免疫染色ガイド No. 5

IHC STAINING GUIDE No.5
EnVisionTM+/HRP ‌ホルマリン固定パラフィン包埋切片での
標準染色プロトコール
使用する主な試薬
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EnVisionTM+ ポリマー試薬（標識二次抗体）
・一次抗体としてマウスモノクローナル抗体を使用する場合：
EnVisionTM+ ポリマー試薬＜マウス一次抗体用＞／HRP 標識（Code No. K4000/K4001）
・一次抗体としてウサギポリクローナル（またはウサギモノクローナル）抗体を使用する場合：
EnVisionTM+ ポリマー試薬＜ウサギ一次抗体用＞／HRP 標識（Code No. K4002/K4003）
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前処理用試薬
・抗原賦活用緩衝液：IHC STAINING GUIDE No.3, No.4（抗原賦活法｜熱による抗原賦活処理, 抗原賦活液）参照
・タンパク分解酵素処理試薬：IHC STAINING GUIDE No.2（抗原賦活法｜タンパク分解酵素処理）参照
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内因性パーオキシダーゼブロッキング試薬
・ Dako REAL パーオキシダーゼブロッキング試薬（Code No. S2023）
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抗体希釈用緩衝液
・ Dako REAL 抗体希釈液（Code No. S2022）
・抗体希釈用緩衝液, Tween 含有（Code No. S3022）
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発色試薬
・ HRP 発色試薬：ダコ DAB+ 基質キット（Code No. K3467/K3468)
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洗浄用緩衝液
・ Wash Buffer（0.05% Tween20, 0.15mol/L NaCl 含有 0.05mol/L トリス塩酸緩衝液（pH7.6）／10 倍濃縮）
（Code No. S3006）
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対比染色用試薬
・ Autostainer ヘマトキシリン（Code No. S3301）など
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封入剤
・非水溶性封入剤：マリノール、ENTELLAN new（他社製品）など
No. 5
染色手順
Step 1 脱パラフィン・親水化
Step 2 抗原賦活処理
・熱による抗原賦活処理
・タンパク分解酵素処理
ホルマリン固定パラフィン包埋切片の場合は、脱パラフィン・親水化処理後、使用する一次抗体の種類と染色する標
本の固定状況に応じて適切な抗原賦活処理を行います。
至適抗原賦活処理条件については、使用する一次抗体の添付文書や Speciﬁcation sheet をご確認ください。
抗原賦活処理実施手順は「IHC STAINING GUIDE No.3（抗原賦活法 | 熱による抗原賦活処理）」をご参照ください。
Step 3 内因性パーオキシダーゼのブロッキング
1）切片上の余分な試薬を取り除き、パーオキシダーゼブロッキング試薬をスライドに滴下し、常温で 5～10 分間反
応させます。
2）洗浄液で切片上の試薬を洗い流した後、スライドを新しい洗浄液に 5 分間浸漬し、さらにこの浸漬操作を 2 回
行います。
Step 4 一次抗体の反応
1）切片上の余分な試薬を取り除き、至適希釈倍率に希釈した一次抗体をスライドに滴下し、常温で 30～60 分間反
応させます。
2）洗浄液で切片上の試薬を洗い流した後、スライドを新しい洗浄液に 5 分間浸漬し、さらにこの浸漬操作を 2 回
行います。
Step 5 EnVisionTM+ ポリマー試薬の反応
使用する一次抗体の種類に応じて、EnVisionTM+ ポリマー試薬＜マウス一次抗体用＞/HRP 標識か EnVisionTM+ ポリ
マー試薬＜ウサギ一次抗体用＞/HRP 標識のどちらかを選択します。
1）切片上の余分な試薬を取り除き、EnVisionTM+ ポリマー試薬をスライドに滴下し、常温で 30～60 分間反応させます。
2）洗浄液で切片上の試薬を洗い流した後、スライドを新しい洗浄液に 5 分間浸漬し、さらにこの浸漬操作を 2 回
行います。
Step 6 発色（DAB+）
基質溶液の調製：あらかじめ必要な量を求め、基質溶液を調製します。基質緩衝液 1mL に対して発色基質 1 滴の
割合で加え混和します。基質溶液は、2～8℃で保存の場合、調製後約 5 日間安定です。
1）切片上の余分な試薬を取り除き、調製した基質溶液をスライドに滴下し、常温で 1～10 分間反応させます。
2）スライドを精製水に浸漬します。
Step 7 ヘマトキシリンによる対比染色
十分に水洗後、ヘマトキシリンによる対比染色、色出しを行います。
Step 8 脱水・透徹・封入
定法に従い、脱水、透徹し、封入します。
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掲載内容は、2010 年 8 月のものです。掲載内容は予告なく変更する場合がありますので、あらかじめご了承ください。

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