SPIRIT21 №24 大腸菌自動測定装置 株式会社 明電舎 第 1 反応終了後，酵素を標識した抗体（第 2 抗体） を添加し，抗原抗体反応を行う。 [D]洗浄 抗原抗体反応終了後，洗浄を行い，上澄み液中に 残留した酵素標識抗体を除去する。 このように，抗原が固相化抗体と酵素標識抗体には さまれた形となっているため，この測定法はサンド イッチ法と呼ばれている。 [E]化学発光反応 第 2 反応終了後，化学発光試薬を加えると，標識 酵素量に比例した発光反応が起こる。 [F]発光量測定 発光量は，標識酵素量に比例し，標識酵素量は抗 原量（大腸菌群数）に比例するので，発光量から間 接的に大腸菌群数を求めることができる。よって， 予め既知濃度の大腸菌群数に対する発光量を計測し て，標準曲線（図−２）の作成を行うことで，未知 濃度の大腸菌群を含む試料の発光計測値から未知濃 度の大腸菌群数を求めることができる。 １．技術概要 本技術は，従来の下水道法（下水の水質の検定方 法に関する省令）で定められている寒天培養後，生 成したコロニーを計数するデソキシコール酸塩培地 による平板培養法（以下，「デソ法」という）とは全 く異なる原理に基づいた方法を採用しており，蛋白 質などの測定法として知られている酵素免疫測定法 （Enzyme Immuno Assay 法，以下「EIA 法」）と，近 年高感度の測定法として注目されている生物発光・ 化学発光法を応用して大腸菌群数を短時間で測定す る方法である。本装置の測定原理を図−１に示す。 ポリスチレン製試験管 （φ１１ｘＬ７０ｍｍ） 第 １抗体 抗原 （超音波破砕大腸菌群） 酵素 第２抗体 発光 試薬 洗浄 ［A］ 抗原・抗体反応 （第１反 応） 抗原・抗体反応 （ 第２反応） ［B］ ［C］ 図−１ 光 ［D］ ［E］ ［F］ 大腸菌群の測定原理 108 発光量[counts/30s] [A]固相調製 ポリスチレン製の試験管（φ11mm×70mmL）に，第 1 抗体を入れて固相化する。 [B]第 1 反応 固相化した試験管に，予め超音波破砕した試料（抗 原：大腸菌群）を加えると特異的な反応（抗原抗体 反応）が起こり，固相化抗体に抗原が結合する。 [C]第 2 反応 107 106 105 104 103 102 103 104 105 106 大腸菌群数[個/cm3 ] 図−２ ‑1‑ 標準曲線 107 108 ２．開発研究 2.1 必要性能と開発目標 【募集要領に記載された開発目標（必要性能）】 「合流式下水道改善に関する技術開発 募集要領」 に記載された開発目標（以下，「必要性能」）は，合 流式下水道において，日常の維持管理が比較的容易 で，雨天時に下水の水質を連続的かつ正確に測定記 録できる技術である。これを表−１に示す。 槽から流入水と流出水を 1 時間毎に交互に調整槽か ら本装置にサンプリングして大腸菌群を測定した。 表−３に実験対象水と期間を示す。 表−３ 表−１ 募集要領に記載された開発目標（必要性能） 開発研究課題 計測・制御に関する開発研究 開発目標 合流式下水道の自然吐き口における 水量・水質を測定できる技術 適用範囲 吐き口からの下水※の水質 測定項目：BOD，SS，COD，T‐N， T‐P，濁度，等 【技術提案者が提示した開発目標】 技術提案者が提示した開発目標（以下，「開発目 標」という）を表−２に示す。開発目標は，表−１ の適用範囲の内，下水の種類と測定項目の内訳およ び必要性能は技術提案者が自ら設定するものである。 開発目標 最初沈殿池流入水 最初沈殿池流出水 平成 15 年 10 月 〜平成 16 年 8 月 項 流入水を含む。 適用範囲 実験期間 表−４ ※）吐き口からの下水には，スクリーン，沈砂池を経た最初沈殿池 表−２ 実験対象水 3.2 実験装置 装置の仕様を表−４に示す。図−３に千葉市中央 浄化センターにおけるシステム構成図を示す。また， 装置外観写真を写真−１，測定部の写真を写真−２ に示す。 連続的にかつ正確に測定記録できる 技術 必要性能 技術提案者が提示した開発目標 測定時間：30 分 検出範囲：500〜5,000,000 個/cm3 測定精度：CV≦10％ ※）吐き口からの下水には，スクリーン，沈砂池を経た最初沈殿池 大腸菌自動測定装置の仕様 目 仕 様 測定方法 化学発光法による酵素免疫測定法 測定時間 30 分（30〜120 分から選択可能） 検出範囲 測定時間により異なる 測定精度 変動係数（CV）≦10％（目標値） 電 AC100V±10％，7A 源 測定系列数 １または２系列選択 データ出力 DC4〜20mA 警報出力 故障警報 1点 接点出力 測定中 測定完了 2点 2点 接点入力 測定指令 2点 入 出 力 信 号 終末処理場の最初沈殿池流入水※ 終末処理場の最初沈殿池流出水 測定項目：大腸菌群 実験対象水と期間 外形寸法 装置本体： 1240mmW×748mmD×1255mmH サンプリング部： 470mmW×740mmD×2249mmH 質 装置本体＋付帯設備：約 600kg 流入水を含む。 ［CV：Coefficient of Variation(変動係数)］ ３．開発研究方法 3.1 実験場所と期間 実験は，千葉市中央浄化センターにユニットハウ スを設置し，ユニットハウス内に大腸菌自動測定装 置を据え付けて実施した。 試料水は，最初沈殿池の流入水と流出水を採水ポ ンプにより揚水し，塩ビ製の配管（65A）を経由し て，本装置の横に設置した調整槽へ送水した。調整 量 使用環境 ‑2‑ 屋内，温度：20℃，湿度：65％以 下（エアコンの設定温度を 20℃ で運転し，使用環境を保持する） ユニット ハウス 携帯電話 【試料水の採取，保存および検定方法】 「下水の水質の検定方法に関する省令（最終改 正：平成一六年三月一二日国土交通省・環境省令 第一号）」に基づいて行った。 ×：手分析用 ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞﾎﾟｲﾝﾄ ﾃﾚｺﾝ ｵｰﾄｻﾝﾌﾟﾗ‑ (24ｻﾝﾌﾟﾙ) ｵｰﾄｻﾝﾌﾟﾗ‑ (24ｻﾝﾌﾟﾙ) 始動指令 検出器 大腸菌自動測定装置 ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞ装置 ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞ装置 × × 【装置の測定試料の確認】 デソ法は，各希釈操作の時に試験管ミキサーで 撹拌を行い，SS に吸着された大腸菌群を SS から 脱着させているが，EIA 法は超音波破砕を行うた め，測定試料の確認として懸濁物質（SS）の影響 について SS の濃度が異なる大腸菌群数について 調査をした。その結果，同じ SS 濃度において EIA 法は，デソ法より大腸菌群数が高くなる結果とな った。大腸菌群をデソ法よりも分離させる効果が あるためと考えられる。 また，ポンプによる採水を行っているため，デ ソ法の採水箇所と装置の採水箇所である調整槽で 大腸菌群数について調査し，差異がないことを確 認した。 調整槽 ｵｰﾊﾞｰﾌﾛｰ VP65A VP65A Ｐ 曝気槽へ 処理の流れ Ｐ 分水槽から 最初沈殿池 流出水ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞﾎﾟﾝﾌﾟ 図−３ 写真−１ 写真−２ 流入水ｻﾝﾌﾟﾘﾝｸﾞﾎﾟﾝﾌﾟ システム構成図 【装置の検出範囲】 検出範囲の検証において，開発目標の最大値と 最小値については，理化学研究所微生物系統保存 施設（JCM）から標準大腸菌株を分譲してもらい， 培養して調製した標準大腸菌を用いて行った。 検出限界は，大腸菌群 0 個/cm3（ブランク値） に対する発光量（Ｎ）と大腸菌群を含む試料水の 発光量（Ｓ）との比率（Ｓ／Ｎ）が 1.5 を検出限 界と定義した。 検出範囲の最小値の 500 個/cm3 の検証は，最終 沈殿池の流出水でも実現できないので，標準大腸 菌を最初沈殿池の流入水のろ過水で希釈して検証 した。 高濃度域の上限は，大腸菌群数と発光量の関係 を下記に示す多項式で表し，段階希釈した標準大 腸菌を表−５に示す全測定時間で EIA 法を測定し， 係数ａ，ｂ，ｃを求め，多項式が直線から 10％外 れる濃度を上限値とした。 ｙ＝ａｘ 2 ＋ ｂｘ ＋ ｃ ･･･(1) ｙ：30 秒間の発光量 ｘ：標準大腸菌数 大腸菌自動測定装置外観 大腸菌自動測定装置測定部 【測定値の信頼性検証】 デソ法による手分析値との相関性試験を行い， 大腸菌自動測定装置の測定値の信頼性について調 査する。相関性については，相関係数（ｒ）が ｒ≧0.8 を目標とする。 3.3 評価方法 本技術に関して，必要性能と開発目標が達成さ れたことを確認するにあたって，以下に示す項目 に留意した。 ‑3‑ 【雨天時の計測値の精度検証】 実験対象とする降雨は総量，最大強度，降雨時 間を明示して，数パターン，複数回測定し，大腸 菌自動測定装置が，雨天時の流入水に対して，精 度良く計測できるかを評価する。 350,000 発光量(counts/30s) 300,000 ４．開発研究結果 4.1 検出限界 検出限界は以下のようにして求めた。 まず，標準大腸菌を最初沈殿池の流入水のろ過水 で希釈した試料を，第 1 反応時間：10 分，第 2 反応 時間：5 分，その他時間：20 分を合計した全測定時 間 35 分で測定した。発光量（counts/30sec）はブ ランクを含めて全ての希釈倍率の標準大腸菌を 2 回 測定して得られた発光量の平均値とする。 次にデソ法にて，希釈倍率 80,000 倍の標準大腸 菌，20,000 倍の標準大腸菌，5,000 倍の標準大腸菌 およびブランクを測定する。その他の希釈倍率 （160,000 倍，40,000 倍，10,000 倍，2,000 倍）の 標準大腸菌数はデソ法の測定値から推定した値であ る。 その結果を表−５および図−４に示す。表−５に おいて，希釈倍率は，標準大腸菌を最初沈殿池流入 水のろ過水で希釈した希釈倍率である。 表−５ 希釈倍率 ブランク 11,200 160,000 倍 8,500 11,400 80,000 倍 17,000 13,200 40,000 倍 34,000 15,400 20,000 倍 73,000 25,300 10,000 倍 146,000 56,150 5,000 倍 260,000 130,500 2,000 倍 650,000 326,500 150,000 100,000 0 10 3 10 4 10 5 10 6 標準大腸菌数(個/cm3) 図−４ 全測定時間 35 分の測定結果 以上の結果から大腸菌数と発光量の関係を多項式 (1)から係数ａ，ｂ，ｃを求めると多項式（2）式と なる。 ｙ＝1.17×10‑7 ｘ 2＋4.25×10‑1 ｘ＋1.79×103 ･･･（2） それぞれの測定時間において，各ブランク値に対 する発光量（Ｎ）の 1.5 倍に相当する大腸菌群数を 対応する多項式のｙの値に代入して検出下限(ｘ) を算出した。 発光量 (counts/30sec) 0 200,000 50,000 全測定時間 35 分の測定結果 大腸菌数 (個/cm3) [デソ法] 250,000 4.2 検出範囲 EIA 法で測定した結果を多項式(2)にて，測定時間 （全測定時間）について求めた検出範囲の検証結果 を，表−６に示す。 その結果，検出範囲の測定下限は，達成できなか ったが，検出範囲の測定上限は，今回検証した全て の測定時間において，5,000,000 個/cm3 以上の測定 が可能であった。 ‑4‑ 検出範囲の検証結果 第 1 反応 時間 (分) 第 2 反応 時間 (分) その他 時間 (分) 全測定 時間 (分) 5 5 20 30 66,410 〜 8,750,000 10 5 20 35 34,980 〜 9,200,000 検出範囲 <大腸菌群数> (個/cm3) 5 20 45 14,700 〜 6,620,000 30 5 20 55 12,610 〜 7,810,000 70 11,830 〜 7,080,000 5 20 60 5 20 85 11,350 〜 7,090,000 20 10 20 50 11,740 〜 8,770,000 30 10 20 60 9,550 〜 7,820,000 45 10 20 75 8,110 〜 6,570,000 60 10 20 90 6,230 〜 6,060,000 CV=1.4 (n=4) 大腸菌群数[装置]( 個/cm3) 20 45 107 CV=2.1 (n=4) 106 CV=4.5 (n=4) 105 104 104 105 106 107 大腸菌群数[ﾃﾞｿ法](個/cm3) 図−５ 4.3 測定精度 最初沈殿池流入水に標準大腸菌を添加した試料 （高濃度：大腸菌群数＝1,044,000 個/cm3），最初沈 殿池流入水（中濃度：大腸菌群数＝508,000 個/cm3） および最初沈殿池流入水を蒸留水で 10 倍希釈した 試料（低濃度：大腸菌群数＝49,400 個/cm3）の 3 段 階の濃度になるように調製した試料を繰り返し 4 回 測定して大腸菌自動測定装置の測定精度について検 証した。 4 回連続して測定した変動係数（CV）の結果を図 −５に示す。 大腸菌自動測定装置による高濃度，中濃度および 低濃度における大腸菌群数の測定値の CV は， CV≦10％で，測定精度に問題ないことを示してい る。 測定精度検証結果（ｎ＝4） 4.4 装置とデソ法による測定値の相関関係 大腸菌自動測定装置とデソ法による測定値の相関 性試験結果を図−６に示す。 図中，●は晴天日，■は雨天日のデータである。 図−６において，手分析の測定値と装置の測定値 の相関係数(ｒ)は，ｒ＝0.94 で，良好な関係にあり， 絶対値についても破線で示すとおり，ｙ＝ｘに対し て±0.35Log の範囲に入っており，装置と手分析の 大腸菌群数に相違がないことを示している。また， 晴天日，雨天日にかかわらず高い相関関係があった。 Ｌｏｇ[大腸菌群数(個/cm3)装置] 表−６ y = 0.9953x r = 0.94(n=44) 5.5 5.0 ●：晴天日 ■：雨天日 4.5 ●晴天時 ■雨天時 4.0 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 3 Ｌｏｇ[大腸菌群数(個/cm )手分析] 図−６ ‑5‑ 装置(EIA 法)と手分析(デソ法)の相関関係 ５．技術評価 【募集要領に記載された開発目標（必要性能）結果】 募集要項に記載された開発目標（必要性能）に対 する評価結果を表−５に示す。 表−８ 技術提案者が提示した開発目標と評価 適用範囲 終末処理場の最初沈殿池流入水 終末処理場の最初沈殿池流出水 測定項目：大腸菌群 ・技術評価 【募集要領に記載された開発目標（必要性能）結果】 募集要項に記載された開発目標（必要性能）に対 する評価結果を表−７に示す。 開発目標 測定時間：30 分 検出範囲：500〜5,000,000 個/cm3 測定精度：CV≦10％ 表−７ 募集要領に記載された開発目標（必要性能） 評価結果 測定時間：30 分での測定は可能である。 検出範囲：30 分の測定時間では 66,410 〜8,750,000 個/cm3 で，上限は達成で きたが，下限は達成できなかった。 測定精度：CV≦5％（ｎ＝3）で目標を達 成した。 以上の結果から，検出範囲の下限値以外 の開発目標は，達成したと認められる 開発研究課題 計測・制御に関する開発研究 開発目標 合流式下水道の自然吐き口における 水量・水質を測定できる技術 適用範囲 吐き口からの下水※の水質 測定項目：BOD，SS，COD，T‐N， T‐P，濁度，等 必要性能 連続的にかつ正確に測定記録できる技術 評価結果 大腸菌群数の装置計測値と手分析値との 相関関係は，下記に示すとおり良好であ り，最初沈殿池の流入水および流出水を 1 時間毎に交互に連続して 1 週間，無保 守で正確に測定記録できたことから，必 要性能を有すると認められる。 （図−７ 参照） ｒ＝0.94（ｎ＝44） ６．留意事項 ・共存物質の影響も受け易いため導入する際には， 予め各処理場の下水中の大腸菌群を測定して，処 理場の大腸菌群と大腸菌群の抗体がきちんと反応 するか（特異性があるか）を調査し，特異性が得 られない場合には，前処理などを行う必要がある。 ※）吐き口からの下水には，スクリーン，沈砂池を経た最初沈殿池 流入水を含む。 【技術提案者が提示した開発目標結果】 技術提案者が提示した開発目標に対する評価結果 を表−８に示す。 ●このプロジェクトに関するお問い合わせは 研究第三部長 研究第三部技術課長 研究第三部研究員 研究第三部研究員 ‑6‑ 照沼 鳥海 津島 前田 誠 弘 勲 充
© Copyright 2024 Paperzz
