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名称:N-結合型糖鎖の精製・検出方法
用途:生体内に含まれる N-結合型糖鎖を精製後蛍光標識し、HPLC で検出する。
特徴:約 2fmol の感度で検出することが可能。
方法:1~6の手順で行う。
1.アセトン沈殿:糖タンパク質の濃縮、乾燥
2.ヒドラジン分解:糖タンパク質からタンパク質と糖鎖を遊離させる。
3.グラファイトカーボンカラム:不純物の除去、再アセチル化
4.ピリジルアミノ化:ピリジルアミノ基による蛍光標識
5.セルロースカラム:未反応のピリジルアミノ基の除去
6.HPLC による検出
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実験プロトコル
(1) アセトン沈殿
1. 組織検体に 9 倍量(v/w)の-20℃アセトンを加える。
(ホモジナイザーで破砕が必要な場合は氷上で 1 分×2-3 回)
2. -20℃で 2 時間~over night
静置
3. 10,000g、20 分、4℃で遠心
4. 上清を捨て、沈殿物に 1)と同量程度の-20℃アセトンを加える。
(ホモジナイザーで破砕が必要な場合は氷上で 1 分×2-3 回)
5. -20℃、60 分間静置
6. 10,000g、20 分、4℃で遠心
7) 上清を捨て、沈殿物を乾燥する
(2) ヒドラジン分解
準備
・無水ヒドラジン (東京化成)
・ヒドラジン用チューブねじ口試験管(iwaki TE32)
・100℃高温槽
※ヒドラジンの取り扱いは特に注意(ドラフト内で操作し、防護めがね、手袋を着用すること)
1. 乾燥したサンプル 2mg を測り、ヒドラジン用チューブに入れる。
2. ドラフト内でサンプルに無水ヒドラジンをパスツールピペットで 200μl 加える。
200μl の水を入れたチューブを準備し、この高さを目安に滴下する。200μで約 8 滴
ヒドラジンは危険なので、1 チューブに 500μl 以上のヒドラジンを入れない。
3. ドラフト内の 100℃の沸騰した湯浴で 10 時間反応する。
4. 水で冷却し、遠心機でスピンダウンする。
(-20℃で保存可能)
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(3) グラファイトカーボンカラム
準備
・A 液:50mM 酢酸アンモニウム
・B 液:50mM 酢酸トリエチルアミン水溶液(pH7.0), 60%アセトニトリル
※A,B 液は冷蔵庫でストックを保管。使用前に常温に戻しておく。
・吸引マニフォールド
・カラム:GL-Psk CARBOGRAPH 300mg/6ml または
GL-Psk CARBOGRAPH 150mg/3ml(GL サイエンス)
※ゲルからの回収時には小カラムを使用する。
・溶出時の試験管チューブ(SARSTEDT 製 55.516)
以下、大カラム使用時の方法を示す。小カラムの時は溶媒量を半分にする。
1. 吸引マニフォールドにグラファイトカーボンカラムを接続する。
2. カラムの洗浄:カラムに B 液を 6ml 通液し、次に A 液 6ml を 2 回通液する。A 液の液面が充填剤の
上面にきたところで通液を止める。
3. サンプルの添加:
3-1) ヒドラジン反応液 200μl に対し、2ml の A 液を加えてボルテックスする。
3-2) スピンダウンした後、ヒドラジン反応液をパスツールピペットでカラムにゆっくりと添加し、通液
する。
3-3) 再度 A 液 3ml でサンプルの入っていたチューブを洗い、その溶液をカラムに添加し、通液する。
3-4) A 液を 6ml 添加し、通液する。
4. 糖鎖のアセチル化・溶出:
4-1) 溶出液を分取するための試験管をセットする。
4-2) 溶出溶媒(1 サンプル当たり B 液 5ml+無水酢酸 100μl を用時調整する)を通液し、回収する。
4-3) 溶出した溶媒はエバポレーターで有機溶媒を取り除いた後、濃縮遠心機で乾燥させる。(Overnight)
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(4) ピリジルアミノ化
準備
・A 液:2-アミノピリジン(関東化学)69mg を酢酸 25μl に溶解する。
・B 液:ジメチルアミノボラン(wako)200mg に milliQ 水 50μl、酢酸 80μl を加え、溶解する。
※用時調整、サンプル本数によって量を調節する。
※2-アミノピリジン、ジメチルアミノボランは吸湿しやすいため、注意を払う。
溶液調整前に冷蔵庫から取り出し、常温に戻しておく。
・ヒートブロック
・チューブふた(SARSTEDT 製 65.806)
1. 1 サンプル当たり 20μl の A 液を加え、ふたをしてヒートブロックで 90℃、60 分間反応させる。
2. スピンダウン後、1 サンプル当たり 70μl の B 液を加え、ふたをしてヒートブロックで 80℃、35 分
間反応させる。
※酸が外れやすいため、すぐに次の精製を行う。
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(5) セルロースカラム
準備
・A 液:1-ブタノール:エタノール:0.6M 酢酸溶液=4:1:1 の割合で混合する。
・B 液:エタノール:75mM 重炭酸アンモニウム=1:2 の割合で混合する。
※用時調整、サンプル本数によって量を調節する。
・セルロース:Cellulose microcrystalline for column chromatography (Merck)
・吸引マニフォールド:グラファイトカーボンカラム参照
・オープンカラム:ルアーチップカラム(SARSTEDT 製 CC.11)
・溶出時の試験管チューブ(SARSTEDT 製 55.516)
1. セルロースの調整
1-1) 3L のビーカーにセルロース 50g を入れる。
1-2) 約 1.5L の MilliQ 水をビーカーの淵に沿わせて静かに加える。
ビーカーを傾けてゆっくり回して混ぜ、数分間静置する。
1-3) 上澄に浮いているセルロースを水流アスピレーターで吸引する。
1-4) 2-3 を 2 回繰り返す。3 回目に MilliQ 水を加えた時は冷蔵庫で 1 時間以上静置する。
1-5) 上澄が透明なことを確認し、上澄をアスピレーターで吸引する。
1-6) B 液を約 500ml 加え、静かに攪拌する。500ml 瓶に移し替える。
1-7) 約 30 分間静置後、上澄をアスピレーターで吸引する。
1-8) 再度 B 液を加えて同様の操作を行う。
1-9) A 液を約 500ml 入れて静かに攪拌後、30 分間静置する。上澄をアスピレーターで吸引する。
1-10) 再度 A 液を加えて同様の操作を行う。
1-11) A 液をセルロースの 3 倍量程度加えて冷蔵庫で保存する。
2. カラムの準備
2-1) 吸引マニホールドにオープンカラムを取り付け、MilliQ 水を流してフィルターの空気を抜く。
2-2) コックを閉じて A 液を 1ml 程度添加する。
2-3) 調整したセルロースをセルロース粒子が壊れないように静かに攪拌し、十分懸濁する。
2-4) 懸濁液 2ml をカラムに添加する。沈殿せずに残っている上澄を取り除き、15 分間静置する。
2-5) A 液をゆっくり加え、舞い上がったセルロースを再度取り除く。
2-6) A 液をセルロース体積の 3 倍量(3ml)通液する。2 回行い、2 回目はセルロースの上端ぎりぎりで
止める。
3. サンプルの添加
3-1) ピリジルアミノ化済みのサンプルに A 液を 2.5ml 加えてボルテックス、スピンダウンする。
3-2) 調整したサンプルをカラムに添加し、通液する。
3-3) A 液 3ml をサンプルの入っていたチューブに加え、ボルテックス、スピンダウンしてカラムに通す。
3-4) カラムに直接 A 液 3ml を通液する。
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4.糖鎖の溶出
4-1) カラムの溶出液を分取するための試験管チューブをセットする。
4-2) B 液を 2ml 加えて通液し、回収する。
4-3) 溶出した溶媒はエバポレーターで有機溶媒を取り除いた後、濃縮遠心機で乾燥させる。(Overnight)
(6) HPLC で検出
精製後のサンプルは HPLC 蛍光検出器で検出できる。
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