ウシ卵胞発育過程における卵胞膜細胞のエンドトキシン受容体の発現動態

北畜会報
5
4:5
9
6
3，2
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1
2
原著
ウシ卵胞発育過程における卵胞膜細胞のエンドトキシン受容体の発現動態
堀内まや・越前谷陸・宮本明夫・村山千明・清水隆*
帯広畜産大学大学院畜産衛生学専攻動物医科学分野
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北海道帯広市稲田町西 2
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Hokkaido，
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5Japan
ラ
キーワード:リポポリサッカライド、ペプチドグリカン、卵胞発育、卵胞膜細胞
Keywords:L
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要約
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分娩後、子宮への細菌感染によって子宮内膜炎を発
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症した乳牛では、発情兆候の減退や卵巣機能低下など
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を引き起こすことが報告されている。感染細菌の細胞
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壁にはリポポリサッカライド (
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) およびペプチド
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グリカン (PGN) が存在し、 LPSは子宮内膜炎発症牛
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の血中および卵胞液中で確認された。このことは LPS
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が卵巣機能の一つである卵胞発育(ステロイド産生)
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に直接的に影響していることを示唆しているが、その
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詳細な機序については不明である。そこで、本研究で
(TLR4a
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dCD14)a
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dPGN(TLR2a
n
dNOD2)r
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は、エストロジェン (
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) 産生の基質であるアンドロ
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) を産生する卵胞膜細胞に着目し、 LPSお
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fTLR4，CD14a
よびPGNの受容体発現を解析した。 LPS受容体である
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.TLR2mRNA
TLR4および、CD14の遺伝子発現は、卵胞発育に伴って
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増加した。一方、 PGN
受容体において、 TLR2の遺伝子
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発現は卵胞発育に伴って減少したが、 NOD2の遺伝子
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発現は増加した。これらの結果は、卵巣は内毒素 (
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および、PGN) の影響を直接的に受けること、また卵胞
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発育に特異的に関与する受容体のあることが明らかと
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緒言
分娩後、細菌感染によって引き起こされる子宮疾患
や乳房炎は繁殖障害の一つの要因である。特に、子宮
受理
2
0
1
2年 1月2
0日
内膜炎を発症した乳牛では、発情発現の減退や受胎率
-59-
堀内まや・越前谷陸・宮本明夫・村山千明・清水
隆
の低下の起こることが知られている。子宮内膜炎は潜
のステロイドホルモン産生は、下垂体から分泌される
在性のものを含めると乳牛の 5割以上が擢患している
黄体形成ホルモン(以下LH) の作用を強く受ける。こ
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J。子宮内
と推察されている [
のようなことから、本研究では卵胞から単離した卵胞
膜炎を発症した乳牛の繁殖障害を引き起こす原因のー
受容体の
膜細胞に LHを処理し、 LPS受容体および、PGN
っとして推察されているのが、グラム陰性細菌および、
mRN
A発現動態に及ぼすLHの影響についても検証し
グラム陽性菌から放出される菌体由来成分である。グ
た
。
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P
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)、グ
ラム陰性細菌からはリポポリサッカライド (
ラム陽性菌からはペプチドグリカン (PGN)が融解、放
材料および方法
出される。 LPSは、その防御機構を誘導することに
食肉処理場(北海道畜産公社十勝事業所家畜処理場)
よって、生体内で様々の現象を引き起こし、致死的な
ta
，
.
l
疾患を引き起こすこともある内毒素である [Mue
で屠殺されたホルスタイン経産牛および、未経産牛より
2
0
0
1
J。子宮内膜炎を患った乳牛の末梢血中 [
M
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採取した卵胞を実験に供した。卵胞から卵胞液を採取
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ta
，
.
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3
Jおよび卵胞液中 [
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ta
，
.
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2
Jにおい
し、卵胞液の重さを計測し、以下に示す計算式に当て
てLPSが検出されている。したがって、子宮内膜炎の
ta
，
.
l2
0
0
5
J。
はめ卵胞直径を算出した [Murasawae
発症に関する細菌群から放出される内毒素が、繁殖障
3
1
.
(y=卵胞直径 (
m
m
)、
計算式: y=12.96xo
x=卵胞液の重さ (
g
)
)
害を引き起こしていると推察される。しかしながら、
卵胞液中からエストラジオール (
E
2
) およびプロ
LPSおよびPGNが乳牛の繁殖器官に与える影響を検証
p
4
) を抽出し、 2抗体法 (Enzyme
ジェステロン (
した事例はほとんどない。
LPSや PGNが、細胞に影響を及ぼすためには、それ
ImmunoAssay，EIA)により E2および、p4濃度の測定をし
らの受容体が標的細胞に発現していなければならな
た
。 2抗体法は本研究室で確立した方法で行なった
い
。 LPSの受容体にはTLR4、CD14およびMD2の 3つ
[Miyamotoe
ta
，
.
l1
9
9
2
J。卵胞液中のステロイドホルモ
の分子が必要である。膜上に位置する CD14は血中の
ンの濃度をもとに、卵胞を低E2大卵胞 (EID，E2/P4<
遊離LPSと複合体を形成し、 CD14-LPS複合体が膜貫通
1)、高 E2大卵胞 (EAD，E2/p4孟 1)、および退行黄
型受容体の TLR4に結合することで LPS刺激が細胞内
体存在下の前排卵卵胞 (POF，E2/p4孟 1)に区分し
(
表 1)、各発育段階の卵胞から卵胞膜細胞を採取し
へと伝達される。 MD2はCD14とTLR4の結合を補助す
る[
C
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n，2
0
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J。一方、 PTGの認識機構は細胞膜上に
た。各発育段階の卵胞から卵胞膜細胞を採取した。
存在する TLR2と細胞内に存在する NOD1およびNOD2
を介して認識される。ヒトの子宮内膜組織では増殖期
前期から後期にかけて TLR4の発現が減少することが
わかっている [
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日甫乳動物における周排卵期の卵胞発育は、視床下部
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ediameter(mm)
14.7:
tO.4
tO.8
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.
1:
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t1
.
1
解除された視床下部-下垂体系が活発になり、その結
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g
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m
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)
13.0:
t6.5a
45.
4
:
t21.3b
nRH)が頻繁
果、性腺刺激ホルモン放出ホルモン (G
P4conc.(
n
g
/
m
l
)
4
:
t12.6
42.
12.3:
t4.0
-下垂体によって制御されている。黄体の退行ととも
にプロジェステロン濃度が低下すると、その抑制から
に放出され、これに対応して下垂体からの黄体形成ホ
E2/P4
ルモン (LH) のパルス状分泌の頻度が増加する。卵巣
0.
4
:
tO.2a
t2.8b
4.5:
t48.7c
214.3:
11.0:
t4.3
23.8:
t5.6c
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.
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)
ではLHのパルス状分泌に反応して卵胞発育が促進さ
培養に用いた卵胞膜細胞の採取は、採取した卵胞を
れるとともに、多量のエストラジオールが合成される
[
G
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t
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，
.
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J。このエストラジオールは発育卵
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れる。特に、卵胞液中に蓄積したエストラジオールは、
Albumin/4mlPBS) に浸漬させ、 3
7Cで 50-60分間加
卵胞の発育段階に伴って増加することが知られている
温した。その後、 DMEM/F12培地 (GIBCO)にNaHC03
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(
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.2g/m
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)，および、Kanamycin
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LPSおよびPGNの受容機構がウシの生殖器官、とく
(
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.1mg/1)を溶解した Washing
溶液を加え、遠心分離
に卵巣に備わっているかどうかは不明である。そこ
後に上清を除去した。その後、 Redb
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で、本研究では卵巣内卵胞のステロイドホルモン合成
(
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.4mg/mlNH4Clp
H
8
.0
)を加え溶
細胞である卵胞膜細胞に着目し、卵胞を発育段階別に
血処理を行った。生存細胞数はトリパンブルー染色
分類し、それぞれの卵胞膜細胞の LPS受容体および
後、血球計算盤を用いて算出した。
PGN
受容体の遺伝子発現動態を解析した。卵胞膜細胞
-60-
本実験では基礎培地として 1%FCSを含有した
ウシ卵胞発育過程における卵胞膜細胞のエンドトキシン受容体の発現動態
Table2
.Sequencesf
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o附 a
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TGGGCAATGTTCAGCAC・3
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CAACTTTGCCATCAACT
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l当たり 1X1
05個の
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l
lフ。レート)、 2
4時間の馴致
卵胞膜細胞を播種し (
ng/mlあるいは 2.5ng/mlのLHを処
培養後、各w
e
l
lに o
TLR4
b
EAD
POF
C014
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EAD
POF
φ
:
.10
6時間培養を行った。培地交換は 4
8時間おきに
理し、 9
c
コ
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行った。培養した細胞は、 T
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v
i
t
r
o
g
e
n
) に溶解
5
25
し、後述する悶対A抽出まで -80Cで保存した。培養し
0
。
た培地は、ホルモン測定をするまで -30Cで保存した。
0
卵胞膜細胞から mRNAを抽出し、 R
e
v
e
r
s
e
EID
T
r
a
n
s
c
r
i
p
t
i
o
n (逆転写)による cDNA
合成を行った。定
量的PCR
はSYBRGreenPCRMasterMix (
Q
i
a
g
e
n
)を
B 2
用い、 iQ5c
y
c
l
e
r (BIORAD) で行った。 PCRの反応条
0分間 (
d
e
n
a
加r
e
)後
、 9
5 Cで 1
0秒間
件は、 9
5 Cで 1
0
0
c
コ
(
寸
(
d
e
n
a
t
u
r
e
)、各因子で設定したアニール温度で 1
0秒間
、
ーJ
園
51
(
a
n
n
e
a
l
i
n
g
)、および7
2o
Cで2
0秒間 (
e
x
t
e
n
s
i
o
n
) を5
0
E
サイクル行った。融解曲線分析はO
.1oC/sec.で70 C
0
0
0
。
0
から 9
5 Cまで温度を上げて行い、 2
0 C/min.で4
0Cま
0秒間冷却した。解析に用いた各因子の
で下げた後、 3
EID
プライマー配列は表 2に示した。それぞ、れのmRNA
発
現は内部標準因子である GAPDHとの割合で示した。
C 8
各mRN
A発現量はそれぞれの GAPDHのmRN
A発現量
で補正した値をmean士 S
.E
.M.で示した。各データは群
M02
66
後
、 Tukey-Kr
amer
法あるいはスチューデント t
検定を
結果および考察
，ι
n
用いて有意差の検定を行った。
a斗
-Zコ﹄﹂EtD
﹄
︿
問の多重比較検定による一元配置の分散分析を行った
。
EID
EAD
POF
8
) CD14 and
F
i
g
u
r
e
1
. Expression o
f(
A
) TLR4 (
(
C
) MD2 mRNA i
n f
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l
l
i
c
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n
d
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c
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.
0
5
.
s
u
p
e
r
s
c
r
i
p
t
s(
a，
、
卵胞発育段階の卵胞膜細胞における LPS受容体およ
び
、PGN受容体のmRNA
発現をそれぞれ図 1および図 2
に示した。 TLR4およびCD14のmRN
A発現は、 EADお
-61-
堀内まや・越前谷陸・宮本明夫・村山千明・清水
隆
果
、 TLR4および、CD14のmRN
A発現は対照区と LH
処理
A
61
I
LI
t
'
"
n
1
:
E
I
D
1
5
手
司
歌)
1
0
NOD2
区との聞に有意な差が認められなかったが(図 3Aお
発現は対照区に比べLH
処理
よび 3B)、NOD2のmRNA
E
コ
=
区で減少する傾向 Cp=0
.
0
5
0
6
)が認められた(図 3C)。
d
a
a
「
二E寸
直面l
EAD
B
吾
〈
E5
』
これらの結果から、卵胞膜細胞における TLR4および
。
E
I
D
POF
EAD
CD14のmRNA
発現はLHによって影響されないことが
POF
F
i
g
u
r
e2
. Expression o
f(
A
) TLR2 and (
8
) NOD2
mRNAi
nf
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l
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i
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columnsi
n
d
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c
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ep<0
.
0
5
.
示された。 POFの卵胞膜細胞における TLR4および
よびEIDの卵胞膜細胞に比べPOFの卵胞膜細胞で有意
mRNA
発現がLHによって低下する傾向が示された。
CD14のmRN
A発現の増加は、 LHではない他の因子に
よって引き起こされる可能性がある。
本研究において、卵胞膜細胞における NOD2の
に増加した(図 lAおよび 1B)。しかし、 MD2のmRNA
この結果は、卵胞発育段階の卵胞膜細胞における
発現は、いずれの卵胞発育段階の卵胞膜細胞で有意な
NOD2のmRN
A発現がEIDおよびEADと比べPOFで有
変化は認められなかった(図 1C
) LPSの細胞内シグ
意に増加した結果と異なる。この相違には、卵胞膜細
ナル伝達には、 TLR4および、CD14が重要な役割を果た
胞で産生されるプロジェステロンの関与が考えられ
すことから [Cohen，2
0
0
2
J、POFの卵胞膜細胞における
る。過去の報告では、ヒト子宮内膜細胞における
これら因子の増加はLPSの感受性の高さを示している
NOD2のmRNA
発現は血中 p4濃度と負の相関関係を
かもしれない。一方、 PGN受容体である TLR2および
K
i
n
ge
ta
，
.
l2
0
0
9
J。本研究
もつことが報告されている [
0
NOD2の遺.伝子発現についてみてみると、 TLR2の
A
mRNA
発現はEADおよびPOFの卵胞膜細胞に比べEID
の卵胞膜細胞で有意に増加していた(図 2A)。本研究
"
'
~
に用いたEIDは、卵胞液中のエストラジオール濃度が
TLR4
1
5
1
0
C
他の卵胞に比べ低い。このような卵胞は、発育せずに
コ
~
退行していく(卵胞閉鎖)ことが知られている。従っ
4園 4
iコ
ー
‘
〈
て
、 TLR2は卵胞の閉鎖に関与する可能性が示唆され
る。また、 NOD2のmRNA
発現はEADおよび、EIDの卵胞
5
。
c
o
n
t
r
o
l
膜細胞に比べPOFの卵胞膜細胞で有意に増加していた
(
図 2B)o NOD2のm即 I
J
A
発現がPOFの卵胞膜細胞で、
b
高かったことから、 LPS受容体と同様、この発育段階
C014
3
凹E
の卵胞はPGNに対する感受性の高いことが推察され
LH
4L
OF
コEEH一心﹄︿
tc
る。このように POFの卵胞膜細胞でLPSおよびPGNに
対する感受性が高い理由として、卵子の正常性の有無
に関係している可能性が挙げられる。すなわち、卵胞
発育の最終段階である排卵期に LPSやPGNが存在した
。
場合、卵胞膜細胞がそれらを受容し排卵卵胞を排卵さ
せないように作用するのかもしれない。事実、培養卵
C
o
n
t
r
o
l
胞膜細胞に LPSやPGNを処理した場合、アンドロステ
LH
ンジオン産生やプロジェステロン産生およびLH受容
C
体発現が抑制あるいは阻害されることを本研究室の実
1
0
N002
n
u
(円E
験で確認している C
d
a
t
an
o
ts
h
o
w
n
)。
OF
Hのパルス状分泌に
卵胞は、下垂体から分泌される L
よって発育が促進される [BaoBe
ta
，
.
l1
9
9
8
J。また、
LHのパルス状分泌は卵胞膜細胞の機能であるアンド
ロステンジオン産生および、プロジェステロン産生を充
:
;
:
;
c
コ
6
~
4
2
主
進することが知られている [McNatty，1
9
8
4
J。このよ
2
0
うなことから、 LPSおよびPGN受容体のmRN
A発現が
C
o
n
t
r
o
l
LH
LHの影響を受ける可能性が推察される。そこで、本研
究室では卵胞発育後期(排卵前期)に相当する POFの
卵胞膜細胞で発現が高かった TLR4、CD14および、NOD2
のmRNA発現における LHの効果を検証した。その結
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i
g
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f LH on e
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A
)、
CD14(8)andNOD2(C)mRNAi
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-62-
ウシ卵胞発育過程における卵胞膜細胞のエンドトキシン受容体の発現動態
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. DUFFIELD，R
.A. FOSTER，C.
1
.
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4
GARTLEY， K
.E
. LESLlE， J
.
S
. WALTON. and W.H.
E
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2
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JOHNSON. (
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.，W. HORNE. ANDREW
，HOMBACH-KLoNISCH.
SABINE，J
.1
. MASON， O.D. HILARY. and CRITCHLEY.
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2
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9
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l
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の図 4に示すように卵胞膜細胞は、 LH処理によってプ
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t
i
o
ndomainp
r
o
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i
n
sNODl andNOD2 i
n
ロジェステロン産生が増加する。さらに、 POFの卵胞
humane
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e
n
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l
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n
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液中のプロジェステロン濃度が低いことから(表 1
、
)
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LH
処理による NOD2のm即ぜA発現の抑制傾向は LHの
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1
1
3
1
9
.
.
， D.A. LOPES，L
.COSTA，P
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I
N
I
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. andA
.
J
.
MATEUS，L
直接的な作用ではなく、フロジェステロンを介する間
接的な作用である可能性が推察される。
Z
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2
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3
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n and
本研究より、ウシの卵胞膜細胞は LPSおよびPGN受
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n (PGE2 and PGFM) c
o
n
c
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i
o
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容体を発現していること、さらに各受容体の m陪..JA発
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現量は卵胞の発育段階間で異なることが明らかとなっ
MCNATTY，K
.
P
.，D.A.HEATH，S
.LUN，J
.
M
.FANNIN，J
.
M
.
た。このことから、子宮内膜炎発症牛における繁殖障
害は、細菌由来成分の LPSおよびPGNが直接的に卵胞
MCDIARMID. and K.M. HENDERSON. (
19
8
4
)
膜細胞に関与している可能性が示唆された。今後、
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LPSおよびPGNが卵胞膜細胞へ与える影響について詳
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細に検証していくことが重要である。
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参考文献
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. HAMASAKI，Y. HIROTA，E
.
NOSE，C
.MORIMOTO，M.HARADA，Y.TAKEMURA，K
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. YOSHINO，T. TAJIMA，A. HASEGAWA，T.
-63-
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