2016 / October No. 37 Science, Products, and Information サーモフィッシャーサイエンティフィック ライフサイエンス情報誌 NEXT Interview 次 世 代 クリニカル シ ー ケンス の 時 代 へ 全 国 規 模 の が ん ゲノム スクリー ニン グ プ ロ ジェクトを 立 ち 上 げ る 土原一哉 氏（国立がん研 究センター先 端 医 療 開 発センターゲノムトランスレーショナルリサーチ分野 分野長） P. 04 LentiArray CRISPR ライブラリー P. 05 Platinum SuperFi DNA Polymerase P. 06 SuperScript IV VILO Master Mix P. 07 TaqPath qPCR Master Mix, CG P. 09 PureLink Expi Endotoxin-Free Mega/Giga Plasmid Purification Kit P. 12 Oncomine Lung cfDNA Assay P. 13 QuantStudio 3D デジタル PCR システム P. 14 PSC Dopaminergic Neuron Differentiation Kit P. 15 TaqMan hPSC Scorecard Panel P. 17 EVOS FL Auto 2 Imaging System Interview 次 世 代 クリニカル シ ー ケンス の 時 代 へ 全国規模のがんゲノムスクリーニングプロジェクトを立ち上げる 土原一哉 氏 国立がん研究センター先端医療開発センター ゲノムトランスレーショナルリサーチ分野 分野長 「来るべき次世代クリニカルシーケンス時代は、 卓越した個人が牽引するのではなく、多様なバックグラウンドを持つ専門家が スクラムを組んで進めていくことになるだろう」 と語るのは、 国立がん研究センターの土原一哉氏。 全国規模で肺がんと消化器がんの腫瘍ゲノムスクリーニングを行う 産学連携プロジェクト 「 SCRUM - Japan（ Cancer Genome Screening Project for Individualized Medicine in Japan ）」 の立ち上げに関わり、 そのハブとなるゲノム情報のデータベース化とマネジメントを担当しています。 このプロジェクトを通して、希少頻度の遺伝子異常を持つがん患者を見つけ出し、 適切な情報を提供するとともに、新たな抗がん剤や診断薬の開発を目指します。 土原氏にプロジェクトの現状と今後の展開について伺いました。 インタビュアー：サーモフィッシャーサイエンティフィック 橋本裕子 希少頻度のドライバー遺伝子を 臨床研究する難しさ 2 0 1 2 年 2 月、国 立が ん研 究センターの河 野隆志氏らのグループは、肺腺がんのドライ バー遺 伝 子として、RET チロシンキナーゼと KIF5B（ kinesin family 5B 遺伝子）の融合 遺 伝 子を発 見しました。そして甲状腺がんの 治療薬として承認間近の「バンデニタブ （ 」マ ルチキナーゼ阻 害 剤 ）が 、この融 合 遺 伝 子に よって誘導されるNIH3T3 細胞の足場非依存 的増殖活性を抑制することを学術誌に報告し す症例を選択するには、その 2−3 倍の数の患 ます。 「 多くの 医 療 関 係 者 が 集まった初 会 合 年で RET 融合遺伝子の治験に必要な患者さ 参画した製薬会社の新薬開発に役立て、国内 者さんを探し出す必要があり、症状が 進んで では、間野先生から『このプロジェクトで最も んが集まり、有効性を示す結果を得ました。こ 外の研 究 者に良 質な臨 床ゲノム情 報を提 供 界中で、今この時も、同じアイデアを試したい いく中で、全員が 治験に参加できる保証もあ 重 要なことは、分 子 診 断の精 度の高さ』とい の時の解析成功率は、93.3% 。国際学会では、 することが目的です」 と土原氏はプロジェクト と思っている人がいるかもしれません」。外科 りません。肺腺がんの半 数を占める有 名なド うアドバイスを受けました。そこでサンプルは、 短期間で実施された精度の高い治験への反 について語ります。 医としてのキャリアを皮切りに、さまざまな分 ライバー遺 伝 子である E G F R の 変 異を持 つ 新鮮なバイオプシー検体を使い、融合遺伝子 響が大きかったそうです。 患者を除いても、約 2,000 名程度の肺腺がん 検 出は検 査 会 社に解 析 手 順を移 管して精 度 患者さんの腫瘍遺伝子をスクリーニングする の高い解析を目指しました。また遺伝子解析 この 過 程で 消 化 器 が んのスクリーニング 必 要が ありました」 と土 原 氏は当 時の厳しい の結果は 2 週間で主治医に戻す体制も整えま 状況を振り返ります。 した」 と一気に進めたプロジェクトの立ち上げ SCRUM プロジェクト始動 ! を話します。多くの人の熱意も後押しし、約 2 プロジェクトである GI-SCREENとも統合し、 「 S C R U M - J a p a n 」が 本 格 的に稼 働します。 プロジェクトへの目 標 登 録 症 例 数は、2 0 1 7 年 3 月末までに 4,500 例ですが、すでに 2016 年 6 月までの登録数は 3,000 例を超え、予定 を上回るペースで進んでいます。プロジェクト 野で研鑽を積み、基礎から臨床まで幅広い知 自分で限界をつくらないこと 識と経 験を身に着けてきた土 原 氏 。 「 今 回の がんの患者さんを救いたいという思いで外 ず か 4 年 で 進 む 時 代 です 。今 後も全 国 の 臨 科に進んだ土原氏。確かに初期のがんは、外 科 的 切 除 で 治りますが 、進 行 が んには 歯 が 立たず、違うアプローチを模索します。まずは 『 敵 』を知るために分 子 生 物 学を学 ぶことを 「治験に必要な患者数は、とてもがん研究セ の意義に賛同した全国約 200 医療機関と10 究センター東病院呼吸器科の後藤功一先生 ンターだけで集められる人数ではありません 数 社の製 薬 企 業がこの活 動を支えています。 からメールを受け取りました。そこには『 日本 でした。数年前に、当時自治医科大学教授の さらに今後も新たなドライバー遺伝子が発見 究に従 事しました。帰 国 後 、次 世 代シーケン で見つかったがんのドライバー遺伝子だから、 間 野 博 行 氏 が 同じく肺 腺 が んのドライバ ー されていくことを想定してターゲットを拡げる サによる腫瘍ゲノム解析に出会い、この技術 治療薬も日本で一刻も早く開発しましょう』と 遺 伝 子として希 少がん ALK 融 合 遺 伝 子を発 ため、がんに関わる143 遺伝子を次世代シー が 臨床応用にもっとも近いと考え、その研究 医 師 主 導 治 験への提 案 が 書いてありました。 見し、全 国 規 模のネットワークと海 外の企 業 ケンサで 一 度に解 析できる I o n To r re n t ™ に飛び込みます。土原氏からの若い研究者へ ます。 「 論文発表から時をおかず、国立がん研 を明 確に持ち、その 実 現を強く願うこと。世 決 意し、C 型 肝 炎ウイルスによる発 が んメカ ニズムや留 学 先ではノックアウトマウスの研 治験に必要な患者数は 17 名。そのうち 9 名に 治験によって治療薬を開発した前例がありま Oncomine™ Cancer Panelを基盤技術と のアドバイスは一言、 「 自分で限界を作らない 有効性が認められれば、バンデニタブは新規 した。そこで 私たちも全 国 規 模 のネットワー して採用しました。 「 貴重な検体を最大限に活 こと」です。 「 今の技 術ではできないからと諦 肺 腺が ん治 療 薬として承 認への道 筋が 見え ク構 築を目 指しました 」と土 原 氏 。こうして 用すること、希少頻度の遺伝子異常を持つが める必 要はありません。情 報 科 学を含め、技 てきます。しかし RET 融合遺伝子による肺腺 2013 年 1 月、肺が んを対 象に SCRUM の前 ん患 者さんにも世 界 中で 実 施される新 薬 の 術の進 歩は私たちの想 像 以 上の速さで進ん がんは、全体の約 1% 。しかも適格規準を満た 身となる LC-SCRUM プロジェクトが 始動し 治験に参加するチャンスを届けること、そして でいます。一番大事なことは、何をやりたいか page 02 page 03 様に論文発表から有効な薬剤の確認まで、わ 床医や基礎研究者、製薬企業の方々と、この スピード感で一緒にスクラムを組んで行きた い 」。が んの患 者さんを一 人でも救いたいと いう変わらない土原氏の強い想いが、次世代 クリニカルシーケンス時代への大きな原動力 になっているのかもしれません。 土原一哉（つちはらかつや） 93 年金沢大学医学部卒業、00 年東京医科歯科大 学大学院修了。93 年より金沢大学医学部附属病院 研修医、00 年よりオンタリオがん研究所（カナダ）研 究員、国立がんセンター東病院 臨床開発センター 室長などを経て、13 年より同センター早期・探索臨 床研究センタートランスレーショナルリサーチ （ TR ） 分 野 長 、1 6 年 より同 センター 先 端 医 療 開 発 セン ターゲノムTR 分野長。現在に至る。 LentiArray CRISPR ライブラリー 最新のゲノム編集ツールでスクリーニングを新しいステージへ User's Voice 鈴 木 貴 紘 氏（ 理化学研究所ライフサイエンス技術基盤研究センター 機能性ゲノム解析部門 オミックス応用技術研究グループ 細胞機能変換技術研究チーム） ダイレクトリプログラミングで細胞の機能を操作する POINT 長いフラグメントの PCR も Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ DNA Polymerase で克服 Invitrogen™ LentiArray™ CRISPR ライブラリー製品は、CRISPR-Cas9 技術を取り入れ、ハイスループットな機能的ゲノムス クリーニングを実現する最新のゲノム編集ツールです。LentiArrayライブラリーは、数百から数万もの遺伝子を迅速に解析し、特異的 な生物学的パスウェイに関与する遺伝子を特定することで、それらが疾患の発生および進展にどのように影響するかを発見するための 因子で制御されていることがわかってきま 突破口として開発されました。 した。ちょうどその頃、iPS 細胞の論文が出 がクリアになり非特異的反応も抑えられた 弊社の LentiArrayライブラリーは、プール型よりも解析しやすいアレイ型で、すぐに使えるレンチウイルスアレイフォーマット、およびグ て、たった 4 つの転写因子を細胞に導入す とか。 「うまくいく保証もないままひたすら リセロールストックフォーマットの 2 種類で提供いたします。 るというコンセプトが 、自分たちの考えに 手間のかかる条件検討を行うのは、無駄に ● 先進の gRNA 設計により、特異性を損なわずに最大のノックアウト効率を実現 ● ターゲット遺伝子ごとに最大 4 つまでの異なるgRNA 配列を含み、幅広い細胞タイプで効率的なノックアウトが可能 NE W ! ● すぐに使用できる高力価のレンチウイルス、およびグリセロールストックの 2 種類のフォーマットで提供 も当てはまると思い、ダイレクトリプログラ 時間やお金を費やすことになり、精神的に ミングの研究を始めるきっかけとなりまし も疲れます。酵素を変えるだけでこれだけ た」 と振り返ります。 うまくいくのなら、価 格よりも性 能で選ん そして、自 分たちの 強 みである転 写 制 御 だ方が、結局は安上がりで効率的ですね」。 ● スクリーニング後のバリデーションに必要な、単一遺伝子ターゲットに対するレンチウイルスも提供予定 iPS 細胞を経ずに目的の細胞をつくる“ダ ● 今回の 19 種類の配列確認済みライブラリーに加え、 フレキシブルに解析できるカスタムオプションも準備中 イレクトリプログラミング ”の実現を目指 の線維芽細胞を単球様細胞に変換させる す理化学研究所研究員の鈴木貴紘氏。10 ことに成功します。これは 「細胞 A の転写制 年ほど 前から細 胞の機 能を決める“ 転 写 御ネットワークを細胞 B の中に再構築すれ 使いやすいレンチウイルスフォーマット psi PRE ［ Cas9 プロテイン発現用フォーマット］ ［ sgRNA 発現用フォーマット］ pLenti-Cas9-P2A-Bsd pLentiCRISPR-EFS-Puro cPPT P2A EFS Cas9 WPRE psi cPPT PRE Bsd sgRNA Scaffold Pol lll term U6 LTR LTR LTR FES WPRE Puro Unique sgRNA ヒトコドンに最適化されたS.pyogenes Cas9タンパク質を発現 Blasticidin 耐性遺伝子とCas9は、自己切断 2A ペプチドを介して接続 U6プロモーターと特異的 sgRNAを接続 EF-1aプロモーターとPuromycin 耐性を接続 多様なライブラリーセットの内容と種類 サブセットグループ 製品番号 遺伝子数 gRNA 数 レンチウイルス グリセロールストック Kinase 822 3,288 A31931 A32167 GPCR 446 1,784 A31947 A32183 Epigenetics 396 1,584 A31934 A32170 Phosphatase 288 1,152 A31932 A32168 DNA damage response 561 2,244 A31946 A32182 Cell surface 778 3,112 A31943 A32179 Cancer biology 510 2,040 A31933 A32169 Ubiquitin 943 3,772 A31935 A32171 Apoptosis 904 3,616 A31940 A32176 Tumor suppressor 716 2,864 A31945 A32181 Transcription factor 1,817 7,268 A31938 A32174 Cell cycle 1,444 5,776 A31936 A32172 LTR 使うと収量が上がり、 しかもスメアなバンド ネットワークからのアプローチにより、ヒト 制御ネットワーク”の解析に取り組んでき ば、細胞 B は細胞 Aになるはずだ」 との発想 ましたが、分化した細胞でも転写制御ネッ によるもの。他の細胞の作製にも使えるこ トワークを再構築することで、別の細胞に とから、再 生 医 療や創 薬 開 発など先 進 医 変えられるのではないかと考え、2012 年 療への貢献が期待されています。 にヒトの線維芽細胞を単球様細胞へと変 「ただし、実際にできた細胞は単球の機能は 換させることに成 功しました。 「 我々のグ もつものの、細かく調べると生体内の単球と ループの最終的なミッションは、細胞の機 は違う部分が多く、元々の線維芽細胞のエ 能を操作すること」 と話す鈴木氏は、さらな ピゲノムがほとんど変化していないことが る飛 躍を目 指して新たなアプローチにも わかりました。現在、それがどのように制御 着手しています。 されているのかを探る研究を進めています」。 転写制御ネットワークの解明から 長いフラグメントの PCR が ダイレクトリプログラミングへ Platinum SuperFiで成功 鈴 木 氏 の 所 属 す る グ ル ー プ は 、2 0 0 6 実験では、PCRで遺伝子のクローニングを 年に国 際 科 学コンソーシアム FA N T O M する機会が多いという鈴木氏。 「 約 4kbpと 今後はエピゲノムの制御がカギに 今 、世 界 中でダイレクトリプログラミング の 課 題を突 破しようと、さまざまなアプ ローチで研 究が 行われています。 「もとの 細胞のエピゲノムが残ってしまうという課 題は、我々だけでなくiPS 細胞研究でも共 通 。避けては通れません。これからはエピ ジェネティクスからのアプローチにも力を 入れていきたい」 という鈴木氏。今後の成 果が楽しみです。 （Functional Annotation of the いう長いフラグメントと他のものをつなげ Mammalian Genome ）4を主催し、ヒト白 血病由来細胞株（ THP-1 ） を用いた解析か るときに、いろいろと条 件を変えても増え てこないことがありました。でもこの酵素を 図 PCR 反応における酵素の比較 ら、分化における遺伝子の転写制御ネット 使ったら、プロトコールどおりに行い、最初 とPlatinum SuperFi DNA Polymerase（ 右） で比較しま ワークモデルの構築に成功しました。 「この からうまくいきました（図参照）」。さらにこ 仕事から、細胞の形質は、案外少ない転写 れまでうまくいっていた反応も、 この酵素を 4kb の DNAフラグメントに対するPCRを、他社酵素 K（左） した。その結果、3 種のプライマーで Platinum SuperFi は 反応が進み、酵素 Kでは進みませんでした。ポジテイブコン トロールの収量もPlatinum SuperFiで増加していました。 Platinum SuperFi DNA Polymerase Taq の 100 倍を超えるフィデリティを実現 ! Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ DNA Polymeraseはプルーフリーディング活性を有するDNAポリメラーゼです。 GCリッチ領域やロングリードなど増幅困難なターゲットにも有効。グリーンバッファ-を利用すれば直接ゲルへロードできます。 Drug transport 98 392 A31941 A32177 Ion channel 328 1,312 A31942 A32178 Membrane trafficking 141 564 A31937 A32173 Nuclear hormone receptor 47 188 A31939 A32175 Protease 製品名 サイズ 製品番号 475 1,900 A31944 A32180 Druggable genome Platinum SuperFi DNA Polymerase 100 ユニット 12351-010 10,132 40,512 A31948 A32184 Whole genome Platinum SuperFi Green DNA Polymerase 100 ユニット 12357-010 ¥17,000 18,392 73,568 A31949 A32185 Platinum SuperFi PCR Master Mix 100 反応 12358-010 ¥43,500 Platinum SuperFi Green PCR Master Mix 100 反応 12359-010 ¥43,500 ※価格はお問い合わせください。サブセットの種類によっては受注生産になります。プールフォーマットでのご提供も可能です。ご興味があるお客様は、弊社営業部までお問い合わせください。 ※製品の詳細・サンプルのご依頼はこちらをご覧ください。www.thermofisher.com/platinumsuperfi page 04 page 05 価格 ¥17,000 SuperScript IV VILO Master Mix TaqPath qPCR Master Mix, CG リアルタイム PCR の cDNA 合成をより速く最高レベルの収量で ! 阻害剤が存在しても、再現性の高い遺伝子発現データを提供 POINT POINT Invitrogen™ SuperScript™ IV VILO™ Master Mix は、2ステップのリアルタイム定量 RT PCR（ RT-qPCR ）用にデザインさ Applieid Biosystems™ TaqPath™ qPCR Master Mix, CGは、厳格な製造品質と優れたパフォーマンスで難しい遺伝子発現ア れた cDNA 合成用のマスターミックスです。優れた DNA 鎖伸長能と熱安定性を併せ持つ新しい Invitrogen™ SuperScript™ IV プリケーションにも確実性と信頼をもたらします。しかも市販の一般的なマスターミックスとは異なり、ヘパリンやヘマチンと言った PCR Reverse Transcriptase（ RT ）酵素を採用することで、従来の VILO™ テクノロジーをレベルアップさせ、cDNA 合成を可能とします。 SuperScript IV RTは、純度が低いサンプルや微量のテンプレートでも、最高レベルの cDNA 収量および感度を提供します。 阻害物質が存在しても、優れたパフォーマンスを維持し、臨床サンプルなどさまざまなサンプルに対するデータの信頼性が向上します。 ● ヘパリンおよびヘマチンなどの PCR 阻害物質に対する高い抵抗性 ● ISO 13485 認証取得施設で、厳格な製造管理および工程管理の下で製造し、ロット間差が極小に ● 高速 ── RT 反応は 10 分、gDNA 除去は 2 分で完了 ● 高収量 ── 他社試薬より2 サイクル以上早く増幅 ● Fastモード、Standardモードのどちらにも対応 ● 簡便 ── RT 反応に必要なコンポーネントが 1 本のマスターミックスに ● 遺伝子発現または miRNAアッセイに対する、7 桁の範囲にわたる効率的かつ直線的な検出 ● 高感度 ── 微量な RNA や純度の低いサンプルにも対応 ● 再現性のあるCt 結果で、コピー数の少ないテンプレートを信頼性高く検出 ● 外来性または内在性ターゲットに対するマルチプレックス性能 NE W ! 迅速なプロトコール 低コピー数サンプルも信頼性高く検出 従来のワークフロー（75分） プライマー アニーリング （25℃）10 分 40 酵素 不活化 （85℃） 逆転写（42℃） 60 分 わずかなロット間差 40 Lot 1 38 Lot 2 Lot 3 36 5分 35 34 Ct RNA サンプル NEW ! Avg. Ct 32 30 SuperScript IV VILOのワークフロー（25分） RNA サンプル 28 26 酵素 不活化 （85℃） 5分 逆転写 （50℃） 10 分 プライマー アニーリング （25℃）10 分 Lot 1 Lot 2 30 Lot 3 25 図 1 低コピー数サンプルの検出 ヒトDNAを10コピー含むサンプルで、3 種類の異なるロットの TaqPath qPCR Master Mix, CG とRNase Pアッセイを使って該当遺伝子を増幅しました。各ロットでのエラーバーは小さく、 しかも 20 ALAS1 APC BCL2L1 BRCA1_1 CAST CCDC57 CCNB1 CELF2 CMIP CTCF CXCL14 ENO1 FAR1 FBN1 FN1 FOXJ3 GPX4 HPRT1 IGF2 KCNIP3 KDM1B LARS LRMP MARS MDM4 MET METTL3 MLH1 MRPS24 MSMO1 MTA3 MTIF2 NOP10 NOS3 NOTCH1 OMD PRDX4 RNF38 RPLP0 RREB1 SKIL SPG7 TBP TCF12 TCF25 TCF7 TFRC_1 VEGFB ZBTB22 ZNF613 ロット間の差がほとんど観察されませんでした。 図 1 逆転写酵素反応にかかる時間の比較 Assays SuperScript IV VILO Master Mixと従来法のワークフロー で R N A サンプ ルを逆 転 写 するプ ロトコールを比 較しました 。 PCR 阻害物質に対する高い抵抗性 SuperScript IV は反応時間が 10 分なので、従来のプロトコー ルでの所要時間 75 分から25 分に短縮できました。 図 2 マルチプレックスアッセイにおけるCt 値の一貫性 ヒトc D N A をテンプレートに、9 6 種 類 の 遺 伝 子 発 現アッセイパネルと 3 種 類 の 異なるロットの TaqPath qPCR Master Mix, CG を使って、各遺伝子を増幅しました。この図は、代表的なサブ Ct shift 14 逆転写困難なサンプルでも、他製品より高い RT 効率を達成 セットの結果を表示しています。3 種類のロット間に、Ct 値の一貫性が観察されました。 TaqPath qPCR mix 12 Supplier R 10 Supplier Q 8 6 4 SuperScript IV VILO Master Mix SuperScript VILO Master MIx 他社製品 1 他社製品 2 他社製品 3 他社製品 4 他社製品 5 他社製品 6 2 他社製品 7 ∆SSIV VILOに対して標準化したRT効率 1.2 0 Heparin, 0.0005 U/µL 1 図 2 逆転写酵素活性に対する各種阻害剤の影響 0.8 SuperScript IV VILO Master Mix および 8 種類のマスター Hematin, 30 µM 図 3 阻害物質耐性に対する他社製品との比較 0.6 ミックスに、100 ng のトータル HeLaRNAを加え、各種阻害剤 0.4 を記 載のとおりに添 加して逆 転 写 反 応を行いました。その後 、 質に起因するCt 値のシフトで阻害物の影響を評価しました。グラフは、阻害物質が存在しない場合 性能評価として定量 PCRを行い、B2M 遺伝子をターゲットとし のベースライン値からの Ct の変化を表示しています。その結果、他社 2 製品の Ct 値の変化は大きく、 0.2 0 阻害剤なし 75 mM LiCl 0.3% TRIzol 0.004% SDS 阻害剤 0.007 U/µL へパリン 15 µM ヘミン 2 種類の PCR 阻害物質として、ヘパリンおよびヘマチンをそれぞれqPCR 反応系に添加し、阻害物 て TaqMan アッセイを、EXPRESS qPCR SuperMixを使っ 阻害剤の影響が顕著でしたが、TaqPath qPCR Master Mix, CG（青） のみ、ほとんどCt 値は変化 て行いました。 せず、qPCR 反応が阻害されないことが示されました。 製品名 サイズ 製品番号 SuperScript IV VILO Master Mix 50 反応 11756050 ¥48,500 価格 製品名 サイズ 製品番号 価格 TaqPath qPCR Master Mix, CG 1 x 5 mL A15297 ¥72,400 SuperScript IV VILO Master Mix 500 反応 11756500 ¥373,000 2 x 5 mL A16245 ¥140,000 SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase 50 反応 11766050 ¥52,500 5 x 5 mL A16247 ¥338,500 SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase 500 反応 11766500 ¥383,500 1 x 50 mL A15298 ¥640,000 ezDNase 50 反応 11766051 ¥20,000 10 x 5 mL A16248 ¥653,500 page 06 page 07 WEB検索が便利! PureLink Expi Endotoxin-Free Mega/Giga Plasmid Purification Kit 幅 広 いラインナップを簡 単に短 時 間 で 。 エンドトキシンフリーのプラスミドDNA の大量調製に ELISA キットをお探しなら、おまかせください ! POINT NEW ! Invitrogen™ PureLink™ Expi Endotoxin-Free Plasmid Purification Kit シリーズ は、手早く、簡単にエンドトキシンフリーのプラスミドDNAを調製するキットです。感受性の高い細胞 株へのトランスフェクションにも使用できる高純度プラスミドDNA が、Mega キットでは最大 5mg 、 POINT Giga キットでは最大 15mg 得られます。さらに、最新のバキュームシステムに対応し、従来では 5 時 800 製品を超える豊富なラインナップと、3000 報以上の文献への引用実績がありま す。 『 研究対象に合った ELISA キットを探したい…。』こんな時はターゲット名で簡単に 間以上かかっていた工程が、わずか 2 時間で終了します。 探せる検索ツールをお使いください。サイトカインやリン酸化タンパク質、神経生物学 の研究対象のタンパク質などに対する豊富なキットを揃えています。また抗体ペアキッ トやマルチプレックスアッセイ用の製品もご利用ください。 スピーディーで簡単な プロトコール M ORE INFO バキュームフィルターの採用により、自然落下プ ELISAキット検索はこちらから → www.thermofisher.com/findELISA ロトコールのような、長い待ち時間が必要なく、 2 時間以内に大腸菌ライセートからプラスミド DNAを抽出できます（図 1 ）。 抗体探しに迷ったら、ここで見つかります！ POINT 失敗しない抗体選びなら、Invitrogen™ にお任せください。 プロテオームの 幹 細 胞 研 究や神 経 化 学を始 めとする 5 0 を超える多 様な研 究分野に対応する抗体を提供中です。また 24 種類の蛍光色 70% をカバーする 抗体ラインナップ 図 1 バキュームプロトコールで、Mega Kit の所用時間を大幅 短縮 から選べるInvitrogen™ Alexa™ 二次抗体や 320 種類の 進化したイオン交換テクノロジーとバキュームシステムにより、 Q 社同等品よりも、劇的に時間が短縮できます。PureLink Expi Endotoxin-Free Mega Plasmid prepキットは、Q 社の Maxi スーパークローナル二次抗体もお勧めです。 48,000 ∼ バリデーション済みの一次抗体と二次抗体の数 続々追加中！ キットとほぼ同じ時間で調製できます。 ■ ■ ■ ■ 感受性の高い細胞にも ■ PureLink Expi ■ Competitor Q PureLink Expi Competitor Q Media Cells 使用できる純度 <0.1 EU/µg のエンドトキシンフリープラスミド を調製できるので、初代培養細胞などでのトラ 4,600 使いやすい標識済みの 一次抗体の数 200,000 ∼ 弊社の抗体を引用した論文数 M ORE INFO 抗体検索はこちらから → www.thermofisher.com/antibodies page 08 ンスフェクションにも使えます （図 2 、3 ）。 高収量 Megaキットでは最大 5 ｍｇ、Gigaキットでは最 大 15mg のエンドトキシンフリーのプラスミド DNAが得られます。 高純度 タンパク質、RNA 、ゲノムDNAコンタミネーショ ンを極めて低いレベルに抑えます。 図 2 感受性の高い細胞へのトランスフェクション用に最適 PureLink Expi Endotoxin-Free Plasmid Purifications Kit で調製されたプラスミドDNA は、感受性の高い細胞へのトラン スフェクションに適しています。肝臓細胞の Huh7はトランスフェ クションの際、エンドトキシンに対して非常に感受性が高いこと で知られています （ Butash et al., Biotechniques, 2000 ） 。 ト ランスフェクション後、ルシフェラーゼアッセイした結果、Huh7 図 3 Q 社よりも、優れた収量 PureLink Endotoxin-Free Mega Plasmid Purificaiton Kit （紫）、および Q 社の同等キット （灰色） を用い、それぞれのプロ トコールにしたがってバックボーンの異なる 10 種 類のユニー クなハイコピーのプラスミドを抽出しました。PureLink Expi Endotoxin-Free Mega Plasmid Purification Kit を使うと 収量が高く、エンドトキシンレベルは0.1 EU/µg 以下でした. 細胞へのトランスフェクションも問題なく行えました。 製品名 サイズ 製品番号 価格 PureLink Expi Endotoxin-Free Mega Plasmid Purification Kit 4 回分 A31232 ¥44,000 PureLink Expi Endotoxin-Free Giga Plasmid Purification Kit 2 回分 A31233 ¥38,000 page 09 Technical Review 単一の血液サンプルから、血中循環がん細胞や cfDNA 、白血球（コ ントロール）の DNA 変異を解析 結果 近年のがん個別化医療の進展から、血液などの体液検体を用いて治療効果予測を行う技術の必要性が高まっています。末梢血中に極微量に存 在する血中循環がん細胞（ Circulating Tumor Cells：CTCs ）や血中循環 DNA（ cell free DNA：cfDNA ）の解析は、低侵襲かつリアルタイム で行うがん治療効果の判定や 適切な治療薬の選定ツールとして期待されています。ここでは 7.5mL の血液の単一検体から、CTC 、cfDNA 、白 血球を分画し、Ion AmpliSeq™ Cancer Hotspot Panel v2とIon PGM™ System 、Ion Reporter™ Software v4.4を使って変異 解析する方法を紹介します。白血球は生殖細胞由来の DNA 変異検出のために使い、腫瘍細胞由来の変異と比較しました。cfDNA は Applied Biosystems™ MagMAX™ Nucleic Acid Isolation Kits（製品番号： A29319 ）で回収し、CTC は Ion Torrent™ LiquidBiopsy™ Platform で回 収しました。LiquidBiopsy Platform を使えば 、血 中の CTC 存 在 率が 1cell/mL ほどでも、低 頻 度（ ≥1% ）の一 塩 基 変 異 （ SNV ）や Indelを検出可能です。 効率的で正確な CTC の回収 7.5mL の健常人全血に、MCF-7 腫瘍細胞を各細胞濃度（ 3, 9, 30, 9 0 , 3 0 0 , 9 0 0 c e l l s / m L ）で 添 加して検 体とし、L i q u i d B i o p s y Platformを用いて反復実験を行いました。その結果、装置の検出限界 である1 target cell/mL から1000 cells/mLまで、相関する高い回収 率を示しました （図 3A ）。 また、CTC からの正確な遺伝子変異検出には、CTC の回収率のみなら ■ Ion Torrent LiquidBiopsy Platform（製品番号：CVLB1-001 ） LiquidBiopsy Platformは、次世代 DNAシーケンサIon Torrent™ システムのシリーズとして、米国 において CLIA 認定を受けた Cynvenio Biosystems 社により開発されました。1 回の採血からCTC 、 cfDNA 、生殖細胞系列由来 DNAを48 時間以内に回収するワークフローに使います。短い稼働時間で 最大 4 検体を同時処理し、CTC 等の希少細胞の分離や免疫蛍光標識を自動で行います。 から得られるNGS（ next-generation sequencing ） アッセイにおけ る遺伝子変異の検出感度が相対的に高くなります。 次に遺 伝 子 変 異 検 出 の 限 界 値を推 定するために、8 種 類 の 異なる COSMIC（ Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ）SNVs を持つ 4 種類の cell line と野生型 cell line（ GM12878 ） を異なる割合 で混合しました。この 12 検体中の CTC 数と遺伝子変異検出数との相 ず、回収された細胞群におけるCTC の存在率（精製率）が重要となりま 関を調べた結果、1% の遺伝子変異頻度においてもCTC 数と遺伝子変 す。図 3Bは、198 検体中の非特異的な細胞数を示しており、それらの平 異検出数は R 2＝0.9851と高い相関を示しました （図 3C ）。以上の結果 均は約 22cells/mL であり、1 分画（ 7.5mL ）あたり165cells とごく少 から、非特異的細胞の平均存在数 165 に対して、CTC 存在数が 2-3 細 数でした。非特異的細胞の割合が 低く抑えられることで、少数の CTC 胞あれば、変異解析において解析可能なことが示されました。 NE W ! 実験 A シーケンスしました。 H H H 10 H H H H 1 0 H 500 375 250 125 0 1 10 100 1,000 Percent mutant reads Nontarget events/mL H H LiquidBiopsy™ Reagents and Consumables Kit に含まれる Digestion Bufferで DNA 抽出し、生殖細胞系列 DNAとして保存しました。 残り9.8mL の血液は遠心分離し、血漿分画からApplied Biosystems™ MagMAX™ Nucleic Acid Isolation Kitsを使って cfDNAを抽出し ました。非 血 漿 分 画に含まれる C T C は、キット付 属 の E p C A M（ a n t i – epithelial cell adhesion molecule ）抗体と結合させました。ラベルさ れた CTC は、LiquidBiopsy Platform で、Isolation Flow Cell（ IFC ） 100 H こから 2 0 0 µ L を分 取し、遠 心 後 の 白 血 球 ペレットを I o n To r r e n t ™ cytokeratin 抗体で自動免疫染色しました。IFC に捕捉された細胞はそ のまま蛍光顕微鏡で観察できます（図 2 ）。また IFC に捕捉された細胞は、 SpinElute™ tubeで回収し、Digestion Bufferで消化しました。 CTC 、cfDNA 、白血球の DNA は、それぞれ Ion AmpliSeq Cancer H o t s p o t P a n e l v 2 を 用 い て が ん 関 連 遺 伝 子 領 域 を 増 幅し 、 IonXpress™ Barcode Adapters 1–16 Kit で検体識別し、標準 的な手法でライブラリー作製後、Ion PGM System（ Ion PGM™ Sequencing 200 Kit v2, Ion 318™ Chip Kit v2 ）で 3 検体同時に C 1,000 H （ 製 品 番 号：A28171 ） を使って、10mL の血 液サンプルを安 定 化しました。こ を使って、非特異的な細胞から分離し、DAPI 、anti-CD45 、anti–pan- B H 専用試薬 Ion Torrent™ LiquidBiopsy™ Blood Collection kit Measured cell density (cells/mL) フロー 14.00 7.00 3.50 0.00 198 samples R2 = 0.9851 10.50 0.0 Spiked cell density (cells/mL) 12.5 25.0 37.5 50.0 Increasing number of target cells per library 図 3 LiquidBiopsy Platform の効率性と正確性 （A） （B） 1–1,000 cells/mL のレンジでターゲット細胞の回収率は相関性があり、検出限界は1 target cell/mLでした。 198 検体を調べた結果、非特異的細胞のキャリーオーバーは約 22 cells/mL（ 赤線）で した。このプラットフォームが安定して非特異的細胞をわずかしか含まないことを確認しました。 （C） を標的細胞として、野生型細胞株と異なる割合 4 種類のcell line（ H195, HCC1419, MCF-7, A549 ） で混合し、 この12 検体のDNA 変異を検出しました。その結果、標的細胞数と変異数は高い相関性を示し、 しかも希少変異を検出する高い感度を確認しました。上記 4 種類の標的細胞には、6 本の染色体に異 cfDNA 「スニーズフロー」 チップ MagMAX cfDNA Extraction WBC Germline Control なる8つのCOSMICのSNV （ COSM517, COSM12925, COSM763, COSM10758, COSM13281, COSM12979, COSM21943, COSM10660 ） が存在します。 免疫蛍光染色 Ion AmpliSeq library prep 強磁性グリッド構造 CTC および cfDNAにおける低頻度（ ≥1% ）の体細胞変異を検出 Lyse RBCs LiquidBiopsy Blood Collection Kit NGS Sequencing CTC LiquidBiopsy™ Platform CTC Enrichment v 4 . 4 で 遺 伝 子 変 異を解 析しました。その 1 例を表 1 に示します。コン トロール の 白 血 球（ W B C ）の D N A には 存 在しない C O S M I C 変 異 す事を確 認しました。次に図 1 のワークフローに従い 、29 検 体の末 梢 C O S M 7 6 0 を含む 2 つの体 細 胞 変 異が 検 出され、低 頻 度の変 異が 血から回 収した CTC 、cfDNA について、Ion Reporter Software 検出可能でした。 Optional verification Optional O e enumeration サンプル追跡用の 埋め込み型 RFID Invitrogen™ EVOS™ FLoid™ Cell Imaging Station 1 枚 の I o n 3 1 8 C h i p で 白 血 球 、C T C 、c f D N A の 3 種 類 のライブラ リーをシーケンスした 結 果 、それぞ れ 2 , 0 0 0 以 上 のカバレッジを示 特異的な流れを生み出す 三次元流路 QuantStudio™ 3D Digital PCR System 図 1 単一の血液検体からCTCs 、cfDNA 、生殖細胞由来 DNAを解析するトータルワークフロー LiquidBiopsy Platformは、捕捉細胞の IFCによる分離、血液検体解析、標的細胞の分離および免疫染色を自動化 することで、CTCを効率よく回収します。このプラットフォームから、蛍光顕微鏡による細胞イメージングや次世代シー ケンサ等を用いた遺伝子解析へとスムーズに移行できます。遺伝子変異解析は、Ion AmpliSeq Cancer Hotspot を作製後、1 枚のIon 318 ChipでIon PGMを用いて行え Panel v2で3 種類のライブラリー（ CTC 、cfDNA 、白血球） ます。Torrent Suite™ Software で塩基配列解析後、Ion Reporter Software v4.4を用いて検体間比較を行い、 1% 以下の希少変異を含む変異解析を行えます。 page 10 図 2 Isolation Flow Cell（ IFC ）の構造 強磁性グリッドと三層構造の流路を持ち、非特異的な細胞の回収を最小限に抑 える構造を有しています。細胞は、チャンバー内の流路において特異的細胞の みが回収され、DAPI （核内 DNA 染色） 、anti–pan-cytokeratin（ 上皮細胞マー 表 1. LiquidBiopsy Platformを使って単一検体から同定したCTC 、cfDNA 、白血球 DNAの 変 異と変異頻度 れ、ラベル化された細胞は、腫瘍細胞を含む分画が全て回収可能であり、サン 図 1に示すLiquidBiopsyワークフローに従い、3ライブラリーをIon AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2でターゲット領域を増幅し、1 枚の Ion 318 Chipでシーケンスしました。赤で示す体細胞 変異（ COSMIC 変異 COSM760を含む） は、白血球（ WBC ） には存在せず、腫瘍細胞由来の変異 プル中の白血球は変異解析や染色でのコントロールとして使用可能です。 であることが確認されました。 カー）抗体、anti-CD45（白血球マーカー）抗体で染色されます。自動で捕捉さ page 11 Oncomine Lung cfDNA Assay 血中セルフリー DNA から、 非小細胞肺がんの高頻度変異を高感度に検出 User's Voice 真 野 潤 一 氏（ 農業・食品技術総合研究機構 食品研究部門） デジタル PCRによる遺伝子組換え作物定量分析法の開発 QuantStudio 3D デジタル PCR システムで検査法の簡易化、低コスト化を実現 POINT Ion Torrent™ Oncomine™ Lung cfDNA Assayは、血漿から分離した肺腫瘍由来のセルフリー DNA（ cfDNA ）を解析する製品 です。ライブラリー構築とマルチプレックスPCR 用のプライマーセットが含まれ、cfDNA からアンプリコンライブラリーを調製します。非 小細胞肺がんで、高頻度にみられる一塩基変異（ SNVs ）や短いインデルを高感度に検出します。11 種類の遺伝子の 150 種類を超える ホットスポットに対応し、タグシーケンス技術を使って、検出限界（ LOD ）0.1%を実現します。 NE W ! を検出 ● Tag シーケンス法を採用し、サンプル中のわずかな変異（∼ 0.1% ） ● 肺がん研究用に絞り込まれた11 遺伝子 157 か所のホットスポット変異を検出 ● 高い感度と特異性で、偽陽性を最小限に抑制 換え（ GM ）食品の表示制度が定められて ム PCRを用いた定量検査が行われていま 肺がん研究用に絞り込まれた標的遺伝子と変異部位 す。一方、新しい遺伝子定量技術としてデ 標的遺伝子 ALK, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, ROS1, TP53 標的部位 （下記変異を含む） 標的遺伝子中の150か所のホットスポット EGFR ：T790M, C797S, L858R, Exon 19 del KRAS ：G12X, G13X, Q61X BRAF ：V600E ALK ：Exon 21-25 PIK3CA ：E545K, H1047R, E542K 本製品は、肺がんにおける原発性のドライバー 遺伝子変異と耐性変異にフォーカスし、cfDNA によるリキッドバイオプシー研究に最適化して います。今後のがん臨床研究や再発モニタリン グ試験開発などに利用可能です。 ジタル PCR 法が開発され、検査への応用 が期待されています」 と語るのは、農業・食 品技術総合研究機構の真野潤一氏。GM 作 物 の 定 量 検 査 の 簡 易 化 、低コスト化を 目指し、デジタル PCRを利用した GMトウ モロコシの定量検査法を開発中です。 GM 作物定量検査における リアルタイムPCR 法の課題 サンプル ており、生殖細胞変異は FFPE および血漿サンプルの両方で 50% でした。 「 GM 作物に導入されている組換え遺伝子 するので 検 量 線を作る必 要 が なく、測 定 の 簡 易 化 が 望 めます 。またリアルタイム P C R 法 に 比 べ て 精 度 が 高く、併 行 測 定 回 数を減らせるメリットもあります 」と真 野氏。 「 開 発 中 のデジタル P C R による分 析 法では、組 換え体を 3 5 S プ ロモーター （ P35S ） とNOS ターミネーター（ TNOS ） で 検 出します。対 照となる内 在 性 遺 伝 子 はトウモロコシ 由 来 のスターチシンター ゼⅡb 遺 伝 子 を 標 的として います 。反 応 系 は 、3 つ の 標 的 をマル チプレックス 検 出できるようにデ ザインしてあり （P35S および T N O S を FA M 検 出 、S SⅡb は V I C 入率が 2 倍に過大評価されます。これに対 2 TP53 -R158L 51.89% 4.32% MET -T1010I 43.87% 51.57% KRAS -G12C 34.62% 0.28% るのが現在の検査法です。このリアルタイ N/A No detection No detection ム PCR 法は汎用的な装置を使う利点があ EGFR -L858R 58.44% 7.28% りますが 、相対定量なので、サンプル測定 MET -T1010I 41.93% 48.72% 精度が高く、 しかも真値に近い値で定量 TP53 -Y220C 35.54% 1.93% 時に毎回、既知濃度の標準物質で検量線 TP53 -R158L 10.19% 1.26% を作成する必要があります。例えば 96ウェ 「その結果、デジタル PCR 法を使うと分析 と作 物がもともともつ内 在 性 遺 伝 子のコ ピー数をリアルタイム PCR で測定し、その 比率から組換え体の混入率（ % ） を算出す ルプレートを使って、組換え遺伝子と内在 cfDNA Isolation KitやIon Torrent 次世代シーケンサを使うことでリキッドバイオプシーにおける cfDNA 解析の全過程をシームレスに行えます。 サイズ 製品番号 価格 る P 3 5 S と T N O S が 同 一ウェルに配 置さ れ、組換え DNAを重複せずカウントできま す （図）。実際に GM 作物を含む試料をリア ルタイム PCR 法とデジタル PCR 法の両方 で分析したところ、後者で過大評価が少な く、真 値に近い測 定 結 果が 得られました」 と真野氏。 「 P35SとTNOSを測定対象に することで流通する GMトウモロコシ全て を一 度に検 出でき、しかもデジタル P C R で過大評価のない正確な測定ができると 期待しています。偽装表示を見逃さない検 査法があってはじめて、食品の表示が信頼 できるものになります。開発中の検査法が、 食品表示の信頼性向上に役立てばうれし い」 と話します。 検 出 ）、デ ジタル P C R 用 チップ 1 枚 の 分 2.62% 再バイオプシーが難しい肺がんにおいて、 リキッドバイオプシーによる臨床研究は注目を集めていま 製品名 「 デ ジ タル P C R 法 は 、絶 対 定 量 で 測 定 71.42% す。本アッセイと共に、血漿からcfDNAを効率よく分離するApplied Biosystems™ MagMAX™ Ion S5 System に P35S とTNOS の両 方が 存 在すると混 EGFR -L858R リキッドバイオプシー cfDNA 解析のトータルソリューションを提供 MagMAX cfDNA Isolation Kit 各領域を個別に定量するので、同一ゲノム 準 物 質のコストが かさんでしまいます」 と 1 6 ※太字の値は体細胞変異、標準フォントは生殖細胞変異を示します。 発に手 間が かかる上 、検 査の現 場でも標 血漿 5 どちらも想定どおりの値となりました。 入されています。リアルタイム PCR 法では、 FFPE 4 表）。FFPEサンプルよりも血漿サンプルの変異出現頻度は低めで一致し TNOS のどちらか、もしくはその両方が導 な品 質 管 理が 必 要になるため、検 査 法 開 変異体 3 （ FFPE ） と血中 cfDNA のがん関連遺伝子の変異解析結果を示します （右 在流通しているGMトウモロコシは、P35S 、 線を作るために必 要な標 準 物 質は、厳 密 デジタル PCRによる定量検査法 「現在、日本では法律に基づいて遺伝子組 おり、その科学的検証のためにリアルタイ 6 人 の 肺 が んサンプルにおいて、腫 瘍 組 織 のパラフィン包 埋サンプル ウェルも使います」 と真野氏。 「しかも検量 してデジタル PCR 法では、近 傍に位 置す ● 効率的なワークフローで、1 本の血液チューブから、わずか 2 日で結果を提供 cfDNA の変異検出 少ない 正 確な混 入 率 が 得られました。現 現在の検査法の課題を指摘します。 ● 1 ∼ 20 ng の cfDNAより解析可能（使用するDNA 量により検出感度は異なります） 腫瘍組織と高い同一性を示す 性遺伝子を定量する場合、検量線用に 36 析 で G M の 混 入 率 を 算 出 することが で きます。測 定は Ap p lied Biosystem s™ QuantStudio™ 3Dデジタル PCRシステ ムで行い、従来法のリアルタイムPCR 法と 比較しました」 と実験内容を説明します。 結 果 のばらつきが 小さく、しかも、偏りの 図 デジタルPCR 法によるGM 定量の模式図 デジタル PCR 法ではポジティブウェルの個数で定量する ので、P35S のみを含む組換え体サンプル 1と同じように、 P35SとTNOSの両方を含む組換え体サンプル2も、過大評 価なく真値に近い値で定量されます。 QuantStudio 3D デジタル PCR システム デジタル PCR でレアな遺伝子変異にアプローチ コンパクトサイズで使いやすいデジタルPCRシステムです。20,000 個の微細なウェルを持つチップで、 微量な遺伝子を絶対定量します。ヒトがん研究で汎用される遺伝子変異検出アッセイも続々ラインアップ中 ! Oncomine Lung cfDNA Assay 8 反応 A31149 ¥280,000 製品名 サイズ 製品番号 Tag Sequencing BC Set 1-24 24 BC × 10 ライブラリー A31830 ¥160,000 QuantStudio 3D デジタル PCR システム ProFlex PCR システム付き 1式 QS3D-PF（ 2 年保証） Tag Sequencing BC Set 25-48 24 BC × 10 ライブラリー A31847 ¥160,000 Custom TaqMan SNP Genotyping Assays for Rare Mutation Analysis 12 反応 4383547 ¥ 11,500 MagMAX cfDNA Isolation Kit 1 キット A29319 ¥80,000 450 反応 4332077 ¥ 65,900 page 12 page 13 価格 ¥ 6,400,000 PSC Dopaminergic Neuron Differentiation Kit TaqMan hPSC Scorecard Panel iPS 細胞を機能性中脳ドーパミン作動性ニューロンへ分化 ヒト多能性幹細胞の三胚葉への分化能を定量的に評価 NE W ! POINT POINT Gibco™ PSC Dopaminergic Neuron Differentiation Kit は、多能性幹細胞 Applied Biosystems™ TaqMan™ hPSC Scorecard Panelは、ヒト多能性幹細胞（ PSC ）の 多能性および三胚葉への分化能を評価するための製品であり、リアルタイム定量 PCRをベースに客 観的な評価を行います。この製品は、ハーバード大学の Alex Meissner 博士が、2011 年に Cell 誌に （ PSC ）を中脳ドーパミン作動性ニューロンへ分化誘導するためのキットです。35 日間で、 適切な生物学的関連性を維持した中脳特異的なドーパミン作動性ニューロンが得られます。 発表した論文を基に共同開発されました。 ● 従来法よりも早く、35 日でドーパミン作動性ニューロンへ分化 ●「特異化」 、 「 増殖」、 「 成熟」の 3ステップで効率よく誘導 ● 一回の実験で、細胞を特徴づける主要な 93 遺伝子の発現を定量解析 ● 増殖ステップでは前駆体細胞集団を維持でき、凍結保存可能 ● 各遺伝子のプライマー・プローブがプレートにセットされているので、誰でも簡単な操作で実施可能 ● 専用のソフトウェア （無償） を使ってリファレンスパネルと比較分析し、結果をスコアリングで表示 ● スコアリング結果は直感的で分かりやすいグラフ、テーブル、 レポートとして出力 多能性幹細胞から、3 ステップ（ 35 日）でドーパミン作動性ニューロンへ 」増殖（ 11-20日）」 Gibco™ Essential 8™ 培地で培養した多能性幹細胞を、PSC Dopaminergic Neuron Differentiation Kitで「特異化（ 0-10日）「 後、 「 成熟（ 21-35 日）」 させることで、中脳特異的ドーパミン作動性ニューロンが得られます。 「 増殖」 ステップの中脳底板由来の前駆細胞は、10 継代まで 増殖させることができ、保存も可能です。 A B C 細胞の多能性と分化能をわかりやすく表示 未分化リファレンススタンダードと比較してスコア化 各サンプルの多能性と分化能を、 「 自己増殖性（ self-renewal ）」、内胚葉、 よく研究されたES や iPS 細胞株を未分化のリファレンススタンダードと 中胚葉、外胚葉の4つのカテゴリーで、スコア化して表示します。 して、各カテゴリーの遺伝子発現量を相対的にスコア化します。 ¨ EB1_Proto3_130430.eds ¨ H9-EB-Day7 ¨ H9-ESC-...50-Day0 Selfrenewal Selfrenewal Ectoderm Mesoderm Endoderm Ectoderm Mesoderm Endoderm 図 典型的な成熟ドーパミン作動性ニューロンの染色画像 キットを使って、 「 特異化」 「 増殖」 後の細胞を、成熟用培地で14日間 「成熟」 させ、Invitrogen™ Human Dopaminergic Neuron Immunocytochemistry キット （製品番号：A29515 ） で染色しました。 と抗 FOXA2 抗体 （赤） 染色のマージ画像 A：抗 TH 抗体（緑） B: 抗 FOXA2 抗体（赤）、および Invitrogen™ NucBlue™ 試薬（青）で核染色 C: 抗 TH 抗体（緑） 製品名 サイズ 製品番号 PSC Dopaminergic Neuron Differentiation Kit 1 キット A3147701 Human Dopaminergic Neuron Immunocytochemistry Kit 40 反応分 A29515 価格 図 1 H9 ES 細胞（左） とH9 胚様体 7日目（右）の解析結果 図 2 相対的な遺伝子発現量を見やすく表示 各サンプル毎に、多能性遺伝子や各種胚葉遺伝子マーカーに対する発現量を未分化リファレンスス ES 細胞（左）では自己増殖性のスコアのみ、プラスと表示され、多能性を保持していることがわか ります。これに対して、分化 7 日目の細胞（右） では三胚葉ともプラスとなり、分化が進んだことが分 タンダードと比較した倍差で色分けして表示します。ここでは4 種類の細胞について、多能性と三胚 かります。 葉性遺伝子マーカーの発現を表示しています。 ¥304,000 ¥86,400 解析結果のエクスポートも簡単 汎用的なリアルタイム PCRシステムに対応 バリデーション結果のグラフ、表、 レポートをエクスポートできます。目 現在研究室で使用している、幅広い Applied Biosystems のリアルタ 的に応じて、さまざまなフォーマットで表示できます。 イムPCRシステム （ 7 機種） でお使いいただけます。 5 4 Algorithm score 3 Real-Time StepOnePlus PCR System 2 1 0 7900HT Fast Real-Time PCR System -1 QuantStudio 12K Flex -2 ViiA 7 StepOnePlus 7900HT -3 -4 Self-renewal 24 Hours of Stem Cellsイベントのご案内 「 24 Hours of Stem Cells 」 は、世界中の幹細胞研究者が参加するイベントです。 Webで行うバーチャルイベントであり、多くの著名な幹細胞研究者が講演します。事前登録して、ぜひご参加ください。 開催日時 ： 2016 年 11 月 17 日 参加方法 ： 事前登録制 イベント詳細と事前登録はこちらから： www.thermofisher.com/24hours H9-ESC-...50-Day0 Ectoderm H9-EB-Day2 Mesoderm H9-EB-Day4 Endoderm H9-EB-Day7 図 3 解析結果の表示 H9 ES 細胞（ Day0 ）、および H9 胚様体（ Day2 、Day4 、Day7 ）の解析結果を示します。グレーのボッ QuantStudio 7 7500 Fast 製品名 サイズ 製品番号 価格 TaqMan hPSC Scorecard Kit, ※ Fast 96-Well 2 × 96-well A15871 ¥96,000 TaqMan hPSC Scorecard Panel, Fast 96-Well 2 × 96-well A15876 ¥70,500 TaqMan hPSC Scorecard Kit, ※ 384-Well 1 × 384-well A15872 ¥89,000 TaqMan hPSC Scorecard Panel, 384-Well 1 × 384-well A15870 ¥50,600 ※キット品にはアッセイプレートの他にマスターミックスが付属しています。 page 14 QuantStudio 6 クスは未分化リファレンススタンダード。 page 15 EVOS FL Auto 2 Imaging System もっと、イメージングを楽しもう! User's Voice 藤 生 克 仁 氏（ 東京大学医学部附属病院循環器内科・特任助教、JSTさきがけ併任） 心臓の性能を決める臓器間・細胞間コミュニケーション解明へ タフで操作が楽な EVOS FL Auto Cell Imaging System で気軽に経過観察 デモ POINT 受付中 ! 新登場の Invitrogen™ EVOS™ FL Auto 2 Imaging Systemは、生細胞イメージン グ、タイムラプス、画像タイリング、Z-スタック撮影をはじめとした細胞ベースのイメージン マクロファージの動員に関与することがわ その性 能に関わっています」 と、誰もが 気 かりました。 になる内 容を口にする藤 生 氏 。心 筋 細 胞 そこで 次に心 筋 細 胞とマクロファージ の は隣の細胞とギャップジャンクション（孔） 関係を探ることに。心臓を構成する細胞の を作ります。内膜がマイナスからプラスに うち、マクロファージはたった 1% ほど。不 なってまたマイナスに戻る脱分極を起こす 要なものを除くただの「ゴミ箱 」と考えら と、細胞は収縮します。脱分極は、孔を介し れていました。 「 K L F 5 を発 現する心 臓 の て隣へ伝わっていき、心臓全体に伝わると 実 質 細 胞にマクロファージがどんな影 響 1 回の拍動になります。拍動にかかる時間 を及ぼすか、共培養で調べることにしまし は、脱分極が伝わる速さ、細胞間の孔の数 た。vivo に近い環境で細胞間コミュニケー に依存します。 循 環 器 内 科 医として 臨 床 に 携 わる 傍ら、 ションを観察するために、胎仔マウスの心 組織学中心の循環器系では珍しい分子生 臓 の 細 胞をバラバラにしてまるまる初 代 物学的な手法で血管研究を進めてきた東 培養しました。ぴくぴくと動く心筋細胞、そ 京 大 学 医 学 部の藤 生 克 仁 氏 。心 臓のスト れをとりまく線 維 芽 細 胞や血 管 内 皮 細 胞 、 レスに応 答する転 写 因 子 KLF5 を組 織 特 そして小さなマクロファージ が 培 養 皿 上 異的にノックアウトし、心臓機能を支える で 共 存する状 況 です。ここから薬 剤 でマ 臓器間コミュニケーションの姿を明らかに クロファージだけを除くと、心筋細胞が 肥 しています。さらに、これまでは見 向きも 大せず、強い収縮力が失われてしまいまし されなかったマクロファージと心 筋 細 胞 た」 と、そのマクロファージの 重 要 性を指 との細胞間コミュニケーションにも着目し、 摘します。 「このような実験は、どんなタイ 寿命を左右するほど重要な機能を生む分 ミングで何が起きるかわからないので、最 子機構に迫っています。 初からタイムコースのスケールを予想でき ません。そこで共 焦 点 顕 微 鏡で本 格 的に 臓器間の連携を 細胞の共培養から探る 「心筋梗塞に繋がる最大のリスクは、腎臓 す。腎臓が正常に機能することで、心臓が 安定すると言われています。臓器を連携さ せる分子機構に、心不全・心筋梗塞の治療 や予 防の可 能 性を感じました」 と、藤 生 氏 は研究の発端を振り返ります。さまざまな 仮説を立て検討するうちに、血管研究で注 ターから取り出し観 察し、適したタイムレ ンジを探りました。細かな設 定なしで 、や りたい 実 験をすぐに開 始できる点が 便 利 ですね」 と、ストレスフリーで進めた予備実 験を振り返ります。 心筋細胞間の収縮伝達を 蛍光観察で追う ● スキャン速度とオートフォーカス機能を強化し、スループットとデータ品質を向上 ● 調光可能な高輝度 LED 光源を採用し、精度の高い定量性を実現 ● 光路設計を改良、カメラ選択機能を追加し、高画質化 製品名 EVOS FL Auto 2 一式（例） た。具 体 的には細 胞 膜を通 過しない 蛍 光 分子を培養液に加え、細胞をひっかき、傷 口から細 胞 内に入れ、蛍 光 領 域が 広がる 仕様 参考価格 対物レンズ：4×Ph, 10×Fl, 20×Fl, 40×Fl メカニカルXY ステージ：電動 ライトキューブ：GFP, RFP, DAPI カメラ：カラー & モノクロ 切り替え可能 製品名 サイズ 製品番号 EVOS Onstage Incubator 1式 AMC1000 ¥7,500,000 価格 ¥1,750,000 速さで、細胞間の孔の数を推定します。マ クロファージを 除くと、この 速 さが 大 幅 に落ちたのです」。その様 子も EVOS FL M ORE INFO デモのお申込みはこちらから → www.thermofisher.com/evosflauto2 Auto Cell Imaging System が確実に捉 えました。 「傷口の場所を記憶し自動撮影 する機 能が あるので、1 ウェルあたり数か 所の傷を短時間で解析でき、負担なくでき 言い得て妙 ! ました。大学院生が初めて画像を撮りまし たが、操作に迷うこともなかった様です。レ 蛍光観察ことわざコンテスト ンズの作 動 距 離が 長く、オートフォーカス などの支 援 機 能が あるので、経 験の有 無 にかかわらず、品質の良い写真が撮れると いう安心感がありますね。またシンプルな 構造なので故障が 少ない点も助かってい ます」 とコメントします。 大好評の Molecular Probes 蛍光教室の募集型企画。今度 は蛍光観察にまつわる 「ことわざ」 コンテストを開催していま す。優秀作品投稿者には豪華賞品をプレゼント! 奮ってご参 加ください。 心筋細胞の活性化因子やその受容体も見 つかってきました。薬剤への応用に期待が ［例］二階から封入剤 募ります。今後は、マクロファージ内の分子 メカニズムに迫る予定と、展望も明白。手 胞でも発現が高いことに気づきました。そ 「心臓の性能が私たちの寿命を決めていま 足として軽やかに動く顕微鏡とともに、拍 の発現量を低下させると、炎症と線維化の す。心臓内の血液の何割を押し出せるかと 動のように着実に、心臓の性能を支える分 ステップが 解離し、KLF5 が 炎症に関わる いう収縮力や、1 回の拍動にかかる時間が 子機構を明らかにしていきます。 蛍光顕微鏡を含め、EVOS シリーズは全部で 5 機種。 どれも使いやすい、オールインワン顕微鏡システムです。 製品詳細やデモのご依頼はこちらから → www.thermofisher.com/EVOS page 16 新を起こす最新モデル、まずはデモで体験してみませんか ? ▶ 封入作業が思うようにいかず、もどかしいさま。 顕 微 鏡 の 前 に も 三 年 …… 目される転写因子 KLF5 が、腎臓の実質細 EVOS FL Auto Cell Imaging System で 、数 時 間 おきに 培 養 皿をインキュベ ー 数をscrape-loading test で評価しまし 追究し、データ分析をより重点的に行うことができます。さらなる進化でイメージングに革 け の機能障害、次に高血圧、糖尿病と続きま タイムラプス撮影を行う前に、使いやすい 「心筋細胞を6ウェルの培養皿に撒き、孔の グ手順を簡略化するベンチトップ型蛍光顕微鏡です。従来の機器から、さらに使いやすさを 募集期間 ： 2016 年 9 月12 日 （月）∼ 11 月30 日 （水）投稿分まで 詳しくはこちらから www.thermofisher.com/jp-fluore-kotowaza page 17 い つ 行く? どうする ? 海 外 留 学 Technical Review Vero 細胞数を Countess Ⅱ FL 自動セルカウンターで Title 子育て中でも 100% の力で Number 19 研究に励んだ留学生活 簡単・正確にカウント Name 幸 谷 愛 氏 （東海大学総合医学研究所教授） がんを治したい。その思いで一度は血液内科医として臨床現場 「夫は東京で単身赴任中。独りで子育てしながらの研究生活に 明のつかない現象で苦しむ患者さんを前に、もどかしさから基 なると伝えたところ、Harvey は『 No Problem! 』と応え、とても 礎研究へと転向します。留学先で得た、子育て中の女性研究者 さまざまな実験やワクチン製造に広く使用されるVero 細胞の数を、 仲間との絆やマイクロ RNA 研究のノウハウを活かし、現在、感 Invitrogen™ Countess™ Ⅱ FL 自動セルカウンターで計測しました。 染 症が 引き金となるが ん化の分 子 機 構を解き明かしています。 オートフォーカス機能で再現性を高め、 そんな幸谷氏に日米両国で受けた支援についても伺いました。 ゲーティング機能でデブリを排除することで正確に細胞数を計測できました。 ルの腎臓から千葉大学医学部細菌学教 室の川 喜 田 愛 郎 教 授 、安 村 美 博 博 士ら によって樹 立されました。ワクチン製 造 用途に広く使用され、細胞の安全性はす でに多くの機関で検証されています。近 保育園料を負担したりと研究所あげての支援で、みな 100% の 実験と結果 医学部で、幸谷氏を夢中にしたのは、臨床系の講義ではなく、本 Vero 細胞懸濁液と0.4% の Trypan Blue Stain 溶液を1:1 で混合し、サンプル 10 µLを Chamber Slideに添加して測定しました。Countess II FL 自動セルカウンターのオート し血 液 内 科に進むものの、現 象を説 明しきれないことにもどか フォーカス機能で個々の細胞が自動認識され、 トリパンブルー排除法により生死細胞が区 別してカウントされました （図 1 ）。 さらに、細胞サイズのヒストグラムを呼び出し、内蔵されているゲーティング機能で、細胞 として認識されるサイズを5 µm 以上に設定しました。これによりデブリと推定される物体 を効率良く除去し、正確な細胞カウントが行えました （図 2 ）。 庶 佑 氏や中 西 重 忠 氏の基 礎 系の講 義でした。が ん治 療を目指 しさを感じます。そんな折、研修先の病院で、不可解な経過をた どる症例に対して立てた仮説が 正しいことが 判明。自ら試験管 を振って臨床の不思議を解明したい。その意志を自覚しました。 緊急入院中の研究をつないだ恩師、本庶氏 臨 床 系 大 学 院で学 位 取 得 後に入った本 庶 研では、が ん発 症 後 の対処ではなく、前がん病変からがんへの移行を食い止める重 年、パンデミックへの柔軟な対応のため 要性を学びました。本来は免疫グロブリンの多様性を生む AID に注目を集めています。 遺 伝 子が 暴 走すると、他の遺 伝 子にも変 異を入れます。この暴 走を防ぐのです。黒 幕は RNAと睨んで実 験を繰り返すうち、そ の幅 広い機 能に惹かれました。 「 妊 娠 中も深 夜まで実 験にのめ り込んだ結 果 、妊 娠 高 血 圧 症になり緊 急 入 院 。6 週 間 後 、恐る 恐るラボに顔を出すと、本 庶 先 生の指 示で、技 官さんが 実 験を 進めていました。理解ある温かい先生です」 と微笑みます。研究 を重ね、成 果を出した 2005 年 4 月、米 国ボストンに研 究 室を構 図 1 トリパンブルー染色したVero 細胞懸濁液を Countess II FLで測定した画像 Countess Ⅱ FL 自動セルカウンター 優秀な人が 濃縮されている。ラボの研究水準を高く保つために、 の戦略を語ったそうです。 「 学会参加のために保育士を雇ったり、 柳田邦男氏の「ガン回廊の朝」に刺激を受け入学した京都大学 Vero 細胞は、1962 年にアフリカミドリザ 安心しました」。ラボの半数以上が 女性で、その 7 割が 子育て中。 「育児中の女性はラボから敬遠されがち。だからこそ、そこには そういう女性を積極的に採用している」 とLodish 氏は人材登用 臨床から研究へ Vero 細胞とは ? 徹底した支援で育てた PI は 70 人 に立ち、骨髄移植などの治療に明け暮れた幸谷愛氏。しかし、説 図 2 Vero 細胞のヒストグラム 総細胞数および生細胞と死細胞の割合が、右画面に表示されていま 生細胞、死細胞はそれぞれ緑か赤の丸で囲まれて ヒストグラムの左側の白抜けしている分 す。また5µm 以下の細胞は、 います。 布であり、 カウントから除去されます。 える、マイクロ RNA 研究の先駆者である Harvey Lodish 氏の 元へ飛び立ちました。 力で働いていました。子育て中の女性研究者は今や全員 PIとな り、共同研究や試料の提供など助け合います」 と幸谷氏は同志 の絆を語ります。もちろん子育て中の男性にも理解のある、働き やすい 環 境でした。 「 H a r v e y は、各 研 究 者が 、ひいてはラボ全 体が 、最 大 限の力を発 揮できる方 法を見 抜いていました。ノー ベル賞受賞者も含め、育てた PI は 70 人に上ります」 と恩師への 敬意を語ります。 がんを引き起こすウイルスに迫る 留学後、東大医科学研究所を経て、東海大学で PI 職を得ました。 同大で開発された、特定の臓器をヒトの細胞に入れ替えた「ヒト 化マウス」 を用い、EB ウイルス感染リンパ 腫がテーマです。 「東 アジアの 9 9 % の人が E B ウイルスに感 染しています。リンパ 腫 になると欧米の治療法では予後が 悪い。感染を前提に、アジア に適した治療法が 必要なはず」。2015 年、感染を引き金に激増 する小分子 RNA を同定。 「ウイルスが 感染するリンパ 細胞は少 なく、潜 伏 期には症 状が ありません。が ん化して全 身に小 分 子 RNA がばらまかれると、あちこちでがんを誘導する仕組みが 見 えてきました」 と、感染とがんの関係性に切り込んでいます。 支援制度をうまく使おう 幸 谷 氏が 、恩 恵を受けた制 度は数 多くあります。育 休で復 帰し た学 術 振 興 会 特 別 研 究 員 制 度 、母 子での留 学を支えた学 術 振 興会の出産育児復帰支援特別研究員制度、医科学研究所内で ただ一 人 採 択された、育 児 中の女 性 研 究 者に技 官を雇 用する まと め 制 度など、どれも積 極 的に利 用してきました。 「 活 用して、価 値 ある制度であることを示さないと、制度は維持されません。先日、 Countess II FL 自動セルカウンターはこれまでの血球計算版を用いた測定法に取って 私が 採 用されている AMED PRIMEという研 究 制 度において、 代わり、作業効率を大幅に改善させます。また測定数値だけでなく、撮映した画像を外部メ 子育てや介護中の女性を雇うと研究費が補助されるという新し モリーに保存できるので、ラボのデータ管理にも重宝します。IQ/OQ/IPV にも対応してい ます。さらにオプションでライトキューブ（図 3 ） を搭載すると、GFP や RFP などの蛍光測定 も可能です。ウイルスワクチン生産に使用されるMRC-5 細胞も同じように計測できます。 図 3 ライトキューブ 日々の細胞カウント軽減のために、Countess II FL 自動セルカウンターをご活用ください。 ライトキューブをオプションとして提供しています。 い制 度が 発 足しました。ラボへの明 確なメリットもあり、女 性 研 究者を募集中です」。Lodish 氏の人育て術は受け継がれている DAPI 、GFP 、RFPなど、7 種類の蛍光測定に対応する ようです。 2003 年京都大学医学研究科博士課程修了。学術振興会特別研究員として同大同研究科 で 3 年間勤務後、渡米。2006 年から2008 年まで Whitehead Institute for Biomedical ラボ登山の様子。この時、Lodish 氏（真ん中） は、 “ You are the youngest climber in our M ORE INFO lab!"と言って幸谷氏（左から3 人目）の息子さんに登山記念バッチをプレゼントしました。 Research Harvey F. Lodish研究室にて博士研究員。2011年より現職。 幸谷研究室ホームページ：www.k-lab.jp 製品の詳細情報やデモのお申込みはこちらから → www.thermofisher.com/countess page 18 page 19 INFORMATION 2016 / October / No.37 川 柳 in the ラボ vol. 4 配 布 中 ! 笑えるイラスト満載の冊子を作成しました。 今後、弊社が出展する各種学会等で配布します。 ご参加の折には、ぜひ展示ブースにお立ち寄りください ! 腹筋は 応募総数 275 件、応募川柳数 981 句から約 100 句を厳選し、 漫画家でイラストレーターの服部元信氏の ない け ど 手 に は 研究者川柳「川柳 in the ラボ」。 ピペッ ト 筋 ︵ 作・き ぬちゃん ︶ ついに今年で 4 回目を迎えた 最優秀人気作品賞 「腹筋は ないけど手には ピペット筋」 （作 ：きぬちゃん） 優秀人気作品賞 「クリスパー ゲノム切れずに 教授キレ」 （作 ： 無本鎖切断） 「自分にも ストレス耐性 付与したい」 （作 ： ふえるワカメ） NEXT 10 月号はいかがでしたか ? 抽選で 特集は、 「 次世代クリニカルシーケンスの実現」 を目指し、全国規模のがんゲノムスクリーニングプロジェクトの立ち上げに 関わった、がん研究センターの土原一哉氏へのインタビュー。また、臨床研究で注目されるリキッドバイオプシーで得た血 液中の遺伝子変異解析に便利な製品群もご紹介しています。ユーザーボイスはデジタル PCR で GM 作物の検出法を開発 中の真野潤一氏やダイレクトリプログラミング研究を推進中の鈴木貴紘氏など。人気の留学記は、子供を連れた留学でも 100% 研究に打ち込めたと語る東海大学の幸谷愛氏です。 感想やコメントをぜひお寄せください ! 読者アンケートで、5 名様にQuoカード （ 2000 円分） が当たります。 アンケートはこちらから → www.surveymonkey.com/s/NEXT37 photographs: hisaya hirose（ p.02-03 ） art direction & design: opportune design inc. NEXT バックナンバーは、こちらから → www.thermofisher.com/NEXT ●記載価格は2016年 10月現在の価格です。●消費税は含まれていません。 ●価格は予告なしに変更する場合がありますのであらかじ めご了承ください。●最新の価格および在庫数は、弊社ホームページ右上の"製品価格と在庫の検索"でご確認いただけます。●研究 用にのみ使用できます。●診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。●記載の社名および製品名は、弊社または各社の商 標または登録商標です。●販売条件はこちらをご覧ください。www.thermofisher.com/jp-tc For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2016 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular System, Inc. Printed in Japan. LSG010-A1609HS サーモフィッシャーサイエンティフィック ライフテクノロジーズジャパン株式会社 本社：〒108-0023 東京都港区芝浦 4-2-8 ウェブサイト：www.thermofisher.com TEL.03（ 6832 ）9300 FAX.03（ 6832 ）9580 販売店 5 名様に Quoカードを プレゼント!
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