29-0211 ベンジルアミン-DPE蛍光誘導体化による前頭前野微小透析液中セロトニン、ノルアドレナリン及びドーパミンの高感度HPLC同時定量法の開発とその適用 ○吉武尚1, Jan Kehr1, 能田均2, 山口政俊2（1カロリンスカ研,2福岡大薬） [目的] 近年、大脳皮質の前頭前野が注意力、判断力、問題解決、短期記憶などに重要な役割を担っている事が解ってきている。また、前頭前野の機能障害により注意欠陥障害、うつ病、強迫性障害等を引き起こす事が知られており、これらの機能障害の病因解明にラット前頭前野中のセロトニン(5-HT)、ノルアドレナリン(NA)及びドーパミン(DA)の in vivo での高感度測定法が望まれている。我々は先にベンジルアミン(BA)及び 1, 2-ジフェニルエチレンジアミン(DPE)を用いた5-ヒドロキシインドール類(5-HIs)及びカテコール類(CAs)の高感度･高選択的な HPLC 同時定量法を報告している。本定量法は、これら誘導体化試薬が共に弱アルカリ溶液中で 5-HIs 及び CAs と反応し、同一蛍光誘導体を形成することに基づいている。今回、本法を応用したラット前頭前野微小透析液中 5-HT、NA 及び DA の同時定量を試み、種々の薬剤処理条件下におけるその経時的変化を計測した。 [実験] 微小透析条件:ラット(体重 245-340 g)を用い、無麻酔・無拘束下でリンゲル液(0.5 μL/min)を灌流、10 分毎に灌流液中 5-HT、NA 及び DA を定量。誘導体化条件：サンプル 5 μ L に、試薬溶液 1 {0.3 M CAPS 緩衝液(pH10.0) - 0.3 M BA - 0.02 M K3[Fe(CN)6] - MeOH (2:6:3:24,v/v)} 5 μL を加え、室温で 2 分間放置。更に試薬溶液 2 {0.3 M グリシン- 0.1 M DPE (1:2, v/v)} 5μL を加え 50℃20 分間反応。反応終了後冷却し、その 10 μL を HPLC に注入。HPLC 条件：カラム{150×1.0 mm i.d., TSK gel ODS-80TM (5 μm)}；移動相：5 mM オクタンスルホン酸ナトリウム及び 5 mM EDTA･2Na を含む CH3CN - Briton-Robinson 緩衝液(pH 7.2)(32:68, v/v)；流速：55 μL/min. 蛍光検出：Ex. 345 nm、Em. 480 nm. [結果及び考察] 5-HT、NA 及び DA は、50 分以内に分離検出された。5-HT、NA 及び DA の検出下限(S/N=3)は、 76、 42 及び95 amol/注入量と高感度であった。ラット前頭前野中5-HT、 NA 及び DA の basal levels は、7.3±0.7、5.3±0.31 及び 8.1±0.47 fmol/5 μL (mean ±S.E.M., n=5)であった。本定量法が高感度である事よりテトロドトキシンを含む灌流液、無カルシウムリンゲル液灌流及び神経遮断薬レセルピン投与による前頭前野 5-HT、NA 及び DA の減少変化も計測可能であった。また、ベンラファキシン、レボキセチン等のうつ薬の評価にも適用可能であった。本定量法はラット前頭前野微小透析液(10 分)中 5-HT、NA 及び DA を高感度かつ同時定量可能な分析法である。