骨芽拙胞を介した破骨細胞形成系におけるカルシウムの役割解明に関する研究総務大学者菌学郊生化学新木敏正要約骨の F 有機では、営努幸運主義と義主す号車議長告によって手話 i こ守争議室をの吸収と形成が繰り返されて p る。本研究では、 E ' ま芽線路と護主号守主総JJiきによって緩まれる資の代議誌に'貯の主主主分であるカルシウムがどのような役 ) 1 署管護綴総と'喜子突き車護霊告を共存培養すると、ごく少数の絞号李総i 認を果たしているのか毒事析した。?ウス(1 g 告が彩滅された。しかし、議議詰譲渡のカルシウムや、事録喜善的カルシウム上昇郊で為るイオノア才ア (A23187) で生活壊すると、務長主{夜子í~ 信号;こ事&'i警綴Eきの形成金t噌ro した。管'!f綴君主における滋'号李総絡会全化図予 (R必殺(1)の議~f父子安患者誌を潟べたところ、培養液のカルシウム滋度の上昇、 iこ伴って発毅レベルが上昇した。網開3 程内カルシウム止刻も隠劇こ R部 K 開発E 誌をよ昇させた。免疫抑昔話郊である F K5燃は、 ANKL 遺伝子の発混とそれに伴う破骨紹飽形成を滋くま者織しカルシウムシグナんによって誘発される R 0 6はカ)J.，シウム依子学的シグナル伝主義物質であるカ}J.，シニュー 1 )ンの活性化を抑えるととから、た。 FK5 RANKL の警告淡にはカルシウム h カ)J.，シニューリンを介したシグナ)1-伝達経絡が関与しているごとが泳峻された。これらの総燃は、骨代謝における彼骨細胞形成調節にカルシウムとそれによって汚然化さ二重重要警であることを主主味する。れるカルシニューリンが狩徽 i キ…ワ…ド:物、カルシウム、五度骨細胸、骨芽細胞、遺伝子発現 1 . 研究の背景と図的 ( 1)後における E 遺骨絞絡の役l i f J 殺は~U本の 3性寺綴謀議として符髪を支える役割とともに、そのま書長完成分であるカルシウムの除草案燃としての綴援を果たしている。之れらの役割を果たすために、 f 誉総選議 i 立一生滋、形成と理主i 以を繰り立、それぞれ潟王室系綴胞に泊予長する脅3 李総僚と延長翼民ぷ総l 漁協策の奇襲符返している。?を形成ど号波紋 i 手ばれている義務総会主縫っており、このー遂の現象は1fの莞潟互主{ヲモデリング}と u ( F 印絞殺7 3， A t h a n a s o ne ta . 11 告9 6 ， B決必邸 e ta . 11 9 9 6 )。ワモデワングにより E きい!をは新し L 明;ニ絞き換えちれ、る。殺全体としての号室疫が容量たれて Lミ近年の，f 急激な高話量化社会への移行に然 Lミ日本でも役会費号室重f としている f 誉総禁愛護1'1 ふ絞号李総I H 撃によな資駿i 設や脅芽経i 胞による骨形成の低下など、'討のすモデリングのパランスが綴れるごとにる滋棄u 1き起こされると考えられる ( U u r s ! ε re ta 1 .1 9 9 1， T o b i 器s e ta 1 . 1鈴 1 ) 。より 5 -68- ( 2 ) 後f 李総2 撃の形態と機能司法管綴胞は管組織のみに“f 主主主しも詩話器r Iこそ五五五化された符組織を五度線・吸収する習性ーの調n 胞である。脅級~文書E をもった被管細胞 (Fig急1) 1ま意義?誌をおし、修雪量産filニ後した部分 iこ波状中華 (ruffled という捌名状の占契機殺とそれを崎支り関u'アクチン i こ綴んだ R 月平静 b o r d e r ) ( c l e a rz o n e ) を形成する ( V 姐且a n e na n dZha o2002) 。日用手書により~投機のようにす李道長総へ絞殺した破怜細胞は、滅状総からプロトン(日+)とプロテアーぞを分泌し、石氏 1~~基銀の脱阪è:'1号線燃タンパクの分解を効率よ〈行う ( S u d ae ta . 11 9 97 b ，B a r o ne ta . 11 9 8 9， V a a n a n e na n dZha o2日0 2 )。プロトンは波状綴 i こ多数干j.:なする被胞型プロトンポンプにより分泌される(悶創re ta 1 .1 9 8 9， V a a n a n e ne ta 1 .1 9 9 0 )。また、カテブシン K などのプロテアーゼは紛胞内 l ご多数存在するミトコンドリア、ゴルジ器密i 際、ライソゾームにより合成、分泌される ( T e z u k ae ta 1 .1 9 9 4 )。ごのように骨吸収を行うよう終殊 1 tした隊隊総日簡は似の総胞には見られない形態的、機能的な特徴を脅する。 F i g . 1 電車曇暴露E 告の形態と獲量主 f 毒事量殺をおこt.J:う絞努幸運吉告は警表誌に主妻したき事分 i こ波渓縁 ( r u f 茸必 b o r せe r ) とそれを取り富喜重;ァこ窓んだ領事葬 ( c l e a rz o n e ) を形成する。号草寺撃によるj曇表蕊へ接着した喜重義豊富絡i 主、波主主豪華ヴチン i からブロトン似つとブ主主テア-i!を分泌し、石灰化基質をBlI.灰し脅さま笠宮ンパウを分望書をする。主主主主主義重i こ島る液喜告書芝プロトンポンプ i こより分溢され、カテプシン K t . J : どのフ。ロテプロトン似つ i こより合成、分泌さア-i!1 ま豊富皇室内には多数字F 復するミトコンドリア、ゴルジ装置、ライソゾーム i れる。 ( 3 ) 絞殺事器般の怒滋 i 絡は議長5 益事争綴!抱 {成後議j ミるなって L ( p l u r i p o t e n th e m a t o p o i e 話cs t ε mc e 1 l: P H S C ) に由来することが明らかと ( A s he ta / .1 9 8 0 ，K u r i h 主r ae ta 1 .均約， S c h e v e ne ta 1 .1 9 8 6 .Ud 証書a w ae ta 1 . 1 官官。 ) 多分化能 0 会総つ i 縫製ゑ紛糾号館ま綴キなサイトカインめ f ド尽により時期日露、 B細胞、赤血球、頼粒球などに分化す f * 器ぬへの分 1 tま，l L( in t e r おu k i n ) ・3や GMCSF( g r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n y るが、静主 ' ‘ -69- s t i m u l a t i n gf a c t Ol ' ) 、 M-CSF( m a c r o p h a ε ec o l o n ys t i m u 1 a t i n gf a c t o r)などのサイトカインや怜芸子細胞支持により誘惑事される ( S u d ae ta l .1 9 9 2 ，1 9 9 5 ，S t a n l e ye ta . 11鈎4) 白俄特細胞の削糊胞は手間~ の3 f 設ょにステラ…ぞやMacl 、M ac-2といったマクロファージの発現するま長脱恕をすことから、分化JIi.IL 繍こ近いと考えられている ( K u r i h a r ae ta l .1 9 9 0，J ohnsωne ta l1 9 8 8 )。破骨刺胞殺も?クロファージ i 句の章者線級協は率緩機脅刻版へ分化し、種目合して多核の破~籾 5告を形成サる述通手援において、 TR.i屯P { ぬr 回 . t er e s i s ねn ta c i dp h o s p h a t a s e ) やCf R( c a J c i t o 凶現 r e c e p t ρがなどの機特鋼n 胸中寺絞め雲監現塑を発 5 認するどともに、いくつかのマクロブアージの表現殺が消滅する(す滅r o h 鍛 h ie ta l .1 9 9 4 ) 令 ( 4 ) 祭苦手事務総による磁発綴2 望書季五誌の l t I J 御撲傷語護符総費量の分化および機後発事主 i 主、管苦手綴践によって厳然 i こ務室若されている ( F i g .2 ) (Sudae ta 1 . 1999)。すなわち脅努暴露君主 i 主、号変常事密費量分化立〉必須総予である MωCSFと革連管線路分化 i 主 ! 子 ODF /RAN KL[08総 o c l a s td泣e 詑丑託g 註o nf a c t o r !r ε c e p t o ra c t i v a t o ro f l ' 苦手kBl i g a n d (以下RANKLと絡品s udae ta l .1 9 9 8 b ，L a c e ye ta l ‘ ，1 9 9 8 ，Sudae ta l .1 9 9 9 ，す)]を霊量生し、号車骨細胞形成を誘導する (y Takahashie tal .1 9 9針。またー・方で、分秘書芝タンパタとして RANKL O)デコイレセプターである OPG!OCIF [ o s t e o p r o t e g e r i nIo s t e o c l a s t o g e n e s i si n h i b i t o r yf a c t o r (以下 uPGと絡す)]を皇室生して、被符紛胞の形成を抑í~Uする (Tsuda e ta l1 9 9 7 ，S 勧lO n e te t昌1.1告97，Yasudae ta 1 .1 9 9 8 a ) MC SF は管芽 0 。心ま験絞合滋閃であり潟t t :1l退ビタミン D( 1 "， 25(uH) 絢胞により恒常的に産生されるが、 RANKLi やPTH ( p a r a 吐l y r o i dhormo 且e )、PGE， ( p r o s t a g l a n 蜘 E，)、JL.l l品、った削吸収E 喜子の刺激により Y a s u d ae ta l .1 9 9 8 a )0 RANKL O)レ.f:プターである RANK( r e c e p t o ra c 註v a t o ro f 発現が促進される ( NF-kB) を発現する破骨細胞前駆細胞は、特苦手綱胞と品目胸附f 接触を介して RANKLを認識し破骨細胞 S u d ae ta l .1 9 9 9 )。また分化した般傍細胞も RANKを発現しており、 RANKLからの刺激に分化する ( 品並核獄事号線総 F i g . 2号 "3 将司院による破警豊田飽形成の事g 御機構骨吸収悶予の刺激により事奇襲F 線総燦ょに汽A NKLの発現が誘導される。 RANKを発現する磁参事国路前駆細胞は惨苦害総胞との級際間接触を介して単核磁骨級胞に分化する。さらに R ANK しは整核獄事号車問 P G I; tR ANKL のデコ胞の延命や融合、多核波長綱般の活性化を誘導する。骨芽細胞から分泌される O イレセプヲーとしてそれぞれの過程在阻書する。 7 0 により骨吸収活性が誘導される(Ji m ie ta l .1999a)。骨芽細胞の非存在下においても、 M-CSFと可溶型RANKLを造血細胞の単独培養系に添加すると破骨細胞が形成される (Yasudae ta . 11998a)。このとき RANKLのデコイレセプターである OPGを添加すると、破骨細胞形成は完全に抑制される。このように破骨細胞の分化や機能発現は骨芽細胞が産生する R A 1 沼(Lと OPGiこより調節されていると考えられる。 ( 5 ) 骨芽細胞における RANKL 発現の制御機構先に述べたように、骨吸収因子である 1a， 25(OH)， D3やPTH、PGE 、， I L 1 1などは骨芽細胞におけるRANKL の発現在促進することが知られている ( F i g .3 ) (Yasudae ta . 11998a) 1a， 25(OH)， D3は 0 1 α， 25(OH)， D3レセプター (VDR) を介し、 l レ1 1や1L 6はgp130を介してRANKL の発現在上昇させる。また、 PTHやPGE ，のレセプターからのシグナルはcAMP ( c yc 1i cadenosine3 '， 5 '-monophosphate) を介して RANKL 発現在促進する。同時に 1 α， 25(OH)， D3やPTH、PGE ，は骨芽細胞による OPGの産生を抑制し、破骨細胞形成を促進する。包亙玉~L[士三工士 o J : 士 o J士 o E主E 工士三ょ士竺ょ竺ーょ士豆 F i g . 3 骨芽細胞における RANKLおよびOPG遺伝子発現の調節機構骨芽細胞における RANKL遺伝子の発現は、少なくとも 4つの独立したシグナル伝達系 (VDR、 cAMP/PKA、gp130、[CaHJIPKCを介した経路)により誘導される。 LPS、T N F α 、L lおよび I L 1 7などはPGE，の産生を介してRANKLの発現を促進する。また1 α， 25(OH)， D 3やPTH，PGE，は骨芽細胞による OPG遺伝子発現を抑制する。 EP:PGE，レセプヲ一、LlF:白血病細胞阻害因子、 PTHrP:副甲状臨ホルモン関連ペプチド、 PTHR:副甲状腺ホルモンレセプヲー ( 6 ) 研究の目的処理や細胞外カルシウム (Ca) 濃度の上昇により、骨芽細胞の細胞内Ca 最近我々は、 i o n o町 rcm ヮt ーレベルカ主上級すると PKC ( p r o t e i n註i n a s eC ) が活性化され、それを介して R釧且の発現が促進され脅した ( 1 泳 a m ie ta . 11997，2 0 0 0 )，これらの 4つのシグナル伝達経路は互いに独立してることを綴f 幻の善悪現を制御していると等えられる。骨芽紛胞における RAN d a 本研究では、'隊fI:認躍におけるカルシウムの激減性を明らかにすることを目的として、我与が見いだした葬~ 4< J . )RANKL 言語議事シグナ } v't'あるカルシウムの役J!lI J についてさらに詳細に解析した。その結こは、カルシウム依符↑設のシグナル伝達図子であるカルシニューリ線、カルシウムシグナル<J.)下流 l の発況を古関節していることが示唆された。ンが RANKL 2明材料と方法 ( 1)マウス遡紛のd dy系統クリーンマウス(総)および問タ持続の級事L1防総クリーンマウス、 5 7 1 霊前告のら7 C 3 H / H e NおよびC 3 H / H e Jクワ…ンマウス(雄}はぷjZラボサ…ピス{護主総}より購入した。 ( 2 )試薬および酵素 vA 5 MX1)ン隊、およびF a s tr e dv i o l e tLB草泌がまS i g 抗JaCt開腹誌. c a 1( S t .1 o ms ，MO) より、ナフトー } 1a， 25(OH)， D，およびN， N -ジメチルホルムアミド、総泌分散問題事繁コラグナーぞは紛うも絡要車工芸薬(火詩人した信長調飽道主事事事記者子、滋-l!)vパンカーは十童書フィールド{策3 笠}、ディスパ…-!!.ま会隠滅阪)より E e l lr n a t r i xt y p eI Aコラーゲンゲ ) v ! 主新箆ぞうチン{大隊}より長選入しまと a 清(東京}より、 ε H u r n a nM-CSF (ロイコプロー }v) は喜怒製薬{大議室}より、 R e c o m b i n a n thu総締ま必~KLIま Pepro TechI . : τ ' D .( 1 o ndon、UK) より雲詩人した。 ( 3 ) 培地および緩衝液 aMEM (aMinimumE s s e n t i a J亘書e d i u r n ) 液体主主i 丑i mumE s s e n t i a JMediumE a g l eA l pha 韮c 必o n( S 添田C hemic a 1 ，S t1o u i s ，MO) 5 0 0 m t lこ、 2 0 0mMl r G l u泌総ne ( をぬmaChe 関l c a 1 ，S t Modi 0 ，告0 00むI r r J .p e n i c i l l i nG (1湾海製薬.東京)を 500μt、 2 0 0 m g l t n e L o u i s，MO) をお努語、 1 s t r e p t o盟 y c i n {明治製薬、東京)を 250〆添加した。さらに FBS ( f e t a lbovineserum，JRH 臨む田， L e n e x a ， KS) をaMEM主主主主i こ総返して実験 i こ問いた(以下、 αMEMと燃した))。 B i o s c i PBS (Pho s p h a t e B u 笠: e r e dSa 1 i n e ) :NaCl ( 8g )、KCI ( 0 . 2討、 N， aP O.‘ 12H ， O (む哲 g ) 及tJ 浴1 ， PO ‘(0.2g) を lザヅトんの精製氷に溶かした。さらに 120.C、20分関オ…トクレーブ滅E 脅して潟いた。 ( 4 )T汽AP ( T 眠 r a t er e s i s t a n ta c i dp h o s p h a t a s e ) 反応液 5 MXリン酸 -慕繁{ナフトー )vA 1m g ) を N， N-ジメチルホルムアミド ( 1 5 0 " . . 1 ')に溶かした。こ溺石重量ナトリウムを含むな 1M 酢酸ナトリウム緩衝液 { pH5 . 0，1 0 m e l を加え、さらに s れに 50mM 禁 ( F 酪 t r e dv i o l e tLBs a 1 t; 6m g ) を加えて調製した。反応液は問時潟製した。 (5) 形成された破骨細胞の同定 (TRAP~書色法) 一72- TRAP ( T a r t r a t er e s i s t a n ta c i dp h o s p h a t a s e ) は破骨細胞に特徴的な酵素として知られており、乙の酵素活性を利用して i nv i v oまたは i nv i t r oにおいて形成された破骨細胞を特異的に染色するごとができるロ培養系より培養液を吸引除去し、 10%ホルマリンを合む PBS で細胞を 1 5 分間固定し、除去後さらにエタノール/アセトン(1:1)で l分間再固定した。固定液を除去し風乾させた後、 TRAP 反応液を加え、室温で 15-30 分間染色した。染色後、流水により染色液を除去し反応を停止した。 ( 6 ) マウス骨髄細胞 ddyおよびC3H/HeN、C3H/He Jマウス(ら7 週齢，雄)を頚椎脱臼により屠殺し、 70%エタノールで消毒した。大腿骨及び腔骨部分の皮膚を切開し、付着筋肉を剥離した。続いて座骨遠心部を切断し、股関節を脱臼させて大腿骨及び腔骨を摘出した。これらの骨に付着していた筋肉を全て除去し、膝蓋骨を脱臼させて下肢長骨(座骨，大腿骨)を得た。両骨端を少しずつ切り落とし、求心端から釘付き 2 . 511leシリンジ (22GX1l/4， TERUMO，東京)で 1 2 m eの αMEM培地を吹き入れ、骨髄細胞を培地中に押し出し、 1 511le の遠沈管 ( C o r n i n gJ n c o r p o r a t e d，NY) に回収した。乙の骨髄細胞含有の α 1， 0 0 0rpm、 5分間)し、沈殿物中の赤血球を 0.83%N H n 含有Tr 叶 HC l緩衝 MEM培地を遠心分離 ( 液 (pH7 . 5 ) に懸濁することによりパーストさせた。再度遠心分離 ( 1， 000rpm、 5分間)し、新鮮な αMEM培地(約 1 01 l l e ) に懸濁した後、有核細胞数を算定した。この操作により、マウス 1匹か個の細胞が得られた。これら一連の操作はクリーンベンチ内で行った。ら約 5X10' ( 7 ) マウス骨芽細胞 H 甫乳 1日齢の ddyマウス約 40匹を屠殺し、 70%エタノールにより消毒した。頭蓋骨皮膚を剥離した後、頭蓋骨を摘出し、 FBS 仕eeαMEM培地中で付着した筋肉及び血球を除去した。得られた頭 e 蓋骨を 5 01ll の遠沈管 (CorningJncorporated，NY) に回収し、酵素溶液 (0.1%コラゲナーゼ、 0.2% ディスパーゼ IFB S f r e eaM EM) 1 01 l l e を添加し、 3 7 ' Cの恒温槽で 5分間、 1 0 0m i n " iこて古辰とうさせた。この細胞浮遊画分は捨て、新しい酵素溶液 1 0泌を添加して 3 7Cの恒温槽にて 1 0分間振とうさせた。 0 この操作を 4回繰り返し、それぞれの細胞浮遊液を回収した。回収した細胞浮遊液を遠心分離 ( 1， 000rpm，1 0 分間)して細胞を回収し、 2 0 m eの αMEM培地を含む培養ディッシュ(直径 100m m， CorningI n c o r p o r a t e d，NY) 中で 6日間培養した。培養後 PBS (pH7.4)で洗治し、 0.02%t r y p s i n 0 分間処理して細胞を回収した。得られた骨芽細胞は細胞凍結保存液セルバンカーに懸濁 EDTAで1 し(約 4X1 0 'c e l l s lmUviall、8 0Cにて凍結保存した。 0 ( 8 ) ReverseT r a n s c r i p t i o n P o l y m e r a s eChainR e a c t i o n (RT-PCR) TR l z o lr e a g e n t( I j f eT e c h n o l o g i e sJ n c .，GrandI s l a n d，NY) を問 L、て、 MMacおよび破骨細胞から t o t a lRNAを抽出した。得られた RNA(3μg) より SUPERSC R lPTJ IRNaseH-ReverseT r a n s c r i p t a s e ( L i f eT e c h n o l o g i e sI nc .，GrandJ s l a n d，NY) を用 L、 cDNAを合成した。 RANKL およびa c t i n 特異的フ。ラ f xDNAp o l y m e r a s e( l i f eT e c h n o l o g i e sJ n ι ，GrandJ s l a n d，NY) を用い、得られた cDNAをイマーと P ， ηa っju 鋳君~として PCR をおとなった。 PCRílを物を 2% アガロ}スゲ;l--で電気泳動し、ヱチジウムブロ?イドにより染色した。 RA. " < K L p r 加l e r : S e n s e : c c a g c c a t t t g c a c a c c t c An t i s e n s 紅 a g c 湖底g g 納底g g t t g g a c a 3 .絡 3 長 ( 1 ) プ1)l--シウム総数による者遺骨綴砲の分化誘導主義幾絞めカルシウム濃度会3者主管多額雪量分化 i 二与える影響について、マウス 0)1i!級車様立きと符ラ夢見渡胞の災孝子F 惑を委主去を滋いてき金言ました (F 匁 4 )。遜常の培養液のカルシウふさ議後 ( 1mM) では、すぬP 綴匁: 義務ぬe"みる道支f 誉総泌がほとんど形成されなかった。しかし、 3mM以上 0); き)l--シウム淡淡ぺきはさ童話Z 欽ねa ¥ H 二量産寺李総ぬの斉手足誌が認められた ( F i g .4 ， A B)，一方、カルシウムと符じ 2f 機4オンであるMgH i こは弘主 . 1 ' t 議Q H 語のうま化誘導活性は認められなかった ( F i g .4 B )，このことから、カルシウムの車せ護l:i こよって温度4 誉総胞の形成が滋導されることがあきらかとなった。 A 豆主主匝ヒ。﹄昌記目玉百草 EU一 Z 300 一一 0 一一 C 冶2 ト司自・ - Mg2+ 2 0 0 j / ♂ - 1 0 0 ・ … … 綱日i 噛婦と一一一ω .......... o 1 0 CoO < . : e 叫惜舗 o n (刑制} B C謹2 ( 1 0額損) 2 C a +( 0俗語) 令 F i g . 4 感濃度のカルシウムによる破脅級憾の分化誘導 A，カルシウム濃度0， 1 ， 3， 10mMの橋蓄を液中ですウスの jlf綴細胞と~~級胞を 68 潤共存培養した。培養後、細胞を画定し、 T円AP染色をおこ耽った。 B，務〈染まった細胞がT内AP陽性細胞{硬骨細胞)である。仏ワ 4 aZ ( 2 ) 細胞内カルシウム上昇剣による量産伶細胞の分化誘導態度上昇 i 立、高額約内のカルシウムのよ昇を引き起こすことから、 A23187，制服外のカルシウム i CPAなどの締結内カルシウムよ夢'j.J穏を浴いて紛総内カルシウムと重要管級胞形成 ( 1 )関係について主主詰ました (Fig.5). その結果、A2 3187およびCPA以後守李総ぬの分化を強力に誘導した b また、カルシウ母子 PKC (protein泌総seC) をPMAによって主義務j 約i ニムによって活性化される級殺内シグナル整E 滋 ? をf とさせたときも号車管事録童話の分化会建議事された ( F i g .5 l o 以上の結果 i 之、豪語5 皇内カルシウムレベルめ上雰が緩脅綴泡の分化を滋望事していることをぷ唆する。また、骨芽釘1 1 ! 告脊夜下でのみとのような作湾が認ぬられたことから{データ i まぶしていな Lサ、これらのカルシウム上昇奔!のターグット i 立、傍要事綴胞であると予想された。 A 2 3 1 8 7 CPA PMA C o n t r o l F i g . 5 細胞内カルシウム上興期J による破骨細胞の分化銭湯共存精華襲 3悶悶のマウスの骨髄細胞と骨芽細胞をA2 3187(0.1μM)， CPA(10μM)， PMA ( 0 . 1~ M) の存殺下で i 5らに 3悶悶共存培議した。培養後、織胞を醗A:し、 T除AP染色をおこなった。赤〈染まった級胞がT内AP陽性細胞{被骨細胞)である。 ( 3 ) 繁華菱液中の 1 3 JJ !シウムおよびA23187が細胞内カルシウムレベJ ! Jl こ与える選手警警到底般的カルシウふが絞孝子綴話題うま化誘導 i 二塁塁与していることを示唆す‘るま喜多裂にさまづき、管妻子綴砲におけるおi 般的カルシウムレベ )，，(1)変化を然析した ( F i g .6 )。労苦李総泌を通話線内カルシウム指示薬で 1 0mM) のカルシウム浴?夜、またはA2 3187でさらに l ある給油 3AMで後処殺した占ちと、総滋変 ( 分総処理した。綿織的カルシウム淡授の上昇は、フローサイトメトリーによって検出した。その結果、網漁内のカルシウムレベル!主主導濃度のカルシウム溶液やA23187の処耳震によって過性に上昇し g .6 ) . これらの総書誌は、'除努説R D 留において高波i 交のカルシウムやカルシウムよ界剤が突際にた(Fi 細胞内カルシウムめよ界を引き紹ごしていることを意味する。 F ワ4 ヘ υ ﹄ oaEヨe=000﹀富田川o E A “ 。 ψF 。幽町一て dAVO zaE22=ωοω 之宮古庄 B ( 10m M ) F l u o陪 scencei n t e n s i t y 「「，、 ‘ ‘ ， - F ~!i' A 2 3 1 8 7 F l u o 陪s cencei n t e n s i t y F i g . 6 高濃度の細胞外カルシウムおよびA23 1 8 7 処理による細胞内カルシウムレベルの変化細胞内カルシウム指示薬 Fluo3-AMで前処理した骨芽細胞を高濃度のカルシウム ( 1 0mM) ( A )あ 0 . 1~ M) ( 8 ) で処理し、 1分後フローサイトメトリーによって細胞内カルシウムるいはA23187( レベルの変化を観察した。 ( 4 ) 骨芽細胞における RANKLmRNA の発現破骨細胞の分化誘導因子である RANKL の発現をRf -PCR 法で解析した ( F i g .7 )。高濃度のカルシウムで骨芽細胞を処理すると、 RANKLm 貯，Aの発現が上昇した ( Fig.7A)。同;様に、A23187，CPA ， PMAも骨芽細胞における RANKLmRNA の発現を誘導した ( F i g .7B)。これらの結果は細胞内カルシウムレベルの上昇や PKCの活性化は破骨細胞分化誘導因子である RANKL の発現を介して破骨細胞形成を誘導していることを強く示唆する。 ( 5 ) カルシニューリン阻害剤による破骨細胞分化抑制カルシウムシグナルに依存する経路としてカルシニューリン・カルモジュリン経路が知られている。このシグナル伝達経路の阻害剤である FK5 06 (別名タクロリムス)およびサイクロスポリンAを用いてカルシウムシグナルの下流へのカルシニコーリン経路の関与について検討した。 FK506およびサイクロスポリン Aで骨芽細胞を前処理し、高濃度のカルシウム溶液で処理すると、濃度に依存して破骨細胞形成は抑制された ( F i g .8 )。同様に、A2 3187， CP A，およびPMAによって誘導される破 -76ー A C a2+ m M 1 0 3 R A N K L Actin 円N﹃ g重 DLZS 一 B- B R A N K L 陸軍軍: : 3 1 : : : 'Actin 発現の誘導 F i g . 7 細胞外カルシウム濃度および細胞内カルシウム上昇剤による骨芽細胞の RANKLmRNA 1 3mM) ( A )， A23187 (0.1μM) ，CPA (10μM) ，PMA ( 0 . 1~ M) ( 8 ) 骨芽細胞をカルシウム ( で 3時間処理し、 RNAを抽出した。 RANKLの発現レベルを RT-PCR法によって比較した。 A= 120 2 8 0 ; 40 2 z 。。 1 3 1 0 FK506 (μM) o 1 10 100 CyclosporinA (μM) B F i g . 8 高濃度のカルシウムによって誘導される破骨細胞形成に対する FK506およびサイヲロスポリンAの作用 FK506 ( 0 10~ M) ，サイヲロスポリン A (0-100μM) と10m Mのカルシウム存在下でマウスの骨髄細胞と骨芽細胞を培養した。 6日後、細胞を固定し、 TRAP染色をおこない、 TRAP陽性多核細胞の数を数えた ( A )。赤く染まつっている細胞が TRAP陽性である ( 8 )。 -77ー骨細胞形成も FK5 06によって強く抑制された ( F i g .9 )。 06はカルシさらに、骨芽細胞における RANKLmRNAの発現レベルについても検討した結果、 FK5 ウムシグナルによって誘導される RANKLmRNA発現レベルを強く押えた ( F i g .1 0 )。以上の結果は、カルシウム.PKCシグナルはカルシニューリン・カルモジュリン経路の活性化を介して RANKLの発現を誘導しているごとを示唆する。 1 5 0 主1 0 0 、¥ C / J (.) z (+)止︿巴 -F = =5 0 2 5 O F K 5 0 6 :一十一十一十一十 A 2 3 1 8 7 C P A C a2+ P M A ( 1 0m M ) F i g . 9 細胞内カルシウム上昇剤によって誘導される破骨細胞形成に対する FK506の作用共存培養 3日目のマウスの骨髄細胞と骨芽車町包を FK506 ( 1 0ドM) および細胞内カルシウム上昇剤 3187 ( 0 . 1ぃ M) ， CPA ( 1 0ぃ M) ， PMA (0.1μM)] の存在下でさらに 3日間培養した。培養後、 [A2 細胞を固定し、 TRAP染色をおこない、 TRAP陽性多椋細胞の教を教えた。 C a2+ A 2 3 1 8 7l o n o m y c i n ( 3 0m M ) F K 5 0 6 :一十十 P M A 十一十柵柵蜘州 IR A N K L 榊川棚柵酬酬明一 A c t i n ￨柵t i 1 発現に対する FK506の作用 Fig.10 細胞内カルシウム上昇剤によって誘導される RANKLmRNA 骨芽細胞を FK506 (10ぃM)で 2時間前処理し、さらに細胞内カルシウム上昇剤 [A23187 ( 0 . 1 μ M) ，CPA ( 1 0ぃ M) ，PMA ( 0 . 1ぃ M)] または高濃度のカルシウム ( 1 0mM) で 3時間処理した。 RNAを回収後、 RT-PCR 法によって RANKLmRNAの発現レベルを比較した。の δ ゥ， a 4 .考察活性型ピタミン DやPT 廷などの骨 q 及奴図子と呼ばれる裂のぞ主体内綴，立、特芥細胞をゴ干しでも連常こ緩'湾総B 認のうま化調節』こ縦殺の分化を誘導することが知られている母しかしながら、どの総予が実際 i 関与しているのかほとんど明らかにされていない。差是キ;立、良誕生誌の後尊重~文 E喜子とは祭主主る機序で被管綴胞の分化を調節する因子としてカルシウムを 5 急いだした。今翻訳〉紛多宝章議長震は、ま立与が章受初 i 二発見し手綴5 告の分化議室事冨子としてのカルシウムの幾重別去を支択すとともに、 ; t J } t "シニューリンの関与をた接支塁 d 新たに示唆した。方)t"シニューヲンはこれまで免疫喜務総の機幾多~;発において三重要害獲されていた図子である。これはカルシニューヲンが免揺を議室事だけでなく、物f { ; 滋i こもさ書く総与する 5 震予であることを意味する。カ)t"シニューリンの滋性化には義援3 智内のカルシウムレぺんの上昇が必婆である。これに伴って、転が渡りン重量化され、組1ff怒号変から名案内へ移行する。免疫邦最J I 舜!として沼いられて Lミ写ll'I子である NF-AT るFK5061立、カルシニューすン ( J )i お 1 ' 1化合閑談することが紛られている。方、 PKCが活'性化される鯵君臨され、 NFATと長官会宇容を 1 隊員免して機能する。ザイクロスポワンAはこのと、 AP-1が新規に合成・ 4 司 ta . l1 9 9 2 ]。翁キ i 立、カルシウムシグナルと同様に、 PKCの複合体の核内への移行を阻殺する[Jぬne の発現を誘導すること、そして、 F K5 06がRANKL の発現を抑制することを示したロこ活性化も RANKL :PKCの泌燃化の下流に、カルシニューリンの活性化が得殺することのごとは、カ )t〆シウムシグナ)t"i を示唆するとともに、 RANKLの通遺伝子発臓がAP・ 1/NドAT~長合体によって転写制御されていることを強く示唆する。最近、骨髄縦胞に白楽する五度' 1 ; 釧胞の自白庫区細胞においても破骨細胞への分化の過程でNF-ATが必須であることが殺?きされた [ T a k a y a n a g ie ta 1 .2 0 0 2 ]。今矧の我々の実験結果は、fJ鹿骨細胞の前駆細胞ではなく、特努紛絡をます象としたものであるため刺殺は異なる。しかし、前駆細胞においてもす寺第縦胞担分化において霊安な役割を担っているということは必然に興においてもカルシニニぇーリンが後す誉総H 事毛深い。これまでの符綴撃護者主主主主義擦は絞1ll'紛胞の骨吸収機能を短害するものがまで、分化を限努する 06は現在免疫抑総売!として湾いられているが、絞後ものはまだ言語発されていない俗したがって、 FK5 総立きのうま化部長率撃することによって降級棄毒症を改号事する作用があるかもしれない。 4 総タトのカルシウム滋疫の上昇が被管綴5 きの分化を誘議事することを;示唆した紗今磁の蓄えノをのま道線;立、議n こ多額立量的カルシウムシグナル i 主総1 泡タ争力)t"シウムの上昇だけでなく、下手孝によっしかしながち、…絞 i ても引き怒とされ、 i 湾総の滋伝子多老若2 議室普通tなされることが知られている[Jo r g e n s e ne ta 1 .1 約 7L ま主総立言内力)t"シウムレべんを上昇させることも級絞されていた、いくつかのサイトカインやホルモン i る。さらに、殺事. f * ， "s 告がメカニカルストレスを受けると、労苦手議s s 告燃のギャッブジヤンクシヲンを介 ] o r g e n s ε ne ta . 11 9 9 7 しこのように、管委F 綴lH程変〉議官絡的カルシしてカルシウムシグナルが言霊祭される [ レが数多産される条件はいくつも想定することができる。終 i こ骨苦手品f f i n 設やf 波う勢調U f s 設が平手ぞますぬウムシグナ f る符J 器禁をはカルシウムを多く含んでいることから、骨基質自身が破脅誕lI s 訟の分化誘導 I こi 義j l:j.している -79- 可能性もある。今後、カルシウムシグナルがどのような刺激によって引き起こされているのか判明すれば、骨代謝におけるカルシウムの重要性と位置づけがより明確なものになるであろう。 5 . 参考文献 Ak a t s uT，TamuraT，T a k a h a s h iN，UdagawaN，T，皿a k aS，S a s a k iT，Yamaguchi， AN a g a t aN，SudaT h a r a c t e r i z a t i o no famouseo s t e o c l a s t l i k em u l t i n u c l e a t e dc e l lp o p u l a t i o n .JBone 1 9 9 2 .P r e p a r a t i o n皿 dc 下1 3 0 6 . 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S c i e n c e . 2 4 5: 8 5 5 8 5 7 . ，MoorePA ，Ag g a r w a lBB .C h a r a c t e r i z a t i o no f吐l ei n 仕a c e l l u l a rdomaino f DamayBG，H a r i d a sV，NiJ K ) .1 9 9 8 r e c e p t o ra c t i v a t o ro fNF-kB(RAN l ]Med.2 8 9: 8 64 8 6 5 F r o s tHM.1 9 7 3 .M e t a b o l i s mo f b o n e .NEng F u l l e r， K OwensJM，JaggerCJ，W1 i s o nA， MossR，C h a r n b e r sTJ .1 9 9 3 .Macrophagec o l o n y s t i m 叫a 出g f a c t o rs t i m u l a t e ss 町v i v a 1andchemotacticbehaviori ni s o l a t e do s t e o c l a s l s .JExpMed.1 7 8: 1 7 3 3 1 7 4 4 . -80ー H o f b a u e rLC， L a c e yDL ， D u n s t a nC ， RS p e l s b e r gTC， R i g g sBL ， Kho s l aS .1 9 9 9 .l n t e r 1e u k i n 1s皿 dtumor n e c r o s l s白c ω r α ，b u tn o ti n t e r 1 e u k i n 6，s t i m u l a t eo s t e o p r o t e g e r i nl i g 皿 dg enee x p r e s s i o ni nh山百組 o s t e o b l a s t i cc e l l s .Bone2 5: 2 5 5 2 5 9 McCa 並e yPG ， V a l ge A r c h e rVE， R且oA 1 9 9 2 .R e l a も e dA r t i c 1e s， Nu c 1 e a r白c t o ro fa c t i v a t e dTc e l l s J a i n J， c o n t a i n sF o sa n d J u n . N a t u r e .3 0 ;3 5 6 ( 6 3 7 2 ) :8 0 1 4 . J i m iE， Aki yamaS， T s u r u k a iT， Ok 泊a s l uN， K o b a y a s l u， K UdagawaN， N i s l u h a r aT， Tak 誼l a s l uN， SudaT . 1 9 9 9 a .O s t e o c l a s td i 百e r e n t i a t i o nf a c t o ra c t sa sam u l t i f u n c t i o n a lr e g u l a t o ri nmurineo s t e oc 1a s t d i 宜e r e 凶 a t i o n皿 df u n c t i o n .JImmu n o I 1 6 3 : 4 34 -4 4 2 . J o r g e n s e nN， RG e i s tST ，C i v i t e l l i， RS t e i n b e r gTH.1997ATP ーa ndgapj u n c t i o n d e p e n d e n ti n t e r c e l 1u l a r l 1 s .JC e l lB i o . lO c t2 0 ;1 3 9( 2 ) :4 9 7 5 0 6 c a l c i u ms i g n a l i n gi no s t e o b l a s t i cc e KahnA J，SimmonsDJ .1 9 7 5 .! n v e s t i g a t i o no fc e l ll i n e a g ei nboneu s i n gac l u m a e r ao fc h i c k阻 dq u i a l 3 2 7 . e m b r γ o n i ct i s s u e .N a t u r e2 5 8 : 3 25 L a c 句rDL ，百mmsE， TanHL ， K e l l e yMJ， D u n s t a nCR ， B u r g e s sT， E l l i o t tR， ColomberoA， E l l i o t tG， Scu l 1 y S， HsuH， Su l 1 i v a nJ ， HawkinsN， DavyE， C a p p a r e l 1 iC，E l iA， Q i 阻 YX ， Kaufm 阻 S ， S a r o s i， !S h a l h o u bV， Sena Id iG，Guo1 .DelaneyJ，BoyleWJ .1 9 9 8 .O s t e o p r o t e g e r i nl i g a n di sac y t o k i n e出 a tr e g u l a t e s o s t e o c l a s td i 宜e r e n t i a t i o n皿 da c t i v a t i o n .C e l l9 3: 1 6 5 1 7 6 . NakashimaT，K o b a y a s h iY，YamasakiS，KawakamiA，EguchiK，S a s a k iH，S a k a iH .2 0 0 0 .P r o t e i n 宜' e r e n c e o fmembrane-boundands o l u b l er e c e p t o r' a c t i v a t o ro fNF-kB e x p r e s s i o nandf u n c t i o n a ld i l 泡阻止 m o d u l a t i o no f白 ee x p r e s s i o nbyo s t e o t r o p i cf a c t o r sa n d' c y t o k i n e s .BiochemB iophysRes Commun2 7 5: 7 6 8 7 7 5 . O ' B r i e nC， AG u b r i j1 ， L i nSC， S a y l o r sRL ， M a n o l a g a sS C .1 9 9 9 .STA 刀 a c t i v a t i o ni ns 甘o m a l / o s t e o b l a s t i c c e [ [ si sr e q u i r e df o ri n d u c t i o no ft h er e c e p t o ra c t i v a t o ro fNF-kBl i g a n dands t i m u l a t i o no f o s t e o c l a s ω g e n e s i sbygp130 -u t i l i z i n gc y t o k i n e so ri n t e r 1 e u k i n 1b u tn o t1 ， 2 5 -d i h y d r o x y v i t a m i nD， o r p a r a t h y r o i dh o r m o n e .JB i o lChem2 7 4: 1 9 3 0 1 1 9 3 0 8 . Sc hevenBA，羽田e rJW，N i j w e i d ePJ .1 9 8 6 .! nv i 甘 oo s t e o c l a s tg e n e r a t i o nf r o md i f f e r e n tbonemarrow i n c l u d i n gaI u g h l ye n r i c h e dh a e m a t o p o i e t i cstemc e l lp o p u l a t i o n .N a t u r e3 2 1: 7 与8 1 f r a c t i o n s， 1 00 S c h w a r t zZ，G o u l t s c h i n， ] DeanDD，BoyanBD.1 9 9 7 .Mechanismso fa l v e o l a rboned e s t r u c t i o ni n p e r i o d o n 世世s .P e r i o d o n t o l 2 0 0 01 4 :1 5 8 1 7 2 . S i m o n e tWS ，L a c e yDL ，D u n s t a nC ， RK e l l e yM，ChangMS，L u t h yR，NguyenHQ， WoodenS，B e n n e t lL， BooneT， Shimamo も oG，DeRoseM，E l l i o t l ， R ColomberoA， TanHL ， T r a i lG， S u l l i v a n ]，DavyE， Bucay Renshaw-GeggL， HughesT M，H i l lD， P a t t i s o nW，C a m p b e l lP， S a n d e rS， V，阻 G， Ta 中l e y ]， DerbyP， N， L e eR， Amg e nESTprogram ， B o y l eW].1 9 9 7 .O s t e o p r o t e g e r i 且: an o v e ls e c r e t e dp r o t e i ni n v o l v e di n血e r e g u l a t i o no fboned e n s i t y .C e l l8 9・ 3 0 9 3 1 9 i e s c h k eG]，G r a i lD， M e t c a l fD， HodgsonG， G a l l ]A， MaherDW， Cebon]， S i n i c k a sV，Dunn S t a n l e yE，l .1 9 9 4 .Granulocyte/macrophagec o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r d e f i c i e n tmiceshownomajor AR p e r t u r b a t i o no fh e m a t o p o i e s i sb u td e v e l o pac h a r a c t e r i s t i cp u l m o n a r yp a t h o l o g y .P r o cN a t lAcadS c iU SA9 1: 5 5 9 2 5 5 9 6 T a k a h a s h iN， M a r t i nT ] .1 9 9 2M o d u l a t i o no fo s t e oc 1 a s td i 宜u e n t i a t i o n .EndocrRev1 3: 6 6 8 0 . SudaT，目 SudaT，] i m iE，Nakamura1 ，T a k a h a s h iN .1 9 9 7 a .R o l eo f1 α， 2 5 d i h y d r o 巧v i t a m i nD 3i no s t e oc 1a s t d i f f e r e n t i a t i o nandf u n c t i o n .MethodsE n z y m o I 2 8 2 : 2 2 3 2 3 5 Nakamura1 ， ] i m iE， T a k a h a s h iN .1 9 9 7 b .R e g u l a t i o no fo s t e oc 1 a s tf u n c t i o n . ]BoneMinerR e s1 2 SudaT， 8 6 9 8 7 9 . i m iE，G i l l e s p i eM T，M紅白1T].1 9 9 9 .M o d u l a t i o no fo s t e oc 1 a s t SudaT ;T a k a h a s h iN，UdagawaN，] d i f f e r e n t i a t i o nandf u n c t i o nbyt h enewmemberso ft h etumorn e c r o s i s白c t o rr e c e p t o randl i g a n d f a m i l i e s .E n d o c rRev2 0 : 3 4 5 3 5 7 .1 9 9 9 .A newmembero ftumorn e c r o s i sf a c t o rl i g a n df a m i l y， TakahashiN，UdagawaN，SudaT ODF/OPGL/TRANCE/RANKL ，r e g u l a t e so s t e oc 1 a s td i f f e r e n t i a t i o nandf u n c t i o n .BiochemB i o p h y s R e sCommun2 5 6: 4 4 ト，4 5 5 . T a k a h a s h iN，UdagawaN，TanakaS，MurakamiH，Owan1 ，TamuraT，SudaT .1 9 9 4 .P o s t m i t o t i c 1 a s tp r e c u r s o r sa r emononu c 1e a rc e l l sw h i c he x p r e s smacrophag 争a s s o c i a t e dpheno 旬p e s .Dev o s t e oc B i o l 1 6 3: 2 1 2 2 21 . -82ー T北 amiM，T ; 北ぬa s h iN，UdagawaN，M i y a u r aC，Suda， K WooJT ，M a r t i nTJ，N a g a i， K SudaT .2 0 0 0 I n t r a c e l l u l a rc a 1 ciumandp r o t e i nk i n a s eCm e d i a t ee x p r e s s i o no fr e c e p t o ra c t i v a t o ro fnu c ! e a rf a c t o r k B l i g a n da n do s t e o p r o t e g e r i ni no s t e o b l a s t s .E n d o c r i n o l o g y1 4 1・4 7 1 147 1 9 WooJT ， N a g a iK 1 9 9 9 .O s t e o b l a s t i cc e l l si n d u c ef u s i o na n da c t i v a t i o no fo s t e o c l a s t s吐 l l " o u g l ta TakamiM， e ∞lony-stimulatingfactorproduction.Cel 1T i s s u eRes2 9 8 : 3 2 7 mechanismi n d e p e n d e n to fmacrophag 3 3 4 T品也miM， WooJT ， N a g a iK1 9 9 8 .R e q u i r e m e n to fo s t e o b l a s t i cc e l l sf o rt h ef u s i o no fo s t e o c ! a s t s .JBone Miner a 1Metab1 6 : 1 5 1 1 5 7 . TakamiM，Woo] T ， TakahashiN，SudaT，NagaiK .1 9 9 7 .C a 'i n h i b i t o r sandC a "i o n o p h o r ei n d u c e 令 ! a s tJ i k ec e l lf o r τ n a t i o ni nt h ec o c u l t u r e so fmousebonemarrowc e J lsa ndc a 1 v a r ia 1c e l l s .Biochem o s t e oc B i o p h y sR，回 Commum2 3 7 : 1 1 1 1 1 5 . T a k a y a n a g iH，K i m S，KogaT， N i s h i n aH，I s s h i k iM， Y o s h i d aH， S a i 町 aA， I s o b eM， Y o k o c h iT，I n o u eJ ， WagnerEF ， M北 τW，KodamaT，TaniguchiT.2002Inductionandactivationofthetranscriptionfactor c 1(NF A : η : )i n t e g r a t eRANf 江 s i g na 1i n gi nt e r r 凶na 1d i f f e r e n t i a t i o no fo s t e oc I a s t s . D e vC e l l .D e c ; NFAT f .9 0 1 3 ( 6 ) :8 8! TezukaK，NemotoK，TezukaY，S a t oT，I k e d aY，K o b o r iM，KawashimaH，EguchiH，Hakeday， KumegawaM.1 9 9 4 .I d e n t i f i c a t i o no fma 仕i xmet a 1 1 o p r o t e i n a s e9i nr a b b i to s t e o c !a s t s .JB i o lChem2回 : 1500ι1日0 9 TsudaE，G o t oM， M o c h i z u k iS， Yano， K KobayashiF， MorinagaT， H i g a s h i oK . .1 9 9 7 .I s o l a t i o no fan o v e l c y t o k i n ef r o mhumanf i b r o b l a s t s血 a ts p e c i f i ca 1 I yi n h i b i t so s t 田c! a s t o g e n e s i s .BiochemB i o p h y s&白 Commun234・1 3 7 1 4 2 . UdagawaN， T ; 水油a s h iN， Ak a t s uT， T血北aH， S a s a k iT， N i s h i h a r aT， KogaT， M紅白 TJ ， SudaT .1 9 9 0 . O r i g i no fo s t e oc 1a s t s :maturemonocytesandmacrophagesa r ec a p a b l eo fd i f f e r e n t i a t i n gi n t o o s t e o c l a s t su n d e ras u i t a b l em i c r o e n v i r o n m 田 t p r e p a r e dbybonem a r r o w d e r i v e ds 仕 om a 1c e J ls .P r o c Na t 1 A cadSciUSA87:7 2 6 0 7 2 6 4 -83ー UdagawaN，T a k a h a s h iN，Ka t a ε i r iT， TamuraT，WadaS，F i n d l a yD M，M a r t i n刀， H i r o t aH， TagaT， K is h i m o t oT， SudaT .1 9 9 5 .I n t e r l e u k i n( lL ) 6i n d u c t i o no fo s t e o d a s td i 旺e r e n t i a t i o nd e p e n d so nI L -6 r e c e p t ρ r se x p r e s s e dono s t e o b l a s t i cc e l J sb u tn o tono s t e o c l a s tp r o g e n i t o r s .JExpMed1 8 2 ・ 1 4 6 1 1 4 6 8 VaananenH K，K a r h u k o r p iEK，S u n d q u i s t， K Wallmarl 玉B ，R o i n i n e n1 ，HentunenT，TuukkanenJ， L a k k a k o r p iP .1 9 9 0 .E v i d e n c ef o rt h ep r e s e n c eo fap r o t o npwnpo f血ev a c u o l a rH( + ) A T P a s et y p ei n 血e ru 血e db o r d e r so fo s t 田 c l a s t s .JC e l lB i o l l l 1: 1 3 0 ι 1 3 11 . WongBR ，B e s s e rD，阻m N，ArronJ ， RV o l o g o d s k a i aM，H四 a f u s aH，ChoiY .1 9 9 9 .TRANCE，aτNF f a m 1 i ymember ，足首v a t e sAkt/PKBt h r o u g has i g n a l i n gcomplexi n v o l v i n gTRAF6andc S r c .MoJC e l l 1 0 41 10 4 9 4・， RJ o s i e n， RL eeSY ，V o l o g o d s k a i aM，S t e i n【nanRM，C h o iY .1998τbeTRAFf a m i l yo fs i g n a l WongB 8 3 5 ι 2 8 3 5 9 . t r a n s d u c e r sm e d i a t e sNF-kBa c t i v a t i o nbyt h eTRANCEr e c e p t o r .JB i o lChem2 7 3・2 YasudaH，ShimaN，NakagawaN，MochizukiS I，YanoK，F u j i s eN，S a t oY，GotoM，YamaguchiK， KuriyamaM，KannoT，MurakamiA，TsudaE，MorinagaT，HigashioK .1 9 9 8 a .I d e n t i t yo f G ) :amechanismbywhich o s t e o c l a s t o g e n e s i si n h i b i t o r yf a c t o r( O C I F )ando s t e o p r o t e g e r i n(0P c ¥ a s t o g e n e s i si nv i 仕o .E n d o c r i n o l o g y1 3 9: 13 2! ) . 13 3 7 . OPG/OCIFi n h i b i t so s t e o NakagawaN， YamaguchiK，Kin o s a k iM， M o c h i z u k iS， TomoyasuA， Yano， K Goto YasudaH，ShimaN， i g a s h i oK，UdagawaN，TakahashiN，SudaT .1 9 9 8 b . M，MurakamiA，TsudaE，MorinagaT，H O s t e o c l a s td i l i e r e n t i a t i o nf a c t o ri sal i g a n df o ro s t e o p r o t e g e r i n / o s t e o c l a s t o g e n e s i s i n h i b i t o r yf a c t o ra n d i si d e n t i c a lt oTRANCE/RANKL.P r o cNatlAcadSc iUSA9 5 :3 5 9 7 3 6 0 2 -84ー