IN Cell User’s Day 2012 発展するサイトメトリー ～ハイコンテントアナリシスを中心とした 細胞イメージングと解析技術の活用方法を考える～ ポスター発表 要旨集 発表日時 場所 2012 年 11 月 16 日（金） 13:05～13:55（奇数 13:05～13:30、偶数 13:30～13:55） 品川プリンスホテル 17 階 「オパール」 ■■ポスター発表 掲示順案内■■ ■■演題リスト■■ P-1 IN Cell Analyzer 2000 による単層カーボンナノチューブの細胞影響評価の研究 ～ナノ材料の細胞影響を形態変化で評価する～ ○永野麗子(1)、加藤晴久(1,2)、遠藤茂寿(1)、丸 田真紀子(1)、衣笠晋一(1,2)、橋本 順子(1)、中村文子(1)、篠原直秀(1,3)、内野加奈子(1)、福 尚(1)、岸本充生(1,3)、小原佐和枝(1)、藤田克英(1,3) (1)技術研究組合 単層 CNT 融合新材料研究開発機構（TASC） 、 (2)独立行政法人 計測標準研究部門、(3)独立行政法人 産業技術総合研究所（AIST） 産業技術総合研究所（AIST） 安全科学研究部門 IN Cell Analyzer 2000 によって、 単層カーボンナノチューブの A549 細胞に対する細胞影響評価 （生細胞数、 ROS、DNA 合成率、Caspase3/7）を形態数値情報（蛍光輝度面積）に変換して行った。細胞生存測定では、 従来の吸光度測定法（WST-8）と比較して核のイメージング解析が有効な値を示した。また、細胞質に局 在する ROS や Caspase3/7 の変動、DNA 合成率の減少も感度良く検出出来た。以上より、イメージング解 析はナノ材料の細胞影響評価において有用な手法であった。 P-2 新規 pH 応答性ポリアミノ酸誘導体の合成とその高分子ミセル型遺伝子キャリアへの組み込みによる細 胞内動態制御 ○服部翔太(1)、武元宏泰(1)、石井武彦(1)、長田健介(1)、位高啓史(2)、片岡一則(1) (1)東京大学大学院 工学系研究科、(2)東京大学大学院 医学系研究科 PEG-b-PLys は pDNA との静電相互作用により PIC ミセルを形成する。しかし、細胞内に侵入後、エンドソ ーム脱出という点において課題を残している。本研究ではエンドソーム脱出能に優れた PAsp(DET)をベー スに pH 応答性高分子(CCP)を合成、ミセル表層へと配置し、細胞内動態制御を目指す。実際に培養細胞を 用いて遺伝子発現効率を評価したところ、1000 倍以上の発現効率向上が認められた。 P-3 Monitoring membrane fusion by dual-functional split reporter protein ○石川大仁(1)、Fanxia Meng(2)、近藤直幸(3)、岩本愛吉(1)、松田善衛(1) (1)東京大学 医科学研究所、(2)中国科学院 生物物理研究所、(3)関西医科大学 医学部 Enveloped viruses require membrane fusion process to infect the cells. We have developed a pair of novel dual functional reporters called dual split protein (DSP) for monitoring the membrane fusion process. Each DSP is a chimeric protein between split GFP and split Renilla reniformis luciferase, which recovers both RL and GFP activities only after they reassociate. By using IN Cell Analyzer, the membrane fusion process can be monitored in the continuous, quantitative, real-time manner. P-4 IN Cell Analyzer 2000 を用いた次世代型幹細胞評価システムの開発 ○菅 三佳、館山大輝、藤木彩加、木根原匡希、柳原佳奈、古江-楠田美保 独立行政法人 医薬基盤研究所 ヒト幹細胞応用開発室 ヒト ES/iPS 細胞から安定した分化誘導を行うためには、安定して未分化状態を維持する必要があり、ヒ ト ES/iPS 細胞の未分化性を評価する方法の開発が求められている。我々は、IN Cell Analyzer 2000 を用い たヒト ES/iPS 細胞株における未分化/分化マーカーの発現陽性率及び細胞・コロニー形態を指標とする品 質評価法を開発している。本法はより正確且つ安定に細胞を評価でき、ヒト ES/iPS 細胞の産業応用促進 の一助となると考えられる。 P-5 IN Cell Analyzer 1000 を用いたメラニン合成の定量化とメラニン合成阻害物質のスクリーニング ○村松康範 第一三共 RD ノバーレ株式会社 IN Cell Analyzer 1000 を用いて、メラニン合成量を定量するアッセイ系を構築した。 384 穴プレートを用いてメラニン合成促進剤添加培養を 6 日行った後、IN Cell Analyzer 1000 で画像を取 得し、黒色化面積を解析した結果、メラニン合成促進剤非添加培養を Low control とした場合、Z’=0.58 が 得られた。 このアッセイ系で化合物サンプルのパイロットスクリーニングを行ったところ、active サンプルが複数得 られた。 従来行われているメラニン可溶化吸光度法では細胞毒性を有して false positive となるサンプルは、IN Cell 法では効率的に除くことが可能であった。 P-6 IN Cell Analyzer 2000 から見えた癌細胞の“全か無”様薬剤反応 ○久米浩平(1,2)、西塚 哲(2)、前沢千早(1)、若林 剛(2) (1)岩手医科大学 医歯薬総合研究所、(2)岩手医科大学 医学部 外科学講座 外部刺激に対して個々の細胞が固有の閾値を持って反応する現象は様々な生体組織において観察される。 この現象は、個々の細胞の過剰反応性やフィードバック機構が双安定性を誘導することで達成され、細 胞集団のリスク回避に寄与していると考えられる。癌細胞にとって抗癌剤接触は回避されるべきリスク であるが、核内 p53 を指標とした癌細胞の抗癌剤への反応において細胞集団の双安定性を示唆するデー タが得られたので報告する。 P-7 VIP36 is a target of ectodomain shedding and regulates phagocytosis in macrophages ○白壁恭子 慶應義塾大学 医学部 シェディングは膜貫通型の蛋白質を膜近傍で切断し細胞外領域を可溶化するという、切断される膜蛋白 質のみならずそれを発現する細胞をも制御する翻訳後修飾機構である。我々は、プロテオミクス解析を 用いて VIP36 という膜蛋白質がマクロファージ細胞でシェディングされる事を明らかにするとともに、IN Cell Analyzer を用いて VIP36 のシェディングが貪食を活性化する事を明らかにした。 P-8 神経幹細胞、癌幹細胞の自己複製的増殖、細胞生存能を制御する転写後調節機構の解析 ○今井貴雄(1)、武藤 淳(1,2)、河瀬 聡(1)、岡野栄之(1) (1)慶應義塾大学 医学部 生理学、(2)慶應義塾大学 医学部 脳神経外科学 幹細胞の性質は転写制御のみならず転写後調節によって精妙に規定されている。 我々は、神経幹細胞と脳腫瘍細胞（グリオーマ）で共通して発現している RNA 結合蛋白質に着目し、そ の下流標的 mRNA を探索することによって、脳腫瘍を生じる癌幹細胞的性質を示す細胞の自己複製的増 殖、細胞生存能を翻訳調節が制御していることを明らかにした。IN Cell Analyzer を使用した成果を含んで おり、本会において紹介する。 P-9 肝再生時に誘導される肝細胞の肥大と特殊な細胞周期制御 ○江波戸一希(1)、宮岡佑一郎(2)、加藤英徳(3)、宮島 (1)東京大学大学院 物学研究所 理学系研究科 篤(3) 生物化学専攻、(2)UCSF Gladstone Institute、(3)東京大学 分子細胞生 発生・再生研究分野 肝再生モデルとして利用される 70%部分肝切除後では、主に肝細胞の増殖が肝再生を進行させると考え られてきた。しかしながら IN Cell Analyzer を用いた手法により、部分肝切除後の肝再生では初めに細胞 の肥大が誘導され、肥大だけでは補償できない際に増殖するという新規モデルを構築した。また部分肝 切除後の肝細胞の核の挙動を解析することによって明らかとなった、肝細胞の特殊な細胞周期機構につ いても報告する。 P-10 ヒト iPS 細胞培養における脱未分化現象の速度論的解析 ○稲森雅和、金 美海、紀ノ岡正博 大阪大学大学院 工学研究科 生命先端工学専攻 ヒト人工多能性幹細胞 (iPS 細胞) を用いた再生医療や創薬などの産業的利用に向けた、良質な iPS 細胞を 安定して提供するためには、未分化維持培養方法としての培養環境の改良や評価手法の 確立が不可欠で ある。これまで、ヒト iPS 細胞の継代培養において、研究者の経験や操作条件により細胞コロニーのサイ ズや未分化能などが異なるコロニーの不均一性が確認された。本研究では、ヒト iPS 細胞の培養中の自発 的に発生する脱未分化現象に着目し、異なるフィーダー上でのヒト iPS 細胞の脱未分化現象の速度論的に 解析を行った。 P-11 IN Cell Analyzer を用いたマウス肝臓組織標本に見られる脂肪肝の定量評価 ○杉原 崇、田中 聡、田中ブラガ、田中公夫 公益財団法人 環境科学技術研究所 生物影響研究部 目的： （公財）環境研ではマウスに低線量率(20 mGy/ 22h/ d)連続放射線照射を行っている。これらのマウ スの病理診断を行った結果、照射群マウスの肝臓では脂肪肝の重篤度、発生頻度共に多いことが確認さ れた。そこで、本研究ではこれらマウスパラフィン標本の脂肪肝を IN Cell Analyzer による画像解析手法 で定量評価することを目的とした。 方法と原理：病理学診断によって脂肪肝と診断されたマウスパラフィン標本を IN Cell Analyzer によって 撮影後、肝組織にみられる空胞を画像解析ソフト IN Cell Developer Toolbox により定量解析（空胞の総面 積/組織総面積）を行い、病理診断結果と比較した。 結果：脂肪肝を持つマウス肝臓のパラフィン標本は脂肪肝に特徴的な空胞を有する。顕微鏡観察による マウス肝臓の脂肪肝の重篤度（空胞の大きさを基準に Severe、Moderate、Mild と分類）と発生頻度を病 理学者の診断基準で診断したところ、照射群マウスの肝臓では非照射群に比べて重篤度、発生頻度共に 多いことが確認された。マウスパラフィン標本を IN Cell Analyzer によって撮影し、画像解析ソフトを用 いて画像の定量化を行ったところ、病理学診断による重篤度の診断基準と同様の結果が得られた。その ため、本結果は肝臓組織における脂肪肝の重篤度を IN Cell Analyzer によって定量評価できることを示唆 する。 （本研究は、青森県からの受託事業により得られた成果の一部である。 ） P-12 Screening of new inhibitors of sphingolipid metabolism by IN Cell Analyzer ○Françoise Hullin-Matsuda(1,2), Nario Tomishige(1), Kumiko Ishii(1), Reiko Ishitsuka(1), Shota Sakai(1), Peter Greimel(1), Asami Makino(1), Mitsuhiro Abe(1), Elad L. Laviad(3), Kentaro Hanada(4), Anthony H. Futerman(3), Toshihide Kobayashi(1,2) (1)Lipid Biology Laboratory, RIKEN, Wako, Saitama 351-0198, Japan, (2)Inserm U1060-Université Lyon1, 69621 Villeurbanne, France, (3)Dept. of Biological Chemistry, Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel, (4)Dept. of Biochemistry and Cell Biology, National Institute of Infectious Diseases, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8640, Japan In order to identify novel inhibitors of sphingomyelin (SM) metabolism, a new and selective high-throughput screening using IN Cell Analyzer and based on the toxicity of the SM-specific toxin, lysenin, was developed. Out of a library of 2011 natural compounds, the limonoid, 3-chloro-8 -hydroxycarapin-3,8-hemiacetal (CHC), rendered cells resistant to lysenin by decreasing cell surface SM. CHC treatment selectively inhibited the de novo biosynthesis of SM without affecting other lipid biosynthesis. Pretreatment with brefeldin A abolished the limonoid-induced inhibition of SM synthesis suggesting that the transport of ceramide (Cer) from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi apparatus was affected. Like the Cer transporter (CERT) inhibitor HPA-12, CHC inhibited the conversion of de novo synthesized Cer to SM and specifically inhibited the CERT-mediated extraction of Cer from ER membranes in vitro. Model membrane studies suggest that other limonoids like gedunin which exhibits anti-cancer and anti-malaria activity, reduced the miscibility of Cer with membrane lipids and thus induced the formation of Cer-rich membrane domains. Our study shows that certain limonoids are novel inhibitors of SM biosynthesis and suggests that some of their biological activities are related to their effect on the ceramide metabolism. P-13 Academic High-Content Analysis: Applications in Basic and Translational Research Justin Boyd(1), Robert Graves(2), Mark Campion(2), Marcie Glicksman(1) (1)Laboratory of Drug Discovery in Neurodegeneration, Harvard NeuroDiscovery Center, Brigham and Women’s Hospital, Cambridge, MA 02139, (2)GE Healthcare High Content Analysis at Laboratory of Drug Discovery in Neurodegeneration (LDDN) functions 1) to facilitate the translation of imaged-based academic research to drug discovery projects 2) to provide core imaging and analysis support to academic research labs who can benefit from automated, quantitative image analysis in order to expedite projects which would otherwise be limited to using conventional, time- and labor-intensive imaging platforms. High-Content Analysis (HCA) which utilizes a highthroughput automated fluorescent microscope coupled with multi-parameter image analysis, is a powerful and rapidly advancing approach to the study of cellular processes, and is used both in research and drug discovery applications. The LDDN uses a GE IN Cell Analyzer 2000 High-Content image analysis system to run a large variety of applications. Here we present five case studies with distinct applications where HCA has been utilized at LDDN in collaboration with academic labs. We demonstrate the strengths and versatility of the platform for academic research. P-14 Automated 1536-well High-Content Screen for Compounds that Disassemble the Perinucleolar Compartment (PNC) Steve Titus, Robert Graves GE Healthcare The perinucleolar compartment (PNC) is a potential biomarker for the metastatic phenotype in solid tumor cancer cells, since PNC prevalence in such cells is indicative of tumor malignancy both in vitro and in vivo. The PNC is highly enriched with small RNAs and RNA binding proteins, and although its function is still unknown, it provides a novel target for drug discovery and biomarker development. An automated 1536-well highcontent screening assay to measure PNC prevalence in human prostate cancer cells (PC-3M) stably expressing a PTB1-GFP fusion protein that localizes to the PNC, has been developed at the NIH Chemical Genomics Center (NCGC), National Human Genome Research Institute, Bethesda, Maryland. Since PNC foci range in size from 0.5-4 microns, the screening assay requires use of high magnification, high resolution automated microscopy with quantification of foci using image analysis. The published screen utilized first-generation instrumentation and analysis software from GE Healthcare (IN Cell Analyzer 1000) and custom data management software. Here we examine the use of current instrumentation (IN Cell Analyzer 2000 and 6000) and IN Cell Miner High-Content Manager (HCM) for data handling. The authors acknowledge the generous supply of fixed assay plates from the NCGC (Wei Zheng and Melanie Bryant). P-15 Multiplexed study of Cell Signaling Nodes using High-Content Analysis Robert Graves(1), Randall K. Wetzel(2), Mark Campion(1), Christopher Manning(2) (1)GE Healthcare, (2)Cell Signaling Technology, (3)Trask Lane, Danvers, MA 01923 Activation state-specific antibodies (e.g., phosphorylation) can be combined with sensitive high-resolution high-content imaging platforms in cell-based assays to elucidate disease-related signaling, identify key biomarkers, or to monitor therapeutic efficacy of novel compounds. We have used a Cell Signaling Technology PathScan® Signaling Nodes Multiplex IF Kit (www.cellsignal.com) containing a four-color panel (three antibodies and a DNA dye) to simultaneously monitor three key signaling nodes that are important readouts for general receptor kinase signaling – phospho-Akt (Ser473), phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), and a downstream target of both, phospho-S6 ribosomal protein (Ser235/236). Here, we demonstrate the use of this panel with multiplexed fluorescent imaging using IN Cell Analyzer 6000 High-Content Cellular Analysis System (GE Healthcare) to quantify cellular signaling. P-16 Flexible high-throughput high-content imaging system for analysis of kinetic cellular assays Hayley Tinkler, Alla Zaltsman, Angela Williams, Elizabeth Roquemore, Robert Graves GE Healthcare A variety of cell-based applications, that are typically addressed in cellular research and screening facilities, especially in the multi-user environment, require versatility of equipment. IN Cell Analyzer 6000 is a flexible laser-based high-throughput confocal imaging system that can be configured to meet the requirements for imaging of a large variety of biological samples and imaging conditions. Along with variable aperture design, CMOS-based detection which provides image quality, effective background rejection and imaging speed, instrument features include the choice of four objectives, a range of matching filters, intelligent kinetic scheduling and optional modules, such as environmental control and liquid handling. IN Cell Analyzer 6000 liquid handling module coordinates reagent dispensing and time-series image acquisition to initiate and capture a range of dynamic cellular events over time. Coupled with the powerful image analysis capabilities of IN Cell Investigator this enables a deep insight into the mechanisms of such kinetic responses. Here we show examples of the use of IN Cell Analyzer 6000 and IN Cell Investigator for dynamic imaging and analysis of some assays, with cellular responses ranging from 3 sec (Carbachol-induced Calcium flux) to 30 min (FYVE assay). An example of a 4 min response (AKT assay) is also demonstrated. P-17 Leveraging human embryonic stem cells to provide an improved model for in vitro cardiotoxicity testing Elizabeth Roquemore(1), Catherine Hather(1), Alex Harrison(2), Nick Thomas(1), Hirdesh Uppal(3) (1)GE Healthcare, (2)Cardiff School of Biosciences, Biomedical Sciences Building, Museum Avenue, Cardiff, CF10 3AX, (3)Genentech 1 DNA Way, South San Francisco CA 94080 USA Cardiotoxicity is one of the most prevalent types of drug toxicity. Current cell models for in vitro preclinical cardiotoxicity testing do not provide adequate predicitivity, which has resulted in an increased demand for more relevant human cell models. In conjunction with the need for better predictivity, there is a drive to reduce the risk of late-stage failures in drug development programs by screening more drug candidates for cardiotoxicity earlier in the development process. This in turn is driving demand for more abundant and reliable cell supplies, as well as higher throughput assays for cardiotoxicity testing. Human embryonic stem cells (hESC) provide a renewable source of cells for large scale production of differentiated cardiomyocytes suitable for preclinical testing. We have established an efficient, scalable expansion and differentiation protocol for the production of cardiomyocytes that have been characterized by flow cytometry, quantitative PCR, immunocytochemistry and electrophysiology. Studies conducted with hESC-derived Cytiva cardiomyocytes demonstrate their utility in identifying and classifying clinically cardiotoxic drugs on the basis of elecrophysiological responses and pleiotropic changes in cell phenotype detected by high content analysis (HCA). The data support the adoption of hESC-derived cardiomyocytes as a single model system that can be applied across a diverse range of cardiotoxicity testing applications to generate complementary data for more comprehensive safety assessment. P-18 OrisTM Pro 384 Cell Migration Assays run on IN Cell Analyzer 6000 Robert Graves(1), Keren I. Hulkower(2) HaiGuang Zhang(1), June Davies(1) (1)GE Healthcare, (2)Platypus Technologies, LLC. 5520 Nobel Dr., Suite 100, Madison, WI 53711 Cell migration and invasion both play important roles in many physiological and pathological processes such as wound healing and metastasis of cancer cells. As these processes provide potential molecular targets for the development of novel therapeutics, there is significant effort to develop physiologically relevant assays suitable for high-throughput screening of compound libraries. Highcontent imagers like GE Healthcare’s IN Cell Analyzer 6000 are suitable instrumentation platforms for these applications by providing high-throughput multiwavelength image acquisition at single-cell resolution, coupled with fast image analysis software, thus enabling collection of multiple end-point data in a single study. P-19 Antibody analyses with Biacore system - convenient , sensitive, versatile Ewa Pol, Anna Moberg, Robert Karlsson GE Healthcare SPR を用いた相互作用測定技術は、装置感度の向上や周辺試薬・プロトコルの開発により、簡便性と適用 範囲が改善されてきています。 今回抗体の相互作用測定を例にとり、固定化の簡便化、多価結合分子や細胞の相互作用測定に関する結 果をご紹介します。 P-20 ラボスケールにおけるリコンビナント抗体大量調製フローの効率化 GE Healthcare 川合 重人 様（株式会社未来創薬研究所）が構築されたリコンビナント抗体の大量調製フローをご紹介 いたします。 培養スケール 10 L における抗体調製の効率化を試みた例で、細胞培養装置 WAVE Bioreactor SYSTEM 2/10EH や限外ろ過装置 QuixStand System を用いることで、従来の方法より抗体調製にかかる時間が大 幅に短縮され、かつ抗体収量をあげることが可能になりました。 www.gelifesciences.co.jp ＊本資料は、GEヘルスケア・ジャパン株式会社に帰属します。無断転載、無断コピー、二次使用を禁じます。 掲載されている内容は2012年10月現在のものです。掲載されている製品は試験研究用以外には使用しないでください。掲載されている内容は予告なく変更される場合がありま すのであらかじめご了承ください。掲載されている社名や製品名は、各社の商標または登録商標です。
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