Image-J を使用した連続薄切標本からの組織立体構築 Image-J は JAVA ベースで作られた画像処理ソフトであり、もともと医療画像解析を主目的に開発されてきた経緯から、 ソフトウェアの演算処理過程が簡易・明確であり多方面の科学研究に使用されている。ここでは、Image-J を用いた組織 立体構築法の基本操作について説明する。 1. Image-J 使用可能な OS 環境 ImageJ は、Windows、Mac OS X, Mac OS, Linux で使用できる。 ・なお、多数枚の連続標本の画像処理には大きなメモリ容量と高性能のPCの使用が推奨される。Windowsであれば64bit のOSを選択(32bitでは1アプリケーションでメモリ2GBが上限)することが望ましい。 2. Image-J のインストール “Image-J Web サイト:http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html”の“download”を選んで、使用するPCの OS 環境に適 した Image-J バージョンをダウンロードする。 ・インストール後には、インターネットに接続して“Update Image-J”コマンドを実行することで、自動的にソフトウェ アとプラグインを更新できる。 3. 組織立体構築に必要なプラグイン Image-J の特徴として、 “プラグイン”という拡張プログラムファイルをダウンロードすることで、目的に適した機能 システムを設計できる。 組織立体構築操作に最小必要なプラグインは、 “ImageJ 3D Viewer”、“StackReg”、“TurboReg”、“Color Deconvolution” の 4 種類である(http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/index.html) ダウンロードしたプラグインファイルは、いずれも圧縮されているので解凍する。解凍処理によって作成されたフォル ダを Image-J フォルダ内の“piugins”フォルダに移動することでプラグイン操作は完了する。 4. 立体構築に用いる原図情報の準備 ・Image-Jで扱えるファイル形式は、生物系顕微鏡のファイル形式(TIFF, GIF, JPEG, DICOM, BMP, PGM, FITS)形 式を網羅している。 組織立体構築に先立って、原図ファイル(CCD カメラで撮影された顕微鏡画像, バーチャルスライドによるデジタル画 像、共焦点顕微鏡像など)を単一のフォルダに保存して、A001、A002・・・のように桁数を揃えた連番号(画像スタ ック)で個別の画像レコードに名称をつける。 <以下の項目では、われわれが日常的に実行している Cytokeratin 抗体/DAB 発色と Ki-67 抗体/Vector SG 発色による二重免疫染色画像を例として、組織立体構築の手順を 説明する> 5. Image-J で画像スタックを開く 1. 「File」→「Import」→「Image Sequence」を選択。 2. 画像スタックが収納されているフォルダを指定し、フォルダにある画像の一つをク リックして選択すると “Sequence Option”ダイアログボックスが表示される。 Number of images:積層する画像数を入力 Starting image: 何番目の画像から始めるのかを指定 Increment: 入力した数値毎にイメージを呼び出す Scale mages: 呼び出す画像サイズを設定 File name contains: 入力した文字列を含むファイルを読み込む Copyright© 2012 Nippon Dental University, Dept. of Pathology Sort names numerically:番号順に読み込み (or enter pattern、Convert to RGB、Use virtual stack は空欄のまま残す) 3. 「OK」をクリックすると画像スタックが読み込まれる。 4. ウインドウ下部のスライダーを動かすと、積層された画像を閲覧で きる。 4. ボリューム情報の入力 空間座標を設定するために数値(薄切標本の厚さと単位ピクセル長さ)を入力。 1. 「Image」→「Properties」を選択すると右図のダイアログボックスが表示される。 Channels: ImageJ で開いているイメージスタックのチャンネル数 Slices:積層表示している画像枚数 Frames: 空欄のまま???? 不明 Use of Length:長さの単位を入力( “nm”, “um”, “mm”など) Pixel Width, Pixel Height: 単位ピクセル長さ Voxel Depth: 厚さ Frame Interval: タイムラプス画像スタックにおいて、フレーム数/秒を設定 Origin: 画像座標系の基準点を設定 Global:チェックを入れると、現在の作業中に開いた全ての画像スタックに対して同一条 件を付与 2. 「OK」をクリックする。 3. ここで設定した空間情報は保存されないので、画像スタックを開くたびに設定する必要がある。 5.積層画像の自動位置合わせ 1. 「Plugins」→「StackReg」を選択すると右図のダイアログボックスが表示される。 2. Transfomation: Translation (平行移動) Rigid Body (平行移動+回転) Scaled Rotation (平行移動+回転+均等拡大) Affine (平行移動+回転+縦横方向への不当拡大) 通常の連続標本の積層では、Rigid Body を選択して「OK」をクリックする。 “Scaled Rotation”や“Affine”では、標本の歪みを補正するため画像の拡大変形を加える。実際上は、良好な位 置合わせ結果は得られない。 4. 位置合わせが完了した後、 「File」→「Save as」→「Image Sequence」で保存する。 Copyright© 2012 Nippon Dental University, Dept. of Pathology 6. 色調抽出(免疫標識に基づく組織要素の分画) 1. 「Plugins」→「Color Decomvolution」を選択すると右図のダイアログボックスが 表示される。 2. 「Vectors」内に頻用される染色法について、その色調抽出条件が与えられている。 例)H&E→ヘマトキシリン・エオジン染色 H DAB→免疫染色(DAB 発色)+ ヘマトキシリン核染色 3. 任意の染色条件を用いた場合(ここでは DAB と Vector SG の二重染色)には、“From ROI”機能を使用して、色調幅を任意で設定する。“From ROI”では、組織画像か ら 3 つの色調幅条件を設定する必要がある。 4. 「From ROI」を選択して「OK」をクリックすると右図のメッセージが表示される。 「OK」ボタンをクリックして、最初に DAB の色調幅を設定する。設定方法は、画像内 の DAB 発色領域を矩形でドラッグ選択する。複数の領域を同時設定することも可能。 設定完了後にマウスの右ボタンをクリックすると設定が完了する。同様の操作を繰り 返して、次に Vector SG の発色領域を同様に設定する。今回の染色条件では、設定す べき 3 番目の色調が存在しないので、背景色を選択しておく。 5. 3 つの色調設定が完了すると、自動的に演算が開始されるので、結果画面が表示されるまで待つ。 6. 色調抽出の結果として、新たに 3 つのウインドウが表示される。 この結果画面を使用して、後述する “Binary”処理を施すと DAB 染色要素と Vector SG 染色要素とが分画できる。 DAB Vector SG 背景 7. 色抽出結果の画像スタックを「File」→「Save as」→「Image Sequence」で保存する。 7. 色抽出結果された画像スタックの 2 値化処理 1. DAB 色調の抽出結果ウインドウをクリックして選択する。 2. 「Process」→「Binary」→「Make Binary」を選択すると、DAB 標識の癌実質が分画される。 3. Vector SG 色調抽出結果ウインドウにつても同様の作業を繰り返して、Vector SG 標識の Ki-67 陽性核を分画する Copyright© 2012 Nippon Dental University, Dept. of Pathology 4. 2 値化処理で得られた画像スタックについても、 「File」→「Save as」→「Image Sequence」で保存する。 8. 論理演算処理による組織要素の分画操作 Vector SG の色調で抽出・2 値化された Ki-67 陽性核を “実質空間に帰属する核質”と“間質空間に帰属する核質”とに 分画する。 1. 癌実質データを反転して間質空間を分画する。2 値化処理で分画された実質ウインドウを選択して「Edit」→「Invert」 を選択する。 2. 実 質 / 間 質 空 間 に 帰 属 す る Ki-67 陽 性 核 を 分 画 す る 。「 Process 」 → 「 Image Calculator」を選択する。「Image 1」と「Image 2」で論理演算対象とするデータ を選択、「Operation」で実行 する演算処理を選び、 「OK」を クリック。 3. 「File」→「Save as」→「Image Sequence」で演算結果を保存する。 Copyright© 2012 Nippon Dental University, Dept. of Pathology 9. 癌実質データの細線化処理 図形の特徴を保持した状態で、立体構築像の最外側の組織要素を 1 ピクセル幅に細線化して透過表示することで、内部構 造を直視することができる。 1. 癌実質ウインドウを選択、 「Process」→「Binary」→「Outline」を実行する。 2. 「File」→「Save as」→「Image Sequence」で演算結果を保存する。 10.抽出・分画要素(癌実質、癌実質 outline、間質、実質 Ki67 陽性核、間質 Ki67 陽性核)の立体表示 1. 立体表示に必要な抽出・分画要素以外の画像スタックウインドウをすべて閉じる。 2. 癌実質要素の画像スタックウインドウを選択し、 「Plugins」→「3D Viewer」→「ImageJ 3D Viewer」を実行すると右図のダイアログパネルが表示される。 Image:立体表示するデータの選択 Name:3D Viewer 上で表示され組織要素の名称 Display as:投影方法(ボクセルモデルかサーフェイスモデルを選択) Color:疑似カラーの選択。後で任意の疑似カラーに設定できる。 Threshold:不明 Resampling factor:不明 Channels:不明 3. 「OK」をクリックすると 3 次元投影ウインドウが開く。 マウスのドラッグ操作で任意方からの観察が可能。 立体画像の拡大・縮小はマウスのホイール操作で可能。 組織要素の追加 1. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「File」→「Add content」を選択。前述のダイアログパネルが表示されるので、 3 次元投影するデータを選択する。 2. この操作を繰り返すことにより、すべての組織要素を 3 次元空間に投影・表示できる。 疑似カラーの設定 1. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「Select」メニューで対象とする組織要素を選択する。 2. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「File」→「Edit」→「Attribute」→「Change Color」を選択。R, G, B のスラ イダーを調整して任意の疑似カラーを適応できる。 組織要素の透過度 1. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「Select」メニューで対象とする組織要素を選択する。 2. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「File」→「Edit」→「Attribute」→「Change Transparency」を選択。スライ Copyright© 2012 Nippon Dental University, Dept. of Pathology ドを調整して適応させる。 立体表示の ON, OFF 1. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「Select」メニューで対象とする組織要素を選択する。 2. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「File」→「Edit」→「Hide/Show」→「Show Content」の「On/Off」を切り替 える。 動画作成 「ImageJ 3D Viewer」には回転動画作成ツールが格納されている。 1. 「ImageJ 3D Viewer」ウインドウの「View」→「Record 360 deg rotation」を選択すると、立体画像が 360 度回転 して新しいウインドウ(動画ウインドウ)が作成される。 2. 新しく作成された動画ウインドウを選択して、「ImageJ」メニューの「File」→「Save as」→「AVI(動画ファイル フォーマット)」を選択・保存すると動画ファイルが保存できる。 なお、 「ImageJ 3D Viewer」で投影させた 3D 情報については保存することができない。 Copyright© 2012 Nippon Dental University, Dept. of Pathology
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