Title Author(s) Journal URL Sixteen X-chromosomal STRs in two octaplex PCRs in Japanese population and development of 15-locus multiplex PCR system 中村, 安孝 歯科学報, 111(5): 524-525 http://hdl.handle.net/10130/2625 Right Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/ ５２４ 歯科学報 氏 名（本 Vol．１１１，No．５（２０１１） なか むら やす たか 籍） 中 村 安 孝 学 位 の 種 類 博 士（歯 学 位 記 番 号 第 １８５５ 号（甲第１１２１号） （千葉県） 学） 学 位 授 与 の 日 付 平成２２年３月３１日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第４条第１項該当 学 Sixteen X-chromosomal STRs in two octaplex PCRs in Japanese 位 論 文 題 目 population and development of 15-locus multiplex PCR system 掲 載 雑 誌 名 International Journal of Legal Medicine 第１２４巻 ５号 ４０５∼４１４頁 ２０１０年 論 文 審 査 委 員 （主査） 水口 （副査） 東 俊文教授 柴原 孝彦教授 論 １．研 究 目 文 内 容 清教授 の 要 石原 和幸教授 旨 的 近年，Ｘ染色体 STR 多型に関する研究が，集団遺伝学や法医学分野で広がってきている。Ｘ染色体 STR 多型は，父子鑑定における女の子供，母子鑑定における男の子供の鑑定などのケースで特に有用である。実際 例への応用に当たっては，日本人における多型頻度を知る必要があり，さらに，少ない回数で多くの情報を得 ることができれば，より理想的である。そこで本研究では，多くの X-STR 座位の multiplex PCR 法を確立す ることと，集団遺伝学，法医学的応用のため，日本人における X-STR の多型情報を得ることを目的とした。 ２．研 究 方 法 試料は血縁関係のない３３９人の男性および１７３人の女性の日本人から得た DNA を用いた。提供者からはイン フォームドコンセントを得ており，本研究は本学倫理委員会の承認を得ている。多型検査はＸ染色体上の１６種 類 の STR 座 位 の 検 出 を 試 み た。こ れ ら の STR は，DXS7424-GATA172D05-HPRTB-DXS8377（group１） ， GATA31E08-DXS9895-DXS7423-DXS981（group２），DXS6803-DXS6789-DXS6800-DXS6809（group３），DXS 7133-DXS7132-DXS101-DXS6807（group４） の４群に分類した。PCR に際しては DXS９８１，６７８９，６８００につい ては新しいプライマーを作製し，その他は既報のプライマー配列を用いた。Multiplex PCR は各グループごと の 4-plex PCR，group１＋２，group３＋４のそれぞれの 8-plex PCR，および 15-plex PCR を行った。PCR 産物の大きさは ABI 310 Genetic Analyzerを用いて GeneScanで決定し，Genotyper ver. 2.5で解析した。塩 基配列決定は ABI PRISM 3100 automated sequencerを用いた。STRデータは PowerStatsV１２，GENE POP にて統計解析を行った。 ３．成績および結論 X-STR の検査対象座位として，Ｘ染色体全体に亙って分布し，他の集団データがある座位を選択した。 Multiplex PCR 法を作り上げるに当たり，各 STR 座位の型判定を他の報告の結果と比較するため common allele の塩基配列を決定した。 １６座位の同時増幅ではいくつかの過剰バンドが出現し，増幅条件の変更では消し去れなかったところから， すべての座位の結果を得るため，8-plex PCR を試みた。その結果 group１＋２，group３＋４の組合せで，す べての型が判定可能となった。そこでこのシステムで５１２人の型を判定した。１６座位の集団データの統計解析 ― ６８ ― 歯科学報 Vol．１１１，No．５（２０１１） ５２５ 結果では，今回選択した STR 座位のうち DXS6800 と DXS7133 が多少多型性が低かったが，その他の座位の 多型性は高く，総合した識別力は女性が０． ９９９９９９９９９９９９９９７，男性が０． ９９９９９９９９９２となり極めて高い数値を示 した。座位間の連鎖については本当の連鎖不平衡は見出されなかったが，さらに検討の余地があるため，近接 する座位のハプロタイプデータを示した。 一度の PCR でより多くの情報を得るため，１６座位の同時増幅の確立を目指した。16-plex PCRでは group２ の VICラベルで６本の過剰バンドが出現し，group３の NEDラベルで多くて３本の過剰バンドが増幅され， これらは他の座位の正確な型判定を妨げた。泳動像を改善するため，その由来を検索した。その結果これらの バンドはいずれも DXS9895と DXS6800または DXS9895と DXS101に起因して出現するもので，DXS6800プラ イマーはそれ自身で９番染色体由来の過剰バンドを増幅し，DXS9895と DXS6800の Forwardプライマー同士 も１３番染色体由来の過剰バンドを増幅し，DXS6800の Reverseプライマーも別の過剰バンドの増幅に関連して いることがわかった。DXS6800はプライマー位置を変更することで，１本の過剰バンドを消したが，特に DXS9895のプライマーは類似配列が極めて多いところから，すべてのバンドを今回の multiplex PCRの条件下 で消すことは不可能と判断した。しかし DXS9895を除けば 15-plex PCRでは明瞭に型判定が可能であった。 これは現状で最も多くの X-STRを検査できるシステムで，充分な識別力を持ち，法医学への応用価値が極め て高いと考えられた。 ４．結 論 X-STR はＸ染色体検査でなければ解決できないケースがあり，同時に多座位を検査できるシステムが期待 されてきた。本研究における１６座位を２度の PCR で検査する方法，および１５座位を一度で検査できるシステ ムは，日本人において非常に多型的で，微量な資料やスクリーニングのために有用で，実際面での利用価値は 非常に高い。 論 文 審 査 の 要 旨 高度に変性した生物学的資料からの DNA 多型による個人識別において，歯を資料とした検査は最終手段に なるが，変性資料は回収 DNA 量が少なく，少ない検査で有用な多くの情報を得る方法が必要になる。１対１ の比較または親子関係の資料による比較は常染色体 STR 多型で事足りる場合が多い。しかし血縁が兄弟より 遠くなった場合はミトコンドリア DNA やＹ染色体多型を併用するが，その中でＸ染色体多型のみしか有効な 補助手段がない場合がある。このような際に，少ない回数の検査で有用な情報が得られる方法は確立されてい ない。そこで本研究はこのような場合に多くの情報が得られる検査法を作り上げ，日本人に応用した場合の有 用性を提示した。 本審査委員会では，本論文内容に付いて，本研究結果の実際面への応用の有用性については共通して評価で きるとの意見が出たが，論文内容に付いては，１）結果説明の順序，２）データ比較結果の示し方，３）研究 の強調する部分や，追加したほうが良いと思われるデータ，４）方法と結果の境界，５）文章表現の意 味，６）提示する文献の量，７）検査ターゲットの STR は遺伝子内に存在するのか否か，８）図をきれいに するなどの提言や質問と共に，それぞれの内容についての質疑が行われ，概ね妥当な回答が得られた。 以上より本研究で得られた結果は，今後の歯学の進歩，発展に寄与するところ大であり，学位授与に値する ものと判定した。 ― ６９ ―
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