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環境水由来レジオネラ属菌の選択培地による効率的検出法の検討

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41
環境水由来レジオネラ属菌の選択培地による効率的検出法の検討
1)
株式会社田辺 R&D サービス東京分析部,2)栄研化学株式会社生物化学研究所
春日
修1)
谷
佳都1)
三沢
均1)
池戸 正成2)
高木紀美子1)
(平成 13 年 6 月 20 日受付)
(平成 13 年 10 月 4 日受理)
Key words:
Legionella, selective medium, environmental water
要
旨
Legionella 属 菌 の 培 地 上 で の 発 育 至 適 pH を 調 べ る た め に,pH を 0.5 間 隔 で 6.0∼8.0 に 調 整 し た
BCYEα 寒天培地,WYOα 寒天培地および MWY 寒天培地を用い,それぞれの培地での菌の発育状態を
比較検討した.Legionella pneumophila の 2 株および L. micdadei 1 株の発育は,選択培地の WYOα 寒天培
地において,pH6.5 と 7.0 以外では著しく影響を受け,両選択培地は非選択培地の BCYEα 寒天培地と比
べ,発育至適 pH の狭いことが確認された.選択培地組成中の vancomycin(VCM)添加濃度の影響を検
討した結果,Legionella 属菌の中にはその濃度に依存して発育が抑制される菌株があり,それらの発育抑
制の程度は菌種および菌株により異なることが確認された.同様に,Legionella 属菌以外の菌についても
VCM 添加濃度が選択性に影響することから,用いる選択剤の量は検水中の Legionella 属菌の種類やそれ
以外の菌の種類によって使い分ける重要性が示唆された.Legionella 属菌の検出におよぼす抗真菌剤
amphotericin-B(AMPH-B)の効果を MWY 寒天培地に添加して検討した.AMPH-B は Legionella 属菌
の発育にはほとんど影響せず,冷却塔水中から分離された糸状菌の Aspergillus sp.,Trichoderma sp.,Scolecobasidium sp.および Mucor sp.に対して,80µg!
ml の添加濃度で顕著な発育抑制効果を示した.さらに,
分離糸状菌の 4 株と Legionella 属菌 3 株を用いた各 1 株づつの混合培養において,培地中に AMPH-B
を 80µg!
ml 添加することにより糸状菌の発育が抑制され,その結果として,Legionella 属菌が効率的に検
出されることを見出した.
〔感染症誌
序
文
76:41∼50,2002〕
水中から分離された Legionella 属菌およびそれ以
環境水中の Legionella 属菌を選択的に分離して
外の細菌を用いて,これらの前処理法による各菌
その菌数を測定するには,検水中に混入している
の発育について検討し,検水の熱処理後に酸処理
Legionella 属菌以外の菌を除去しなければならな
を組み合せる前処理法により,Legionella 属菌の発
1)
および「新
い.そのため,
「レジオネラ症防止指針」
育に対してはほとんど影響せず,Legionella 属菌の
2)
版レジオネラ症防止指針」では,酸または熱によ
菌数測定時に環境水中から分離される構成比率の
る検水の前処理法が採用されている.我々は環境
高いグラム陰性桿菌の Pseudomonas aeruginosa お
よび Acinetobacter spp.を効率よく除去できること
別刷請求先:
(〒335―8505)埼玉県戸田市川岸 2―2―
50
株式会社田辺 R&D サービス東京分析部
春日
修
平成14年 1 月20日
を報告した3).その後,この前処理法,すなわち,
検水の遠心濃縮液を 50℃ で 20 分間熱処理した
後,0.2M HCl-KCl 緩衝液(pH 2.2)を添加する酸
42
春日
修 他
材料と方法
処理を組み合わせる方法により,検水中に混在し
て い る Legionella 属 菌 以 外 の 菌 を 除 去 し,Le-
1.試験菌株
gionella 属菌の効率的な生菌数計測を実施してき
使用した菌株とその由来を Table 1 に示した.
た.一方,Legionella 属菌以外の菌の除去を目的と
環境水中からの細菌および糸状菌は 1999 年 5 月
して,すでにいくつかの分離選択培地が工夫され
から 2000 年 6 月までに入手し た 冷 却 塔 水 中 の
市販されている.これら各種の分離培地には,環
Legionella 属菌の菌数測定時に,分離選択培地上に
境水,とくに冷却塔水中の Legionella 属菌の検出
発育してきたグラム陽性菌 7 株およびグラム陰性
において,それぞれに特徴を有していることが示
菌 6 株ならびに糸状菌 10 株の計 23 株である.こ
4)
5)
3)
されている .前報 では,市販選択培地の特性を
れらの菌株の分離は,検水を遠心濃縮し,50℃,
環境水から分離された各種菌株を用いて確認し,
20 分間の熱処理の後,同量の 0.2M HCl-KCl 緩衝
一部の培地,とくに,WYOα 寒天培地が Legionella
液(pH 2.2)
を加えて,さらに 25℃,4 分間処理し,
属菌以外の菌の除去に加えて,Legionella 属菌に対
その処理液を MWY 寒天培地(OXOID)平板に塗
しても発育を抑制する可能性のあること,また,
布して 37℃,5 日間培養することにより行った.
10 種類の抗菌薬について,Legionella 属菌とそれ
平板上に発育してきた細菌および糸状菌集落を分
以外の細菌に対する感受性試験を行い,市販選択
離し,細菌は市販同定キットにより,糸状菌は培
培地に使用されている polymixin-B の添加量につ
養所見ならびに形態学的観察により同定した.い
いては, Legionella 属菌の発育には影響を与えず,
ずれの菌株も検水の採取場所および時期などから
一般細菌の発育を効果的に抑制することを報告し
由来の異なると思われるものを選んだ.
た.そこで,このような Legionella 属菌の発育抑制
2.各培地での生菌数測定
に対する選択培地の特性を明らかにするため,培
試験菌株のうち,Legionella 属菌は BCYE 寒天
地 pH および培地に添加する選択剤のうち vanco-
培地(OXOID)で 37℃,5 日間,それ以外の細菌
mycin
(VCM)
の影響について検討した. さらに,
は標準寒天培地(栄研化学)で 18∼20 時間培養し
冷却塔水からの Legionella 属菌の検出に抗真菌剤
た集落を,滅菌水に McFarland No. 1(約 108 CFU
として anisomycin を使用している MWY 寒天培
ml になるよう
!
ml)に懸濁し,それを約 103 CFU!
地を用いた場合,糸状菌の発育により Legionella
に希釈したものを試験懸濁液として用いた.糸状
属菌が分離できない例を日常業務中に多く経験し
菌はポテトデキストロース寒天培地(PDA,栄研
た.そこで,WYOα 寒天培地に添加されている
化学)の斜面培地で 25℃,5 日間培養した集落の
amphotericin-B(AMPH-B)を MWY 寒天培地に
分生子を滅菌水に懸濁し,Burker-Turk の血球計
添加して糸状菌に対する抑制作用を確認した.ま
ml に
算板により分生子数を測定し,約 103 CFU!
た,AMPH-B を添加した MWY 寒天培地に糸状
なるように希釈したものを試験懸濁液として用い
菌と Legionella 属菌を混合培養し,Legionella 属菌
た.これらの試験懸濁液 0.1ml を各平板培地上に
に対する影響と糸状菌の抑制を確認した.それら
接種し,コンラージ棒で均一に展開した.所定の
の結果から,選択剤を添加した培地では Legionella
条件で培養後,平板培地表面に発育した集落数を
属菌の発育至適 pH が狭いこと,選択剤として添
計測し,平板 2 枚の平均値として表示した.培養
加されている VCM は一部の Legionella 属菌の発
条件は,培地 pH の検討を除いてすべて Legionella
育を阻害するものの,Legionella 属菌以外の菌,特
属菌は 5 日間,それ以外の細菌は 18∼24 時間,糸
にグラム陽性菌に対して抑制効果のあることが確
状菌は 5 日間,いずれも 37℃ で行った.
認できた.また,AMPH-B は糸状菌の発育抑制に
3.培地 pH の検討
効果を示し,MWY 寒天培地にこれを添加するこ
BCYEα 寒天培地と WYOα 寒天培地は奥田ら4)
とにより,Legionella 属菌の発育に影響することな
の記載に準じて調製し,培地の最終 pH がそれぞ
く選択性を高めることが確認できた.
れ 6.0,
6.5,
7.0,
7.5,
お よ び 8.0 に な る よ う に pH
感染症学雑誌
第76巻
第1号
環境水 Legionella 属菌の選択的検出法
43
Table 1 List of 32 strains and their descriptions used
The 7 strains of Legionella species
3677
Legionella pneumophila
serogroup 1
ATCCa 33152
serogroup 4
ATCC 33156
3681
Legionella pneumophila
3684
3685
Legionella bozemanii
Legionella micdadei
ATCC 33217
ATCC 33218
3686
Legionella dumoffii
ATCC 33279
3687
Legionella gormanii
ATCC 33297
3689
Legionella longbeachae
ATCC 33462
The 2 strains of reference organisms
5084
Staphylococcus aureus
5079
FDAb 209P JC-1
NIHJc JC-2
Escherichia coli
The 23 strains isolated from cooling tower water
RB114
Staphylococcus sp.
RB232
Staphylococcus sp.
RB002
RB005
Corynebacterium aquaticum
Corynebacterium aquaticum
RB007
RB250
RB1H2
RB003
Corynebacterium aquaticum
Corynebacterium aquaticum
Corynebacterium aquaticum
Pseudomonas alcaligenes
RB006
RB025
RB106
RB125
Sphingobacterium multivorum
Pseudomonas pseudoalcaligenes
Acinetobacter sp.
Moraxella sp.
RB242
RF001
RF002
Pseudomonas picketti
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
RF003
RF010
RF020
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
RF029
RF033
RF017
RF030
Aspergillus sp.
Aspergillus sp.
Tricoderma sp.
Scolecobasidium sp.
RF036
Mucor sp.
a
: American Type Culture Collection
: Food an Drug Admistration
c : National Institute of Health, Japan
b
メ ー タ を 用 い て 調 整 し た.MWY 寒 天 培 地 は
加),1.25,
2.5,
5µg!
ml(現処方)に添加した培地を
growth supplement(OXOID)溶液をそれぞれの
作製した.また,同様に BCYE 寒天培地に VCM
最終 pH になるように調整して調製した.これら
を添加し,MWY 寒天培地は VCM の添加量を 1
の培地に L. pneumophila 3677 株,3681 株と L. mic-
µg!
ml(現処方)および 5µg!
ml に添加した培地を
dadei 3685 株の試験懸濁液を接種し,3,6,9 および
作製した.これらの培地に Table 3 に記載した Le-
11 日後の集落数を計測した.
gionella 属 7 菌株の試験懸濁液を接種し,平板上に
4.選択剤の検討
発育した集落数を計測した.また,VCM の選択効
1)Vancomycin(VCM)の添加量の検討
果を確認するため,WYOα 寒天培地(VCM:5µg
WYOα 寒天培地組成のうち,VCM を 0(無添
!
ml)と MWY 寒天培地(VCM:1µg!
ml)に冷却
平成14年 1 月20日
44
春日
修 他
Table 2 Viable counts of 3 strains of Legionella spieceis on the selective agar plate adjusted at various pH
Growth
(CFU/plate)at the incubation days
Strain
pH
BCYEα agar
3
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
L. micdadei 3685
6
9
WYOα agar
11
3
6
9
MWY agar
11
3
6
9
11
6.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
4
6.5
189
238
244
244
17
179
180
180
12
192
194
194
7.0
7.5
213
105
236
161
236
161
236
161
0
0
5
0
10
0
10
0
148
40
202
104
206
104
206
104
8.0
0
2
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
382
288
177
382
288
177
0
6
0
212
254
0
265
254
0
265
254
0
6
86
34
296
254
150
298
254
150
304
256
152
6.0
0
6.5
7.0
7.5
338
276
146
0
8.0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
6.0
6.5
7.0
0
341
299
192
361
308
246
361
310
246
361
311
0
233
180
0
240
199
0
242
200
0
242
200
0
25
82
0
253
251
0
256
255
259
255
7.5
8.0
0
0
25
0
28
0
28
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
30
0
33
0
33
0
379
287
177
0
Incubation : 37℃.
Table 3 Influence of vancomycin in the selective media on the growth of Legionella sp.
Growth
(CFU/plate)
Concentrations of vancomycin(μg/ml)
Strain
BCYEα agar
(pH6.9)
WYOα agar
(pH6.7)
MWY agar
(pH6.7)
0
1.25
2.5
5.0
0
1.25
2.5
5.0
1.0
5.0
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
1.3×103
1.1×103
9.2×102
7.1×102
8.4×102
8.2×102
6.3×102
4.0×102
7.4×102
4.5×102
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
6.9×102
5.0×102
4.8×102
4.5×102
2.8×102
3.2×102
3.8×102
3.4×102
4.4×102
4.6×102
L. bozemanii 3684
2.2×102
4.4×10
1.5×10
1.2×10
6.6×10
4.8×10
3.4×10
2.7×10
6.2×10
3.7×10
L. micdadei 3685
1.8×102
1.5×102
1.5×102
1.4×102
6.2×10
5.3×10
1.1×102
5.6×10
1.7×102
1.7×102
L. dumoffii 3686
1.4×102
1.2×102
1.2×102
1.3×102
2.7×102
2.2×102
2.2×102
1.4×102
2.7×102
1.9×102
L. gormanii 3687
5.0×102
4.6×102
4.7×102
4.2×102
3.0×10
0
0
0
1.9×10
3.5
L. longbeachae 3689
2.5×102
2.0×102
1.7×102
1.4×102
7.9×102
5.0×102
4.8×102
6.2×102
7.3×102
5.1×102
Incubation : 37℃ for 5 days
塔水から分離した Legionella 属菌以外のグラム陽
80 および 160µg!
ml に添加した培地を作製した.
性菌 8 株,グラム陰性菌 7 株(Table 4)の試験懸
Legionella 属菌に対する AMPH-B の影響を試験す
濁液を接種し,発育した集落数を計測した.対照
るため,これらの培地に Table 5 に記載した Le-
培地として,Legionella 属菌は BCYE 寒天培地を,
gionella 属 7 菌株の試験懸濁液を接種し,平板上に
それ以外の菌には標準寒天培地を用いた.
発育した集落数を計測した.また,糸状菌に対す
2)Amphothericin-B(AMPH-B)の添加の検討
る抑制効果を試験するため,冷却塔水から分離し
MWY 寒天培地に,AMPH-B を 0(無添加)
,40,
た糸状菌 10 株(Table 6)の試験懸濁液を接種し,
感染症学雑誌
第76巻
第1号
環境水 Legionella 属菌の選択的検出法
45
Table 4 Growth of co-existing microbe strains on the selective media refered to standard agar
Growth
(CFU/plate)
Straina
Standard agar
WYOα agar
MWY agar
Staphylococcus sp. RB114
7.3 × 102
0
4.3 × 102
Staphylococcus sp. RB232
Corynebacterium aquaticum RB002
1.2 × 103
5.9 × 102
0
0
7.7 × 102
1.7 × 102
Corynebacterium aquaticum RB005
9.0 × 102
0
2.5 × 102
Corynebacterium aquaticum RB007
7.3 × 102
0
5.7 × 102
Corynebacterium aquaticum RB250
3.1 ×
102
0
2.4 × 102
Corynebacterium aquaticum RB1H2
7.6 × 102
0
5.5 × 102
Staphylococcus aureus. 5084
5.2 × 102
0
0
Pseudomonas alcaligenes RB003
1.5 × 105
0
2.2
Sphingobacterium multivorum RB006
Pseudomonas pseudoalcaligenes RB025
5.4 × 102
5.2 × 102
2.5 × 102
0
6.0 × 102
1.1 × 102
Acinetobacter sp. RB106
1.2 × 102
1.2 × 10
1.6 × 102
Moraxella sp. RB125
8.6 × 103
2.5
2.5 × 102
Pseudomonas picketti RB242
Escherichia coli 5079
1.6 × 102
2.0 × 102
0
0
1.4 × 102
1.5
Incubation : 37℃ for 2 ∼ 5 days
a
: The strains were isolated from cooling tower water samples together with Legionella sp.
Table 5 Influence of amphotericin B in MWY agar on the growth of Legionella sp.
Growth
(CFU/plate)
Strain
Concentration of amphotericin B(µg/ml)
0
40
80
160
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
2.5 × 103
2.9 × 103
2.9 × 103
2.0 × 103
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
2.1 × 103
2.4 × 103
2.7 × 103
1.9 × 103
L. bozemanii 3684
1.7 × 102
1.3 × 102
1.9 × 102
2.8 × 102
103
103
103
2.9 × 103
L. micdadei 3685
3.1 ×
L. dumoffii 3686
3.5 × 103
2.9 × 103
2.3 × 103
2.0 × 103
L. gormanii 3687
1.4 × 102
9.3 × 10
9.6 × 10
9.6 × 10
L. longbeachae 3689
4.6 ×
103
3.6 ×
4.5 ×
103
2.3 ×
4.5 ×
103
3.8 × 103
Incubation : 37℃ for 5 days
集落数を計測した.この際,対照として WYOα
発育した各菌の集落数を計測した.接種菌量は混
寒天培地と PDA を同時に試験した.また,実際の
合前の試験懸濁液を測定して算定した.
成
検体からの Legionella 属菌の検出を想定して,L.
pneumophila 2 菌株,L. micdadei 1 菌株と冷却塔水
から分離した糸状菌 4 株を各々混合し,AMPH-
績
1.Legionella 属菌の生育におよぼす選択培地
pH の影響
B を添加した MWY 寒天培地での培養を行った
培 地 の pH を 0.5 間 隔 で 6.0∼8.0 に 調 整 し た
(Table 7)
.それぞれの試験懸濁液を等量混合した
BCYEα 寒天培地,WYOα 寒天培地および MWY
もの 0.1ml を各培地に接種して培養後,平板上に
寒天培地での Legionella 属菌の発育状態を培養日
平成14年 1 月20日
46
春日
修 他
Table 6 Effect of amphotericin B in the selective media on the growth of co-existing fungus strains
Growth
(CFU/plate)
Straina
Concentration of amphotericin B
(µg/ml)
Potato-dextrose
agar
MWY agar
0
102
40
102
102
WYOα agar
80
80
Aspergillus sp. RF001
1.8 ×
2.0 × 10
3
Aspergillus sp. RF002
2.0 × 102
1.6 × 102
2.3 × 10
0
0
Aspergillus sp. RF003
1.9 × 102
1.8 × 102
5.1 × 10
0
0
Aspergillus sp. RF010
1.6 × 102
1.8 × 102
1.7 × 102
0
0
Aspergillus sp. RF020
1.3 × 102
7.1 × 10
0
0
0
Aspergillus sp. RF029
2.8 × 102
1.7 × 102
3.5 × 10
0
0
Aspergillus sp. RF033
2.1 × 102
2.1 × 102
7.9 × 10
0
0
Trichoderma sp. RF017
Scolecobasidium sp. RF030
2.1 × 102
1.4 × 102
1.8 × 102
2.0 × 102
4.6 × 10
0
0
0
0
0
over growth
8.9 × 10
0
0
Mucor sp. RF036
5 × 102
1.9 ×
1.9 ×
Incubation : 37℃ for 5 days
a
: The strains were isolated from cooling tower water samples together with Legionella sp.
数による生菌数変化として検討し,その結果を
の BCYEα 寒天培地に比べて発育速度が遅い傾向
Table 2 に示した.選択剤を含有しない BCYEα
を示した.L. pnemophila 3681 は pH 6.5 で最高の
寒天培地では供試した Legionella 属菌 3 株とも最
発育菌数を示したが,他の 2 株は pH 6.5 と pH 7.0
も出現集落数が多かったのは pH 6.5 であり,次い
でほぼ同数に発育した.また,pH 7.5 において,
で pH 7.0 であった.いずれの菌株でも 6 日間の培
供試 3 株は各最高菌数の 10∼50% が発育し,これ
養でほぼ最高集落数に達したが,pH 6.5 と 7.0 で
らの発育 pH 域は BCYEα 寒天培地よ り も 狭 い
は 3 日間の培養で 80% 以上の集落数に達した.
が,WYOα 寒天培地よりも広いことが明らかに
pH 6.0 で は L. pneumophila 2 株 は 11 日 間 の 培 養
なった.
でも集落は認められなかったが,L. micdadei 3685
では,6 日後に最高集落数(pH 6.5)の約半数の集
2.Legionella 属菌の検出におよぼす選択培地中
の VCM 濃度の効果と影響
落が出現した.培地の pH が 8.0 では L. pneumo-
Legionella 属菌の発育に対する VCM 濃度の影
phila 3677 がわずかに発育したのみで,他の 2 株
響 を BCYE 寒 天 培 地,WYOα 寒 天 培 地 お よ び
は全く発育しなかった.選択培地の WYOα 寒天
MWY 寒天培地の基礎培地に添加して検討し,そ
培地では,BCYEα 寒天培地と同様に pH6.5 が最
の結果を Table 3 に示した.BCYE 寒天培地では
も出現集落数が多かった.最高集落数に達するの
VCM 添加(1.25∼5.0µg!
ml)により,L. bogemanii
に要する培養時間は,L. pneumophila 2 株は 6 日間
3684 の 発 育 は 5∼20% に 減 少 し た.L. pneumo-
を要し,L. micdadei 3685 は 3 日目で最高集落数に
phila 3677 ,L. pneumophila 3681 および L . long-
近い発育を認めた.L. pnemophila 3681 と L. mic-
beachae 3689 は VCM の添加濃度によって抑制さ
dadei 3685 は pH 7.0 で,pH 6.5 とほぼ同数の集落
れる傾向を示し,5µg!
ml 添加で 50∼60% に減少
が発育したが,L. pneumophila 3677 はわずかに発
した.WYOα 寒天培地の場合,L. longbeachae 3689
育したのみであった.一方,pH 6.0 と pH 7.5,
8.0
を除く Legionella 属菌 6 株は VCM の無添加にお
では試験した 3 株とも 11 日間の培養でも発育を
いても,BCYE 寒天培地の無添加に比べてその発
認めなかった.MWY 寒天培地では供試した Le-
育集落数は 10∼70% に減少した.L. pneumophila
gionella 属菌 3 株とも 3 日間培養において発育菌
3677,L. bozemanii 3684 および L. dumoffii 3686 は
数が少なく,WYOα 寒天培地と同様に選択剤不含
VCM の添加濃度に従い,発育が抑制される傾向
感染症学雑誌
第76巻
第1号
環境水 Legionella 属菌の選択的検出法
47
Table 7 Effect amphotericin B in MWY agar on the growth of Legionella sp. and fungi in the mixed culture
Growth
(CFU/plate)
Strain
(Legionella sp. + fungus)
Inoculum size*
102
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
5.2 ×
+ Aspergillus sp. RF001
5.5 × 102
102
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
5.2 ×
+ Aspergillus sp. RF020
8.2 × 102
102
Concentration of amphotericin B
(µg/ml)
0
40
80
0
0
2.1 × 102
2.5 × 102
1.8 × 102
0
1.5 × 102
7.5 ×
102
4
2.0 × 10
3.8 × 102
0
102
3.8 × 102
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
5.2 ×
+ Trichoderma sp. RF017
4.9 × 102
3.2 × 102
1
0
L. pneumophila 3677
(serogroup 1)
5.2 × 102
0
4.2 × 102
5.1 × 102
102**
0
7.5 ×
+ Mucor sp. RF036
5.0 ×
Over growth
2
0
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
1.5 × 103
0
1.1 × 102
7.1 × 102
+ Aspergillus sp. RF001
5.5 × 102
3.5 × 102
9.3 × 10
15
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
1.5 × 103
0
9.7 × 102
1.0 × 103
+ Aspergillus sp. RF020
8.2 × 102
1.8 × 102
1
0
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
1.5 × 103
0
1.1 × 103
1.1 × 103
+ Trichoderma sp. RF017
4.9 × 102
3.0 × 102
0
0
L. pneumophila 3681
(serogroup 4)
1.5 × 103
0
1.1 × 103
1.0 × 103
+ Mucor sp. RF036
5.0 × 102**
Over growth
6
0
L. micdadei 3685
1.1 × 103
0
5.5 × 10
7.6 × 102
+ Aspergillus sp. RF001
5.5 × 102
2.9 × 102
2.1 × 102
8
103
L. micdadei 3685
1.1 ×
+ Aspergillus sp. RF020
8.2 × 102
103
L. micdadei 3685
1.1 ×
+ Trichoderma sp. RF017
4.9 × 102
103
L. micdadei 3685
1.1 ×
+ Mucor sp. RF036
5.0 × 102**
0
1.9 × 102
0
2.9 × 102
0
Over growth
9.1 ×
102
1
7.6 ×
0
102
0
7.4 ×
3
7.3 × 102
8.6 × 102
0
102
6.9 × 102
0
Incubation : 37℃ for 5 days
* : Legionella sp. : BCYE agar ; fungus : potato-dextrose agar
** : Numbers of spore by microscopy
を示し,L. pnemophila 3681,L. micdadei 3685 およ
冷却塔水中から分離されたグラム陽性菌 7 株お
び L. longbeachae 3689 はその影響がほとんど見ら
よびグラム陰性菌 6 株,参考菌株として Staphylo-
れ な か っ た.L. gormanii 3687 は 試 験 し た VCM
coccus aureus 5084 お よ び Escherichia coli 5079 を
の最少の 1.25µg!
ml の添加量でも発育が認められ
用い,WYOα 寒天培地(VCM:5µg!
ml),MWY
な か っ た.MWY 寒 天 培 地 を 用 い て 検 討 し た
寒天培地(VCM:1µg!
ml)および対照培地として
VCM 濃度の影響は,L. gormanii 3687 がわずかで
標準寒天培地における各菌の発育菌数を Table 4
はあるが 5.0µg!
ml の VCM 濃度で発育が確認で
に示した.グラム陽性菌は,WYOα 寒天培地で供
きた以外,全試験菌株とも WYOα 寒天培地の成
試した全菌株が発育を抑制されたが,MWY 寒天
績とほぼ同様の傾向を示した.
培地では参考菌株として用いた S. aureus 5084 以
平成14年 1 月20日
48
春日
修 他
外の冷却塔水由来の分離株 7 株すべてが発育を認
み合わせた系で,いずれも少数の糸状菌が発育し
めた.標準寒天培地における菌数との比較では
たが,各 Legionella 属菌は容易に検出でき,他の 2
Corynebacterium aquaticum の RB 002 および RB
種類の糸状菌と組み合わせた系では,すべて糸状
005 は 30% 以下であり,その他の株はほぼ同数で
菌の発育が完全に抑制され,各 Legionella 属菌は
あ っ た.グ ラ ム 陰 性 菌 は,WYOα 寒 天 培 地 で
良好に発育した.
Sphingobacterium multivorum RB006 の 菌 数 が 46
%に 減 少 し,Acinetobacter sp. RB106 お よ び Mo-
考
察
近年の免疫抑制宿主の増加傾向やライフスタイ
raxella sp. RB125 は 10% 以下に減少した.また,
ルの変遷などにより,今後は Legionella 属菌が呼
Pseudomonas pseudoalcaligenes RB025,P. alcaligenes
吸器感染症の主要な原因菌になるであろうと Ad-
RB003,P. picketti RB242 および E. coli 5079 の発
ams6)は予測している.Legionella 属菌は培養によ
育は完全に抑制された.MWY 寒天培地では,参考
る検出困難な細菌であることから,臨床的には,
菌株を含むすべての菌株で発育を認め,そのうち
より迅速で,直接的な診断法が求められ,免疫化
E. coli 5079 および P. alcaligenes RB003 は 1% 以
学的あるいは遺伝子による迅速検出法が進展して
下 に,Moraxella sp. RB125 お よ び P. pseudoalcali-
きている.しかし,Doern7)は,Legionella 属菌を含
genes RB025 は 20% 以下に減少した.その他の分
む培養困難な細菌の感染症診断であっても,これ
離株はほとんど抑制をうけなかった
らの迅速検出法は初期の診断に利用し,培養法を
3.Legionella 属菌の検出におよぼ す MWY 寒
天培地中の AMPH-B 濃度の効果と影響
用いた原因菌の確認は感染症の診断には欠くこと
ができないと強調している.我々も,感染症診断
MWY 寒天培地への AMPH-B の添加は,試験
には感染部位に生存する原因菌の確認が重要であ
した Legionella 属菌 7 株とも最 高 濃 度 の 160µg!
ると考え,Legionella 属菌の培養法による検出につ
ml でもほとんど発育に影響を与えなかった(Ta-
いて検討してきた.前報3)では,環境水中から分離
ble 5)
.
された Legionella 属菌を用いて各種選択培地にお
Table 6 に,分離糸状菌 10 株に対する AMPH-
ける発育状態を比較し,WYOα 寒天培地で発育し
B の発育抑制効果を示した.MWY 寒天培地に
た菌数が MWY 寒天培地での菌数に比べて 1!
4∼
AMPH-B の 40µg!
ml を添加することにより,10
1!
20 に抑制されることを報告した.その理由には
株中 6 株は 20% 以下の菌数に減少し,80µg!
ml
両者の培地組成や分離された菌株の性状の違いな
添加ではほとんどの菌株が完全に抑制された.ま
どが考えられる.Legionella 属菌の発育は培地 pH
た,AMPH-B が 80µg!
ml 添加されている WYOα
により厳しい制限を受けるとされている.奥田ら8)
寒天培地では Aspergillus sp. RF001 がわずかに発
は BCYE 培地および WYO 培地における発育至
育したのみで全菌株の発育が抑制された.
適 pH を各種の Legionella 属菌を用いて詳細に検
Legionella 属菌 3 株および糸状菌 4 株を用いた
討し,pH 6.6∼7.0 の範囲では菌の発育支持力に明
12 種の混合培養におけるそれぞれの菌の生菌数
らかな差が認められなかったとしている.今回,
測定結果を Table 7 に示した.AMPH-B の無添加
より広域な pH 範囲における菌の発育を BCYEα
培地では,いずれの組み合わせ培養においても糸
寒天培地,WYOα 寒天培地および MWY 寒天培
状菌は平板培地表面全体に発育し,Legionella 属菌
地を用いて比較した結果,Legionella 属菌は選択剤
の発育は認められなかった.AMPH-B 濃度が 40
を含有する WYOα 寒天培地において,その発育
µg!
ml では,Aspergillus sp. RF001 の発育が十分
が著しく影響をうけ,きわめて狭い pH 範囲でし
抑制されずこの株を組み合わせた 3 つの系では,
か発育できないことが明らかになった.したがっ
混合した L. pneumophila の検出が困難で,1 例で
て,選択剤を含有する培地の自家調製にあたって
はまったく検出されなかった.AMPH-B を 80µg
は,pH 調整の厳密な管理の重要性が示唆された.
!
ml 添加した培地では,Aspergillus sp. RF001 と組
さらに,Legionella 属菌の中には,選択剤を含有す
感染症学雑誌
第76巻
第1号
環境水 Legionella 属菌の選択的検出法
49
る培地で,培養 6 日以降に生菌数が安定して計測
添加によって,検出可能になることが確認できた.
される菌株が認められたことから,選択培地を用
これらの成績から,AMPH-B の 80µg!
ml を含有
いる Legionella 属菌の検出には,37℃,6 日以上の
している WYOα 寒天培地を用いた場合には,試
培養が適当と考えられた.
験材料中に混在する糸状菌の発育を効果的に抑制
WYOα 寒天培地には選択剤として,VCM が 5.0
していることが推測された.奥田ら4)は Candida
µg!
ml 添加されている.この濃度は MWY 寒天培
属の株を用いて,AMPH-B の有効性を報告し,Lin
地の 1.0µg!
ml に比べると 5 倍の濃度である.Le-
ら10)は臨床材料から Legionella 属菌を検出する場
gionella 属菌の発育に対する VCM の添加量の影
合に,混在する酵母を抑制する目的で,選択培地
響を検討した結果,Table 3 に示したように,発育
に anisomycin と fluconazole を組み合わせて添加
抑制の程度は Legionella 属菌の菌種および菌株に
する改良法を提案しているが,実際の Legionella
よって異なるが,VCM の添加濃度により影響を
属菌の検出では,こうした酵母様真菌よりも培地
うける菌株のあることが確認された.一方,環境
表面全体に発育する糸状菌の抑制が重要であるた
水中から Legionella 属菌の検出時に MWY 寒天培
め,今 回 冷 却 塔 水 か ら 分 離 し,Aspergillus sp.
地で発育してきた Legionella 属菌以外の細菌の中
Trichoderma sp.,Scolecobasidium sp.お よ び Mucor
には,WYOα 寒天培地によって効率よく抑制され
sp.と同定された糸状菌を用いて AMPH-B の抗真
ることをすでに認めている3).とくに,グラム陽性
菌効果を試験し,その有用性が確認できた.今回
菌は WYOα 寒天培地では効果的に抑制され,さ
供試した糸状菌は anisomycin(80µg!
ml)を含有
らに今回の結果では,グラム陰性菌の中にも発育
する MWY 寒天培地で分離した菌株であり,すべ
が抑制される菌株が見出された(Table 4)
.Leoni
ての糸状菌について anisomycin の抑制作用がな
9)
ら は給湯水からの Legionella 属菌の分離培地を
いとは断定できないが,冷却塔水を対象とする場
比較し,VCM を 5.0µg!
ml 含有する GVPC 培地に
合,真菌に対する選択剤としては AMPH-B が有
おいて,最も高い検出率が得られたと報告してい
用で, 使用濃度は 80µg!
ml が効果的と思われた.
る.選択培地中に含まれる抗菌剤の種類と濃度は
したがって,糸状菌などの真菌が多く混在してい
試験材料中に混在している Legionella 属菌以外の
ると予測される環境水の Legionella 属菌検出にあ
菌の抑制と Legionella 属菌の発育の間にシーソー
たっては,AMPH-B 80µg!
ml を添加 し た MWY
(seesaw)
の関係を示すと考えられ,用いる抗菌剤
寒天培地を用いることにより,より高い検出率が
の効果は予想される Legionella 属菌以外の菌の種
得られるものと考えられる.一方,AMPH-B は難
類によって使い分ける重要性が示唆された.
水溶性で毒性を有していることから,より取り扱
冷却塔水からの Legionella 属菌の検出に,抗真
菌剤として anisomycin を使用している MWY 寒
天培地を用いた場合,糸状菌の発育により Legionella 属菌が分離できない例を経験した.そのた
め,WYOα 寒天培地に抗真菌剤として添加されて
いる AMPH-B の MWY 寒天培地への添加効果と
影響を試験した.その結果,MWY 寒天培地に
AMPH-B を 80∼160µg!
ml を添 加 す る こ と に よ
り,Legionella 属菌の発育に影響することなく冷却
塔水由来の糸状菌は顕著に抑制された.さらに,
これら糸状菌と Legionella 属菌と混合培養した場
合,混在する糸状菌の旺盛な発育のために抑制さ
れていた Legionella 属菌が,AMPH-B の 80µg!
ml
平成14年 1 月20日
いが容易で抗真菌力が強く,安全性の高い選択剤
の利用が望まれる.
文
献
1)厚生省生活衛生局企画課監修:レジオネラ症防
止指針.財団法人ビル管理教育センター,1994.
2)厚生省生活衛生局企画課監修:新版レジオネラ
症防止指針.財団法人ビル管理教育センター,
1999.
3)春日 修,高木紀美子,谷 佳都,絹巻明生:環
境水由来レジオネラ属菌の分離方法に関する検
討.感染症誌 1999;73:25―34.
4)奥田敬一,池戸正成,薮内英子:冷却塔水から Legionella 属 菌 を 検 出 す る た め の 新 選 択 培 地:
Wadowsky-Yee-Okuda(WYO)培地.感染症誌
1984;58:1073―82.
50
春日
5)Ikedo M, Yabuuchi E:Ecological studies of Legionella species I. Viable counts of Legionella pneumophila in cooling tower water. Microbiol Immunol 1986;30:413―23.
6)Adams SL:Legionella :A new millennium bug.
Clin Lab Sci 1999;12:309―15.
7)Doern GV:Detection of selected fastidious bacteria. Clin Infect Dis 2000;30:166―73.
8)奥田敬一,池戸正成,阿部 晃:WYO 培地の至適
pH と α-ケトグルタル酸の添加効果.臨床と微生
修 他
物 1991;18:823―9.
9)Leoni E , Legnani PP : Comparison of selective
procedures for isolation and enumeration of Legionella species from hot water systems. J Appl
Microbiol 2001;90:27―33.
10)Lin A, Stout JE, Rihs JD, Vickers RM, Yu VL:
Improved Legionella selective media by the addition of fluconazole:Results of in vitro testing and
clinical evaluation . Diagn Microbiol Infect Dis
1999;34:173―5.
Studies on Efficient Methods for Detection of Legionella species from
Environmental Water by use of its Selective Media
Osamu KASUGA1), Hitoshi MISAWA1), Kimiko TAKAGI1)
Kato TANI1)& Masanari IKEDO2)
1)
Tanabe R & D Service Co., Ltd.
Biochem. Res. Lab., Eiken Chemical Co., Ltd.
2)
To examine the optimal pH range for growth on media, growth of Legionella spp. on its selective
media, BCYEα,WYOα and MWY agar media, in a pH range of 6.0∼8.0(at 0.5 intervals)was compared. The growth of two strains of L. pneumophila and one strain of L. micdadei on a WYOα agar supplemented with some selecting antimicrobial agents was markedly inhibited at all pH range except
6.0 and 7.0, suggesting a narrow optimal pH range for growth of these species compared to the
BCYEα without selecting antimicrobioal agents. Vancomycin(VCM)added to the selective agar suppressed the growth of some Legionella spp. depending on the concentration. However, the extent of
suppression was different among species and!or strains of Legionella spp. The selectivity for species
other than Legionella spp. was also affected similary by VCM concentration added to their media, suggesting that it is important to use proper amounts of the selecting antimicrobial agent depending on
the species and!or strains of Legionella spp. or the other species in water samples. Amphothericin B
(AMPH-B)added to a selective medium, MWY agar, in the concentration of 80µg!
ml hardly affected
the growth of Legionella spp. examined, but effectively inhibited the growth of fungal strains identified as Aspergillus sp., Trichoderma sp., Scolecobasidium sp. and Mucor sp. which were isolated from
cooling-tower water samples together with Legionella spp. Furthermore, the growth of a combination
culture of one each of the 4 strains of isolated fungi and one each of the 3 strains of Legionella spp. was
examined at various concentration of AMPH-B. Addition of AMPH-B to the selective medium at the
concentration of 80 µg!ml suppressed the growth of spreading fungi, permitting the growth of Legionella spp. to allow efficient detection of the species.
感染症学雑誌
第76巻
第1号
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