独立行政法人科学技術振興機構協定事業 平成 26 年度サイエンス・リーダーズ・キャンプ タンパク質研究の先端技術を活用した 実践型次世代生命科学教育 業 務 成 果 報 告 書 国立大学法人愛媛大学 プロテオサイエンスセンター ┠㻌 㻌 㻌 㻌 ḟ㻌 㻌 䠄䠍䠅䝥䝻䜾䝷䝮ྡ䚸ᐇᶵ㛵ྡ㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻟 㻌 䠄䠎䠅ᴗົ䛾┠ⓗཬ䜃䝥䝻䜾䝷䝮䛾┠ᶆ㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻟 䜰䠊ᴗົ䛾┠ⓗ㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻟 䜲䠊ᐇᶵ㛵䛾䝥䝻䜾䝷䝮䛾┠ᶆ㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻠 㻌 䠄䠏䠅ᐇෆᐜ䛸ᡂᯝ㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻡 䜰䠊ᐇෆᐜ㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻡 㻣 ᭶ୖ᪪䛛䜙䜻䝱䞁䝥ᙜ᪥䜎䛷㻌㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻚㻌㻡 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MALDI-TOFMSƴǑǔЎ܇ยܭ ƂBFPƃ 467. 1 100 15430.17 90 15774.50 11679.00 90 28527.49 80 70 70 60 % I n ten si ty % I nt ensi t y 2861. 4 100 18184.38 80 50 40 10469.10 10347.64 60 10603.41 50 12236.24 18170.64 13484.05 40 26791.93 15409.92 30 30 20 20 10 10 0 10000. 0 0 15000. 0 18000. 2 21000. 4 24000. 6 27000. 8 14000. 2 18000. 4 22000. 6 0 30001. 0 26000. 8 Mass (m/ z) 0 30001. 0 M ass ( m / z) ٻᐂᓏϋưӳƠƨᖩήǿȳȑǯឋ MALDI-TOFMSƴǑǔЎ܇ยܭ ƂRFPƃ ٻᐂᓏϋưӳƠƨᖩήǿȳȑǯឋ MALDI-TOFMSƴǑǔЎ܇ยܭ ƂOFPƃ Voyager Spec #1[BP = 1455.3, 16651] 100 2158. 2 100 25293.03 80 90 % I n ten si ty 70 60 18174.06 10761.30 10242.72 10108.94 12641.75 25229.21 50 60 50 40 40 30 30 18157.99 10802.60 10552.06 13477.11 11288.32 13573.24 12985.38 20 20 10 0 10000 1579. 4 10462.01 70 % I n t en si t y 80 11669.89 90 26741.32 17704.49 18115.86 26709.05 26847.54 18006.01 10 14000 18000 22000 26000 0 30000 0 10000 Mass (m/ z) 15000 20000 25000 Mass (m/ z) 69 30000 0 35000 SDS-PAGEƴǑǔЎ܇Ʒਖ਼ܭ MALDI-TOFMSƴǑǔЎ܇ยܭ ȷ ȷ ᖩήǿȳȑǯឋ Ў܇Ტ᳥DaᲣ GFP BFP RFP OFP ᲬᲰᲨᲲᲭᲫᲯᲯ ٻᐂᓏኒ Ў܇Ȟȸǫȸ A B C D E F G H 97.0 ᲬᲰᲨᲱᲳᲫᲳᲭ 66.0 45.0 ᲬᲯᲨᲬᲳᲭᲪᲭ 30.0 ᲬᲰᲨᲱᲮᲫᲭᲬ ኬᏘኒ #᳸' ٻᐂᓏϋưᖩήǿȳȑǯឋǛӳ AᲴGFP BᲴBFP CᲴRFP DᲴOFP EᲴdzȳȈȭȸȫ (᳸*Ჴ dzȠǮኬᏘኒưᖩήǿȳȑǯឋǛӳ FᲴGFP GᲴRFP HᲴdzȳȈȭȸȫ 21.1 GFP,BFP,OFPƸŴDŽDžӷơЎ܇Ტኖ26.7᳸26.8᳥ DaᲣưƋǔŵ RFPƷLjŴǍǍЎ܇ƕݱƞƍŵ 14.4 MALDI-TOFMSưࢽǒǕƨЎ܇ƱƷൔ᠋ SDS-PAGEƴƓƍƯЎ܇ƕٻƖƘƳǔྸဌ ᲢٻᐂᓏϋưӳƞǕƨᖩήǿȳȑǯឋƷൔ᠋Უ żǢȟȎᣠኵƴǑǔئӳŽ ĬǿȳȑǯឋƴԃLJǕǔျ൦ࣱǢȟȎᣠƕݲƳƍŵ ЍSDSƷȉȇǷȫؕƸျ൦ࣱǢȟȎᣠസؕƴኽ ӳƢǔŵ Ѝျ൦ࣱǢȟȎᣠƕݲƳƍئӳŴҗЎƷSDS ƕኽӳưƖƳƍŵ ЍȞǤȊǹƷᩓᒵǛ࠘ƼǔƕݲƳƘƳǓපѣ ƕƘƳǔŵ ЍЎ܇ƕٻƖƘƳǔŵ • μ˳ႎƴSDS-PAGEưਖ਼ܭƞǕƨЎ܇Ʒ૾ ƕٻƖƍŵ • RFPƷЎ܇Ƹ˂ƷᖩήǿȳȑǯƱൔ᠋Ƣǔ ƱஇNjݱƞƍƸƣƩƔŴSDS-PAGEưƸGFP ǍBFPǑǓٻƖƍ͌ƱƳƬƯƍǔŵ • OFPƷЎ܇ƸGFPǍBFPƱӷᆉࡇưƋǔƸ ƣƩƔŴƔƳǓٻƖƍ͌ƱƳƬƯƍǔŵ ǢȟȎᣠኵൔ᠋ ĭദᩓᒵǛNjƭǢȟȎᣠƕٶƘԃLJǕǔŵ ЍദƷᩓᒵǛٶƘǢȟȎᣠƷлӳƕٶƍئӳŴ SDSƴǑǔƷᩓᒵǛƪෞƢئӳƕƋǔŵ ЍƷᩓᒵƕƢƘƳƍƨNJŴᩓൢපѣƕƘ Ƴǔŵ ЍЎ܇ƕٻƖƘƳǔŵ 70 ᲢǢᲣျ൦ࣱǢȟȎᣠƷԃஊૠƱлӳ ዮǢȟȎᣠૠ ျ൦ࣱǢȟȎᣠૠ 䠣䠢䠬 㻞㻟㻥 㻝㻜㻣 䠞䠢䠬 㻞㻟㻥 㻝㻜㻣 䠮䠢䠬 㻞㻞㻡 㻥㻝 䠫䠢䠬 㻞㻟㻢 㻝㻝㻜 лӳ㻔㻑㻕 㻠㻠㻚㻤㻌 㻠㻠㻚㻤㻌 㻠㻜㻚㻠㻌 㻠㻢㻚㻢㻌 ᲢǤᲣദᩓᒵǛNjƭǢȟȎᣠƷԃஊૠƱлӳ ዮǢȟȎᣠૠ ദᩓᒵǛNjƭǢȟȎᣠૠ 䠣䠢䠬 㻞㻟㻥 㻟㻡㻌 䠞䠢䠬 㻞㻟㻥 㻟㻢㻌 䠮䠢䠬 㻞㻞㻡 㻟㻠㻌 䠫䠢䠬 㻞㻟㻢 㻟㻢㻌 лӳ㻔㻑㻕 㻝㻠㻚㻢㻌 㻝㻡㻚㻝㻌 㻝㻡㻚㻝㻌 㻝㻡㻚㻟㻌 ᲢǦᲣᩓᒵǛNjƭǢȟȎᣠƷԃஊૠƱлӳ ዮǢȟȎᣠૠ ᩓᒵǛNjƭǢȟȎᣠૠ 䠣䠢䠬 㻞㻟㻥 㻟㻠㻌 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般の高校では実施が困難な実験を体験し，「遺伝情報の流れ」や「DNAとタンパク質の働き」を理解させるために必要とな る「生命現象を分子レベルで理解する素養」を体得すること，および研究センターにおける先端研究の見学や才能教育に関 する講義などによって，学習レベルを超えた高度な課題研究なども実施できるようになること，にあります。そのため，キャ ンプ参加者は，勤務地において生命を理解するための授業を実践する一方で，より高度な課題研究や教材などを考案し， その情報を共有することも求められています。 各県の教育委員会などから推薦を受けた20人の化学あるいは生物担当の高校教員（東京都，長野県，滋賀県，岡山県， 広島県，各2人，愛知県，京都府，奈良県，和歌山県，大阪府，兵庫県，山口県，香川県，徳島県，熊本県，各1人）は，ま ず，プロテオリサーチ領域の林秀則教授から，遺伝子とタンパク質に関する講義を受けた後，理工学研究科の大学院生お よび理学部学生などから指導を受けながら実験に取り組みました。 1日目に，DNA断片を接続して組換えDNAを作製し，これを大腸菌に導入しました。2日目には，本キャンプの目玉となるコ ムギ胚芽による無細胞タンパク質合成実験を，高校向け教材として市販されているキットを主に用いて実施しました。また， キャンプ終了後の情報共有を目的として，本学のe-ラーニングのサイトの利用法を学習しました。午後には，坪井敬文セン ター長から，マラリアワクチンの開発状況や，プロテオリサーチ領域の各研究において研究内容や実験装置などの説明を 受けました。 本学学生の指導を受けながら実験開始 無細胞タンパク質合成に用いるRNAの確認 169 http://www.ehime-u.ac.jp/education/news/detail.html?new_rec=12008 1/3 2015/3/14 詳細／教育活動トピ ックス／教育｜愛媛大学 e-ラーニングの実習 マラリアの観察（重信ステーション） 3日目は，遺伝子組換えによって作られたタンパク質を電 気泳動によって分析したり，質量分析装置による測定を見 学したりしました。また，高崎健康福祉大学の片山豪教授 および丸亀城西高校の藤本博文教諭から「無細胞タンパ ク質合成実験の授業の導入例」，隅田学准教授から「才能 教育への展開」など，実践に向けての講義を受けました。 午後からは重信キャンパスで，プロテオイノベーション領 域の今村健志教授から，生きた状態での生体微細構造の 解析について，プロテオメディシン領域の武森信暁教授か ら，質量分析の医療への応用に関する講義を受けました。 そして，各研究部門において，研究対象や先端設備を見 タンパク質の電気泳動 学しました。 多くの参加者にとって，ほとんど初めての実験もあり，器具の使い方や試薬の成分，各操作の意義などを学生補助員に 熱心に質問していました。また，見学では，活発な質問と説明が交わされ，「生命科学の現状と医学への応用について聞く ことができ，高校生に教えるときにより具体的なイメージをもって教えることができる」といった感想が聞かれました。 さらに，4日目には，テレビ会議システムを用い，米国サンタクルーズから遠藤弥重太特別栄誉教授による「生命って？私 って？〜神秘的な生命の原理を探ってみよう」と題した講義を受けました。参加者は，海外との双方向授業に感動した様子 でした。 米国サンタクルーズの遠藤特別栄誉教授とともに 夕食後の時間にはポスターセッションを行い，新しい学習指導要領に関連した実験授業や探究活動，あるいは生命活動 を分子レベルで理解させるための教材などについて活発な討議をしました。最終日には参加者が5班に分かれ，それぞれ 指示されていたテーマについてキャンプ中の実験の結果や考察を発表し，活発な討議によって内容の理解を深めました。 170 http://www.ehime-u.ac.jp/education/news/detail.html?new_rec=12008 2/3 詳細／教育活動トピ ックス／教育｜愛媛大学 2015/3/14 各自が考案した実験教材などを相互に紹介 実験結果と考察の発表 このような参加者自らの積極的な取組みや教材に関する質問などから，今後，キャンプに参加した教員が，無細胞タンパ ク質合成法やタンパク質の分析などの実験を授業に取り入れ，分子生物学や生化学に関連した生命科学教育が高校でも 実施されること，また本学における生命科学の研究が県外の多くの高校生に紹介されることが期待されます。 参加者の集合写真 プログラム概要 （PDFファイル 181KB） サイエンス・リーダーズ・キャンプHP 新しい高校教科書「生物」 （PDFファイル 2,269KB） ＜プロテオサイエンスセンター＞ 前のページに戻る ページの先頭へ戻る 171 http://www.ehime-u.ac.jp/education/news/detail.html?new_rec=12008 3/3 ᏛⓎ⾲㻌 㻌 ᐇ᪥䞉ྲྀᮦ᪥➼㻌 Ⓨ⾲ྡ䞉ྲྀᮦྡ➼㻌 Ⓨ⾲⪅➼㻌 ᡤᒓ䞉Ặྡ㻌 ෆᐜ㻌 㻌 ᖹᡂ䠎䠓ᖺ㻌 䠍᭶䠍䠌᪥䠄ᅵ䠅㻌 ᪥ᮏ⏕≀ᩍ⫱Ꮫ㻌 ឡᏛ䞉ᯘ㻌 ⚽๎䚸㧗ᓮᗣ⚟♴Ꮫ䞉∦ᒣ㻌 䚸ឡᏛ䞉ᆤ㻌 ᩗᩥ䚸ឡ Ꮫ䞉㐲⸨㻌 ᘺ㔜ኴ㻌 䛂䝍䞁䝟䜽㉁◊✲䛾ඛ➃ᢏ⾡䜢ᇶ┙䛸䛩䜛ᐇ㊶ᆺḟୡ௦⏕⛉Ꮫᩍ⫱䜢┠ᣦ 䛧䛯䝃䜲䜶䞁䝇䞉䝸䞊䝎䞊䝈䞉䜻䝱䞁䝥䛾ྲྀ䜚⤌䜏䛃䛸䛔䛖⾲㢟䛷㻌 ᮏ䜻䝱䞁䝥䛾┠ⓗ䞉┠ᶆ䚸ᐇ⩦䛾ෆᐜ䜔ᵝᏊ䚸䛚䜘䜃ཧຍ⪅䛻䜘䜛ົᰯ➼䛻 䛚䛡䜛ᤵᴗ䛾ᐇ䜔య㦂ሗ࿌➼䛾䜢⤂䛧䛯㻌 㻌 ᐇ᪥䞉ྲྀᮦ᪥➼㻌 Ⓨ⾲ྡ䞉ྲྀᮦྡ➼㻌 Ⓨ⾲⪅➼㻌 ᡤᒓ䞉Ặྡ㻌 ෆᐜ㻌 㻌 ᖹᡂ䠎䠓ᖺ䠍᭶䠍䠌᪥䠄ᅵ䠅㻌 ᪥ᮏ⏕≀ᩍ⫱Ꮫ㻌 㧗ᓮᗣ⚟♴Ꮫ䞉∦ᒣ䚸ᯘ⚽๎ឡᏛ㻌 䛂ヨ㦂⟶ෆ䛷㌿䞉⩻ヂ䜢⌧䛩䜛ᐇ㦂ᩍᮦ䛾ᬑཬ㻌 䠉䝁䝮䜼⬇ⱆ↓⣽⬊䝍䞁 䝟䜽㉁ྜᡂ⣔䜢⏝䛔䛯 㼘㼍㼏㼆 Ⓨ⌧⣔䛻䜘䜛⩻ヂ䛾ྍど䠉䛃䛸䛔䛖₇㢟䛷ឡ Ꮫ䛾㐲⸨ᰤᩍᤵ䛾㛤Ⓨ䛧䛯䝁䝮䜼⬇ⱆ↓⣽⬊ྜᡂ⣔䜢⏝䛔䛯㌿⩻ヂ 䜻䝑䝖䛾 㼓㼒㼜㻌 㻔㻳㻲㻼 㑇ఏᏊ㻕Ⓨ⌧⣔䛾᭰䜟䜚䛻 㼘㼍㼏㼆 Ⓨ⌧⣔䜢⤌䜏㎸䜏䚸䜻䝑䝖౯ ᱁䛸ᛂ㛫䜢䜽䝸䜰䞊䛷䛝䜛䛣䛸䜢Ⓨ⾲䛧䛯䚹ᬑཬάື䛾䛸䛧䛶䝃䜲䜶䞁 䝇䞉䝸䞊䝎䞊䝈䞉䜻䝱䞁䝥䜒⤂䛧䛯䚹㻌 㻌 ᐇ᪥䞉ྲྀᮦ᪥➼㻌 Ⓨ⾲ྡ䞉ྲྀᮦྡ➼㻌 Ⓨ⾲⪅➼㻌 ᡤᒓ䞉Ặྡ㻌 ᖹᡂ䠎䠓ᖺ䠍᭶䠍䠍᪥䠄᪥䠅㻌 ᪥ᮏ⏕≀ᩍ⫱Ꮫ㻌 㧗ᓮᗣ⚟♴Ꮫ䞉∦ᒣ䚸ឡᏛ䞉ᯘ⚽๎㻌 䛂ヨ㦂⟶ෆ䛷㌿䞉⩻ヂ䜢⌧䛩䜛ᐇ㦂䠉䝁䝮䜼⬇ⱆ↓⣽⬊䝍䞁䝟䜽㉁ྜᡂ ⣔䜢⏝䛔䛶䝍䞁䝟䜽㉁䜢Ⓨ⌧䛧䛶䜏䜘䛖䠉䛃䛸䛔䛖₇㢟䛷䝽䞊䜽䝅䝵䝑䝥䜢㛤䛝䚸 ෆᐜ㻌 㻌 ឡᏛ䛾㐲⸨ᰤᩍᤵ䛾㛤Ⓨ䛧䛯䝁䝮䜼⬇ⱆ↓⣽⬊ྜᡂ⣔䜢⏝䛔䛯㌿ ⩻ヂ䜻䝑䝖䛾⩻ヂᐇ㦂䜢య㦂䛧䛶䜒䜙䛳䛯䚹䛣䛣䛷䛿䚸㼓㼒㼜 Ⓨ⌧⣔䛰䛡䛷䛺䛟ୖグ 䛾 㼘㼍㼏㼆 Ⓨ⌧⣔䜒య㦂䛧䛶䛔䛯䛰䛔䛯䚹㻌 㻌 ᐇ᪥䞉ྲྀᮦ᪥➼㻌 Ⓨ⾲ྡ䞉ྲྀᮦྡ➼㻌 Ⓨ⾲⪅➼㻌 ᡤᒓ䞉Ặྡ㻌 ෆᐜ㻌 㻌 㻌 ᖹᡂ䠎䠒ᖺ䠍䠌᭶䠍䠏᪥䠄᭶䠅㻌 㻭㻭㻮㻱䠄䜰䝆䜰⏕≀ᩍ⫱༠㆟䠅䠗䝬䝺䞊䝅䜰㻌 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プラスミド DNA（実験操作 2-2-1 で調製したサンプル） 1 μL 13.5 μL 水 がだんだん透明になる）。 6. 3.5 μL 5×BigDye Sequencing Buffer 離し、大腸菌を沈殿にする。 3. 5. 以下の組成で DNA 配列解析のための PCR 反応液（20 μL）を調製する。 （プレミックスとよばれる試薬に蛍光ラベルされた 4 種類のジデオキシヌクレオチドが含まれている） 350 μL の Buffer N3（プラスミド DNA 以外の不必要なもの、ゲノム DNA やタ ンパク質などを沈殿させる溶液）を加え、チューブのふたをしっかり閉めて上 下反転して白い沈殿を生じさせる。 2. 7. 15,000 回転、4℃で 10 分間遠心分離する。 8. スピンカラム（DNA を吸着する樹脂が付いている）を廃液回収用のチューブ 前処理 にセットする。 9. PCR サーマルサイクラーにセットし、以下の温度反応を行う。 96℃ 2分 ↓ 操作 7 の遠心後、上澄み液を 800 μL だけピペットマンで注意深く吸い取り （白い沈殿を一緒にとらないように）、スピンカラムに注入する。 10. 15,000 回転、4℃で 1 分間遠心分離する。 11. チューブにたまった液をすてたのち、スピンカラムを再びチューブにセットす DNA 解離 96℃ 10 秒 アニーリング 50℃ 5秒 伸長 60℃ 2分 25 サイクル る。 PCR 反応産物の精製（エタノール沈殿） 12. スピンカラムに 750 μL の Buffer PE を注入し、15,000 回転、4℃で 1 分間遠 心する。 1. 13. チューブにたまった液をすてたのち、スピンカラムを再びチューブにセットし、 14. スピンカラムを操作 1 で用意したマイクロチューブにセットする、 15. 50 μL の Buffer EB をスピンカラムの底の中央に注ぎ、1 分放置したのち、15,000 回転、4℃で 1 分間遠心し、樹脂に吸着した DNA をマイクロチューブに回収する。 参考： 使用する溶液 TE（DNA を溶解させる緩衝液） 10 mM トリス HCｌ （pH 8.0）、 PCR 反応後の溶液に 2 μL の 3 M 酢酸ナトリウム (pH5.2) と 50 μL の 99.5%エタノールを加え、15 秒間 ボルテックスする。 15,000 回転、4℃で 1 分間遠心する。 1 mM EDTA Buffer P1（大腸菌を懸濁する緩衝液） 50 mM グルコース、 25 mM トリス HCl（pH8.0）、 10 mM EDTA（pH8.0) 2. 室温で 15 分間放置する。 3. 15,000 回転にて 4℃で 20 分間遠心する。 4. 上清をマイクロピペットで除去する。 5. 125 μL の 70%エタノールを加える。 6. 15,000 回転にて 4℃で 10 分間遠心する。 7. 上清をマイクロピペットで除去する。 8. 50℃のヒートブロックで 1 分間置き、残存のエタノールを完全に蒸発させる。 9. 15 μL のホルムアミドを加えて、15 秒間ボルテックスし、スピンダウンする。 10. オートシーケンスの専用チューブに移す。 Buffer P2（大腸菌の細胞を破砕する溶液、室温保存） 11. サンプルを 95℃で 2 分間処理後、氷上で急冷する。 0.2 N NaOH、 1％ SDS 12. ABI310 オートシーケンサーにセットし、解析をスタートする。 Buffer N3（ゲノム DNA を沈殿させるために使用、氷冷しておく） 5 M 酢酸カリウム 60 mL 酢酸 11.5 滅菌水 28.5 mL 41 42 ☆参考： プラスミドベクターの一例 ☆参考： インサート DNA の塩基配列 このプラスミドベクターを XbaI と BamHI で処理して、インサート DNA を挿入しています。 以下の文字列は大腸菌に導入したプラスミド DNA のインサートの部分の塩基配列です（両端の下線の部 分でベクターDNA と接続している。この文字列を解読して光るタンパク質のアミノ酸配列に変換してください。 実際に遺伝子導入した緑色蛍光タンパク質の DNA は遺伝子 A～C のどれかです。 ヒント： ＡＴＧという文字列を探す（300 番目近くにあるものがそうです）。ＡＴＧからあとの文字列を 3 個ずつ次 のページの暗号表にしたがってアミノ酸に変えていく。例えば遺伝子 A についてはＴＧＡという文字列が出て きたら終わりです。その直前のアミノ酸がチロシン-アスパラギン.となれば正解です。 構成成分であるアミノ酸 遺伝子 G 1 TCTAGAATTCGAGCGGGATTTTATGGCTTTTTTAGGTATTTTTGTAAGGGTAAAATAGGC 61 CCATCAAACAGCATTAGAAATGCTAATCAGCCCAAAAAACAAAAGCAATCTTTTTTTGTT 121 GCTAAAAGATAAAAATAAGTCGAGGCTGTGGTAACATATCCCACAGATTAAAGAAAGTCA 181 TAAGACTTGAATCTTCAGAATTTTAAAAAGCAGTTTTGCCAACGTAAGATTTTTGAAGTT 241 TTCGACCAACAATACCGTTACTGGTATTTGTCTGTTAAAGATAAGCATTTTTGCTGGAGG 301 AAAACCATATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTCTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTG 361 AATTAGATGGTGATGTTAACGGCCACAAGTTCTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATG 421 CAACATACGGAAAACTTACCCTGAAGTTCATCTGCACTACTGGCAAACTGCCTGTTCCAT 481 GGCCAACACTAGTCACTACTCTGTGCTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCGGATC 541 ATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGGA 601 CCATCTTCTTCAAAGATGACGGCAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG 661 ATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGACTTCAAGGAAGATGGCAACATTC 721 TGGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAAC 781 AAAAGAATGGAATCAAAGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATTGAAGATGGAAGCGTTC 841 AACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAG 901 ACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACC 961 ACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTGT 1021 ACAACTGAGGATCC 43 185 44 遺伝子Ｂ 遺伝子 R 1 TCTAGAATTCAAGCGGGATTTTATGGCTTTTTTAGGTATTTTTGTAAGGGTAAAATAGGC 61 CCATCAAACAGCATTAGAAATGCTAATCAGCCCAAAAAACAAAAGCAATCTTTTTTTGTT 1 TCTAGAATTCGAGCGGGATTTTATGGCTTTTTTAGGTATTTTTGTAAGGGTAAAATAGGC 61 CCATCAAACAGCATTAGAAATGCTAATCAGCCCAAAAAACAAAAGCAATCTTTTTTTGTT 121 GCTAAAAGATAAAAATAAGTCGAGGCTGTGGTAACATATCCCACAGATTAAAGAAAGTCA 121 GCTAAAAGATAAAAATAAGTCGAGGCTGTGGTAACATATCCCACAGATTAAAGAAAGTCA 181 TAAGACTTGAATCTTCAGAATTTTAAATAGCAGTTTTGCCAACGTAAGATTTTTGAAGTT 181 TAAGACTTGAATCTTCAGAATTTTAAAAAGCAGTTTTGCCAACGTAAGATTTTTGAAGTT 241 TTCGACCAACAATACCGTTACTGGTATTTGTCTGTTAAAGATAAGCATTTTTGCTGGAGG 241 TTCGACCAACAATACCGTTACTGGTATTTGTCTGTTAAAGATAAGCATTTTTGCTGGAGG 301 AAAACCATATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTCTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTG 301 AAAACCATATGGCTAGCTCCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTCCGCA 361 AATTAGATGGTGATGTTAACGGCCACAAGTTCTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATG 361 TGGAGGGCTCCGTCAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAAGGCGAAGGCGAGGGCCGACCGT 421 CAACATACGGAAAACTTACCCTGAAGTTCATCTGCACTACTGGCAAACTGCCTGTTCCAT 421 ACGAAGGCACCCAGACCGCCAAGTTGAAGGTCACCAAGGGCGGCCCATTGCCCTTCGCCT 481 GGCCAACACTAGTCACTACTCTGTCCCATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCGGATC 481 GGGACATCTTGTCCCCACAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTACGTCAAGCACCCGGCCG 541 ATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAAAGGA 541 ACATCCCCGACTACTTGAAGTTGTCCTTCCCAGAAGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTCATGA 601 CCATCTTCTTCAAAGATGACGGCAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTG 601 ACTTCGAGGACGGCGGCGTCGTCACCGTCACCCAGGACTCCTCATTGCAGGACGGCGAGT 661 ATACCCTTGTTAATAGAATCGAGTTAAAAGGTATTGACTTCAAGGAAGATGGCAACATTC 661 TCATCTACAAGGTCAAGTTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCGGTCATGCAGA 721 TGGGACACAAATTGGAATACAACTATAACTCACACAATGTATACATCATGGCAGACAAAC 721 AGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCACCGAGCGCATGTACCCCGAGGACGGCGCCTTGA 781 AAAAGAATGGAATCAAAGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATTGAAGATGGAAGCGTTC 781 AGGGCGAGATCAAGATGCGCTTGAAGTTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTCA 841 AACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAG 841 AGACCACCTACATGGCCAAGAAGCCCGTCCAGTTGCCCGGCGCCTACAAGACCGACATCA 900 ACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACC 901 AGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTCGAGCAGTACGAGCGCGCCG 961 ACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTGT 961 AGGGCCGCCACTCCACCGGCGCCTAAGGATCC 1021 ACAACTGAGGATCC 45 46 ☆参考： 遺伝暗号表（DNA の塩基配列とアミノ酸の対応） 遺伝子 O 1 TCTAGAATTCGAGCGGGATTTTATGGCTTTTTTAGGTATTTTTGTAAGGGTAAAATAGGC 61 CCATCAAACAGCATTAGAAATGCTAATCAGCCCAAAAAACAAAAGCAATCTTTTTTTGTT 第 1 文 字 121 GCTAAAAGATAAAAATAAGTCGAGGCTGTGGTAACATATCCCACAGATTAAAGAAAGTCA U 181 TAAGACTTGAATCTTCAGAATTTTAAAAAGCAGTTTTGCCAACGTAAGATTTTTGAAGTT C 241 TTCGACCAACAATACCGTTACTGGTATTTGTCTGTTAAAGATAAGCATTTTTGCTGGAGG 301 AAAACCATATGGCTAGCAAGGGCGAGGAGAATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGC A 361 GCTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGG 421 GCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCTTTCAGACCGCTAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCC 481 CCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCACCTACGGCTCCAAGGCCTACG G 541 TGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTCAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGT UUU UUC UUA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AUC AUA AUG GUU GUC GUA GUG U Phe／F Phe／F Leu／L Leu／L Leu／L Leu／L Leu／L Leu／L Ile／I Ile／I Ile／I Met／M Val／V Val／V Val／V Val／V UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG 第２文字 C Ser／S UAU Ser／S UAC Ser／S UAA Ser／S UAG Pro／P CAU Pro／P CAC Pro／P CAA Pro／P CAG Thr／T AAU Thr／T AAC Thr／T AAA Thr／T AAG Ala／A GAU Ala／A GAC Ala／A GAA Ala／A GAG 601 GGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCC ☆参考 アミノ酸の名称と略号 661 TGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACG 1 文字 A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y 721 GCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCG 781 AGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGATGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACT 841 ACACCTCCGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCT 901 ACATCGTCGGCATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAAC 961 AGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGC 1021 GGCCGCGACTCTAGAATTCCAAGCTT 47 186 3 文字 Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr 英語名 Alanine Cysteine Aspartic Acid Glutamic Acid Phenylalanine Glycine Histidine Isoleucine Lysine Leucine Methionine Asparagine Proline Glutamine Arginine Serine Threonine Valine Tryptophan Tyrosine 日本語名 アラニン システイン アスパラギン酸 グルタミン酸 フェニルアラニン グリシン ヒスチジン イソロイシン リジン ロイシン メチオニン アスパラギン プロリン グルタミン アルギニン セリン スレオニン バリン トリプトファン チロシン 48 A Tyr／Y Tyr／Y 終了 終了 His／H His／H Gln／Q Gln／Q Asn／N Asn／N Lys／K Lys／K Asp／D Asp／D Glu／E Glu／E UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G Cys／C Cys／C 終了 Trp／W Arg／R Arg／R Arg／R Arg／R Ser／S Ser／S Arg／R Arg／R Gly／G Gly／G Gly／G Gly／G ☆参考： SDS-PAGE 用ゲルの作製 準備するもの 7. 濃縮ゲル溶液に重合反応開始剤 TEMED を加えて混合し、すみやかに分離ゲルの上に重層する。 8. コームを挿し込み、30 分間静置してゲルを重合させる。 9. 濃縮ゲルが固まったら、クリップ、ゴム、コームを抜き、すぐに純水でレーンを洗浄する。 10. 泳動槽にゲルをセットして、1× SDS-PAGE 泳動 buffer で満たしてサンプルをチャージする。 ガラスプレート コーム シール用ゴム板 クリップ 手順 1. 2 枚の泳動用ガラスプレートをイソプロピルアルコールでよく拭き、乾燥 させてからストッパーのゴムをはさみクリップで固定する。分離ゲルを注ぐ 目安となる線をコームの先から 1.5 cm のところに引いておく。 2. 必要な溶液 下記の表 1 に従って、TEMED 以外の試薬を 50 ml のチューブ内で混合し、 分離・濃縮ゲル溶液をそれぞれ調製する。 3× タンパク質溶解液 表 1 SDS-PAGE 用ゲルの組成 12.5% ポリアクリルアミド分離ゲル（9 ml） 150 mM Tris-HCl(pH6.8) 6% SDS 30% グリセロール 純水 3 ml 0.03% ブロモフェノールブルー 30% アクリルアミド溶液 3.75 ml 7% β-メルカプトエタノール 分離ゲル buffer〔1M Tris-HCl(pH8.8), 0.4% SDS〕 2.25 ml 10% 過硫酸アンモニウム（APS） 40 µl N,N,N’,N’-テトラメチルエタン-1,2-ジアミン（TEMED） 5 µl 1× SDS-PAGE 泳動 buffer ポリアクリルアミド濃縮ゲル（3 ml） 純水 1.8 ml 30% アクリルアミド溶液 450 µl 濃縮ゲル buffer〔1M Tris-HCl(pH6.8), 0.4% SDS〕 750 µl 10% 過硫酸アンモニウム（APS） 20 µl N,N,N’,N’-テトラメチルエタン-1,2-ジアミン（TEMED） 5 µl 3. 分離ゲル溶液に重合反応開始剤 TEMED を加えて混合し、すみやかにガラスプレートの隙間に注ぐ。 4. マイクロピペットを使って、分離ゲルの上から純水をぎりぎりいっぱいまで重層する。 5. 30 分～1 時間室温で静置してゲルを重合させる。 6. 分離ゲルが固まったら、純水を取り除き水気を切る。 スケジュール クマーシーブリリアントブルー 5% メタノール 7.5% 酢酸 50 . 16:00～18:00 実習「大腸菌による組換えタンパク質の大量発現」 18:00～19:00 夕食（生協食堂他） 19:00～20:30 ポスターセッション「生命を理解するための教材と探究活動」 7 月 31 日（木曜日） 8:45～ 9:00 実験結果の観察と解析 9:00～10:00 講義「遺伝子とタンパク質－遺伝情報の解読」 10:00～11:00 実習「無細胞合成系によるタンパク質の合成-1：mRNA の合成」 11:00～12:00 実習「PCR による DNA の増幅」 12:00～13:00 昼食（生協食堂他） 13:00～14:00 講義「生体分子って何？－生体分子を視てみよう！パソコンで触ってみよう－」 14:00～15:00 実習「無細胞合成系によるタンパク質の合成-2：タンパク質の試験管内合成」 15:00～16:00 実習「電気泳動による DNA の分析」 16:00～17:30 講義「タンパク質はマラリアを無くす切り札」 および研究センター（城北キャンパス、プロテオリサーチ領域）の見学 18:00～20:00 講師等との交流会（セトリアン２階） 8 月 1 日（金曜日） 8:45～ 9:00 実験結果の観察と解析 9:00～10:00 実習「電気泳動によるタンパク質の分析」 10:00～11:00 講義「ヒトのタンパク質は何種類？」 11:00～12:00 実習「質量分析によるタンパク質の分析」 12:00～13:00 昼食（生協食堂他） 13:00～14:45 生命科学教育の事例紹介および講義「無細胞タンパク質合成実験の新学習指導要領生物 への導入」 15:30～18:30 研究センター（重信キャンパス、プロテオメディシン領域、プロテオイノベーション領域）の見学 19:00～20:00 夕食（生協食堂他） 20:00～20:30 結果の観察 宿舎に移動 8 月 2 日（土曜日） 講義「生命って？私って？」 0.25% SDS:ドデシル硫酸ナトリウム 15:00～16:00 講義「遺伝子とタンパク質－タンパク質の多様性」 実験結果の観察と解析 SDS 略語 14:00～15:00 開講式／概要説明 9:00～10:30 0.1% Tris: トリスヒドロキシメチルアミノメタン 7 月 30 日（水曜日） 8:45～ 9:00 Tris グリシン CBB 染色液 49 20:30 25 mM 192 mM 10:30～11:30 実験結果の解析および発表の準備 11:30～12:30 昼食（弁当） 12:30～13:45 結果の考察と発表（各グループで実施） 13:45～14:00 閉講式 56 187 平成２６年度サイエンス・リーダーズ・キャンプ タンパク質研究の先端技術を活用した実践型次世代生命科学教育 「業務成果報告書」 発 行 日 平成 27 年 (2015 年) 3 月 10 日 編 集 ・ 発 行 国立大学法人 愛媛大学 プロテオサイエンスセンター 〒790-8577 松山市道後樋又 10 番 13 号 問い合わせ先 愛媛大学 林 秀則 [email protected] 高崎健康福祉大学 片山 豪 [email protected] 印 刷 不二印刷株式会社 〒790-0054 松山市空港通 2 丁目 13-30
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