目次 2007年8月 ¾ 分離の仕組み と 分析事例 (1)ノンポーラス充てん材によるイオン交換 (2)GPCクリーンアップ (3)ポリマー系逆相カラムとODS (4)超高分子から数千以下のサイズ分離 (5)マルチモード (6)スケールアップの考え方 知っておきたい LC分析のノウハウ ¾ 製品一覧 昭和電工株式会社 http://www.autoprep.jp 1 分離の仕組み(1) 2 事例:ノンポーラスイオン交換 x x x x 分子サイズ ノンポーラス粒子 を利用した分離 分析対象物質 ノンポーラス 2.5μm *高速分析 *高分解能 *ただし 分取に不適 大きな細孔 小さな細孔 x ポーラス 8μm 細孔 カラム : Shodex® DEAE-825 ( 8mmI.D.×75mm ) 溶離液 :グラジエント溶出 1mL/min Shodex® DEAE-420N ( 4.6mmI.D.×35mm ) グラジエント溶出 1.5mL/min 3 分離の仕組み(2-1) 4 分離の仕組み(2-2) • 大 ↑ 排除限界 分 分子量 子 量 ↓ 小 サイズ分離が 起こる範囲 • 充てん材との 相互作用で 分離が起こる • 溶出容量 充てん材 間の隙間 細孔内部 の容積 充てん材 の骨格 ゲルろ過クロマトグラフィー GFC Gel Filtration Chromatography ゲル浸透クロマトグラフィー GPC Gel Permeation Chromatography サイズ排除クロマトグラフィー SEC Size Exclusion Chromatography 排除限界 分子量 Total permeation 5 6 事例:GPCクリーンアップ-1 事例:ポリマー分析 牛脂 カラム : オレイン酸(282)、パルミチン酸(256) リノール酸(280) リノレン酸(278) アセトン Shodex® GS-310 7G ( 旧カラム) ( 7.6mmI.D.×500mm ) クロロホルム/メタノール混液 0.5mL/min 溶離液 : 流 量: 残留農薬用GPCクリーンアップ Shodex® EV-G + EV-2000 カラム内容積=125.6mL 0 0 5 25 10 50 サイズ分離 CHCl3/CH3OH=80/20の時 最も相互作用の少ない GPC分離パターンを示す 7 15 75 *脂質は GPC的に分離 トリシクラゾール アクリナトリン 20 100 25 125 30 150 35 min 175 mL カラム : 分配吸着 溶離液 : 流 量: Shodex CLNpak EV-G AC + EV-2000 AC ( 20mmI.D.×100mm + 20mmI.D.×300mm) アセトン/シクロヘキサン (1/4)混液 5mL/min 8 事例:GPCクリーンアップ-2 アクリナトリン COO CHOOC S C CF3 H トリシクラゾール 牛脂 CN N N アセトン CH 3 60 | 70 N O HH Elution volume range (mL) CH 3 MW 541 LogKow 5.26 アクリナトリン (5mg/L) MW 189 LogKow 1.70 トリシクラゾール (5mg/L) 10 15 20 25 30 35 min 0 5 0 25 50 75 100 125 150 175 mL *農薬の分画の分離は? 9 事例:GPCクリーンアップ-3 Elution volume range (mL) 60 | 70 以前の分画範囲 キノメチオネート 0 5 トリシクラゾール 10 15 min 20 25 30 35 *農薬の種類毎に サイズ順に溶出されている organochlorine アクリナトリン N-contg. フルバリネート fluvalinate chinomethionat cyhalothrin flucythrinate cypermethrin cyfluthrin deltamethrin fenvalerate terbufos diazinon prothiofos pirimiphos methyl chlorpyrifos isofenphos malathion parathion phosalone phenthoate thiometon EPN fenitrothion fenthion dimethoate acephate methamidophos pretilachlor pyridaben chlorpropham propanil bitertanol fenobucarb mepronil isoprocarb aldicarb ethiofencarb iprodione bendiocarb imibenconazole pirimicarb carbaryl mefenacet dicofol vinclozolin aldrin β-HCH α-HCH pp'-DDT pp'-DDE procymidone endosulfan methoxychlor dieldrin endrin captafol captan TPN fthalide Note: 16 80 | 90 90 | 100 100 | 110 110 | 120 120 | 130 130 | 140 mL 84 100 100 64 28 18 4 2 フ ル バ リ ネ | ト 16 25 36 72 82 100 100 96 100 98 96 80 33 29 82 75 100 100 98 96 90 72 100 100 96 86 80 72 49 22 17 3 2 4 20 67 71 100 98 95 61 7 2 4 10 28 100 100 100 96 60 53 4 14 20 28 51 78 83 42 95 89 2 5 39 93 98 95 94 75 4 40 47 61 55 5 11 100 48 2 5 6 25 100 35 97 キ ノ メ チ オ ネ | ト 4 3 52 100 90 The total of each pesticide eluted is taken as 100%. organochlorine 現行の分画範囲 organophosphorus pyrethroid アクリナトリンの溶出時間から トリシクラゾールの溶出終了までを分取 70 | 80 pyrethroid CH 3 organophosphorus H C=C N-contg. H CF3 10 10 fluvalinate chinomethionat cyhalothrin flucythrinate cypermethrin cyfluthrin deltamethrin fenvalerate terbufos diazinon prothiofos pirimiphos methyl chlorpyrifos isofenphos malathion parathion phosalone phenthoate thiometon EPN fenitrothion fenthion dimethoate acephate methamidophos pretilachlor pyridaben chlorpropham propanil bitertanol fenobucarb mepronil isoprocarb aldicarb ethiofencarb iprodione bendiocarb imibenconazole pirimicarb carbaryl mefenacet dicofol vinclozolin aldrin β-HCH α-HCH pp'-DDT pp'-DDE procymidone endosulfan methoxychlor dieldrin endrin captafol captan TPN fthalide Note: 16 70 | 80 80 | 90 90 | 100 100 | 110 110 | 120 120 | 130 130 | 140 mL 84 100 100 64 28 18 4 2 フ ル バ リ ネ | ト 16 25 36 72 82 100 100 96 100 98 96 80 33 29 82 75 100 100 98 96 90 72 100 100 96 86 80 72 49 22 17 3 2 4 20 67 71 100 98 95 61 7 2 4 10 28 100 100 100 96 60 53 4 14 20 28 51 78 83 42 95 89 2 5 39 93 98 95 94 75 4 40 47 61 55 5 11 100 48 2 5 6 25 100 35 97 キ ノ メ チ オ ネ | ト 4 3 52 100 90 The total of each pesticide eluted is taken as 100%. Column : Shodex CLNpak EV-G + EV-2000 20mm x 100mm + 20mm x 300mm Eluent : Acetone / Cyclohexane = 2 / 8 Flow rate : 4 mL/min Column temp.: 40℃ 10 GPCクリーンアップ → GC/MS プロトコル 塩素系農薬の測定例 畜水産物中のGC/MSによる農薬等の一斉試験法 (概要) 肝臓・腎臓 筋肉・脂肪・魚介類 乳・卵 アセトン・n-ヘキサン(1:2) はちみつ アバンダンス 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 アセトニトリル 抽出 塩析 塩素系農薬標準溶液 * 1 2 精製 画分Ⅰ 5 6 16 19 20 10 12 15 11 14 17 18 21 9 13 7 8 12.00 GPC 34 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 22 28.00 23 30.00 min GPC 画分Ⅱ 農薬画分 (※1) アバンダンス 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 農薬画分 (※1) (※1) (※2) GPCクリーンアップ後コーン油マトリックスサンプル * パルミチン酸 12.00 14.00 16.00 18.00 リノール酸 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 min 1:α-BHC,2:Hexachlorobenzene,3:β-BHC,4:γ-BHC,5:δ-BHC,6:Heptachlor,7:Aldrin, 8:Heptachlor epoxide,9:trans-Chlordane,10:o,p’-DDE,11:α-Endosulfan,12:cis-Chlordane, 試験溶液 13:trans-Nonachlor,14:Dieldrin,15:p,p’-DDE,16:o,p’-DDD,17:Endrin,18:β-Endsulfan,19:p,p’-DDD, 20:o,p’-DDT,21:Endosulfan sulfate,22:p,p’-DDT,23:Mirex ※1:エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムによる精製 ※2:シリカゲルミニカラムによる精製 食安発第1129002号(平成17年11月29日)の第2章 「GC/MSによる農薬等の一斉試験法 (畜水産物)」11 GC/MS測定条件 *ピーク:システムバックグラウンド : Agilent GC/MS 6890N/5975 : HP-5MS 30mx0.25mmx0.25μm 12 アジレントテクノロジー社ご提供 クロロフィル除去効果 GPCクリーンアップ 40 脂質除去効果 60 ② ③ フルバリネート 254nm 400000 300000 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 min ① 500000 400000 GPCクリーンアップによって マトリックス成分が減少 300000 ② 5g / 5mL EV-2000によるGPCクリーンアップ後 コーン油マトリックスサンプル アバンダンス ③ 440nm 600nm 20g / 5mL 200000 440nm 600nm 100000 0 0 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 25 50 75 100 125mL クリーンアップ後の農薬分画を 濃縮 440nm 600nm 0 クリーンアップにより捨てる部 分 100000 クリーンアップ前のほうれん草中抽出液 ほうれん草 2.5g /5mL 200000 40.00 min ※いずれもスプリット(5:1)、1μL注入 13 アジレントテクノロジー社ご提供 GPCクリーンアップ → LC/ LC/MS/ MS/MS クロロフィル 除去効果 ① 130mL キノメチオネート コーン油 GPCクリーンアップ前コーン油マトリックスサンプル アバンダンス 500000 使用機器 カラム カラム :CLNpak EV-G+EV-2000 溶離液 :アセトン/シクロヘキサン=2/8 流 量 :5mL/min 14 分離の仕組み(3) EV-2000を用いたGPCクリーンアップ処理サンプルを Agilent 6410 LC/MS/MSにてMRM測定した例です。 シリカ基材 ポリマー系基材 従来法の固相抽出カートリッジカラムを使用せず, OH l C18 クロロフィルの除去が可能なことがわかります。 C18 GPCクリーンアップ後クロロフィルマトリックスサンプル OH l OH l OH l x103 1. 2. 3. 4. 5. 1 4.4 3.8 Thiabendazole Imidacloprid Carbofuran Indoxacarb Milbemectin A4 0.8 Milbemectin A4 シリカ 0.4 ーOH x105 5.0 ーOH C18 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 3.2 3 ーOH 4 2.6 2 2.0 PSゲル 1.4 PVAゲル 0.8 5 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 Retention Time (min) 25 27 29 31 15 アジレントテクノロジー社ご提供 シリカ 充てん材構造が異なる 16 事例:分配吸着特性の違い 事例:下痢性貝毒の分析 ポリマー充てん材なら、グラジエントが不要な場合も 構造の大きく異なる貝毒も 短時間に溶出が可能 オカダ酸 SIM: 803.5 PTX6 (ペクテノトキシン6) SIM: 887.5 PTX2 (ペクテノトキシン2) SIM: 903.5 DTX1 (ジノフィシストキシン1) SIM: 817.5 DTX3 (ジノフィシストキシ ン3) SIM: 1055.7 1.ベンゼン 2.トルエン 3.エチルベンゼン 4.n-プロピルベンゼン 5.ナフタレン カラム: Shodex® DE-413 (4.6x150mm) 充てん材: ポリヒドロキシメタクリレート 溶離液: CH3CN:H2O=50:50 流速: 1mL/min YTX (イェッソトキン) SIM: 1141.5 独立行政法人 水産総合研究センター 鈴木 敏之先生ご提供 大← 粒子径 →小 大 ↑ 分 子 量 ↓ 小 ハードゲル ソフトゲル ノンポーラスな ハードゲル 小← ソフトゲル 前処理 シリカ 基材 HPLC 細孔 細孔分布 の違い 直線範囲 t 小さな細孔がないため の直線範囲が狭い → 大 t 超高分子から低分子 までのGPC が可能 までのGPCが可能 19 超高分子も 楽々分離 106 106 105 105 104 104 103 102 タンパク質のSECに 適した細孔サイズ 20 分離の仕組み(5) マルチモード 事例:細孔分布に合わせて シリカ基材 ポリマー系基材 107 18 分離の仕組み(4-2) シリカ基材 ポリマー系基材 細孔分布の違い ハードゲル カラム: Shodex® DE-413 2B (2x50mm) 溶離液: CH3CN と H2Oのグラジエント 0.2mL/min 17 分離の仕組み(4-1) ポリマー系 基材 PTX1 (ペクテノトキシン1) SIM: 919.5 : 測定妨害成分 : カビ毒 測定妨害成分は充てん材に捕集 脂質、タンパク質・・・・・ 分配吸着 イオン性物質 ・・・・・・ イオン交換 色素 ・・・・・イオン交換、分配吸着 103 カビ毒は通過 KW-800シリーズ(シリカ系) SB-800シリーズ(ポリヒドロキシメタクリレート) 21 22 事例:アフラトキシンの機器分析 事例:香辛料のイムノクロマト分析 Autoprep® MFMF-Sは、70%メタノール中のアフラ 食監発第0326001号 抽出 抽出溶媒 90%アセトニトリル 多機能カートリッジによる クリーンアップ 濃縮 ② ①の抽出液の0.6mLを MF-Sに自然流下させる (コンディショニングなし) 最初の1mLをHPLC測定へ 多機能カートリッジ 多機能カートリッジ 機器分析での妨害成分 *蛍光物質 *アフラトキシンと溶出が重なる成分 バイオアッセイでの妨害成分 *抗アフラトキシン抗体と反応する成分 and/or 抗原抗体反応を阻害する成分 *ELISAにおける発色反応を阻害する 成分 P CH2 N HCH 2 COOH OH 標品の添加回収率(%) B1 100 B2 99 G1 85 G2 87 添加量 B1、G1: 各2ppb B2、G2: 各0.7ppb 24 (2) 抽出溶液の極性が異なる 90%アセトニトリル抽出 ↓ 機器分析 アセトニトリル% in 水 0 逆相分析において、 同じk’が得られる 溶離液組成 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 メタノール% in 水 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 70%メタノール抽出 ↓ バイオアッセイ 26 NN-614カラムには ポリヒドロキシメタクリレート にスルホ基を導入した 充てん材を採用 ↓ 陽イオン交換と 分配吸着作用により 分離されています R2 R3 - -N | + R1 PVA R1 R2 -N|+ - SO3- R3 27 SO3- PHMA - カラム : Shodex® NN-614 ( 6mmI.D.×150mm ) 溶離液 : 8mM HNO3 / NH4NO3aq. 流速: 0.4mL/min 検出器: LC/MS (SIM Positive) カラム温度: 40℃ 3 SO カラム : Shodex® IC SI-90 4E ( 4mmI.D.×250mm ) 溶離液 : グラジエント溶出 1mL/min (A) 0.3mM NaOH (B) 0.3mM NaOH + 20mM Na2CO3 サプレッサー: Dionex AMMS-ICP II 検出器: ICP/MS, P at m/z=31 R3 O HO + グリホサート N- NH 2 <MF-Sによるアフラトキシンの添加回収率> IC用SI-90カラムには PVAに第4級アンモニウム基 を導入した充てん材を採用 ↓ 陰イオン交換作用に 分配吸着作用が加わって 分離されています | OH CH2 CH 2CHCOOH 抽出比率1:4のため境界値は8ppbになります ※AgraStripTM Afla 4 の通常の抽出比率は1:2(境界値は4ppb) 事例:有機ヒ素 R2 P 8ppb添加群をMF-S処理後: 陽性を示す MF-S 25 R1- O MF-S処理後: 陰性を示す(2本ライン) 参考資料: Autoprepニュースレター No.5 : 測定妨害成分 : カビ毒 事例:グリホサート CH 3 ③ クリーンアップ後の流下液を AgraStripTM Afla を用いて イムノクロマト測定する 0.6mL 共用できない理由(2) (1) 測定妨害成分が異なる グルホシネート 未処理:陽性を示す(1本ライン:擬陽性) 流下液 #226、 #226、#228、MF #228、MF--Aは90%アセト ニトリル中のアフラトキシンが通過 するように充てん材組成を最適化23 共用できない理由(1) : 測定妨害成分 : カビ毒 <カレー粉のイムノクロマト測定例> ① カレー粉10gに 70%メタノール40mLを 加えて振とうし、遠心、 ろ過後、抽出液を調製する 抽出比率 1:4(w:v) MultiSepTM #226, #228 Autoprep® MF-A 1000 HPLC測定 <操作方法> 測定例: カレー粉 多機能カートリッジ 誘導体化 トキシンが通過するように充てん材組成を最適化 28 製品一覧(1) 分離の仕組み(6) スケールアップの考え方 ¾ ノンポーラス充てん材によるイオン交換 * 別途、消費税を申し受けます。 品 名 粒子径 充填材 (μm) 官能基 カラムサイズ 希望小売 カタログナン (meq/g) I.D. X L (mm) 価格(円)* バー イオン交換容量 弱陰イオン交換カラム 最大注入 条件を得る 内径8mm×長さ300mm 14.5 15.5 2) 16.5 17.5 18.5 19.5 1) 流速を6.25倍 すれば 注入量も6.25倍に Shodex® PAE-800 Eluent: Acetone 0.5mL/min、 RT 1) Corn oil 0.090mg/500μL 2) Di-2-ethylhexyl phthalate 0.036mg/500μL 充填材 粒子径 品 名 カラム封入溶媒 0.6 PHMA 2.5 Shodex IEC DEAE3N-2B ノン ジエチルア Shodex® IEC DEAE3N-2T ポーラ ミノエチル 基 ® スゲ Shodex IEC DEAE3N-1B ル ® 2) 0.4 Shodex IEC DEAE3N-1T 8.0 4.6 2.0 2.0 1.0 1.0 X X X X X X 75 35 50 35 50 35 98,000 98,000 120,000 120,000 150,000 150,000 F611 F611 F795 F795 F795 F795 8255 2000 0223 0224 0233 0234 8.0 4.6 2.0 2.0 1.0 1.0 X X X X X X 75 35 50 35 50 35 98,000 98,000 120,000 120,000 150,000 150,000 F611 F611 F795 F795 F795 F795 8250 3000 0123 0124 0133 0134 強陽イオン交換カラム Shodex® IEC SP-825 13 14 15 16 17 18 Shodex® IEC SP-420N ® Shodex® PAE-2000 3.2mL/min 0.540mg/3000μL 0.216mg/3000μL 29 製品一覧(2),(6) ¾ GPCクリーンアップ ¾ スケールアップの考え方 8 Shodex® IEC DEAE-420N ® スケールアップ 1) Shodex® IEC DEAE-825 内径20mm×長さ300mm 断面積 → 6.25倍 Shodex IEC SP3N-2B Shodex® IEC SP3N-2T Shodex® IEC SP3N-1B Shodex® IEC SP3N-1T 8 0.5 2.5 PHMA ノン スルホプロ ポーラ ピル基 スゲ ル 0.3 内径1mm以下のカラムについては、URLをご参照ください。 http://www.shodex.com/ 30 製品一覧(3) ¾ ポリマー系逆相カラムとODS * 別途、消費税を申し受けます。 カラムサイズ 希望小売 カタログナン I.D. X L (mm) 価格(円)* バー 食品用 Shodex® CLNpak EV-2000 AC Shodex® CLNpak EV-G AC PS 16μm アセトン/シクロヘキサン封入 ® PS 16μm Shodex CLNpak EV-200 Shodex® CLNpak EV-2000 Shodex® CLNpak EV-G 酢エチ/シクロヘキサン封入 20 X 300 20 X 100 2 X 150 20 X 300 20 X 100 300,000 120,000 130,000 300,000 120,000 F609 F609 F609 F609 F609 0003 0004 0005 0001 0002 198,000 400,000 50,000 198,000 400,000 50,000 F760 F681 F671 F760 F681 F671 0026 0023 4008 0025 0022 4007 環境用 Shodex® CLNpak PAE-800 AC Shodex CLNpak PAE-G AC アセトン封入 8 X 300 20 X 300 8 X 50 Shodex® CLNpak PAE-800 Shodex® CLNpak PAE-2000 PVA 5μm ただしEV-Gは 9μm アセトニトリル封入 8 X 300 20 X 300 8 X 50 PVA 5μm Shodex® CLNpak PAE-2000 AC ただしEV-Gは 9μm ® Shodex® CLNpak PAE-G -G の付く品名は、ガードカラム 31 製品一覧(4) 32 製品一覧(5) ¾ マルチモード ¾ サイズ分離 品 名 充填材 http://www.shodex/com/ 溶離液 適用 親水性ポリマーコー トシリカ 水溶液 本数 カートリッジ形状 希望小売 カタログナン /箱 シリンジ その他 価格(円)* バー 充填材 注1) アフラトキシン用多機能カートリッジ(サンプル前処理) 25 - MycoSep® #226 AflaZon+ 注2) 多機能 TM #226 AflaZon+ 25 6mL MultiSep - MycoSep® #228 AflaPat #226に逆相を強化 25 注2) TM #228 AflaPat 25 6mL MultiSep 多機能 1000mg 50 3mL Autoprep® MF-A 1000 近日発売 ELISA分析のための前処理カートリッジ! 多機能 500mg 30 1mL Autoprep® MF-S シリカ系 Shodex® PROTEIN KW シリーズ * 別途、消費税を申し受けます。 品 名 ミクロカラムから分取まで、各種のカラムサイズを品揃えしております タンパク質 ポリマー系 Shodex® GPC KF、LF シリーズ THF PS 汎用ポリ マー クロロホルム PS Shodex® GPC K シリーズ 極性ポリマー DMF PS Shodex® GPC KD シリーズ HFIP PS Shodex® GPC HFIP シリーズ 難溶性ポリマー トルエン Shodex® GPC HT、UT、ATシリーズ PS 水/有機溶媒両用 各種 PVA Shodex® Asahipak GF シリーズ 水溶液 親水性物質 PHMA Shodex® OHpak SB シリーズ 水溶液 親水性物質 Shodex® Asahipak GS シリーズ PVA 水溶液 糖類 Shodex® SUGAR KS シリーズ スルホン化PS マルチモードカラム - 18,000 R908 3000 - マイコセップ R905 R905 R905 R905 R908 0226 9226 0228 9228 1000 注3) 品 名 Shodex® IC SI-90 4E Shodex® IC SI-90G ® Shodex RSpak NN-414 Shodex® RSpak NN-614 33 - - 37,500 40,000 40,000 40,000 48,000 マイコセップ 粒子径 (μm) 9 9 9 9 充填材 (meq/g) PVA 第4級アンモニウム基 PHMA スルホ基 カラムサイズ 希望小売 カタログナン I.D. X L (mm) 価格(円)* バー 4.0 4.6 4.6 6.0 X X X X 250 10 150 150 150,000 50,000 110,000 150,000 F699 F699 F700 F700 5244 9620 8160 8150 注1) その他のカビ毒については、URLをご参照ください。 http://www.autoprep.jp 注2) アフラトキシンの他に、#226はゼアラレノンのクリーンアップに、#228はパツリンのクリーンアップに適用 注3) この他に 各種カラムサイズ、充填材の品揃えがあります。 http://www.shodex.com ® ® MycoSep 、MultiSepTM、AflaStarTM、AgraQuant および AgraStripTM はRomer Labs社の商標です。 34 トラブルシューティング Shinoチャンの分析SOS http://www.autoprep.jp/kensa_kit/sos/index.html 35 各種応用データ 前処理の 各種応用データ HPLC分析の 各種応用データ http://www.autoprep.jp http://www.shodex.com *改良のため仕様を予告無く変更することがあります。 *本資料中の数字は分析の一例(または、測定値)であって、保証値ではありません。 36
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