，miR-122 により 2 倍以上の抑制がみられました。したがって，
本スクリーニングによって数々の miR-122 新規標的を同定できただけでなく，これまで報告されてきた miR-122 標的に比べてより有力な標的候補をい
くつか同定することができました。
3' UTR GoClone レポーターコレクション (p.66) を用いて予測された標的スクリーニングを行った後，初期結果の詳細を把握するためにいくつかの追
跡実験を行いました。スクリーニングにおいて高い抑制を示したいくつかの標的に対して，miRNA 濃度 0.0625 ∼ 100nM で追試をしました。使用した
3' UTR レポーターコンストラクトは，何れも miR-122 に対して濃度依存性の応答を示し，その EC50 は 1.5nM 以下でした（図 3）
。さらに，3'
UTR レポーター中のシード認識部位に 2 - 3 塩基の変異を導入し，miR-122 ノックダウンの特異性を検討しました。6 構築中 5 構築において，miR122 のシード認識部位に変異を導入することで発光低下の顕著な抑制がみられました（図 4）。残りの 3' UTR 変異型レポーターでは抑制効果は低下した
ものの，その変化は統計的に有意ではありませんでした。最後に，miR-122 やノンターゲットコントロール存在下による内在性遺伝子発現への影響を調べ
るため，内在性 3' UTR の発現レベルを qPCR にて確認しました。miR-122 とノンターゲットにおける内在性遺伝子発現と 3' UTR レポーター発色の
それぞれの log2 比をプロットした結果，その相関係数は R=0.78（N=14）ででした（図 5）。
142 predicted miR-122 target UTRs
CAT1 UTR
(known target)
Relative Iuciferase activity
1.0
58 altered significantly by t-test (p<0.05)
25 significantly repressed >2-fold
EC50 (nM)
0.08
0.80
0.59
1.44
0.6
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
0.4
0.2
0.2
1
5
20
図 3 miR-122 による 3' UTR 標的により濃度依存的なルシフェラーゼ変化がみられた
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5
-0.5
-1.5
-2
WT
Mut
WT seed seq
mutant seq
ACACTCC
ACACTCCA
ACACTCC
ACACTCCA
ACACTCC
ACACTCCA
AGTCTCC
AGTCTCCA
ACAGACC
ACAGACCA
GGTCTCC
AGGTCTCCA
-0.5
translationally repressed
gene candidates
-1.0
-2.5
-1.5
-3
RIMS1
GNPDA2 ANKRD13C
G6PC3
G3BP2
ALDOA
図 4 miRNA シード領域に経荷を入れることで miRNA 抑制の低下がみられた
-2.0
R=0.78
log2 ratio of transcript knockdown
(by qTR-PCR)
log2 ratio of luciferase knockdown
-2.5 -2.0 RIMS1
GNPDA2
ANKRD13C
G6PC3
G3BP2
ALSOA
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
log2 ratio of luciferase knockdown
0
-1
インヒビター
コントロール
siRNA
100
mir-122 concentration (nM)
Mutagenesis of seed sequence
disrupts miR-122 function
検出
gene 1
gene 2
gene 3
gene 4
0.8
0.0
図 2 HT-1080 細胞を用いた miR-122 標的スクリーニング結果の概略
定量
miR-122 dose response curve
Random UTRs
ALDOA UTR
(known target)
プロファイリング
-2.5
図 5 3' UTR ルシフェラーゼ活性は内在性転写物レベルと高い相関性が見られる
おわりに
補完的手法をも取り入れたさまざまな検討の結果，3' UTR ハイスループットレポータースクリーニングは用量依存的，特異的，かつ再現性が高いことが
示唆されました。数値解析による予測および転写物による発現解析だけでは miRNA の機能的役割を測定することはできませんが，SGG 社の 3' UTR レ
ポータースクリーニングを用いることで本来の miRNA 機能測定が可能であることが示唆されました。また，ルシフェラーゼアッセイを利用することで
mRNA の安定性変化だけでなく翻訳効率の測定ができることも利点となります。SGG 社のスクリーニングでは，4 種類の 3' UTR において RT-PCR
での抑制率よりも高い発光抑制がみられ，当該転写物は翻訳抑制を受ける傾向にあることが示唆されています。SGG 社の構築したヒト 3' UTR ルシフェ
ラーゼレポーターコンストラクトを用いたゲノムワイドライブラリーの利用により，何千もの miRNA 標的候補のスクリーニングが可能となり，わずか１
回の実験による miRNA 機能解明の可能性が示唆されました。
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
「引用文献」
1. Cui Q, Yu Z, Purisima EO, Wang E (2006) Principles of microRNA regulation of a human cellular signaling network. Mol Syst Biol 2:
46.
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
2. Esquela-Kerscher A, Slack FJ (2006) Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nat Rev Cancer 6: 259‒269.
3. Calin GA, Croce CM (2006) MicroRNA Cancer Connection:The Beginning of a New Tale. Cancer Research 66, 7390-7394.
4. Chen JF, Murchison EP, Tang R, et al. (February 2008).“Targeted deletion of Dicer in the heart leads to dilated cardiomyopathy
and heart failure”. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (6):
Cosmo Bio would like to acknowledge and thank SwitchGear Genomics for providing microRNA information presented here.
135
技術情報
miRNA
プール型 shRNA ライブラリー
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
信頼性の高いプール型 shRNA ライブラリースクリーニングに
おけるライブラリーデザインと次世代シークエンシングの重要性
Cellecta（CLT）社では，これまで市販のプール型 200,000 shRNA レンチウイルスライブラリーを使用し，FAS 誘導型 HeLa 細胞をモデルに情報
伝達分子のゲノムワイドスクリーニングを行ってきました。ここで得られた結果には多くの偽陽性または偽陰性が含まれ，わずか 4% の”陽性”クローン
のみ既知のアポトーシス情報伝達経路の修飾因子関連遺伝子でした。有用な情報も得られたものの，スクリーニングに問題があったともいえます。そこで，
CLT 社はスクリーニングを最適化し，かつプール型 shRNA ライブラリー効率の評価を目的として，同様のスクリーニングが可能な改良型 Cellecta
shRNA レンチウイルスライブラリー (p.104 ∼ p.107) を新規に構築しました。
定量
スクリーニング実験における問題点：真の陽性はほとんど得られず，多くは偽陽性
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
市販のプール型 200,000 shRNA レンチウイルスライブラリーを用いて，HeLa D98/
AH2 細胞をモデルとし FAS 誘導型アポトーシス調節に関与する遺伝子の同定を行いまし
た。本ライブラリーには Affymetrix 社 Human Genome U133+2 GeneChip に搭載さ
れた 47,000 トランスクリプトを標的する shRNA が，各トランスクリプトに対して 4
∼ 5 種類含まれています。各 shRNA 配列は Genome U133+2 array のプローブ配列
と相補しているため，スクリーニング後の shRNA 検出に当該アレイを使用することが可能
となっています。
HeLa 細胞 (1x108 cells) を 2 セット用意し，200K shRNA ウイルス粒子ライブラ
リーを MOI=0.3 で各細胞群にトランスダクションしました。細胞は，FAS 経路を活性化し
アポトーシスを誘導することで知られる抗 Fas レセプター抗体で処理した後，7 日間培養
し，Mock 処理群をコントロールとしました。コントロール群および処理群より生存細胞を回
収して cDNA を作製し，ベクター特異的プライマーおよび shRNA ループ配列特異的プラ
イマーを用いた 2 回の PCR により siRNA 挿入配列を回収し，これを Affymetrix 社 HG
U133+2 array にハイブリダイズしました（図 1 参照）。
セレクションにより 95% の細胞死が誘導できたことから，手法は適切なものであると考
えられます。しかし，コントロール群と処理群を比較した結果，2,500 もの shRNA が濃縮
の結果として同定された反面，半数以上の同定 shRNA 配列が 2 回繰返し実験の片方のみ
からしか検出されず，偽陽性率の高さが疑われました。同定された遺伝子は，アポトーシス関
連遺伝子候補が 20 遺伝子と 3 つの既知アポトーシス関連遺伝子（Bax, Bcl-xl, FasL）で
あったことから，セレクション手法は適当であったといえます。一方，偽陽性（バックグラン
ド）が高く，得られた実験結果から " 真の陽性結果 " を導きだすことは困難でした。さらに，
CASP8, BID, DR4 といった FAS 誘導性アポトーシス活性化に関与する既知遺伝子が検出
されず，偽陽性率の高さも伺えました。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
FAS-Treated Cells
Tranduced Control Cells
図 1 200K shRNA ライブラリースクリーニング結果：
FAS 処 理 細 胞 群 ま た は Mock 細 胞 群 よ り 抽 出 し た ゲ ノ ム DNA を 用 い て
shRNA 配列を回収し，Affymetrix 社 HG U133+2. にハイブリダイズした。
コントロール群（x 軸）または処理群（y 軸）より同定された shRNA 配列の
ハイブリダイゼーションシグナル強度（shRNA 存在量に比例すると考えられる）
を示した。処理により多くの細胞が死滅したため shRNA 配列が回収できず，こ
れらは図表中 x 軸付近の底辺に表記されている。Mock 群および処理群に同程
度で存在していた shRNA は対角線上に示されている。図中，対角線より上部に
現われる shRNA は処理群においてより多く検出されたものであり，これら遺
伝子を抑制することで FAS 活性型アポトーシス耐性が得られたものと考えられ
る。約 2,500 種の shRNA では，処理群において２倍のシグナル強度を示した
（対角線付近の赤色で表記した領域）
。また，多くの shRNA は処理群／未処理群
の何れからも検出されなかった（赤丸で示した領域）
。
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
200K shRNA ライブラリーのスクリーニング結果およびライブラリーの問題
まず使用したライブラリー自体の検証を目的として，ライブラリーから回収した shRNA 配列を Affymetrix 社 HG U133+2 array にハイブリダイズ
したところ，わずか 50% の shRNA 配列のみ検出できました。この結果より，特定 shRNA 配列のハイブリダイゼーション効率の低さ，または shRNA
自体がライブラリーに含まれていないことが憂慮されました。この点を検証するため，先のライブラリーを用いた検証で検出できなかった 40 種の
shRNA に対して，これらに対する特異的プライマーを用いた shRNA 配列増幅を試みました。残念ながら 36 の shRNA は PCR により回収できず，
ライブラリー自体に含まれていない可能性が示唆されました。つまり，ライブラリーは 200K shRNA を考慮して構築されたものの，そのうち 40% 程度
のものはライブラリーに含まれていないことが疑問視されました。一方で，ライブラリーに存在しているであろう shRNA 配列においても，各 shRNA の
存在比にバラツキがあるなどの問題が憂慮されました。
本検討で行ったハイブリダイゼーション結果を検討する中で，さらに下記 2 つの問題点が浮上しました。
その他
1) いくつかの配列では他の配列との交差性が憂慮され，偽陽性を招く可能性が疑われる
2) ダイナミックレンジが狭く，わずか 100 倍程度であった。つまり，検出限界を下回る場合ハイブリダイズしていたとしても shRNA 配列は検出できず，
一方，shRNA 存在量は多くともシグナル強度に反映されず，結果検出できない可能性がある。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
136
スクリーニング効率改善を目指して新規ライブラリーを構築
設計した shRNA が構築済み shRNA に含まれているかどうか，ハイブリダイゼーション時の交差性，アレイへハイブリダイズしたところダイナミック
レンジが低かった，といった問題を受け，CLT 社独自の新規ライブラリー構築を試みました。この際，shRNA 挿入配列ごとに，Illumina 社 次世代シークエ
ンシング技術に対応した”検出用特異的配列（バーコード配列）
”を付与し，スクリーニング結果を次世代シークエンシングで同定できるように設計しました。
さらに，ライブラリーの大きさとして，信頼度の高いアノテーションをもつ 8,000 遺伝子を標的とした 38,000 種の shRNA プールとしました。ライ
ブラリーは小規模ではあるものの，詳細な検討かつ全 shRNA を検討するには実用的なスケールであると考えられます。
次世代シークエンシングを用いて Cellecta 38K shRNA ライブラリーを分析したところ，各コンストラクト構築およびウイルス粒子へのパッケージング
に問題はなく，全 shRNA 配列がライブラリーに含まれることを確認しています。さらに，一部のものにおいては 5 オーダー以上の差が存在したものの，
95% 以上の shRNA について，ライブラリーに含まれる各配列の存在量は最大で 10 倍程度の違いしかありませんでした（図 2 参照）。
技術情報
本検討結果と考察：品質が向上した新規ライブラリー
200K shRNA ライブラリーを使用したスクリーニングでは偽陽性率が高く，セレクショ
ンで濃縮された shRNA 群の同定が困難でした。そのため，小さいライブラリーを用いて同
様のセレクションを行い，かつ，より定量性の高い検出法である次世代シークエンシングを利
用することを考慮しました。検討の結果，小スケールライブラリーと次世代シークエンシング
の利用が有用であることが示唆されました。
Cellecta 38K shRNA ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い た ス ク リ ー ニ ン グ の 結 果，約 350 種 の
shRNA が処理群において多く検出されました。そのうち，150 の shRNA（43%）は既知
のアポトーシスの修飾因子であり，NF-κB と p53 経路に関するシグナル伝達経路に関与す
る遺伝子でした。本結果より，ノックダウン実験手法を熟考し良質の shRNA プール型ライ
ブラリーを用いてスクリーニングを行うことで，特定の生物学的応答に関与する遺伝子群の同
定が可能になると考えられます。200K shRNA ライブラリーと Cellecta 38K ライブラ
リーとの大きな違いは，予定した shRNA がどの程度ライブラリーに含まれるか，ライブラ
リーの複雑度（標的遺伝子数 / shRNA コンストラクト数など）であり，この点がスクリー
ニング実験結果を左右する大きな問題となると考えています。
FAS-Treated Cells
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
Tranduced Control Cells
図 2 Cellleta 社 38K shRNA ライブラリー実験結果：
shRNA ライブラリーをトランスダクション後，処理群または非処理群よりゲ
ノム DNA を抽出し，ライブラリーに含まれる各 shRNA 配列に対応するバー
コード配列を Illumina 社の次世代シークエンシングにより同定した。x 軸はコ
ントロール，y 軸には処理群を示し，各プロットは各 shRNA の存在量比を示し
ている。先のスクリーニング実験で示した通り，機能しなかった shRNA は x
軸付近に現れる。前回の 200K shRNA ライブラリーを使用した際と異なり，本
スクリーニングでは処理群より検出された shRNA 数は 200K ライブラリーを
使用した場合に比べ少なかった。およそ 350 shRNA がセレクションにより検
出できた。
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
プール型 shRNA ライブラリー
TGF-β誘導型アポトーシスの制御遺伝子スクリーニング
多機能性の細胞外サイトカインである TGF- β は，細胞周期進行を停止して細胞増殖を抑制しアポトーシスを誘導します。一方，いくつかのがん細胞にお
いては転位反応や血管新生を促進します。これには生長抑制機能耐性が必要であることから，このシグナル伝達経路に関与する遺伝子の変異による不活化と，
TGF- β のアポトーシス機能崩壊が示唆されています。TGF- β シグナル伝達は比較的よく研究されていることから Cellecta（CLT）社の shRNA スク
リーニングライブラリーの機能評価に適したモデルシステムといえるでしょう。
CLT 社では，転写因子，細胞シグナル伝達および薬物標的遺伝子を始めとする 8,000 種の遺伝子を標的とした 25,000 種の shRNA を含むレンチウ
イルスライブラリーを構築しました。このライブラリーをヒト肝がん細胞 Hep3B に導入してスクリーニング実験を行い，さらに，2 種類の他の研究所で
構築されたライブラリー（例：50,000 種のヒト遺伝子を標的とした 200,000 種の shRNA を含むライブラリーなど）を使用して同様の実験を行いま
した。本研究では，モデル細胞にライブラリーをトランスダクションした後，多くの細胞において細胞死を誘導する TGF- β を添加して培養を行いました。
生存細胞に発現する shRNA は TGF- β 誘導性アポトーシスを阻害する可能性が考えられ，TGF- β シグナル伝達を標的し，下方制御するのに必要な遺伝
子を標的していると推測されます。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
実験手法
● プール型 25K shRNA ライブラリー構築
各 8,000 遺 伝 子 群 に 対 し て 3 ∼ ４種 の バ リ デ ー ト 済 み shRNA を 選 出 し，
25,000 種 の バ ー コ ー ド 付 き shRNA オ リ ゴ を 合 成 し ま し た。プ ー ル し た オ リ ゴ を
CLT 社 pRSI-U6Tet-CMV-TetRep-2A-Puro ベクターにクローニングし，Tet 誘導型
のプール型 25K shRNA レンチウイルスベクターライブラリーを構築しました。本ライ
ブラリーにおけるクローニング効率および実際の構築数は，バーコード配列を利用した次
世代シークエンシングにより評価し，95% 以上の shRNA が少なくとも各 10 個以上
ライブラリーに含まれることを確認しました。任意に抽出したクローンをシークエンシン
グした結果，変異度は 0.2% 未満でした。
● スクリーニング
2 セットの 250,000 Hep3B 細胞（ライブラリーに含まれるコンストラクト数の約
100 倍の細胞を使用）を用意し，25K shRNA ライブラリーを MOI=0.5 にてそれぞ
れトランスダクションしました。この細胞群を低密度で播種した後，TGF- β (1 ng/ml)
処理を 3 週間行いました。生存細胞群よりゲノム DNA を抽出して各 shRNA に対応
するバーコード配列を増幅した後，Illumina 社 Solexa Genome Analyzer を用いて次
世 代 シ ー ク エ ン シ ン グ を 行 い ま し た。ス ク リ ー ニ ン グ と は 別 に，細 胞 に 導 入 で き た
shRNA 数を評価するため，ライブラリートランスダクション直後の TGF- β 処理してい
ない細胞よりゲノム DNA を抽出し，shRNA の同定を行いました。
他の研究所で構築された 2 種類のライブラリー（一方は，25,000 種の shRNA コ
ンストラクトを含むとされているライブラリーではあるがシークエンシングによる
shRNA 確 認 が 行 わ れ て い な い も の。他 方 は，50,000 ヒ ト 遺 伝 子 を 標 的 と し た
200,000 種の shRNA コンストラクトを含むとされているもの）を使用して同様のス
クリーニングを 2 セットずつ行いました。25,000 shRNA ライブラリーに対しては，
従来法のシークエンシングを行って生存細胞群に含まれる shRNA を同定しました。
200,000 shRNA ライブラリーに対しては Affymetrix 社 U133+2 array にハイブ
リダイズして shRNA 同定を行いました。
Cells treated with TGF-β
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
図 1 Hep3B 細胞を使用した TGF- βスクリーニングにおける shRNA 分布
トランスダクション直後または TGF- β処理後の細胞群よりゲノム DNA を抽出
し，shRNA バーコードを増幅して次世代シークエンシングにより配列決定した。
各処理群における各 shRNA の存在比を図示した（x 軸：トランスダクション直
後，y 軸：TGF- β処理後）。特定 shRNA が導入された細胞においても TGF-β
処理が細胞増殖率に変化を与えない場合，非処理群と処理群間における shRNA
存在比は基本的に同等となり，これらの shRNA プロットは対角線上に出現する
はずである。もし TGF- β処理により増殖速度の減少や細胞死滅がみられる場合，
生存細胞群中における特定 shRNA 分子数は処理群において低下し，これらの
shRNA プロットは対角線より下方またはベースラインに出現すると考えられ
る。したがって，対角線より上方に出現する shRNA は，TGF- β処理においても
生存し生長し続けた細胞より回収されたものであり，これらの細胞は TGF- β阻
害を受けないか生長刺激を受けたかの何れかである。そのため，これら shRNA
の標的遺伝子は TGF- β応答に重要な役割を担うと考えられる。
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
137
技術情報
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
図 2 RNAi スクリーニング実験により同定された TGF- β
誘導型アポトーシス耐性遺伝子
プロファイリング
TGF- βおよび PI3K/NFkB ネットワークにおいて既知のタ
ンパク質相互作用を模式図に示した（Ingenuity Pathway
Analysis software を 使 用 し て 作 成）。Cellecta 社 が 構 築
した 8,000 の転写因子，細胞シグナル伝達および薬物標的
遺伝子を標的とした 25K shRNA レンチウイルスライブラ
リーを用いたスクリーニング実験により，この情報伝達経路
に関与する緑色の星で示した遺伝子が同定できた。処理におい
ても生存し生長し続けた細胞より回収されたものであり，こ
れらの細胞は TGF-β阻害を受けないか生長刺激を受けたか
の何れかである。そのため，これら shRNA の標的遺伝子は
TGF- β応答に重要な役割を担うと考えられる。
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
138
検討結果
TGF-β シグナル情報伝達は比較的よく研究されており，本スクリーニングにより同定され
ることが期待できる遺伝子群が存在するため，スクリーニングが良好に行われたかの判断基準
とすることが可能です。実際，本スクリーニングでは TGF-β シグナル伝達経路に関与する既
知遺伝子（SMAD4，I 型および II 型 TGF- β レセプター，WNT5A など）が高頻度で同定
できただけでなく，PI3K / NFkB 経路に関与する多くの遺伝子が同定できました（表 .1 参
照）
，この他にも，caspase 1 といった一般的に知られるアポトーシス遺伝子が複数同定でき
ました。
他の研究所で構築された 2 種類のライブラリーにおいては，3 遺伝子が同定されたのみで
し た。25,000 shRNA ラ イ ブ ラ リ ー か ら は TGF- β レ セ プ タ ー I 型 の み が 同 定 さ れ，
200,000 shRNA ライブラリーでは TGF-β シグナル経路に関与する転写因子 SMAD4
と TGF-β との関与が報告されていない PLCB4 が同定されたのみでした。興味深いこと
に，200,000 shRNA ライブラリーを用いた場合では，TGF- β レセプターが挙がってきま
せんでした。
本検討により，CLT 社 25K shRNA ライブラリーを用いたスクリーニングでは，100 種
以上の TGF-β 関連遺伝子または新規遺伝子が同定できました。このうち，80% 以上の遺伝
子は 2 セット行った繰返し実験の何れからも同定されました。2 セットいずれからも同定さ
れた 19 遺伝子では，shRNA 発現コンストラクトを再構築して再度実験を行い，このうち
18 遺伝子においては，これら遺伝子のノックダウンにより TGF- β 誘導性アポプトーシス
耐性が獲得できました（表 .1 参照）
。
Genes Conflirmed after Screening
TGFBR1
ID3
DTX1
CASP1
GABPB2
TCN1
MAF
DMRTA1
DAP
OASL
G6PD
LTB4DH
TRIM59
MMP9
EYA2
TGFB3
RHOBTB1
SMAD4
表 1 スクリーニングで同定できた遺伝子の一例
本スクリーニングにより複数の遺伝子が同定できた。スクリーニングで同定され
た 19 種の遺伝子を標的する shRNA 配列をもつ発現ベクターを構築し，細胞
にトランスダクションした。18 遺伝子において遺伝子ノックダウンが再現でき，
細胞は TGF- β誘導性アポトーシス耐性を示した。
結論
本検討より，良好にデザインされたプール型ライブラリーを用い，熟考された RNAi スクリーニング実験を行うことで，本稿で示した TGF- β 誘導型
アポトーシスを始めとした特定の生物学的応答に関与する機能遺伝学的要求の網羅的解析が可能となることが示唆されました。CLT 社 25K shRNA ライ
ブラリーと他の研究所により構築されたライブラリーでは結果に顕著な差がみられたことから，プール型ライブラリーを構築する際のデザインが非常に重要
であると考えられます。CLT 社ライブラリースクリーニングにより数多くの遺伝子が同定できた理由として，最適化された shRNA デザイン，次世代シー
クエンシングを利用したライブラリーに含まれる shRNA 存在量の確認，shRNA 同定にバーコード配列および次世代シークエンシングの利用，さらにセ
レクションアッセイ手法の熟考などが挙げられます。
技術情報
プール型 shRNA ライブラリー
プール型レンチウイルス shRNA ライブラリー FAQ
Cellecta（CLT）社では，これまで市販のプール型 200,000 shRNA レンチウイルスライブラリーを使用し，FAS 誘導型 HeLa 細胞をモデルに情報
伝達分子のゲノムワイドスクリーニングを行ってきました。ここで得られた結果には多くの偽陽性または偽陰性が含まれ，わずか 4% の”陽性”クローン
のみ既知のアポトーシス情報伝達経路の修飾因子関連遺伝子でした。有用な情報も得られたものの，スクリーニングに問題があったともいえます。そこで，
CLT 社はスクリーニングを最適化し，かつプール型 shRNA ライブラリー効率の評価を目的として，同様のスクリーニングが可能な改良型 Cellecta
shRNA レンチウイルスライブラリーを新規に構築しました。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
A. shRNA / Bar-code Design
検出
1. Cellecta 社の shRNA デザインアルゴリズムとは何か。どのように最適化かつ検証されていますか？
Cellecta 社ではプール型 RNAi スクリーニングに適した shRNA デザインを開発しています。
プール型ライブラリーでは，ライブラリー内の shRNA が均質であることや，トランスダクションした細胞に組込まれたわずか１コピーの shRNA カ
セットに由来した発現量の低い shRNA より十分なノックダウン効果を得ることが必要です。さらに，HT validation screens（下記参照）により高い
機能をもつ shRNA を同定した結果，高いノックダウン効果を得るためにベクターや shRNA デザインの最適化や，ライブラリー内における shRNA
の均一なレプリゼンテーションが可能となりました。最近の報告や Cellecta 社における種々の細胞モデルを用いた in vitro RNAi スクリーニング（下
記参照）結果より，U6 プロモーターからの shRNA 発現を組込んだ Cellecta 社のレンチウイルスベクターデザインを用いることで，H1 プロモー
ターや miR30 骨格を利用した shRNA 発現 ※ 1 に比べてより高いノックダウン効果が得られることが示唆されました。
shRNA 構造を最適化するため，shRNA validation vector (U6Tet-sh-PGK-GFP-Target) を利用した shRNA ターゲットライブラリーを開発しま
した。本ライブラリーでは，150 種類の shRNA をデザインし，かつ各 shRNA は論文報告のある 40 種類のデザインに組込んで shRNA 構築を行
いました。この 150 x 40 bar-coded shRNA-Target Library を CHO-TRex 細胞にトランスダクションし，レプリゼンテーションの測定（ライブ
ラリー内および導入細胞）と各 shRNA 構築によるノックダウン効果の評価を行いました。ノックダウン効果が高く，同一デザインのオリゴプールから
の回収効率が均一であり，かつ同一プールライブラリーにおけるレプリゼンテーションが同等であった 10 種類のデザインを選択しました。さらに，こ
の 10 種類のデザインを用いた 3 種類の p53-shRNA レンチウイルスベクターをマウス繊維芽細胞にトランスダクションし，RT-PCR を用いてそ
の効果の 2 次確認を行いました。
※ 1: An D.S., et al . Mol Ther. 2006 October;14(4), Boudreau R.L., et al. Mol Ther. 2009 Jan;17(1):169-75
2. shRNA の構造やその長さを評価するために，いくつのコンストラクトを使用しましたか。
上記参照
3. バーコード配列長を教えてください。どのようにデザインし検証しましたか。マイクロアレイにおける交差性はどの程度ありますか。
Cellecta 社では 18, 25, 34 塩基長の複数種類のバーコード配列をデザインしました。過去 3 年にわたる 25 種類のスクリーニング結果より，遺伝
子スクリーニング実験における shRNA/ バーコード同定にはハイブリダイゼーションを利用する手法よりも次世代シークエンシングが非常に優れてい
ることがわかりました。特に，ハイブリダイゼーション手法では，1）バーコード検出時のダイナミックレンジに限度がある（約 100 倍）
，2）異なるバー
コード間でハイブリダイゼーション効率に最低 100 倍の配列特異的相違がみられるため，少なくとも 30% 程度のバーコードにおいてハイブリダイ
ゼーションシグナルの欠損がみられる，3）異なるバーコード間での交差性がみられること，が問題となります。次世代シークエンシングではデジタルデー
タが得られるため，これらの制限がありません。したがって，Cellecta 社では次世代シークエンシングに対応するバーコードを開発してきました。現在，
コンプレキシティが 55K 以下の shRNA ライブラリーでは，18 塩基のバーコードを使用していますが，Illumina-Solexa プラットフォームでは変異
率約 0.2% で各バーコードの特異的検出が問題なく行えます。さらに Cellecta 社独自のバーコードデザイン用アルゴリズム開発を行い，各配列が最大
限相違し，かつオリゴ合成における変異導入に左右されにくいバーコードデザインを行っています。上記および Illumina-Solexa 次世代シークエンシン
グ技術により，各バーコードを精度よく区別することが可能となりました。
shRNA 同定をハイブリダイゼーション法または次世代シークエンシング法で行われるお客様用に 34 塩基のバーコードもご用意しています。配列類似
性の回避だけでなく，この 34 塩基バーコードでは GC コンテントも同程度にデザイン（50 - 70%）してありますので，Agilent マイクロアレイへ
のハイブリダイゼーションにもご利用頂けます。ただし，Cellecta 社ではマイクロアレイにおける機能性は検証しておりません。
4. 別のバーコードデザインを使用することはできますか。
はい，可能です。Cellecta 社ではアプリケーションやライブラリーコンプレキシティに応じたバーコードデザインの改良を続けています。お客様のカス
タムライブラリーに最適なバーコードデザインも承ります。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
5. mir30 骨格ではなく，短鎖ヘアピンを使用したライブラリーを使用している理由を教えてください。
これまでの報告を始め，mir30 骨格を使用した shRNA に比べ短鎖ヘアピンを使用したものの方が高いノックダウン効果が得られると言われています。
●
mir30 骨格 shRNA に関するノックダウン効果に関しては，これまで１報しかなされていません。 NCI (Cancer Gene Anatomy Project) は，
2008 年に Open Biosystems に対して mir30 骨格コンストラクトを検討するためのプロジェクトを提示しています。このプロジェクトは
136 種類のがん関連遺伝子に対して 3 種類ずつの shRNA を使用し，OVCAR-8 および MCF-7 細胞を使用して 2 回繰り返し実験を行うもの
で す (http://cgap.nci.nih.gov/RNAi/shRNAValidation/)。そ の 結 果，OVCAR-8 細 胞 に お い て 約 46%，MCF-7 細 胞 に お い て 約 25% の
miR30-shRNA が 70% 以上のノックダウン効果を示しました。短鎖（GG21-S6) shRNA の TRC コレクションに関してはいくつかの報告が
あります ※ 2, 3。70% 以上のノックダウン効果を示す TRC 型 shRNA コンストラクトは，A549 および HT29 細胞を使用して 54 種の
shRNA を検証した場合で 35% ※ 2，同じく 256 種の shRNA を検証した場合で 38% ※ 3，A549 細胞を主に用いて 340 種類の shRNA
を検証した場合で 57 - 68% であることが示されています (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/
shrna/learning-center/mission-application-data.html)。
●
いくつかのアカデミアのグループが複数の遺伝子に対する shRNA および mir30 骨格 shRNA コンストラクト（mature siRNA 配列は同一）
を 構 築 し，siRNA へ プ ロ セ ス さ れ る 程 度 お よ び ノ ッ ク ダ ウ ン レ ベ ル を 検 証 し て い ま す ( 例 : Boudreau, R.L. et al. Mol. Therapy
(2009)17:169-175.; McBride, J.L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2008)105:5868-5873.)。その結果，ノックダウン効果および細胞内の
プロセスされた siRNA レベルは，shRNA コンストラクトにおいて約 1.5 ∼ 2 倍程度高かったと報告しています。
●
mir30 骨格 shRNA の開発者による結果をうけ，Cellecta 社では複数のコントロール遺伝子に対してそれぞれ少なくとも 10 種類の mir30 骨
格 shRNA を構築し，そのノックダウン効果を検証しました。Cellecta 社の実験では，shRNA コンストラクトの方が mir30 骨格のものに比べ
て少なくとも 50% 程度高いノックダウン効果が得られています。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
139
技術情報
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
以上より，mir30 骨格デザインは in vivo や ex vivo または初代培養細胞を用いた実験系において，毒性を低く抑えつつ siRNA 発現調節やノック
ダウン誘導を行う際には有用なツールであると思われます（U6 を用いた shRNA 発現コンストラクトではその毒性が報告されています）。しかし，HT
RNAi スクリーニングにおいては，従来の shRNA デザインの方が少なくとも 50% 優れた性能をもち，より信頼できると考えます。一方，Cellecta
社においても，現存する in silico デザインした shRNA コレクションを検証するにあたり多大な労力（MIT, Sigma, Cellecta）を費やしたため
RNAi consortium platform (TRC collection) の使用を決めています。Cold Spring Harbor Laboratory (mir30 collection) や Thermo Fisher
がゲノムワイドスケールでの機能検証プロジェクトを実施することはないと思われます。
※ 2： Moffat J, et al . A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell (2006) 124:1283-1298.
※ 3：Root DE, et al . Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library. Nat Methods (2006) 3:715-719.
プロファイリング
6. 他社製品に比べて Cellecta 社製品のノックダウン効果はどうですか。
定量
上述の既報および 120 種類の Cellecta 社の検証済み shRNA コンストラクトを用い
て Cellecta 社にて実施した機能テスト結果より 70% 以上のノックダウン効果が得られ
る shRNA 率を算出した結果を下にまとめました。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
shRNA の種類
ノックダウン効果を
示す shRNA の比率
miR30 デザイン
20％
他社 20-mer shRNA デザイン
50％
Cellecta 社 21-mer デザイン
65％
B. オリゴ作製
1. チップごとに作成可能なオリゴ数。
現在のオリゴプールは，6.5K，13K，27K または 55K のコンプレキシティで合成できます。実質，上限はライブラリーのコンプレキシティにより決
まり，オリゴ合成の限界というよりは効率的なスクリーニングが行えるか（Cellecta 社の経験では 27K または 55K が上限）によります。
2. オリゴの長さの限度はどの程度ですか。
最長 180 塩基です。ただし，精度よく合成できるのは 160 塩基未満です。
siRNA
3. トランスダクション後の PCR およびクローニングに最適なオリゴ長。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
200 ∼ 300bp であれば，オリゴのサイズは PCR 増幅やクローニングに影響しません。ただし，Cellecta 社の経験では，PCR 反応中により安定構造
をとる shRNA 配列が減少する可能性があるため，shRNA のステムループを不安定化することが重要です。より安定構造をとるものはバクテリアでの
プラスミドライブラリー増幅時にも減少する可能性があります。
4. オリゴの変異率。
約 0.2% です（約 1000 塩基に 2 つの変異 / 欠損）
。Cellecta 社では変異率を約 0.1% まで抑える技術を保有していますが，shRNA ライブラ
リー構築において必要とは考えていません。
5. 各チップにおける至適 shRNA 数（shRNA / ライブラリー）
現在の Illumina-Solexa sequencing platform を約 10 x 106 reads / サンプルで使用した場合，統計的に信頼性の高いデータが得られる至適ライ
ブラリーコンプレキシティは 27K 以下です。55K のライブラリーも許容範囲であると考えますが，HT sequencing を行う際に２組のサンプルを使
用することをお勧めします。
6. 独自の shRNA デザインを提供して Cellecta 社にてオリゴ作製することは可能ですか。
可能です。ノックダウン効果を期待できるデザインをお持ちの場合，それを使用することもできます。ただし，お手持ちの shRNA デザインが Cellecta
社の次世代シークエンシング利用するプール型ライブラリープラットフォームに適合するか確認するための予備実験が必要となります。
7. アレイ型 shRNA ライブラリーの提供は可能ですか。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
可能です。お客様のご要望に応じたフォーマットでご提供致します。ただし，アレイ型のものは非常に高価となる上，開発に多大な時間を要すること，ご
了承ください。
8. プール型オリゴまたはアレイ型オリゴの提供は可能ですか。
Agilent 社により合成されたプール型オリゴは提供可能ですが，アレイ型の提供は行っていません 。
その他
9. shRNA ライブラリーにおいて，アレイ型に比べプール型の利点はなんですか。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
140
プール型のゲノムワイド RNAi スクリーニング（少なくとも 10,000 遺伝子を対象とし，各遺伝子に対して 3 種の shRNA を含む場合）は，アレイ
型に比べて少なく見積もっても 100 分の 1 程度しか費用がかかりません。現実問題として，個々の研究者にとってはプール型フォーマットが唯一の選
択肢であるともいえます。
プール型の利点：
数十の細胞株を用いたラージスケールの実験が可能（下記論文参照）
Moffat, J., Gruenerberg, D.A. et al . Cell (2006) 124: 1283-1298.
Root, D.E. et al . Nat Methods. 2006 Sep;3(9):715-9.
●
●
特別な設備（ロボティクスを完備した HT スクリーニング施設など）が必要なく単独の研究者が実験を行うことが可能
●
病原微生物を使用し，細胞モデルを用いたドラッグターゲット創薬ターゲット探索研究が実施可能（Biosafety Level 3）。同様のスクリーニングを
アレイ型で行うことは非現実的である。
●
生物学的サンプルを使用しバーコードの次世代シークエンシングによりデジタルデータを得るため，統計解析に適しており，かつ，複数の研究グルー
プ間で互換性のあるデータベースを構築することが可能。
●
同一の shRNA カセットを，種々の蛍光マーカー（GFP, RFP など），薬物耐性（Puro, Neo, Bleo など），shRNA プロモーター（H1, U6 など）
および shRNA 発現形態（tet - 制御型など）をもつ発現ベクターに組込み，さまざまな shRNA ライブラリーを構築することが可能。さらに，
shRNA デザイン改変による新規 shRNA ライブラリー構築も容易である。shRNA のデザインや組合わせの自由度は，アレイ型に比べて特に有
利な点である。
技術情報
アレイ型の利点：
● HTS 用に開発された生物学的アッセイにはアレイ型 shRNA ライブラリーのみ利用可能なものが種々存在する（例： ハイコンテント解析）
。
●
一般に，得られる生データはアレイ型の方がプール型に比べてよい。主な理由として，プール型ではコンプレキシティの維持が困難なことが挙げられる。
●
小分子ライブラリーの HT スクリーニング施設など既存の施設が利用可能。
miRNA
miRBase
LNA
以上より，Cellecta 社ではプール型とアレイ型の shRNA ライブラリーは対称的なものであると考えています。価格面を考慮すると，プール型を用いて
１次スクリーニングを行うことが妥当であると思います（モデルシステムなどの制限が無い場合）
。その後，プール型スクリーニングによるヒットをアレ
イ型を用いた 2 次スクリーニングで検証し，動物モデルにおける追試や検証実験に使用するといった流れが考えられます。プール型ライブラリーとアレ
イ型ライブラリーの双方を利用することで，ラージスケール RNAi スクリーニングがより柔軟かつ費用対効果の高いものとなると考えます。
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
C. ライブラリー構築：QC および含まれる量
1. 変異および誤って合成する頻度はどの程度ですか。どの程度のコンストラクトがデザイン通りに構築できていますか。
変異率は約 0.2% です。25nt の shRNA では，約 95% の shRNA は正しい配列であるといえます。また，通常ベクターへの挿入率は 95% 程度
です（単一インサート）
。
2. プラスミド DNA ライブラリーには，デザインしたコンストラクトの何パーセントが含まれていますか。
デザインした挿入配列のうち約 90 ∼ 95% が検出できています。各サンプルでは全 10 x 106 のリードが得られ，各挿入配列に対し最低 10 個の
シークエンシングリードを得ています。
3. シークエンシングのための PCR ステップ後のレプリゼンテーションはどの程度ですか。エラー率はどの程度ですか。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
PCR ステップ後にプール中の各オリゴのレプリゼンテーションを推定することは可能ですが，ベクタークローニング後に確認すべきであると思います。
次項をご参照ください。
4. クローニングおよびプラスミド DNA 調製後のレプリゼンテーションはどの程度ですか。
プラスミドライブラリー構築後の各 shRNA コンストラクト間における存在量の分布は約 100 倍です（shRNA デザインに依存し，ヘアピンが不安定
構造をとるものほど分布はよい）。エラー率は約 0.2% です（1,000 塩基中２つの変異／欠損）。
5. ウイルスライブラリーには，デザインしたコンストラクトの何パーセントが含まれていますか。
a. ウイルス調製後のレプリゼンテーションおよびその検証方法。
バーコード shRNA コンストラクトをパッケージングした後のレプリゼンテーションは，ウイルス RNA より RT-PCR によりバーコード配列を増
幅し次世代シークエンシング解析することで確認可能です。しかし，実際問題として，ライブラリーをトランスダクションしてゲノムに組込まれたベク
ターよりバーコード領域を PCR 増幅して次世代シークエンシング解析し，shRNA のレプリゼンテーションを確認する方が意味があると考えます。
b. ウイルス粒子調製に際してプールサイズの限度はどの程度ですか（1 度にトランスフェクションが可能なコンストラクト数）。
shRNA ライブラリーのコンプレキシティが 100,000 以下である場合，パッケージングにおけるプールサイズの限度は特にありません。より複雑な
ライブラリーをパッケージングする場合，使用するパッケージング細胞の数を最大 1 x 108 まで増やしています。
c. パッケージングにおけるライブラリーの最大コンプレキシティはどのように決定していますか。
プラスミドライブラリー構築およびトランスダクションステップ後におけるバーコード（shRNA）のレプリゼンテーションを比較しています。
6. ウイルスタイターの決定法。
ベクターに蛍光タンパク質や薬物耐性等のマーカーが含まれている場合，ウイルスをトランスダクションしてマーカーによる選択を行い，ウイルスタイ
ターを算出しています。ベクターがマーカーを持っていない場合，トランスダクションした細胞のゲノムとベクター 特異的プライマーを用いて PCR を
行い，組込まれたウイルスのコピー数を測定しウイルスタイターを算出します。
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
7. ライブラリートランスダクション後の一般的なレプリゼンテーションはどの程度ですか。
一般に，導入ライブラリーのレプリゼンテーションはプラスミドライブラリーのそれと同程度です。ただし，細胞毒性のある shRNA を含むコンストラ
クトは，トランスダクション後の細胞を数日間にわたり培養した場合や shRNA が野生株のプロモーター（tet - 制御型ではないもの）より発現させた
場合，トランスダクションしたプールより消失します。
8. 間違いや期待するトリガーの消失を特定するため，各プロセスではどのような品質管理測定を行っていますか。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
プラスミドライブラリーの品質管理のため，20 種類のクローンをランダム抽出して PCR 増幅およびシークエンシング解析を行い，正しいインサート
の割合と変異度を確認しています。追加で，バーコードの増幅および次世代シークエンシング解析により，プラスミドライブラリーやトランスダクション
後のウイルスライブラリーにおける shRNA レプリゼンテーションを測定することもできます。
D. ベクターデザイン
1. tet 制御効率を示すデータはありますか。
Cellecta 社では，tet 抑制やマーカー（Puro/Bleo, GFP/RFP）を発現し，H1-tet または U6-tet プロモーターから shRNA を発現するベクターの
開発を目指しています。これまでのところ，いくつかの Tet- 制御型ベクターを開発し，形質導入した細胞において dox 処理の有無により shRNA 発
現を少なくとも 10 ∼ 50 倍制御できることを実証しています。しかし，tet - 制御型プロモーターは野生型（wt）プロモーターに比べ活性が低いことも
わかっており，wt に比べて tet - 制御型では活性化される shRNA が少ないと考えられます。そのため，tet - 制御型 shRNA ライブラリーでは偽陰
性ヒットを最小限に抑えるため，各遺伝子に対し最低 10 種類の shRNA をデザインしています。現在，U6-wt プロモーターと同程度の活性を有する
U6 - tet プロモーター開発を目指して，U6 - tet プロモーターの部位特異的変異誘発を試みています（約 6,000 種の変異体構築）。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
2. 各研究者独自のベクターを使用することはできますか。
お客様のベクター骨格を使用することも可能です。ただし，shRNA クローニングおよび HT スクリーニング用の Gex プライマー結合部位などを組込
むため，shRNA 発現カセット（U6 または H1 プロモーター）を変更することになると思います。さらに，選択マーカーや tet 抑制遺伝子なども組込
む必要があるかもしれません。
3. さまざまなベクターの比較方法。
レンチベクターは全て非常に類似しており，同様の骨格をもっています。主な違いは組込まれている要素です（上記参照）。
141
技術情報
miRNA
miRBase
LNA
E. シークエンシング
1. マルチプレックスの障害は何ですか。
シークエンシング時のリードの数が問題となります。27K ライブラリーではサンプルあたりのリード数が 10 x 106 となり，shRNA / バーコードあ
たり約 350 リード得ることになります。コンストラクト間で存在量のレプリゼンテーションにバラツキがあること（上記参照），50 リードが統計的に
有意なリード数であることを考慮すると，現行の技術で遺伝子スクリーニングを行うには 27K ライブラリーが限度であると思われます。27K バーコー
ドライブラリーは，27,000 の単一バーコードまたは 9,000 の三つ組バーコードが付与された shRNA を使用しています。
抽出 / 精製
2. 三つ組バーコードの生データを提供してもらい，使用可能かどうか確認することはできますか。
プロファイリング
定量
検出
生データの提供は可能です。三つ組バーコードおよび繰り返し実験は，統計解析を行って偽陽性と真の陽性を区別する際に非常に有用です。その一方で，
HT スクリーニングのコスト増につながり，またはコンプレキシティの低いライブラリー（5 ∼ 10K）を選択することになります。
3. ヘアピン構造はシークエンシング済みですか。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
QC の一環としてヘアピンもシークエンシング済みです（上記 " ライブラリー構築 " の項参照）。しかし，遺伝子スクリーニングにおいては，各 shRNA
に付随するバーコードのシークエンシングをお奨めしており，この方法ではステム - ループの増幅やループ配列に相補なプライマーを使用する必要があ
りません。
4. シークエンシングとハイブリダイゼーションの比較データはありますか。
比較データはございます。Cellecta 社の初代 shRNA ライブラリーは Affymetfix HG-U133 または Exon 1.0 アレイと相補配列をもつ shRNA
配列を利用したものでした。さまざまな検討の結果，ダイナミックレンジ，交差性，配列特異的なハイブリダイゼーション効率の違いによる問題など種々
の問題が露呈してきました。次世代シークエンシングでは，これらのハイブリダイゼーションにおける問題が回避できます。次世代シークエンシングにお
ける課題は，サンプルごとのリード数（新規技術開発にともない，常時増加中）や，特にポジティブセレクションスクリーニングにおいていくつかの特定
ヒットが多数存在する場合は存在量の少ないヒットを回収することが困難となることです。例えば，前述の「TGF- β 誘導型アポトーシスの制御遺伝子ス
クリーニング」では，TGF- β レセプター shRNA に対するバーコード配列が全シークエンスの 95% を占め，他の TGF- β シグナリングエフェクター
の探索が困難です。この場合，次世代シークエンシングを行う前の PCR ステップを変更して再度シークエンシングすることで改善できる可能性があり
ます。
5. シークエンシングサービスはありますか。その価格を教えてください。
Cellecta 社では，サンプル調製，次世代シークエンシング，リード数の算出，および統計解析を含めた一連のサービスを承っています。価格はご依頼頂く
検体の数やサービス内容によって異なりますので，コスモ・バイオ販売支援部へお問合せください。
F. プール型スクリーニング
1. プール型スクリーニングが可能な最大コンプレキシティはどれくらいですか。どのように決定していますか。
上述の通り，shRNA ライブラリーコンプレキシティの上限は，実質 25K ∼ 50K と考えています。これは，1）ライブラリーに存在する shRNA コ
ンストラクトのレプリゼンテーションを保つために，細胞 / shRNA 比を 100 以上とする必要があること，2）次世代シークエンシングの限度が 10
x 106 リード / サンプルであること，によります。
2. スクリーニングにおいて推奨する MOI および濃縮率
Cellecta 社では，通常，MOI=0.2（ネガティブセレクション）から MOI=0.5（ポジティブセレクション）および細胞数 / shRNA 比 100 ∼ 200
にてトランスダクションを行った後，マーカー選択を行い，1000 程度の感染細胞 / shRNA を用いて特定表現型におけるセレクションを行っていま
す。表現型セレクションステップにおける濃縮ファクターはスクリーニングにより異なります。ポジティブセレクションスクリーニングでは，通常
1000 倍を超える濃縮が見られます。一方，ネガティブセレクションスクリーニングでは，
「逆向きに選択可能」な濃縮レベルは感染細胞率および十分な
shRNA 発現レベルによって異なります（例えば，生存能の喪失など）。もし shRNA のバーコードをもつ 90% の細胞が，表現型を示すのに十分なレ
ベルでこのような shRNA を発現する場合，濃縮率は 10 倍程度になると考えられます。もし，バーコードをもつ細胞の 50% 程度のみが表現型を示す
場合，濃縮率は 2 倍程度となります。
3. 使用経験のある細胞株
これまでのところ，種々のヒトおよびマウスのがん由来細胞を用いて 25 種類を超えるスクリーニングを実施しています。
4. 細胞株によってライブラリーのレプリゼンテーションはどのように異なりますか。
その他
細胞株によってライブラリーレプリゼンテーションが大きく異った経験はありません。一方，トランスダクションの際に各オリジナルクローン / shRNA
が 100 個以下となった場合や，感染細胞 / shRNA 数に対して 500 倍未満で感染細胞を継代培養した場合にレプリゼンテーションの低下がみられます。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
G. 納品商品
1. プール型プラスミドを購入した場合，パッケージングは何回程度行えますか。提供されるウイルス粒子のタイターおよび提供量はどの程度ですか。
通常，> 200 μg のカスタムプラスミドライブラリー DNA をご提供しますので，スクリーニングが少なくとも 50 ∼ 100 回行える程度のウイルス
粒子が得られると思います。ウイルス粒子の場合，お客様のご要望に応じてご提供可能です。27K ライブラリーを用いて 3 回繰り返し実験を行う場合，
おそらく 1 ∼ 2 x 107 ifu 程度のウイルスが必要になると思います。
2. 提供されるウイルス粒子を使用して何回のスクリーニングが行えますか。
上記参照
3. 提供されるプラスミドライブラリーで何回のパッケージングが行えますか。
上記参照
4. ウイルスパッケージングを繰り返し実施してもらうことはできますか。
承っております（別途，繰り返し実施の追加料金が必要となります）。
142
技術情報
H. ライセンス / IP
1. Cellecta 社は実験結果による新規知見に対して何らかの権利を持ちますか。
ご購入頂いたライブラリーおよび受託解析データは全てお客様に帰属します。本製品およびサービスは，Cellecta 社の誇る遺伝子スクリーニング技術を
お客様の研究に役立てて頂くためのサービスですので，製品やサービスの利用により得られた新規知見に対し，Cellcta 社が権利を主張することはござい
ません。
2. オリゴは Agilent 社のプリント技術を利用したものでしょうか。Agilent 社への支払い義務等はあるのでしょうか。
Cellecta 社では Agilent 社のオリゴプール技術を利用しカスタムライブラリーを構築することに関して Agilent 社とライセンス契約を結んでいます。
Cellecta 社がオリゴプール購入に際して Agilent 社に支払う費用には，お客様が研究目的でこれらのライブラリーを使用するライセンス費が含まれて
います。ただし，第三者への譲与はこの限りではありません。詳細は下記の WEB ページよりご確認ください。
http://www.cellecta.com/legal/documents/Cellecta-Agilent-Terms-100408.pdf
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
I. 経験
1. Cellecta 社により構築したライブラリー数
Cellecta 社ではこれまで shRNA，mir30，ペプチドおよび shRNA-target ライブラリーなど，200 種を超えるライブラリーを何十種類ものベク
ターを用いて構築してきました。知識量などから，Cellecta 社は shRNA ライブラリー開発の先駆けかつ最も経験をもつグループといえるのではない
かと思います。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
2. Celleta 社のライブラリーを繰返し購入している顧客はどの程度ありますか。
現在，5 ∼ 7 つの研究グループと常に研究を続けています。いくつかのリファレンスをご紹介します。
次世代
シークエンシング
Andrei Gudkov, Cleveland BioLabs, Inc.
Costas (Gus) Frangou, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC)
Peiqing Sun, The Scripps Research Institute
Yutaka Eguchi, Osaka University
siRNA
共同研究者のプライバシーを保護し，spam を防ぐためにコンタクト情報は web に掲載していません。Cellecta 社の共同研究者とコンタクトをご希
望の場合，まずは Cellecta 社へご連絡ください。一方，数々の製薬企業やバイオテック企業でもご使用頂いていますが，情報開示は致しかねます。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
143
技術情報
miRNA
遺伝子デリバリー（ウイルス）
レンチウイルス発現システムによる遺伝子デリバリー
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
・ViraSafeTM miRNA Lentiviral Expression System, Ecotropic（品番：VPK-220-ECO 他）
・ViraBindTM レンチウイルス精製 / 濃縮キット（品番；VPK-090）
・QuickTiterTM レトロウイルス定量キット（品番：VPK-107，VPK112，VPK-108-HIV-P24 他）
・ViraDuctinTM レンチウイルストランスダクションキット（品番：LTV-200） ▶商品リスト 62 ページ
※ここに掲載したプロトコールは 2010 年 12 月現在のものです。実際にご使用される際には，キットおよび試薬のプロトコールに準じて実験して下さい。
定量
レンチウイルスの一般的なワークフロー
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
目的遺伝子のクローニング
ウイルス発現用
プラスミド
ウイルスのパッケージング
パッケージング用
プラスミドおよび
パッケージング細胞
タイター測定
ウイルス定量キット
濃縮および精製
精製 / 濃縮キット
ターゲット細胞への感染
トランスダクション試薬
Step1
Step1
Step2
Step3
Step4
機能検証
次世代
シークエンシング
1
リコンビナントレンチウイルスの産生
●使用するキットおよび試薬
ViraSafeTM miRNA Lentiviral Expression System, Ecotropic
（品番 #VPK-220-ECO）
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
キット構成品
・pSMPUW-miR-GFP/Puro レンチウイルス クローニング / 発現ベクター
（品番：VPK-220）
・pRSV-Rev パッケージングベクター
・pCMV-Eco エンベロープベクター
・pCgpV パッケージングベクター
・pSMPUW-LacZ コントロールベクター
<< キットに含まれないもの >>
・293T 細胞（メーカー推奨：293LTV 細胞（品番 LTV-100）
）
・細胞培養培地
・トランスフェクション試薬
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
●プロトコール
Ⅰ：miRNA precursor のクローニング
※ miRNA precursor のクローニングのための設計方法は p.148 ページをご参考ください
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
レンチウイルス発現のしくみ
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
144
図 1： pSMPUW-miR-GFP-Puro ベクター
技術情報
Ⅱ : トランスフェクション・レンチウイルスの産生
1．目的遺伝子をレンチウイルスベクターにクローニングします。miRNA precursor のクローニング方法は 148 ページ step1 をご参照下さい。
miRNA
※または，キットに含まれる pSMPUW-LacZ コントロールベクターをコントロール実験用に使用します。
2．トランスフェクションの 1 日前に 293T 細胞または 293LTV 細胞をプレートに 70 - 80％コンフルになるように培養します。
3．リン酸カルシウムまたは他のトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを開始します。
miRBase
LNA
※細胞へのトランスフェクションは，FuGENE® Transfection reagent や LipofectamineTM Plus などの試薬をご使用いただけます。
※推奨混合比； pSMPUW：pCMV-Eco：pRSV-Rev：pCgpV ＝ 3：1：1：1
4．トランスフェクション後 36 - 72 時間，レトロウイルスウイルス上清を培養します
12 時間毎に 2-3 回上清を採取し，それぞれ 4℃ で保存します。
抽出 / 精製
5．集めた上清をプールし，1,500rpm で 5 分間遠心し，細胞の残渣を取り除き，0.22μm フィルターを通します。
プロファイリング
6．上清はそのまま精製 / 濃縮に使用します。長期間保存する場合は，分注して - 80℃に保存してください。
定量
検出
2
レンチウイルスの精製 / 濃縮
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
●使用するキット
TM
・ViraBind
Lentivirus Concentration and Purification Kit（品番；VPK-090）
過剰発現
（ベクター）
構成内容
1．ViraBind
機能検証
TM
次世代
シークエンシング
Lentivirus Reagent A (100X)
2．ViraBindTM Lentivirus Reagent B (100X)
3．Purification Columns
4．Centrifugal Concentrators
5．Purification Buffer
siRNA
配列解析
サービス
特 長
カスタム合成
サービス
・迅 速：4 ∼ 6 時間でウイルス精製
・高回収率：in vivo 研究に十分な 500 倍，109 ∼ 1010 TU/ml まで濃縮
コントロール
siRNA
・高 純 度：回収率は 60％ 以上
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
図 1：プロトコール
関連試薬
●プロトコール
トランスフェク
ション試薬
Ⅰ：精製と濃縮
その他
※下記の方法は，100mL のレンチウイルス上清の精製および濃縮用に記載しています。
※ 100mL より少ないウイルス上清をご使用される場合は，Reagent A，B（ステップ 1）と精製バッファー（ステップ 5）の量をご調整ください。
1．1mL の ViraBindTM レンチウイルス Reagent A（100x）を 100mL のウイルス上清に加えて混合
します。混合後すぐに 1mL の Reagent B（100x）を加えて混合します。
技術情報
2．37℃ で 60 分インキュベートします。
3．レンチウイルス混合液を 15 分間 10,000 x g で遠心します（ペレットがご確認いただけます）。
4．培地を注意深く吸い取り，ペレットを採取します。
miRNA
プロファイリング
5．ペレット化されたレンチウイルス複合体を 2mL の精製バッファーで再懸濁します。
ペレットを溶かすためにボルテックスします（白濁したように見えます）。
miRNA
機能解析
6．遠心チューブに溶かしたレンチウイルス複合体を入れ，10,000xg で 5 分間遠心します。
ここで，溶けなかった物質を除去します。上清を他のチューブに移します。
7．遠心型濃縮用チューブを組み立てます（図 2）。
図 2：遠心型濃縮用チューブ
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
8．0.5mL の溶かしたレンチウイルス複合体を濃縮用チューブ内の sample reservoir にアプライします。
濃縮用チューブをセットし，卓上型遠心機で 10,000 x g，10 分遠心します。
サンプルが濃縮されたら，次の濃縮用チューブにレトロウイルスを追加して下さい。
フロースルーは捨てます。
9．レンチウイルス液が 200μl になるまで濃縮します。
10．清潔なリカバリーを用いてレンチウイルス液を集めます。
最終量が 200μl になるように精製バッファーで調節します。
145
技術情報
miRNA
miRBase
Ⅱ．精製カラム
1．精製カラム内（図 3）のマトリクスを上下に振って完全に懸濁します（白濁するまで混合します）。
2．精製カラムを 50mL のコニカルチューブにいれ，1,000rpm で 3 分間遠心します。
LNA
3．精製カラムの底のチップを取り除き，すぐに空の 50mL コニカルチューブに入れます。
青色のキャップを緩め，充填材の液を自然落下で落とします。
抽出 / 精製
4．充填材の液が完全に落ちたら，200μl の濃縮したレンチウイルス液をカラムに加えます。
充填材にいきわたるようにゆっくりと加えます。
5．濃縮したレンチウイルス液が充填材入れ，滴下が終わったら，コニカルチューブ内のフロースルーを捨てます。
プロファイリング
定量
6．ゆっくりと 800μl の精製バッファーをカラムの上部に加えます。充填剤にいきわたるようにゆっくりと
加えてください。滴下が終わったら，注意深く 3mL の精製バッファーを同様に加えてください。
7．カラムの滴下が止まったら，精製カラムを新しい 50mL のコニカルチューブに移します。
図 3： 精製カラム
8．2.0mL の精製バッファーをカラムに加えて，フロースルーを採取します。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
Ⅲ．バッファー置換と濃縮
1．遠心型濃縮用チューブを図 2 の通り組み立てます。
2．0.5mL のリカバーしたレンチウイルスフラクション（上記ステップ 8）を遠心型濃縮用チューブ内の
sample reservoir にアプライします。濃縮用チューブを卓上型遠心機に入れ，10,000 x g で 5 分間
遠心します。フラクションサンプルが濃縮されたら，濃縮用チューブに追加のレンチウイルスをいれ，遠
心します。フロースルーは廃棄します。
3．レンチウイルスフラクションを 100μl になるまで sample reservoir 内で濃縮します。
4．400μl の PBS またはご希望のバッファーを濃縮用チューブに加え，100μl になるまで遠心します。
siRNA
5．ご希望の量まで濃縮します。
6．新しいリカバリーチューブを用いて，濃縮されたサンプルを集めます。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
3
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
レンチウイルスの力価測定
●使用するキット
・QuickTiterTM Lentivirus Titer Kit（品番：VPK-107）
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
構成内容
・ViraBindTM Lentivirus Reagent A（100X）
・ViraBindTM Lentivirus Reagent B（100X）
・Sample Diluent
・Anti-p24 Antibody Coated Plate
・FITC-Conjugated Anti-p24 Monoclonal Antibody
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
・HRP-Conjugated Anti-FITC Monoclonal Antibody
・Assay Diluent
・10X Wash Buffer
・Substrate Solution
その他
・Stop Solution
・Recombinant p24 Standard
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
146
●プロトコール
Ⅰ：スタンダードカーブの調製
1．下記の通りスタンダードカーブを作成します。
2．p24 stock solution をサンプル希釈液で溶解し，ボルテックスにより良く溶かして 37℃ で 30 分間インキュベートします。
Standard Tubes
1
2
3
4
5
6
7
8
Recombinant p24
Standard（μL）
10
500 of Tube #1
500 of Tube #2
500 of Tube #3
500 of Tube #4
500 of Tube #5
500 of Tube #6
0
Sample Diluent（μL）
p24（ng/mL）
990
500
500
500
500
500
500
500
100
50
25
12.5
6.25
3.125
1.5625
0
技術情報
Ⅱ：レンチウイルスサンプルの調製と不活化
1．
（オプション）レンチウイルス上清を新しい培養培地に溶かし，1mL になるように調節します。ネガティブコントロールとして，培養培地のみの
ものも使用します。
※サンプルが不明の場合，それぞれのサンプルの希釈液を数種類作成することを推奨します。
miRNA
miRBase
2．10μL の ViraBindTM Lentivirus Reagent A を 加 え，ゆ っ く り と 混 合 し，す ぐ に 10μL の ViraBindTM Lentivirus Reagent B を 加 え ま す。
37℃ で 30 分間インキュベートします。
LNA
3．12,000 rpm で 5 分間遠心し，上清を注意深く取り除きます。ペレットを 250μL のサンプル希釈液で懸濁し，ボルテックスでよく混合します。
ウイルスを不活化するために，37℃ で 30 分間インキュベートします。
抽出 / 精製
プロファイリング
III：アッセイ方法
定量
1．使用する前に全ての試薬をプロトコールにそって，準備してください。
2．それぞれのレンチウイルスサンプル，HIV p24 スタンダード，ブランク，コントロールを duplicate でアッセイします。
3．100μL の不活化したレンチウイルスサンプルと p24 抗原スタンダードを抗 p24 抗体でコートされたプレートに加えます。
検出
インヒビター
4．プレートカバーでカバーし，37℃ で少なくとも 4 時間以上，または 4℃ で一晩インキュベートします。
5．カバーおよび，空ウェルを外します。マイクロウェルストリップを 3 回 250μl の洗浄バッファーで洗浄します。
（それぞれの洗浄ステップでは，
ウェルから洗浄液をアスピレーションによって取り除いてください）
最後の洗浄で，ウェルを空にし，パットまたはペーパータオル上でタッピングして残りの洗浄バッファーを取り除いてください。
6．100μL の希釈した FITC 標識 Anti-p24 モノクローナル抗体を加えます。
7．プレートカバーでカバーし，orbital shake を用いて室温で 1 時間インキュベートします。
8．プレートカバーを外し，ストリップを 3 回 Step 5 と同様に洗浄します。
9．100μL の希釈した HRP 標識 Anti-FITC を加えます。
10．プレートカバーでカバーし，orbital shake を用いて室温で 1 時間インキュベートします。
11．プレートカバーを外し，ストリップを 3 回 Step 5 と同様に洗浄後，すぐに次のステップに進んでください。
12．基質を室温に戻し，100μl をブランクを含む全てのウェルに加えます。orbital shake を用いて室温で 1 時間インキュベートします。
実際には，2 - 30 分間の場合もあります。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
※プレートを注意深く観察し，色がすぐに変化した場合，すぐに反応を止める必要があります。
13．ブランクを含む全てのウェルに 100μl の停止液を加えて酵素反応を止め，450nm で測定します。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
4
レンチウイルスのトランスダクション
デザイン済み
siRNA
●使用するキット
ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Kit（品番：LTV-200）
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
構成内容
・ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Reagent A（100X）
・ViraDuctin
コントロール
siRNA
TM
Lentivirus Transduction Reagent B（100X）
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
・ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Reagent C（8X）
si/shRNA
ライブラリー
●プロトコール
1．トランスダクションの前日に，トリプシン処理し，細胞をカウントします。
0.2 - 2 x105 細胞を 2.0 - 3.0mL の培地で 24 ウェルプレートに播きます。
細胞を 37℃で一晩インキュベートします。
関連試薬
2．トランスダクションを行うびにレトロウイルス上清を滅菌したチューブに移します。5μL の ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Reagent A
（100X）を加え，ゆっくりと混合し，5μL の ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Reagent B（100X）を加えます。
トランスフェク
ション試薬
3．37℃ で 30 分間インキュベートします。
その他
4．12,000g で 10 分間遠心し，注意深く上清を取り除き，ターゲット細胞用の新しい培地 0.5mL で懸濁します。
5．24 ウェルプレートにから培地を取り除き，0.5mL の Lentivirus-ViraDuctinTM 混合液を細胞に入れます。
6．37℃ で一晩インキュベートします。
7．培地で 1X になるように，適切な量の ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Reagent C（8X）を希釈します（例えば，70μL の
8X Reagent C を 490μL の培地に加えます。）
8．Lentivirus-ViraDuctin
TM
複合体を含む培地を除去し，0.5 mL の培地を入れます。
9．完全にトランスダクション複合体を取り除くために，希釈した ViraDuctinTM Lentivirus Transduction Reagent C（1X）をそれぞれのウェルに加
え，30 - 60 秒間ゆっくりと揺らします。すぐに Reagent C が含まれる培地を取り除き，0.5mL の培養培地と交換します。
複合体を完全に取り除くために，2 回培地で洗浄します。
10．トランスダクション 48 - 72 時間後，次のステップに進んでください。
安定株を選択するには，培地を抗生物質を含むものに交換し，3 - 4 日ごとに抗生物質耐性コロニーができるまで続けます。
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
147
技術情報
miRNA
遺伝子デリバリー（ウイルス）
アデノウイルスウイルスによる遺伝子デリバリー
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
・RAPAd miRNA アデノウイルス発現システム（品番：VPK-253）
・293AD セルライン（品番：AD-100）
・ViraBindTM アデノウイルス精製キット（品番：VPK-100 など）
・QuickTiterTM アデノウイルス定量キット（品番：VPK-109 など）
・ViraDuctinTM アデノウイルストランスダクションキット（品番：AD-200） ▶商品リスト 63 ページ
※ここに掲載したプロトコールは 2010 年 12 月現在のものです。実際にご使用される際には，キットおよび試薬のプロトコールに準じて実験して下さい。
定量
一般的なウイルス遺伝子デリバリーのワークフロー
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
目的遺伝子のクローニング
ウイルス発現用
プラスミド
ウイルスのパッケージング
パッケージング用
プラスミドおよび
パッケージング細胞
タイター測定
ウイルス定量キット
濃縮および精製
精製 / 濃縮キット
ターゲット細胞への感染
トランスダクション試薬
Step1
Step1
Step2
Step3
Step4
機能検証
次世代
シークエンシング
1
リコンビナントアデノウイルスの作製
●使用するキットおよび試薬
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
● RAPAd® miRNA Adenoviral Expression System
（品番：VPK-253）
構成内容
1．pacAd5 miR-GFP/Puro Shuttle Vector
2．pacAd5 9.2-100 Vector
3．pacAd5 CMV-GFP Control Vector
4．pacAd5 CMV-ntLacZ Control Vector
<< キットに含まれないもの >>
・トランスフェクション試薬
・制限酵素（PacI）
● 293AD Cell Line（品番：AD-100）
si/shRNA 発現
●プロトコール
ノックダウン検証
Ⅰ：miRNA Precursor のクローニング
si/shRNA
ライブラリー
mature miRNA の過剰発現用に miRNA precursor を哺乳動物発現ベクター
(pacAd ベクター，図 2) にクローニングします。
・miRNA precursor クローンのデザイン例（ヒト let-7a-2 miRNA の場合）
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
1．miRNA の ス テ ム ル ー プ 配 列 を Sanger' s miRNA database か ら
ダウンロードします。
Sanger' s miRNA database：http://www.mirbase.org
Homo sapiens let-7a-2
その他
図 1: アデノウイルス発現システムの概要
技術情報
miRNA
プロファイリング
Homo sapiens let-7a-2
AGGUUGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUUUAGAAUUACAUCAAGGGAGAUAACUGUACAGCCUCCUAGCUUUCCU
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
2．miRNA ステムループ配列を Blast で検索します。
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
図 2: pacAd ベクター
148
技術情報
3．PCR とクローニング
（100bp の flank 配列を含む Human let - 7a - 2 miRNA precursar 配列の例）
1) 100bp のネイティブフランク配列を miRNA の上流と下流に加えます。
GCCCAAATAGGTGACAGCACGATGAATCATTATAAGACTAACTTGTAATTTCCCTGCTTAAGAAATGGTAGTTTTCCAGCCATTGTGAC
TGCATGCTCCCAGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTGAATTACATCAAGGGAGATAACTGTACAGCCTCCTAGCTTTCCTTGGGTC
TTGCACTAAACAACATGGTGAGAACGATCATGATTCCTCCAGGCCTTTTCTCCCTATGAAAGGTAAGATTGGGTACGTTATTTTATGGT
ATTT
2) BamHI サイトを含むフォワードプライマー，NheI サイトを含むリバースプライマーを設計します。
（制限酵素サイトはベクターにより異なる場合がございます。必ずプロトコールでご確認下さい。）
（例）ヒト let-7a-2 miRNA precursor の場合
Forward PCR Primer: tcga-ggatcc (BamHI)-21 nt
Reverse PCR Primer: tcga-gctagc (NheI)-21 nt
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
3) ゲノム DNA 由来の miRNA を PCR で増幅させ，発現ベクターの BamHI/NheI サイトにそれぞれクローニングします。
インヒビター
4) インサートを DNA シーケンスによって確認します。
Forward Sequencing Primer: TTTGCACCATTCTAAAGAAT
Reverse Sequencing Primer: AAACCTCTTACATCAGTTAC
Ⅱ：リコンビナントアデノウイルスの調製
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
1．ベクターを Pac I によってリニア化します。
1) 十分量の目的遺伝子のクローニングされた pacAd5 シャトルベクターと pacAd5 9.2-100 Ad バックボーンベクターを Pac I で制限酵素処理
します。
2) 制限酵素処理したそれぞれの DNA と処理していない DNA 0.5μg を 0.8% アガロースゲルに流し，完全に PacI で消化されているかどうかを
確認します。
3) 制限酵素処理した DNA を精製し，滅菌した水に溶かし，- 20℃ で保存します。
次世代
シークエンシング
2．トランスフェクション
1) トランスフェクション前に 2 × 106 細胞を 60mm 培養ディッシュに抗生物質を加えずに播きます。
16 - 24 時間後，70 - 80% コンフルになった時点でトランスフェクションを開始します。
2) トランスフェクション試薬（Fugene® や LipofectamineTM Plus など）を用いてトランスフェクション後，次の日にトランスフェクション試薬が
含まれる培地をアスピレートし，4mL の完全培地を加えます。
3) プラークの状態をチェックしながら 7 日間インキュベートします。
4) トランスフェクション後 10 日にプラークを確認し，培養ができていれば（50％ 以上）クルードウイルスライセートを回収します。
配列解析
サービス
※ 15 日以上の培養は行わないでください。
3．クルードウイルスライセートの回収
1) アデノウイルスを含む細胞を 5 - 10mL の滅菌したピペットで，プレートからはがし，回収します。細胞と培地を滅菌したチューブに移します。
2) 凍結融解を 3 回繰り返し（37℃ のウォーターバスとドライアイス - メタノールバス）ウイルスを細胞からリリースさせます。
3) 細胞溶解液を卓上遠心機で 3000rpm，15 分間室温で遠心し，細胞残渣をペレット化します。
4) 得られたクルードライセート（ウイルスストック）を - 80℃ で保存します。
siRNA
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
4．ウイルスの増幅
si/shRNA
ライブラリー
下記手順は T75 フラスコで行うことを推奨します。
1) インフェクション前に 3 - 5 x 106 細胞を播きます。
2) 上記のクルードライセート 50％ を培地に加えます。
3) インフェクション中の 24 - 48 時間は，顕微鏡で cytopathic effects（CPE）をチェックします。CPE がほとんど完了したら（ほとんどの細胞が
円状でフラスコに完全に接着していない状態）培地をピペッティングして細胞を採取し，フラスコ表面から培地中に感染細胞を移動させます。
4) 感染細胞と培地を集め，1000 x g，5 分で遠心し，細胞をペレット化させます。
5) 上清を取り除き，細胞ペレットを培地または 10 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl に再懸濁させます。
6) 凍結融解によって細胞懸濁液からウイルスをリリースさせます。
3000 x g，10 分間で遠心し，得られた上清をウイルスストックとして保存します。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
＊ウイルス上清は - 80℃に保存できますし，すぐに精製・タイター測定にも使用できます。
2
アデノウイルスの精製
●使用するキットおよび試薬
TM
・ViraBind
Adenovirus Purification Kit（品番：VPK-100）
構成内容
1．Purification Filter
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
2．10X Wash Buffer
3．2X Elution Buffer
4．1X Regeneration Solution
<< キットに含まれないもの >>
・Glycerol
・0.45μm filter
・10 or 30-mL size syringe with a Luer-Lok® tip
149
技術情報
miRNA
●プロトコール
1．増幅したウイルス上清を精製フィルターに入れる前に，0.45μm sterile filter を通してください。
miRBase
LNA
2．シリンジを精製フィルターにつけ，1x 洗浄バッファーでフィルターを事前に洗浄します。ウイルス上清を精製フィルターに通し，フロースルーは
捨てずにとっておきます。
回収量を最大にするために，フロースルーを同じフィルターで流します。
3．洗浄フィルターを 10mL の 1x 洗浄バッファーで洗浄します（2 回）。
抽出 / 精製
プロファイリング
4．コレクションチューブを洗浄フィルターの下にセットし，2 - 3mL の 1X Elution Buffer（25 mM Tris, pH 7.5, 2.5 mM Mg2Cl, 1 M NaCl）
を加え，
流します。
※シリンジとフィルターの間に気泡ができないように気をつけてください。
5．グリセロールを最終濃度が 10％ になるように，精製ウイルスに加えます。
定量
精製したウイルスは - 80℃ で保存可能です。
6．4 で使用した精製フィルターは 2 回ご使用いただけます。精製が終わったら，10mL の 1X Regeneration Solution をフィルターに加えた後，
5mL の洗浄バッファーを加えます。regenerated filter はパラフィルムでラップし，次回使用するまで，4℃ で保存してください。
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
3
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
アデノウイルスの定量
●使用するキットおよび試薬
・QuickTiterTM Adenovirus Titer Immunoassay Kit（品番：VPK-109）
構成内容
1．Anti-Hexon Antibody
siRNA
2．Secondary Antibody, HRP Conjugate
3．DAB Substrate
配列解析
サービス
4．Diluent (10X)
カスタム合成
サービス
<< キットに含まれないもの >>
1．Recombinant adenovirus of interest
2．HEK 293 cells and cell culture growth medium
3．Methanol
4．1% BSA/PBS
5．H2O2
6．Light Microscope
7．(optional) β-Galactosidase Staining Kit (Cat.# AKR-100)
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
5．Ad-β gal Positive Control
●プロトコール
ノックダウン検証
ご希望のウイルスを準備します。
si/shRNA
ライブラリー
免疫染色
1．プレートを傾け，プレートの縁から培地をアスピレートします。
0.5mL の冷メタノールをゆっくりと加え，感染させた 293 細胞を固定します。
- 20℃ で 20 分インキュベートします。
2．固定した細胞を 3 回 1xPBS，5 分間洗浄します。
関連試薬
3．1％ BSA in PBS で室温で 1 時間ブロックします。
（orbital shaker をご使用ください）
トランスフェク
ション試薬
5．固定した細胞を 3 回 1xPBS，5 分間洗浄します。
4．0.25 mL の Hexon 抗体をそれぞれのウェルに加え，室温で 1 時間インキュベートします（orbital shaker をご使用ください）
。
6．0.25 mL の希釈した HRP 標識した二次抗体をそれぞれのウェルに加え，室温で 1 時間インキュベートします（orbital shaker をご使用ください）
。
その他
7．固定した細胞を 3 回 1xPBS，5 分間洗浄します。
8．0.25mL の 1X DAB working solution をそれぞれのウェルに加え，室温で 10 分間インキュベートします（orbital shaker をご使用ください）
。
※インキュベーション後 5 分以内にアデノウイルス感染細胞は濃茶色に染色されます。
技術情報
9．DAB をアスピレートし，1xPBS で二回洗浄します。
10．染色された細胞をカウントします。
miRNA
プロファイリング
11．染色された細胞の平均をとり，ウイルスのタイターを計算します。(infectious units/mL).
※ 1 ウェルあたり少なくとも 5 つのフィールドに分けてカウントしてください。
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
150
技術情報
4
アデノウイルスのトランスダクション
●使用するキット
TM
ViraDuctin
Adenovirus Transduction Reagent（品番：AD-200）
●プロトコール
1．トランスダクションの前日に，トリプシン処理し，細胞をカウントします。
0.2 - 2x105 細胞を 2.0 - 3.0mL の培地で 6 ウェルプレートに播きます。
細胞を 37℃ で一晩インキュベートします。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
2．ト ラ ン ス ダ ク シ ョ ン を 行 う 日 に ViraDuctinTM Adenovirus Transduction Reagent を 室 温 で 10 分 間 温 め ま す。9μl の ViraDuctinTM
Adenovirus Transduction Reagent を 300μl の血清，抗生物質を含まない DMEM または RPMI に加え，ゆっくりと混合し，室温で 10 分間
インキュベートします。
検出
3．アデノウイルスストックを上記の混合液に加え，ゆっくりとピペッティングします。室温で 10 分間インキュベートします。
インヒビター
4．インキュベーターから準備した細胞を取り出し，培地を除去し，FBS を含む培地を 450μl 加えます。
5．トランスダクション混合液をプレートに加え，前後に動かし，37℃ で 4 時間インキュベートします。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
151
技術情報
miRNA
遺伝子デリバリー（ウイルス）
レトロウイルスによる遺伝子デリバリー
miRBase
・pMXs-miRNA-GFP/Pur Retroviral Vector（品番 RTV-017）
・Platinam-E Packaging Cell Line（品番 RV-101）
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
キット構成品
キットに含まれていないもの
・Plat-E レトロウイルスパッケージングセルライン
・Plat-E 培養培地
・Platunum Cell 凍結用培地
定量
・トランスフェクション試薬
・プラスミド抽出キット ▶商品リスト 64 ページ
検出
※ここに掲載したプロトコールは 2010 年 12 月現在のものです。実際にご使用される際には，キットおよび試薬のプロトコールに準じて実験して下さい。
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
一般的なレトロウイルス遺伝子デリバリーのワークフロー
目的遺伝子のクローニング
ウイルス発現用
プラスミド
ウイルスのパッケージング
パッケージング用
プラスミドおよび
パッケージング細胞
タイター測定
ウイルス定量キット
濃縮および精製
精製 / 濃縮キット
ターゲット細胞への感染
トランスダクション試薬
Step1
Step1
Step2
Step3
Step4
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
Platinum Packaging Cell Line を用いたレトロウイルス発現システム
Platinum Packaging Cell Line は pol-gag 遺伝子および env 遺伝子（注1）が含まれています。
（注 1）Plat-GP Cell Line には env 遺伝子は含まれません。
その他
1
技術情報
miRNA
プロファイリング
リコンビナントレトロウイルスの作製
●使用するキット
・Platinum-E Packaging Cell Line（品番：RV-101）
・pMXs-miRNA-GFP / Pur Retroviral Vector（品番 RTV-017）
miRNA
機能解析
●プロトコール
プール型 shRNA
ライブラリー
Ⅰ：Plat-E パッケージングセルラインの培養
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
1．凍結細胞から Plat-E の起こし方
1．37℃ のウォーターバス内で凍結細胞をすばやく溶かします。溶かした細胞を 10mL の培養培地が含まれる 15mL のチューブに懸濁します。
2．チューブを 1,300 ∼ 1,500 rpm で遠心します。
3．上清を捨て，指で軽くたたいて細胞のペレットを壊します。
4．数滴の培地を加え，緩やかに金剛し，数回指でタッピングします。
5．2mL の培地をチューブに加え，緩やかに 2 回ピペッティングします。
6．細胞懸濁液を 8mL の培地が入った 10cm 培養ディッシュに加えます。
7．円を描くようにディッシュをゆっくりと動かし，細胞を混ぜ，2 - 3 日間培養します。
※ 完全なコンフル状態まで培養しないでください。70 - 90％ コンフルになったら，2 - 3 日毎に 4 ｘまたは 6 ｘ に分けてください。
※ 培養操作中は，できるだけ泡ができないように気をつけてください。
152
技術情報
2．細胞の分割
1．細胞が 70 - 90% コンフルになったら，細胞を PBS で洗浄します。
2．4mL の 0.05％ Tripsin / 0.5mM EDTA をディッシュに加え，37℃ で 3 - 5 分間インキュベートします。
3．ディッシュのふちをタッピングし，ディッシュの表面から細胞を剥がします。
4．10mL の培地を 50mL チューブに入れます。
5．同じピペットを使って，ディッシュの表面をやさしく 3 回，4mL の Tripsin / EDTA で洗浄します。
6．細胞の懸濁液を 7 回，ゆっくりとピペッティングし，懸濁液をステップ 4 の培地の入った 50mL チューブに入れます。
7．細胞を 1,300 - 1,500 rpm で遠心します
8．上清を捨て，指で軽くたたいて細胞のペレットを壊します。
9．数滴の培地を加え，緩やかに混合し，数回指でタッピングします。
10．5mL の培地をチューブに加え，緩やかに 2 回ピペッティングします。
11．15mL の培地を加え，細胞の数を数え，細胞を播きます。通常，10cm ディッシュ 1 枚あたり 107 細胞です。
miRNA
miRBase
LNA
抽出 / 精製
プロファイリング
定量
検出
Ⅱ : レトロウイルスの作成
インヒビター
1．クローニングトランスフェクション
1．目的遺伝子をレトロウイルスベクターにクローニングします。miRNA precursor のクローニング方法は 148 ページ step1 をご参照下さい。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
siRNA
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
※または，キットに含まれる pMX-GFP をコントロール実験用に使用します。
デザイン済み
siRNA
6
2．トランスフェクションの 1 日前に 2 x 10 細胞を 60mm 培養ディッシュに抗生物質を入れずに培養します。
3．16 - 24 時間後，トランスフェクションを開始し，70 - 80％ コンフルになるまで，培養します。
®
※細胞へのトランスフェクションは，FuGENE Transfection reagent や Lipofectamine™ Plus などの試薬をご使用いただけます。トランスフェクションの条件は，各試薬のマニュアルをご参照ください。
4．トランスフェクション後 48 時間，レトロウイルスウイルス上清を培養してください。
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
2
レトロウイルスの精製 / 濃縮
si/shRNA
ライブラリー
●使用するキット
・ViraBindTM Retrovirus Concentration and Purification Kit
（品番：VPK-130）
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
特 長
・迅 速：わずか 3 時間でウイルス精製
その他
・高回収率：回収率は 70％ 以上
・高 純 度：導入を妨げる成分を排除して濃縮
構成内容
技術情報
・ViraBindTM Retrovirus Reagent A (100X)
miRNA
プロファイリング
・ViraBindTM Retrovirus Reagent B (100X)
・Purification Columns
miRNA
機能解析
・Centrifugal Concentrators
プール型 shRNA
ライブラリー
・Purification Buffer
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
図 1： プロトコール
153
技術情報
miRNA
●プロトコール
Ⅰ：精製と濃縮
miRBase
※下記の方法は，100mL のレトロウイルス上清の精製および濃縮用に記載しています。
※100mL より少ないウイルス上清をご使用される場合は，Reagent A，B（ステップ 1）と精製バッファー（ステップ 5）の量をご調整ください。
LNA
1．1mL の ViraBindTM レトロウイルス Reagent A（100x）を 100mL のウイルス上清に加えて混合
します。混合後すぐに 1mL の Reagent B（100x）を加えて混合します。
抽出 / 精製
2．37℃ で 60 分間インキュベートします。
プロファイリング
4．培地を注意深く吸い取り，ペレットを採取します。
定量
5．ペレット化されたレトロウイルス複合体を 2mL の精製バッファーで再懸濁します。
ペレットを溶かす為にボルテックスします（白濁したように見えます）。
検出
6．遠心チューブに溶かしたレトロウイルス複合体を入れ，10,000 x g で 5 分間遠心します。
ここで，溶けなかった物質を除去します。上清を他のチューブに移します。
インヒビター
7．遠心型濃縮用チューブを組み立てます。
（図 2）
3．レトロウイルス混合液を 15 分間 10,000 ｘ g で遠心します（ペレットがご確認いただけます）。
過剰発現
（オリゴ）
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
図 2： 遠心型濃縮用チューブ
8．0.5mL の溶かしたレトロウイルス複合体を濃縮用チューブ内の sample reservoir にアプライします。
濃縮用チューブをセットし，卓上型遠心機で 10,000 x g，10 分間遠心します。
サンプルが濃縮されたら，次の濃縮チューブにレトロウイルスを追加して下さい。
フロースルーは捨てます。
9．レトロウイルス液が 200μl になるまで濃縮します。
10．清潔なリカバリーチューブを用いてレトロウイルス液を集めます。
最終量が 200μl になるように精製バッファーで調節します。
Ⅱ：精製カラム
siRNA
1．精製カラム内（図 3）のマトリクスを上下に振って完全に懸濁します（白濁するまで混合します）。
2．精製カラムを 50mL のコニカルチューブに入れ，1,000rpm で 3 分間遠心します。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
shRNA クローン
コレクション
3．精製カラムの底のチップを取り除き，すぐに空の 50mL コニカルチューブに入れます。
青色のキャップを緩め，充填材の液を自然落下で落とします。
4．充填材の液が完全に落ちたら，200μl の濃縮したレトロウイルス液をカラムに加えます。充填材に
いきわたるようにゆっくりと加えます。
5．濃縮したレトロウイルス液が充填材入れ，滴下が終わったら，コニカルチューブ内のフロースルーを捨てます。
6．ゆっくりと 800μl の精製バッファーをカラムの上部に加えます。充填剤にいきわたるようにゆっくりと
加えてください。滴下が終わったら，注意深く 3mL の精製バッファーを同様に加えてください。
7．カラムの滴下が止まったら，精製カラムを新しい 50mL のコニカルチューブに移します。
8．2.0mL の精製バッファーをカラムに加えて，フロースルーを採取します。
si/shRNA 発現
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
Ⅲ：バッファー置換と濃縮
1．遠心型濃縮用チューブを（図 2）の通り組み立てます。
2. 0.5mL のリカバーしたレトロウイルスフラクション（上記ステップ 8）を遠心型濃縮用チューブ内の
sample reservoir にアプライします。濃縮用チューブを卓上型遠心機に入れ，10,000 x g で 5 分間
遠心します。フラクションサンプルが濃縮されたら，濃縮用チューブに追加のレトロウイルスをいれ，
遠心します。フロースルーは廃棄します。
3. レトロウイルスフラクションを 100μl になるまで sample reservoir 内で濃縮します。
関連試薬
トランスフェク
ション試薬
その他
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
154
4. 400μl の PBS またはご希望のバッファーを濃縮用チューブに加え，100μl になるまで遠心します。
5. ご希望の量まで濃縮します。
6. 新しいリカバリーチューブを用いて，濃縮されたサンプルを集めます。
図 3： 精製カラム
技術情報
3
レトロウイルスの力価測定
●使用するキット
TM
・QuickTiter
Retrovirus Quantitation Kit（品番：VPK-120）
miRNA
miRBase
LNA
構成内容
抽出 / 精製
1．QuickTiterTM Solution A
プロファイリング
2．QuickTiterTM Retrovirus Solution B1
3．QuickTiterTM Retrovirus Solution B2
4．QuickTiterTM Solution C (2X)
5．CyQuant® GR Dye (400X)
6．QuickTiterTM Retrovirus RNA Standard
定量
検出
インヒビター
過剰発現
（オリゴ）
●プロトコール
Ⅰ：スタンダードカーブの作成
1．200μg/mL, 100μg/mL, 50μg/mL, 25μg/mL, 0μg/mL (1:2 serial dilution) で RNA のスタンダードを用意します。
遠心チューブに＃ 1 ∼＃ 9 の番号を書きます。
2．20μL の 1X QuickTiter™ Solution C をチューブ＃ 2 ∼＃ 9 に入れます。20μL の 200μg/mL の RNA スタンダードを＃ 1 と＃ 2 に加え
ます。
チューブ＃ 2 をよく混合し，20μL の混合液 (100μg/mL) を次のチューブに入れます。同じステップを＃ 8 まで繰り返します。＃ 9 はブランクと
して使用します。
過剰発現
（ベクター）
機能検証
次世代
シークエンシング
3．それぞれの希釈液から 5μL をとり，フルオロメーターに適したプレートに入れます。
95μL の 1X CyQuant® GR Dye をそれぞれのサンプルに入ったウェルに加え，480 / 520nm フィルターセットで読みます。
siRNA
Ⅱ：アッセイ方法
1．適切な方法でパッケージングセルラインを用いてレトロウイルスを生産します。
2．ウイルスサンプル（最大 2mL）を遠心チューブに入れ，10％ FBS が入った DMEM などの培地を使って，2mL にあわせます。
※ネガティブコントロールは，必ず使用してください。同量のトランスフェクトしていないパッケージング細胞またはモックのパッケージング細胞培地の上清を使用してください。
3．10μl の QuickTiterTM Solution A をアッセイチューブに入れ，数回緩やかに混合します。37℃ で 30 分間インキュベートします。
4．20μL の QuickTiterTM Retrovirus Solution B1 を加え，緩やかに混合し，すぐに 20μl の QuickTiterTM Retrovirus Solution B2 を加え，
ゆっくりと混合します。37℃ で 30 分間インキュベートします。
5．12,000 x g で 10 分間遠心し，注意深く上清を取り除きます。残りの少量の液体は再度，12,000g で 30 秒遠心して，ペレットを吸わないように，
少量サイズ用のピペットで取り除きます。
6．20μL の 1X QuickTiterTM Solution C を加え，ペレットを懸濁し，10 秒間ボルテックスにかけて，よく混合します。
配列解析
サービス
カスタム合成
サービス
コントロール
siRNA
デザイン済み
siRNA
shRNA 配列解析
（カスタム解析）
7．12,000 x g で 5 分間遠心し，5μL の上清をフルオロメーターに適したプレートに写し，新しく準備した 95μL の 1X CyQuant® GR Dye を
加えます。480 / 520nm フィルターセットで読みます。
shRNA クローン
コレクション
8．スタンダードカーブを用いて，レトロウイルスのタイターを測定します。
si/shRNA 発現
4
レトロウイルスのトランスダクション
●使用するキット
ノックダウン検証
si/shRNA
ライブラリー
ViraDuctinTM Retrovirus Transduction Reagent（品番：RV-200）
構成内容
・ViraDuctin
関連試薬
TM
Retrovirus Transduction Reagent A (100X)
・ViraDuctinTM Retrovirus Transduction Reagent B (100X)
・ViraDuctin
TM
Retrovirus Transduction Reagent C (8X)
トランスフェク
ション試薬
その他
●プロトコール
1．トランスダクションの前日に，トリプシン処理し，細胞をカウントします。
0.2 - 2 x 105 細胞を 2.0 - 3.0mL の培地で 24 ウェルプレートに播きます。
細胞を 37℃ で一晩インキュベートします。
2．トランスダクションを行う毎にレトロウイルス上清を滅菌したチューブに移します。5μL の ViraDuctinTM Retrovirus Transduction Reagent A
(100X) を加え，ゆっくりと混合し，5μL の ViraDuctinTM Retrovirus Transduction Reagent B(100X) を加えます。
3．37℃ で 30 分間インキュベートします。
4．12,000 x g で 10 分間遠心し，注意深く上清を取り除き，ターゲット細胞用の新しい培地 0.5mL で懸濁します。
5．24 ウェルプレートにから培地を取り除き，0.5mL の Retrovirus-ViraDuctinTM 混合液を細胞に入れます。
6．37℃ で一晩インキュベートします。
7．培地で 1X になるように，適切な量の ViraDuctinTM Retrovirus Transduction Reagent C (8X) を希釈します（例えば，70μL の 8X
Reagent C を 490μL の培地に加えます。）
技術情報
miRNA
プロファイリング
miRNA
機能解析
プール型 shRNA
ライブラリー
遺伝子デリバリー
（ウイルス）
8．Retrovirus-ViraDuctinTM 複合体を含む培地を除去し，0.5mL の培地を入れます。
9．完全にトランスダクション複合体を取り除くために，希釈した ViraDuctinTM Retrovirus Transduction Reagent C (1X) をそれぞれのウェルに加え，
30 - 60 秒間ゆっくりと揺らします。すぐに Reagent C が含まれる培地を取り除き，0.5mL の培養培地と交換します。
複合体を完全に取り除くために，2 回培地で洗浄します。
10．トランスダクション 48 - 72 時間後，次のステップに進んでください。
安定株を選択するには，培地を抗生物質を含むものに交換し，3 - 4 日ごとに抗生物質耐性コロニーができるまで続けます。
155
お願い および 注意事項
● 希望販売価格・・・
「希望販売価格」は参考であり、販売店様からの販売価格ではございません。
記載の希望販売価格は 2012 年 6 月 1 日現在の希望販売価格です。
予告なしに改定される場合がありますので、ご注文の際にご確認ください。消費税は含まれておりません。
● 使 用 範 囲・・・記載の商品は全て、「研究用試薬」です。
人や動物の医療用・臨床診断用・食品用等としては使用しないよう、十分ご注意ください。
取扱店
〒135-0016 東京都江東区東陽 2-2-20 東陽駅前ビル
URL : http://www.cosmobio.co.jp/
● 営業部（お問い合せ）
TEL :（03）5632-9610 FAX :（03）5632-9619
TEL :（03）5632-9620

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