ヒト型疾患変異 ARX-KI マウスを用いた X 連鎖滑沢

新潟大学脳研究所
｢脳神経病理標本資源活用の先端的共同研究拠点｣
共同利用・共同研究報告書
ヒト型疾患変異 ARX-KI マウスを用いた
X 連鎖滑沢脳症、精神遅滞、てんかんの解明
木村
穣 1)
中村健司 1)
横山峯介 2)
1)
東海大学医学部、
2)
新潟大学脳研究所
研究要旨
X 染色体連鎖のてんかんを伴う精神遅滞、あるいは重度脳形成障害の滑脳症等の疾患は、これまで
家系調査等から多くの候補遺伝子が分離、同定されて報告されているが、各遺伝子異常と疾病の発症
機構の関係は、未だ殆ど解明できていない状況にあるといえる。
本研究は、数多くの原因遺伝子の中から ARX (aristaless related homeobox gene)遺伝子変異に
着目して、疾病発症のメカニズムを追究してきた。ヒトから同定された変異を元に遺伝子改変マウス
を作成して、その変異がいかなる異常をもたらすかを神経発生学的、電気生理学的、行動学的に解析
して、
疾病発症のメカニズムを明らかにすると共に、
有効な疾病治療に寄与することを目指している。
A.研究目的
ネガティブ効果等の付加機能を解明する。さらに、
我々は、Arx 遺伝子発見者である北村邦夫博士
多様な表現型が機能低下による結果と判明した
との共同研究により、神経疾患の家系より見つか
場合は、変異 Arx 遺伝子の遺伝子量効果を推量し
った、ARX 遺伝子変異を再現したヒト疾患モデル
て、疾病治療に結びつけることも考慮する。
マウスを作成して研究を進めてきた。
Arx Tg マウスは、特に大脳で強発現する系統確立
Arx KI マウスは、ヒトの病態が精神遅滞を認める
を進めるだけでなく、導入遺伝子を誘導的に発現
ARX 変異２種類、てんかんを発症する ARX 変異２
させることも併せて検討した。
種類、
滑脳症を呈する ARX 変異２種類を選別した。
さらに、遺伝子変異の種類として、ポリアラニン
B.研究方法（倫理面への配慮を含む）
伸長変異から２種類、１アミノ酸置換変異から４
１）行動学的解析および生化学的解析
種類を選定したヒト疾患モデルマウスである。
本研究目的は、病態発症のメカニズムを明らか
にする為、新たな Arx Tg を作成して、各種変異
Arx KI マウスの特徴的な病状（表現型）が回復で
きるかどうか検討することを目的とする。
また、病態発症が Arx 遺伝子の機能低下によるも
のか、あるいは１アミノ酸変異による付加機能で
あるのかを検討して、変異 ARX によるドミナント
発生工学技術を応用した Arx KI マウスの生産
は、新潟大学脳研究所の横山が行う。不稔や早期
致死のマウスは、生殖工学技術とキメラマウスを
利用して、世代を維持、管理する。Arx KI マウス
の特徴的な病状は、遺伝子発現様式の解析と、運
動量の定量的測定と運動異常をビデオモニター
して解析する。
２）マウスリソースバンクを利用した遺伝子操作
マウスの作成と配偶子の保存
であることが実証された。
Arx ヒト疾患モデルマウスにおける病態発症の
Arx ヒト疾患モデルマウスは、原因遺伝子が X
メカニズムをさらに明確にする為、トランスジェ
染色体に位置する影響からか、オスマウスは致死、
ニックマウス（Arx Tg）を作成して、各種変異 ARX
または不稔である。さらに、多くの系統が出生時
の特徴的な病状（表現型）が回復できるかどうか
致死、尐なくとも約２ヶ月齢までの致死であるこ
を検討した。現在のところ、遺伝子変異と疾病の
とから、変異マウスの維持は大変難しく困難を極
表現型は結びついたが、病態発症のメカニズムが
めた。
Arx 遺伝子の機能低下によるものか、あるいは、
自然交配を用いた実験では研究が困難であり、
Arx 遺伝子１アミノ酸変異による付加機能である
高度な生殖工学や発生工学技術を用いた実験が
のかは明確でない。各種変異 ARX による多様な病
必須である。当該実験技術を用いて、優れたヒト
態発症のメカニズムは、Arx 遺伝子の機能低下に
疾患モデルマウスをレスキューして、新規マウス
よるものと推測されるが、変異 ARX によるドミナ
の作成を積極的に試みた。
ントネガティブ効果等の付加機能であることも
否定できない。そこで、病態発症のメカニズムを
C.研究結果
さらに明らかにする為、Arx Tg マウスと Arx KI
患者家系調査より認められた ARX 遺伝子変異の
マウスとを交配することにより、各種変異 ARX の
特徴として、欠失変異だけでなくポリアラニンの
特徴的な表現型が救出できるかどうか研究を進
伸長変異が認められた。さらに、１アミノ酸置換
めている。更に、本研究で多様な ARX 関連疾患の
変異も認められた。ARX 遺伝子変異の種類（欠失
原因が、機能低下によるものと明らかになった場
変異、ポリアラニンの伸長変異、１アミノ酸置換
合は、変異 Arx 遺伝子の遺伝子量効果を推量して
変異）と変異部位は非常に多様性を示しており、
疾病治療に結びつけることも考慮している。
また、変異の種類や部位と、病態の表現型（滑脳
Arx Tg マウスは、特に大脳での強発現系ライン
症、てんかん、精神遅滞）と重症度の間には何ら
の系統確立を進めるだけでなく、導入遺伝子を誘
相関性が無く、ARX 変異の種類が病態を決定して
導的に発現させることも併せて検討した。また、
いるのか、それともさらに別の修飾遺伝子が存在
ヒト ARX 遺伝子変異を忠実に再現した ES 細胞を
するのか不明であった。
作成して、新規に雄キメラマウスを作成した。
我々は、北村邦夫博士等が世界で初めて開発、
致死性の Arx KI マウスは、雄キメラマウス個体
公表した、ヒト ARX 遺伝子変異を忠実に再現した
では、生存して生殖能力もあると推測されること
ヒト疾患モデルマウス（各種変異 Arx KI マウス）
から、疾病発症のメカニズムが明確になるだけで
を共同作成して研究を進めてきた。この Arx KI
なく、配偶子を凍結保存してバイオリソースの維
マウスは、ヒトの病態が精神遅滞を呈する ARX 変
持、保全が円滑に進むと期待できる。
異２種類、てんかんを呈する ARX 変異２種類、滑
脳症を呈する ARX 変異２種類を選別した。
さらに、
変異の種類は、ポリアラニン伸長変異から２種類、
D.考察
本研究から、各患者で多彩な表現型をもたらす
１アミノ酸置換変異から４種類を選定して作成
病態の原因は個人の遺伝的な背景の違いに基づ
したヒト疾患モデルマウスである。
くものではなく、ARX 遺伝子変異の種類と部位に
Arx KI マウスの解析結果より、Arx 遺伝子の特
より、疾患の表現型(病状)を運命づけることが明
異的変異は、マウスにおいて異なる神経発生障害
らかとなった。すなわち、X 染色体連鎖性疾患の
をもたらし、神経症状や行動異常をはじめとする
滑脳症、並びに精神遅滞が疑われる症例に関して、
特徴的な病状を示すと共に、疾病の直接的な要因
ARX 遺伝子変異を検査して何らかの遺伝子変異が
認められれば、ARX 遺伝子変異の種類（欠失変異、
and
ポリアラニン伸長変異、１アミノ酸置換変異）と
real-time PCR assay to quantitate airborne
変異部位によって、障害の程度と病態の重篤度が
fungi collected on a gelatin filter．Journal of
推測できることを意味する。
Bioscience and Bioengineering, 109(1):83-88
近年、ヒト ARX 遺伝子は、主として大脳、精巣、
膵臓において胎児期から発現して、各組織の発生、
Yanagisawa, H: Optimization of a
(2010)
2. Matsuzaka,Y., Kikuti, Y.Y., Izumi, S. Suzuki,
分化に重要な働きを持っているだけでなく、成人
T., Cai L.-Y., Goya, K., Inoko, H., Makino, T.,
後も脳、骨格筋、肺等で発現していることが分か
Kulski, J.k. and Kimura M. ： Mapping of
ってきた。しかしながら、出生後の ARX 機能は、
susceptibility locus for endometriosis with
未だ良く分かっておらず、成体期での機能解析も
the HLA region using microsatellite markers
非常に重要となってきた。変異 Arx KI マウスは、
in Japanese women.
雄マウスは致死、あるいは〜２ヶ月齢までの致死
Tissue Antigens 75(1):65-67 (2010)
であるため、成体期の機能解析が不可能である。
3. Ohtsuka, M., Ogiwara, S.,
Miura, H.,
対して、ARX 遺伝子変異を再現した ES 細胞に由来
Mizutani, A., Warita, T., Sato, M., Imai, K.,
する雄キメラマウスは生存する可能性が高いこ
Hozumi, K., Sato, T., Tanaka, M., Kimura,
とから、組織学的、電気生理学的（単一ニューロ
M.
ンの脳波測定）解析を進めて発症機構を追究する
injection-based
ことにより、成体期での機能解析が、より一層進
transgenesis for reproducible andhighly
展することを期待している。さらに、ARX 遺伝子
efficient transgene expression. Nucleic Acid
変異を原因とするヒト X 染色体連鎖性疾患が、ARX
Research,
の機能低下に基づく疾患であれば、疾病治療に役
(2010)
立つ基礎研究となることを期待して研究を進め
ている。
and
Inoko,
H.:
Pronuclear
mouse
targeted
38 (22):e198. Epub 2010 Sep 29.
4. Chiba, T., Matsuzaka, T., Warita, T., Sugoh,
T., Miyashita, K., Tajima, A.,
Nakamura,
M., Inoko, H., Sato, T. and
Kimura, M. :
NFKBIL1 confers resistance to experimental
E.結論
各種変異 ARX による多様な病態の発症機構は、
autoimmune arthritis through the regulation
発生過程における Arx 遺伝子の機能低下と推測さ
of dendritic cell functions.
れる。しかし、変異 ARX のドミナントネガティブ
Journal
効果等の付加機能によるものかどうかは明確で
(2011)
of
Immunology
Scandinavian
73(5),
478-485
ない。変異 Arx 遺伝子の遺伝子量効果を推量する
5 ． Taniguchi Y., Tanaka O., Sekiguchi M,
には、各種 Arx Tg マウスとのレスキュー実験が
Takekoshi S., Tsukamoto H., Kimura M.
有効であることから、今後さらに Arx KI マウス
and Inoko H. Enforced expression of the
の遺伝子発現量と病態の重症度を比較検討する
transcription factor HOXD3 under the
と共に、解剖学的、組織学的解析を進めて発症機
control of the Wnt1 regulatory element
構を追究する。
modulates cell adhesion properties in the
developing mouse neural tube. J. Anat.
F.研究発表
1.論文発表
木村
穣
1. Yamamoto, N., Kimura. M., Matsuki. H.
Doi.:10.1111/j.1469-7580.2011.01425.x
(2011).
6．Chiba, T, Miyashita, K, Sugoh T., Warita T.,
Inoko, H., Kimura, M. and Sato T.: IκBL,
a novel member of the nuclear IκB family,
Mizutani A., Tsuda, M., Aoyama, Y., Kakuta,
inhibits inflammatory cytokine expressions
K., Oka, A., Inoko, H., Sakabe, K., Ishikawa,
FEBS Letters 585(22), 3577-3581 (2011).
S.,
7. Ohtsuka, M.,
Kulski,
JK.
and
Kimura,
M.
Miura, H., Nakaoka, H.,
Association of sick building syndrome with
Kimura, M.. Sato, M. and Inoko, H.:
neuropathy target esterase (NTE) activity
Targeted transgenesis through pronuclear
in Japanese. Environmental Toxicology in
injection of improved vectors into in vitro
press (2013) Feb 18. doi: 10.1002/tox.21839.
fertilized
[Epub ahead of print]
eggs.
Transgenic
Res.
DOI
10.1007/s11248-011-9505-y (2011)
13. Mitsunaga, S., Shimizu, S., Okudaira, Y.,
8. Matsuzaka, Y., Kikuti, YY., Izumi, D., Goya,
K., Suzuki, T., Cai, L., Oka, A., Inoko, H.
KimuraM.:
Kulski, JK.,and
Oka., A., Tanaka, M., Kimura, M., Kulski,
J.K. Inoue, I. and Inoko H. :
Improved
Failure in
loop-mediated isothermal amplification
detection of significant association between
for HLA-DRB1 genotyping using RecA
estrogen
gene
and a restriction enzyme for enhanced
in
amplification specificity. Immunogenetics
Environmental Health
(2013) in press 2013 Mar 9. [Epub ahead
receptor-alpha
polymorphisms
and
Japanese women.
endometriosis
and Preventive Medicine
17(5), 423-428
(2012)
of print]
14. Ohtsuka,
9. Matsuzaka, Y., Kikuti, YY., Izumi, S., Goya,
M., Miura, H., Hayashi, H.,
Nakaoka, H., Kimura, M.., Sato, M. and
K., Suzuki, T., Cai, L., Oka, A., Inoko, H.,
Gurumurthy , C.B. :
Kulski , JK and Kimura M.: Lack of an
pronuclear
association human dioxin detoxification
transgenesis
genes polymorphisms with endometriosis in
mRNA-mediated
Japanese women: results of a pilot study.
recombination. Transgenic Research (2013)
Environmental
in press 2013 Mar 26. [Epub ahead of
Health
and
Preventive
Medicine 17(6): 512-517
Improvement of
injection-based
(PITT)
targeted
by
iCre
site-specific
print]
DOI: 10.1007/s12199-012-0281-y (2012)
10.
Ohtsuka, M., Miura H., Gurunurthy,
C.B., Kimura, M., Inoko H., Yoshimura, S.
中村健司
and Sato, M. : Fluorescent transgenic mice
1. Kaitsuka T, Li ST, Nakamura K, Takao K,
suitable for multi-color aggregation chimera
Miyakawa
studies. Cell Tissue Res. 350(2):251-60
Forebrain-specific constitutively active
(2012)
CaMKK α transgenic mice show deficits in
11. Ohtsuka, M., Miura, H., Sato, M., Kimura,
M., Inoko H., Gurumurthy, CB.:
Pronuclear
Injection-Based
PITT:
Targeted
T,
Matsushita
M.
:
hippocampus-dependent
long-term
memory.
Neurobiol Learn Mem.
96 (2)
238-247
(2011)
Transgene
2. Hino T, Oda K, Nakamura K, Tateno H, Toyoda
Expression Method in Mice. Exp Anim.
Y, Yokoyama M.：Accelerated modification of
61(5):489-502. (2012)
the zona pellucida is the primary cause of
Transgenesis,
a
Reliable
12. Matsuzaka, Y., Ohkubo, T., Yukie Y. Kikuti,
decreased fertilizability of oocytes in the
129 inbred mouse strain.
315-22
Zygote.
19 (4)
7. M Otsuka, H Miura, M Kimura, H Inoko.
Mouse targeted transgenesis through
(2011)
pronuclear
2.学会発表（学会名・発表年月・開催地なども記入）
木村
穣
injection.
Development
Genetics
2010 2010 年 10 月
1. 梶原景正、麥倉信一郎、木村穣。
Targeted
and
Mouse
Genomics
New York U.S.A.
8. 三浦浩美、木村穣、猪子英俊、大塚正人。
disruption of the mouse homolog of the
Pronuclear
DGCR2 gene, Sez12, causes a nasal septum
transgenesis for in vivo RNAi in the mouse.
abnormality and some dental problems in
第 33 回日本分子生物学会年会第 83 回日本生
mice。第 33 回日本分子生物学会年会第 83
化学会大会
2010 年 12 月
回日本生化学会大会合同大会
injection-based
合同大会
targeted
2010 年 12 月（神
戸）
9. 大塚正人、三浦浩美、木村穣、猪子英俊。
（神戸）
2. 麥倉信一郎、梶原景正、木村穣。
受
DGCR2 遺
精卵への顕微注入による、マウス部位特異的遺
伝子のマウスホモログ Sez12 遺伝子ノックアウ
伝子導入法の開発。第 57 回日本実験動物学会
トマウスの胸腺細胞分化の解析。第 33 回日本
総会
分子生物学会年会
合同大会
第 83 回日本生化学会大会
2010 年 12 月（神戸）
会
10. モハマド・ユスリ、井上毅彦、木村穣、梶原景
痛み
の客観的評価手法と新規無痛針の創製技術の開
新規 IkB ファミリー
発 U。
第 23 回バイオエンジニアリング学術
第 33 回日本分子生
講演会
2011 年 1 月
NFKBIL1 の機能解析。
物学会年会
（京都）
正、槌谷和義、上辻靖智、仲町英治。
3. 須郷達也、千葉朊希、宮下京子、割田貴之、木
村穣、佐藤健人。
2010 年 5 月
第 83 回日本生化学会大会合同大
2010 年 12 月（神戸）
村穣。
4. T Yonezawa, N Hirayama, H Tsukamoto, M
Tanaka, M Kimura, H Inoko.
11. 麥倉信一郎、千葉朊希、渡部聡、梶原景正、木
Combination
with alpha sphere filter method and Surface
Sez12 遺伝子欠失マウスの免疫系細胞
における細胞増殖能の検討。第 34 回日本分子
生物学会年会 2011 年 12 月（横浜）
12. 木村穣、割田貴之、斉藤亜矢、大久保朊一、津
plasmon resonance-based assay identified
田道雄、坂部貢、増田治史。
small molecule mimicking V1-2.
第 33 回日
発生への影響—Neuropathy Target Esterase 活
第 83 回日本生化学会大
性と出血傾向について。第 34 回日本分子生物学
本分子生物学会年会
会合同大会
2010 年 12 月（神戸）
5. 本杉奈美、篠生環、大塚正人、木村穣。
会年会 2011 年 12 月
高
有機リンの鶏卵
（横浜）
13. 梶原景正、麥倉信一郎、木村穣。
顎顔面領域
温感受性ラムダファージを利用した新規トラン
の形態形成に関わる Dgcr2 ホモログ Sez12 と
第 33 回日
Tbx1 との比較解析。第 34 回日本分子生物学会
スジェニックマウス作出の試み。
本分子生物学会年会
会合同大会
第 83 回日本生化学会大
2010 年 12 月
2011 年 12 月
（横浜）
14. T Chiba, T Warita, K Miyashita, M Kimura, T
（神戸）
6. 木村穣、津田道雄、大久保朊一、割田貴之、齋
藤亜矢、坂部貢、石川哲、阿部幸一郎。
年会
Sato. 新規核内 Ikb 分子 IkBL の炎症応答におけ
有機
る役割／Role of IkBL, a novel nuclear IkB
リンの鶏卵発生への影響—シックハウス症候群
member, in the regulation of inflammatory
第 33 回日本分子生
response. 第 40 回日本免疫学会学術集会
のモデル実験系の開発。
物学会年会
会
第 83 回日本生化学会大会合同大
2010 年 12 月（神戸）
2011 年 11 月
（千葉）
15. 井上茂亮、鈴木恭子、佐藤健人、穂積勝人、千
葉朊希、八幡崇、木村穣。 Klotho マウス敗血
症モデルにおける免疫機能解析／ Immune
analysis of septic Klotho mice.
免疫学会学術集会
第 40 回日本
2011 年 11 月（千葉）
16. モハマド・ユスリ、木村穣、梶原景正。
日本分子生物学会年会 2012 年 12 月（福岡）
24. 安岡有紀子、大塚正人、佐藤雄一、木村穣、河
原克雅。腎近位尿細管 K チャネル（TASK2）の
酸塩基調節における役割。第 42 回日本腎臓学
サブ
会東部学術大会 2012 年 10 月（新潟）
スタンスＰによる注射針穿刺時の痛みの客観的
25. 大塚正人、三浦浩美、木村穣、猪子英俊。
評価手法の確立。精密工業会大会学術講演会
Recombinase 及び Integrase による部位特異的
2012 年 3 月（東京）
遺伝子導入効率の比較検討。第 59 回日本実験動
17. 坂部貢、隅山香織、小沢学、田中理、関口雅樹、
物学会総会
2012 年 5 月
（別府）
角田正史、木村穣、相澤好治。ミクログリアに
対する環境エストロゲンの作用機構-GPR30 と
関連させて。第 20 回日本臨床環境医学会学術
集会
2011 年 11 月（柏、千葉）
18. 三浦浩美、猪子英俊、木村穣、大塚正人。
再
現性良いノックダウン効率を示す、miRNA 発現
トランスジェニックマウス作製法の確立。
104 回日本繁殖生物学会大会
第
2011 年 9 月（盛
岡）
19. 大塚正人、三浦浩美、木村穣、猪子英俊。
受
精卵への顕微注入法を介した、部位特異的トラ
ンスジェニックマウス作製法。第 58 回日本実
験動物学会総会 2011 年 5 月
（東京）
20. モハマド・ユスリ、槌谷和義、梶原景正、木村
穣。
穿刺時間に対する唾液中αアミラーゼ
量変動。
2012 年 9 月
精密工学会大会学術講演会
（北九州市）
21. 梶原景正、安田佳代、林秀樹、木村穣、石井直
明、新井信。
線虫を用いたダイオウ薬効に関
わるヒト分子メカニズムの網羅的解析。第 29
回和漢医薬学会学術大会
2012 年 9 月（東京）
22. K Kajiwara, S Mugikura, S Watanabe, M Kimura.
Sez12, the Murine Homolog of DGCR2 Gene Laid
within the Microdeletion of 22q11.2 Deletion
Syndrome, Functions in the Endochondral
Ossification. 第 35 回日本分子生物学会年会
2012 年 12 月（福岡）
23. S Mugikura, S Watanabe, K Kajiwawa, M Kimura.
The Sez12, Coding the C-type Lectin-like
Domain-containing Membrane Protein, Plays a
Regulatory Role in T Cell Growth.
第 35 回
G.知的財産権の出願・登録状況（予定を含む）
なし

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