シークエンシングワークフロー 研究用 ライブラリー調製 サンプル 調製 末端修復 エンドポイントライブラリー増幅 A-TAILING アダプター ライゲーション サイズセレクション & サイズ確認 または リアルタイムライブラリー増幅 ライブラリー 定量 クラスター 増幅 KAPA Library Quantification Kits ライブラリー定量キット qPCRによるライブラリーの定量により、安定したシークエンス結果が得られます。 • 信頼性の高い定量化法（qPCR法）により画期的な効率改善が得られます。 • GC, AT リッチでも安定した結果をもたらします。 • ロット間差を最小限に抑えたバリデーション済みDNA 定量スタンダードが希釈済みで 添付されています。 シーク エンシング KAPA Library Quantification Kits 信頼性の高い定量化による安定したクラスター形成 ライブラリーの定量化にqPCRを導入する前は、クラスター形成はまったく安定しませんでした。 しかし、KAPA Library Quantification Kitを我々のワークフローに導入したところ、多くのライ ブラリーで変動性が大きく減少し、クラスター増幅滴定の手間が省けました。 ブロード研究所（アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ケンブリッジ） Average Clusters per Tile 400000 KAPA Library Quantification Kitを使用する前後のクラスター形成の比較 ブ ロ ード 研 究 所 に お け るillumina GAシ ー ク エ ン シ ン グ の ワ ー ク フ ロ ー にKAPA Library Quantification Kitsを導入したところ、クラスター形成の変動性が大きく減少し、滴定の必要がな くなった。1タイルあたりの平均クラスター数がそれぞれのライブラリーに示されている。 KAPA導入前 KAPA導入後 350000 300000 250000 200000 150000 100000 Implementation of KAPA Library Quantification Kit 50000 0 0 20 40 60 80 Consecutive Library ID qPCRは、PCRで増幅可能なライブラリー分子だけを定量します Raw Clusters [1,000k/mm2] 600 500 アダプターライゲーション 分光光度測定や 後のサンプル 蛍光測定による定量 qPCRによる定量 400 300 200 100 0 0 20 40 60 80 Sample Number qPCRベースのKAPAライブラリー定量キットはA社泳動解 析装置よりも、クラスター密度のバラツキを抑えます。 分光光度測定法、蛍光分析法および電気泳動法と比べ、qPCRはアダプター結合し たライブラリー分子および増幅可能なライブラリー分子だけを定量します。 ヒトエクソームサンプルを、Nimblegen溶液ベースのキャプチャ を用いて調製しました。調製はすべて、リキットハンドリングシス テムの96ウェルプレート・フォーマットで実施しました。データ は、illumina GAIIxでペアエンド76bpを解析したときの1タイル あたりのクラスター数です。 このデータはワシントン大学のご厚意で掲載させていただきま した。 アダプター（オレンジとブルー）がライブラリー DNA分子（グレー）の両端へ結合します が、図のようにアダプターが結合しない分子が混合した状態となります。 しかし、次世代シークエンスでは、最 適なクラスター密度やテンプレート：ビーズ 比は、 「PCR増幅可能なDNA分子」の濃度に依存します。 泳動解析法や分光光度測定法で濃度測定した場合、これら混合した分子全ての濃度を測 定してしまいますが、一方、両端にアダプターを持つライブラリーのみを測定するｑPCR ベースのライブラリー定量法では、最適なライブラリー濃度を得ることができます。 10 -0.0 10 -0.1 10 -0.2 10 -0.3 10 -0.4 10 -0.5 10 -0.6 10 -0.7 10 -0.8 10 -0.9 Slope: Efficiency: R2 : 5 10 15 20 Cycle 25 Concentration (pM) Norm. Fluoro. 30 -3.334 99% 0.999 30 Lot 1, set-1 Lot 1, set-2 Lot 2 Human 25 20 15 10 Rh o (~7 doc 0% occ Sta GC us s p p. ) h (~3 ylo 5% co GC ccu ss ) p. ロット間差を最小限に抑えた信頼性の高いDNA定量スタンダード 5 35 Roche Titaniumシリーズ・プラットフォーム向け KAPA Quantification Kitのロット間差 各定量スタンダードセットの増幅プロットを分析し、3つの異な るロット（レッド、ピンク、ブルー）を比較した。各データ点の3反 復を平均化した。 0 566 601 557 606 270 400 375 438 438 375 405 Average fragment size (bp) ロット間、キット間での最小の変動性 9つのヒトDNAライブラリーと2つの微生物DNAライブラリーを用い、定量結果の比較 を し た。異 な る ロ ット（Lot 1とLot 2）と、illumina GAプ ラ ットフ ォ ー ム 向 けKAPA Library Quantification Kitsの同一ロットから得た 異 なる試 薬 のセット（set 1とset 2）を用いた。 特長 • • • • • • 次世代DNAシークエンシングと次世代エンジニアqPCR用酵素の融合 信頼性の高い定量化法(qPCR法)により画期的な効率改善が得られます。 GC,ATリッチでも安定した結果をもたらします。 ロット間差を最小限に抑えたバリデーション済みDNA定量スタンダードが希釈済みで添付されています。 （唯一のキット） 他の方法では得られない再現性 コストと細心の注意を払って調整されたライブラリーに最適なクラスター定量手法です。 保存条件 −20℃で1年間（30回凍結融解可能） キット内容 • • • • マスターミックスKAPA SYBR FAST qPCR Kit（2X） 5ml ROX High / Low ＊Universalタイプのみ 200μl×各1本 プライマーミックス 1ml DNA定量スタンダード（6濃度） 各80μl Cat.No. 下記よりお選びください 包装単位 価格（税抜） 500 回用 ￥153,000 ※所有されているシークエンサーとqPCR装置の組み合わせにより、キットをご選択ください。 Universal qPCR装置 次世代シークエンサー キャピラリータイプの LightCycler® を除く、 ほとんどの機器に使用可能 illumina Eco ABI Prism® ABI5700 / 7000 / 7300 / 7700 / 7900HT / StepOne TMPlus ROX Low ABI7500 / ViiATM 7 / QuantStudio / Stratagene MX3000P TM / MX3005P TM / MX4000 TM Bio-Rad iCyclerTM iCycleriQ ® / iQ TM5, MyiQ TM Roche LightCycler® 480 LightCycler® 480 / 96 / Nano （キャピラリータイプの LightCycler® には対応して いません） illuminaGA / HiSeq / MiSeq / NextSeq500 *1 KK4824 KK4835 KK4873 KK4844 KK4854 454 FLX Titanium -"Rapid Library" -"Lib-L" *2 KK4821 KK4831 KK4871 KK4841 KK4851 454 FLX 454 FLX Titanium -"Lib-A" *3 KK4820 KK4830 KK4870 KK4840 KK4850 SOLiD *4 KK4823 KK4833 KK4872 KK4843 KK4853 Ion Torrent *5 KK4827 KK4838 KK4874 KK4847 KK4857 ※そのままご使用できるキットです。 （「スタンダードDNA」 「プライマー＆マスターミックス（KAPA SYBR FAST 5mL）」を含みます。） *1：キットに含まれるプライマー配列は、TruSeqキットにも適合することが確認されております。 illumina Primer P1: 5’-A A T GA T ACG GCG ACC ACC GA-3’ illumina Primer P2: 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’ *2：キットに含まれるプライマー配列は以下のとおりです。 Titanium Primer A: 5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3’ Titanium Primer B: 5’-CCT ATC CCC T GT GTG CCT TG-3’ *4：キットに含まれるプライマー配列は以下のとおりです。 SOLiD Primer P1: 5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3' SOLiD Primer P2: 5'-CTGCCCCGGGTTCCTCATTCT-3'. *3：キットに含まれるプライマー配列は以下のとおりです。 FLX Primer A: 5’-GCC TCC C T C GCG CCA-3’ FLX Primer B : 5’-GCC T T G CCA GCC CGC-3’ *5：キットに含まれるプライマー配列は以下のとおりです。 Ion Torrent Primer IT A : 5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3’ Ion Torrent Primer IT trP1: 5’-CCT CTC T A T GGG CAG TCG GTG AT-3’ KAPA Library Quantification Kits スペシャルパッケージ KAPA ライブラリー定量（LQ）キットをお使いいただいている皆様に感謝の気持ちを込めて お得にご購入頂けるスペシャルパッケージをご用意致しました。 価格などの詳細はお気軽に営業担当までお問い合わせください。 ホームページにも専用お問い合わせページがございますのでご利用ください。 Cat.No. 下記よりお選びください 包装単位 価格（税抜） 1000回用（500回用×2） お問い合わせください ※所有されているシークエンサーとqPCR装置の組み合わせにより、キットをご選択ください。 ABI Prism® Universal qPCR装置 次世代シークエンサー キャピラリータイプの LightCycler®を除く、ほとんど の機器に使用可能 illumina Eco ROX Low ABI7500, ViiATM7, QuantStudioを除くABI社機器 ABI7500 / ViiATM7 / QuantStudio / Stratagene MX3000P TM/ MX3005P TM / MX4000 TM Roche LightCycler® 480 LightCycler® 480 ／ 96 ／ Nano （キャピラリータイプの LightCycler®には対応してい ません） illuminaGA / HiSeq / MiSeq / NextSeq500 *1 KK4824/D KK4835/D KK4873/D KK4854/D Ion Proton / Torrent *2 KK4827/D KK4838/D KK4874/D KK4857/D ※上記に記載のないキット（454FLX、SOLiD用など）のスペシャルパッケージもお取り扱いがございます。詳しくはお問い合わせください。 *1：キットに含まれるプライマー配列は、TruSeqキットにも適合することが確認されております。 illumina Primer P1: 5’-A A T GA T ACG GCG ACC ACC GA-3’ illumina Primer P2: 5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’ *2：キットに含まれるプライマー配列は以下のとおりです。 Ion Torrent Primer IT A : 5’-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TC-3’ Ion Torrent Primer IT trP1: 5’-CCT CTC T A T GGG CAG TCG GTG AT-3’ キット内容 • • • • マスターミックスKAPA SYBR FAST qPCR Kit（2X） 5ml ROX High / Low ＊Universalタイプのみ 200μl×各1本 プライマーミックス 1ml DNA定量スタンダード（6濃度） 各80μl ×2セット分 トライアルキット イルミナ社シークエンサーをお使いのお客様にお求めやすい少量包装のトライアルキットをご用意致しました。 Cat.No. KK4828 illumina / Universal 包装単位 価格（税抜） 200 回用 ￥81,000 キット内容 • マスターミックスKAPA SYBR FAST qPCR Kit（2X） 1ml×2本 • ROX High / Low 200μl×各1本 • プライマーミックス 200μl×2本 • DNA定量スタンダード（6濃度） 各80μl ※トライアルキットは、200反応分入りで6ライブラリー×2プレート分の評価が可能です。 価格は2015年6月現在のものです。製品は改良のため予告なく変更する場合があります。 http://www.n-genetics.com 本 社：〒112-0004 東京都文京区後楽1丁目4番14号 後楽森ビル18F Tel. 03（3813）0961・ Fax. 03（3813）0962 西日本営業所：〒604-8277 京都府京都市中京区西洞院通御池下ル565番地 ラフィーネ御池3F Tel. 075（257）5421・ Fax. 075（257）5422 10PR1506C1K
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