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帝京科学大学紀要 Vol. 1 (2005)
pp. 107-110
事業報告
日本私立学校振興・共済事業団私立大学等経常費補助金特別補助（高度化の推進）
大学院重点特別経費−研究科共同研究経費
平成 12∼14 年度
「テロメラーゼ体内動態の把握と選択的阻害剤の分子設計」
研究代表者：実吉峯郎（理工学研究科バイオサイエンス専攻）
研究分担者：山口十四文（理工学研究科バイオサイエンス専攻）
平井俊朗（理工学部バイオサイエンス学科）
川口健夫（城西大学大学院薬学研究科）
本研究は、テロメラーゼの体内動態を把握し、解析するために重要な役割を果たすと考えられる選
択的阻害剤の分子設計に関するものである。
真核生物テロメラーゼは、２本鎖らせん DNA の末端テロメア構造を保持するために必須の酵素で生殖
細胞（最近、子宮内膜細胞でも）
、とがん化（トランスホームした）した細胞に特有のものとされ、細
胞不死化の裏付けとなる重要なものである。そのことから。がん研究、老化の研究、さらにがん化学
療法の研究において屈指の標的分子の一つに数えられている。我々の研究グループでは、従来、テロ
メラーゼ活性の測定に用いられて来たいわゆる TRAP 検定法が定量性に欠けるため酵素動力学的解析
に向かないことから、その目的に合致するストレッチ検定法を用いることにより、阻害剤の効果を定
量的に解析することが日常的に実施することを可能とした。この系を繁用することにより、以下のこ
とを明らかにすべく本研究を実施した。すなわち、１）ヒトを含む脊椎動物の内在性逆転写酵素であ
るテロメラーゼと、レトロウイルス性の逆転写酵素の基質—構造特異性を内在性鋳型との相互作用と
の関連で明らかとする。2）塩基部、糖部を変換させたヌクレオチド類縁体を分子設計し、その阻害能
を吟味する。3）新生 DNA 鎖の末端に阻害剤が取り込まれるか否か？４）最後に細胞レベルで実際
にテロメア鎖の短小化が惹起されうるかを吟味することである。
まず、ウイルス逆転写酵素（RT）とテロメラーゼに共通なことは、糖部のジデオキシ誘導体により強
く阻害されることである。しかし、RT では、塩基部が、
A,G,T,C のいずれでもその阻害能に影響は少ないが、テロメラーゼでは、G が最も強く、T でやや弱く、
A, C では全くといっていいほど阻害能を示さないことが明らかとなった。内在性鋳型の配列
–AAUCCC-を見事に反映していた。
HIV 逆転写酵素が、真核細胞 DNA ポリメラーゼ各分子種を全く抑えない L—エナンチオマーにより
極めて選択的に阻害されることは我々が世界に先駆けて報告しているが、テロメラーゼも又、L—エナ
ンチオマーにより有効に阻害されることが、今回の研究で明かとなった。これは、一つの共通的性質
であったが、糖部の認識では大きく違う点も今回見い出された。すなわち、ヘルペスウイルスの誘導
するポリメラーゼや、HIV の逆転写酵素を全く抑えない、糖部を非環状型（アシクロ糖など）や、４
員環糖に変換したものは、テロメラーゼを阻害しうるという興味有る結果であった。HIV 逆転写酵素
は、糖をアラビノースに置換すると全くその親和性を失うが、テロメラーゼでは、アラビノースその
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ものでは勿論、２
−位をフッ素に置換した類縁体も強い親和性を示した。これらの 5’-トリりん酸誘
導体が、プライマーとしてのオリゴマー末端に取り込まれるかどうかであるが、顕著な取り込みが観
察されたのは 2’,3’-ジデオキシリボ及び 3’-アジドー2’,3’-ジデオキシリボ型（T, G）であった。幸い、3’アジド-ジデオキシグアノシンは、細胞中でりん酸化されうるので、引き続き、細胞レベルの検討を行
い、長期間の暴露により、著明なテロメア短小化が観察され、あるところまで行くとアポトーシスが
惹起されることが見い出された。このように、本研究では、当初の研究計画はおよそすべて実行でき
たこととなる。
以上の結果は以下の論文に公表してある。著者中太字で示したのは、本研究課題の分担研究者である。
1. 実吉峯郎：サクラマスの DNA ポリメラーゼ群：化学と生物, 37, 764-770（1999）
2. T. Yamaguchi, R.Yamada, K. Shudo, M. Saito, F. Ishikawa and M. Saneyoshi:
Inhibitory effcts of L-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (L-dGTP) and L-2'-Deoxythymidine
5'-triphosphate(L-dTTP) on human telomerase. Nucleic Acids Symposium Ser., 42, 205-206 (1999)
Abstract:
Telomerase, which synthesizes telomeric DNA in eukaryotic cells, is classified as a reverse
transcriptase. To clarify the recognition of 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphate (dNTP)
chirality by telomerase, we studied the inhibitory effects of L-dGTP on HeLa cell telomerase
activity using a quantitative 'stretch PCR' assay. L-dGTP had a weakly inhibitory effect (IC50 =
200 μM) in the presence of 10 μM dGTP. This effect was less obvious when the concentration of
dGTP was higher. L-dTTP had a similar inhibitory effect. These findings suggest that telomerase
may bind to L-dGTP and L-dTTP, and that the ability of telomerase to bind
3. T.Yamaguchi, R. Yamada, A. Tomikawa K. Shudo, M. Saito, F. Ishikawa, and M. Saneyoshi:
Recognition of 2'-deoxy-L-ribonucleoside 5'-triphosphates by human telomerase.
Biochem.Biophys.Res.Commun., 279, 475-481 (2000)
Abstract:
Telomerase is classified as one of the reverse transcriptases (RTs). To clarify whether
L-enantiomers of natural 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphates (dNTPs) are recognized by
human telomerase, a quantitative telomerase assay based on the "stretch PCR" method was
developed and used for kinetic analysis of the inhibitory effects of these compounds on the
enzyme. Among the four L-enantiomers of dNTPs, L-dTTP and L-dGTP inhibited telomerase
activity and the others showed slight or no inhibitory effect. Lineweaver-Burk plot analysis
showed that the inhibition modes ofL-dTTP and l-dGTP were partially competitive (mixed type)
and competitive with the corresponding substrate dNTP, respectively. However, the K(i) values of
L-dTTP and L-dGTP (21 and 15 μM) were several times larger than the K(m) values (3-6 μM).
These results suggest that the active site of telomerase is not able to discriminate strictly the
chirality of dNTPs, although it is more discriminatory than HIV-1 RT.
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T.Yamaguchi, M. Kawarai, Y.Takeshita, F. Ishikawa, M. Saneyoshi:
Inhibition of human telomerase by nucleotide analogues bearing a hydrophobic group.
Nucleic Acids Symposium Ser., 44, 175-176 (2000)
Abstract:
Telomerase, which synthesizes telomeric DNA in eukaryotic cells, is classified as a reverse
transcriptase. To clarify the susceptibility of telomerase to nucleoside 5'-triphosphates bearing a
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hydrophobic group on the base moiety, we studied the inhibitory effects of
2',3'-dideoxy-5-styryluridine 5'-triphosphate analogues and
9-(β -D-arabinofuranosyl)-2-(p-n-butylanilino)purine 5'-triphosphate analogues on telomerase
activity using a quantitative 'stretch PCR' assay. 2',3'-Dideoxy-5-styryluridine 5'-triphosphate
(StddUTP) showed more potent inhibition than 2',3'-dideoxythymidine 5'-triphosphate (ddTTP).
On the other hand, 9-(β-D-arabinofuranosyl)-2-(p-n-butylphenyl)guanine 5'-triphosphate
(BuParaGTP) showed no inhibition, even though 9-(β-D-arabinofuranosyl)guanine
5'-triphosphate (araGTP) is a potent inhibitor of telomerase. The influence on telomerase of
hydrophobic substituents on the base moieties of nucleotides is described.
5.
Yamaguchi, T., Yamada R, Tomikawa A, Shudo K, Saito M, Ishikawa F, Saneyoshi M.:
Inhibition of human telomerase by L-enantiomers of natural 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphates.
Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids., 20, 1243-1246 (2001)
Abstract:
In order to clarify whether L-enantiomers of natural 2'-deoxyribonucleoside 5'-triphosphates
(dNTPs) are recognized by human telomerase, a quantitative telomerase assay based on the
'stretch PCR' method was developed and used for kinetic analysis. Among the four L-dNTPs,
L-dTTP and L-dGTP inhibited telomerase activity and the others showed slight or no inhibitory
effect. Lineweaver-Burk plot analysis showed that the inhibition mode L-dGTP was competitive
with dGTP.
6.
Jinmei, H., Takahashi, H., Amano, R., Suzuki, K., Saneyoshi, M., and Yamaguchi, T.:
Telomerase-inhibitory effects of sugar-modified nucleotide analogues.
Nucleic Acids Res. Suppl. 2, 221-222 (2002)
Abstract:
Telomerase is an endogenous reverse transcriptase that uses its internal RNA moiety as a
template for the synthesis of telomere repeats, thus maintaining telomere length. To study the
susceptibility of telomerase to sugar-modified nucleotide analogs, inhibition by
arabinofuranosylguanine 5'-triphosphate (araGTP), 3'-azido-2',3'-dideoxyguanosine
5'-triphosphate (AZdGTP), 2',3'-dideoxy-2'-fluoroarabinofuranosylguanine 5'-triphosphate
(FaraGTP), and their thymine counterparts was investigated. Among these compounds, all
dGTP analogs showed potent inhibitory activity against human telomerase. Conversely, dTTP
analogs showed moderate or weak inhibition. Partially purified telomerase from cherry salmon
testis utilized ddGTP and AZdGTP as substrates into the 3'-terminus of DNA.
7.
Yamaguchi T, Takahashi H, Jinmei H, Takayama Y, Saneyoshi M.:
Inhibition of vertebrate telomerases by the triphosphate derivatives of some biologically
active nucleosides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 22, 1575-1577 (2003)
Abstract:
In order to clarify the effect of the base moiety of nucleotide analogs on telomerase inhibition,
triphosphate derivatives of biologically active nucleosides, 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT),
2'-deoxy-2'-fluoroarafuranosylthymine (FaraT), acycloguanosine (ACG) and their guanine or
thymine counterparts (AZdG, FaraG and ACT, respectively) were investigated. In all of the
present cases, guanine derivatives showed more potent inhibition than their thymine
counterparts.
8.
Takahashi H, Amano R, Saneyoshi M, Maruyama T, Yamaguchi T.:
Inhibition of vertebrate telomerases by the triphosphate derivatives of carbocyclic oxetanocin
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analogs. Nucleic Acids Res Suppl. 3, 285-286 (2003)
Abstract:
Telomerase is a cellular endogenous reverse transcriptase that uses its internal RNA as a
template for extension of the telomere repeat, thus maintaining telomere length. In order to
clarify the susceptibility of telomerase to triphosphate derivatives of carbocyclic oxetanocins,
inhibition by 9-[trans-trans-2,3-bis(hydroxymethyl)cyclobutyl]guanine triphosphate
(C.OXT-GTP) and its methylene analog,
9-(cis-3-hydroxymethyl-2-methylenecyclobutyl)guanine triphosphate (m-C.OXT-GTP) was
investigated. Both compounds showed potent inhibitory activity. Lineweaver-Burk plot
analyses showed that the inhibition mode of these compounds was competitive with dGTP, the
Ki values for C.OXT-GTP and m-C.OXT-GTP being 2.0 μM and 4.9 μM, respectively, and
thus smaller than the Km of dGTP (11 μM).
9.
Yamaguchi, T., Takahashi,H., Harada, Y., Yoshikawa, M., Iyono, S., Inomata, M., Maruyama, T., and
Saneyoshi, M.
Telomere shortening in human HL-60 cells by treatment with deoxyguanosine analogs
Nucleic Acids Symposium Series, 48,187-188 (2004)
Abstract:
Telomerase is a cellular endogenous reversetranscriptase thought to play an
important role in the maintenance of telomerase length. We investigated the
effects of 3’-azido-2’,3’-dideoxyguanosine (AzddG) and carbocyclic oxetanosine
G(C,OXT-G), of which the triphosphate derivatives AZddGTP and C.OXT-GTP
show potent telomerase inhibition, on telomere length of human HL60 cells in
culture. Although AzddG caused more significant telomere shortning than
C.OXT-G, only a slight decrease of cell growth rate was observed.
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