07a in situ 法による羊水細胞培養 In Situ 法による羊水細胞培養 図１．カバーガラスを用いる in situ 培養法． 培養法． 1 フラスコ法、◯ 2 in situ 法、が 羊水の培養法は ◯ フラスコ法、◯ などのための時間的余裕を考えると、16 週が最適で あります。フラスコ法は培養後に細胞を浮遊させス あります。フラスコ法は培養後に細胞を浮遊させス す。週数が多くなれば細胞も増えるが死滅した細胞 ライド上に拡げて染色体標本を作るので良い標本 ライド上に拡げて染色体標本を作るので 良い標本 も多くなるので、33 週以上では培養の成功率が低く を作り易いのですが、コロニーごとに核型を分析で なります。羊水採取時に胎児が死亡していると培養 なります。羊水採取時に胎児が死亡していると培養 きず、遠心沈殿して細胞を集めるため細胞のロスが しても生えないことが多いので、流産では羊水細胞 多く培養期間が長いなどの欠点があります。In 多く培養期間が長いなどの欠点があります。In situ ではなく胎盤絨毛を採取し培養するのが賢明です。 法（図１）はカバーガラス上に羊水細胞を培養し、 母体組織（母体腹壁・子宮壁・胎盤組織） ・血液の そのまま標本を作るのでコロニーごとに核型を分 そのまま標本を作るの でコロニーごとに核型を分 混入を防ぐために、最初の 1~2 ml を捨てます。血 析でき、培養時間も短くモザイクの分析に有効です 液は少量混入しても差し支えありませんが、羊水 10 が、良い標本を作るのに工夫と熟練が要ります。 ml に対して血球層が 0.1 ml 以上混じると羊水細胞 の底面への付着が妨げられ、培養の成功率が落ちま １．羊水の採取時期と採取量（表１） １．羊水の採取時期と採取量（表１） す。血液細胞は培養液を換えるときに洗い流され、 出生前診断には妊娠 15 週～16 週～16 週が最適です。≦ 分裂細胞として残ることはありません。羊水の採取 14 週は羊水量・細胞濃度共に低いので好ましくあり 時期が適当で量も充分で血液の混入もなければ、培 ません。 培養期間だけを考えると 18 週が最短です。 養の成功率は 99％以上です。 99％以上です。 しかし羊水の再採取・両親のリンパ球の染色体分析 表１．妊娠週数と羊水の採取量 妊娠 採取量 (ml) 羊水の量 (ml)b 細胞の濃度 b 範囲 平均 （ /μ l） 捨てる 採取 a 15 1 16 64~ 64~245 136.8 134,845 16 2 20 27~ 27~285 191.2 184,324 17 2 20 140~ 140~573 252.6 18～ 18～32 2 20 週数 a 目安と考えること。 b Elejalde BR et al. al. (1990 (1990) 1990) 1 07a in situ 法による羊水細胞培養 ２．In ２．In situ 培養法 羊水細胞の染色体分析、殊に高齢妊婦の分析の主 羊水を遠心沈殿して得た細胞に培養液を加えて細胞 目的はトリソミー21 目的はトリソミー21 です。しかし、羊水細胞の染色 浮遊液を作り、Petri 浮遊液を作り、Petri 皿中に置いたカバーガラス上 体異常に占めるトリソミー21 体異常に占めるトリソミー21 の割合は 30％に過ぎ 30％に過ぎ に載せて培養します。複数 (羊水の量と週数に応じ (羊水の量と週数に応じ ません。残りの 70％はトリソミー 70％はトリソミー18 ％はトリソミー 18, 18, XXX, XXX, XXY, XXY, て増減) て増減) の Petri 皿を作り、二系統に分けて別々の 45,X, 45,X, 均 衡 型 ・ 不 均 衡 型 構 造 異 常 ( 相 互 転 座 ・ インキュベーターで培養し、別々に処理します。カ Robertson 型転座・逆位・欠失・重複・過剰マーカ バーガラス上に生じたコロニーをそのままの形で処 バーガラス上に生じたコロニーをそのままの形で処 ー)、モザイクなどです。その他に表現型に影響しな 理し、染色体標本を作り、トリプシン G-分染します。 い種々の正常変異、偽性モザイク、母体細胞の混入 カバーガラス 1 枚のコロニー数は 1~20 で、その大 なども見分ける必要があります。 部分は単一の細胞から出発したと考えてよいでしょ ４．偽性モザイク（pseudomosaicism ４．偽性モザイク（pseudomosaicism）と真性モザ pseudomosaicism）と真性モザ う。 複数の培養から合計 15 コロニーを選び、各コロ イク（mosaicism イク（mosaicism） mosaicism） ニーについて 1 細胞をカウント分析します。80 細胞をカウント分析します。80％以 80％以 正常核型/ 正常核型/異常核型のモザイクで、異常核型の出現 上の検体で 15 コロニーを分析するのが基準です。 の仕方によってレベルⅠ~ の仕方によってレベルⅠ~Ⅲに分けます（表２） Ⅲに分けます（表２）。異 常核型の 70％が均衡型・不均衡型構造異常、 70％が均衡型・不均衡型構造異常、30 ％が均衡型・不均衡型構造異常、30％が 30％が ３．羊水細胞の染色体異常 数の異常です。 表２．真性モザイクの確率 レベル 核型異常の細胞 Ⅰ 1 細胞 検体の頻度 a (％) 偽性モザイク 2.5~ 2.5 ~7 100 Ⅱ 1 コロニー 0.7~ 0.7~1.1 99.5 0.5 Ⅲ 2 コロニー以上 0.2 60 40 a 文献の頻度。自験例ではこれより多い。 1) レベルⅠモザイク 1 コロニーの 1 細胞だけが異常核型で他の細胞は 細胞だけが異常核型で他の細胞は 正常核型。 偽性モザイク。 2) レベルⅡモザイク 1 コロニーの細胞が全部異常核型。 99.5％は偽性モザイク。 99.5％は偽性モザイク。 3) 確率 (％ (％ ) モザイクを持つ レベルⅢモザイク 複数のコロニーが異常核型。偽性モザイクの確率 が 60％、真正モザイクが 60％、真正モザイクが 40％。核型異常のコロ 40％。核型異常のコロ ニーがひとつのカバーガラスに限定しているとき は偽性モザイクの確率が高く、複数のカバーガラ スにあるときは真性モザイク。 正常／構造異常モザイク：偽性モザイクの確率が高い。 正常／トリソミー8 正常／トリソミー8, 9, 13, 13, 18, 18, 21 モザイク：真性モザ モザイク：真性モザ イクの可能性が多い。 2 真性モザイク 0 07a in situ 法による羊水細胞培養 レベルⅡの正常／構造異常モザイク：偽性モザイクと考えます。 ５．羊水培養で細胞が急速に増殖するとき 胎児血で検出できないものがあることに注意すべき です。＋iso12p ＋iso12p モザイク; モザイク; モザイク・トリソミー5 トリソミー5, 7, 羊水細胞を培養して染色体標本を作るまでには 少なくとも 5 日～8 日～8 日はかかりますが、急速に羊水 16, 16, 20 などがその例です。 細胞とは違う形の細胞が底面に付着して増殖し、2 細胞とは違う形の細胞が底面に付着して増殖し、2 ４）超音波検査 日～3 日～3 日で容器の底面がいっぱいになることがあり 胎児の染色体異常を疑うときに詳細な超音波検査 胎児の染色体異常を疑うときに詳細な超音波検査 ます。このようなときは、次の可能性があります。 で胎児の異常の有無をチェックすることは で胎児の異常の有無をチェックすることはカウンセ の異常の有無をチェックすることはカウンセ ① 開放型脊椎披 開放型脊椎披裂・無脳症などで神経系の膠（glia （glia） glia） リングにも役立ち、 リングにも役立ち、有用です。胎児染色体異常のほ 有用です。胎児染色体異常のほ 細胞または星状細胞が羊水中に遊出し、増殖した。 ぼ半数に超音波所見の異常を認めます。 膠細胞は免疫染色で同定可能です（Cre 膠細胞は免疫染色で同定可能です（Cremer Cremer et al., ５）新生児臍帯血の染色体分析 1981） 1981）。② 臍帯ヘルニア・腹壁披 臍帯ヘルニア・腹壁披裂などで腹膜から 羊水培養で染色体異常・レベルⅢ以上のモザイク マクロファージが遊出した（Gosden マクロファージが遊出した（ Gosden and Brock, を発見したが妊娠を継続したとき、新生児の臍帯血 1977） 1977）。③ 羊水穿刺で胎盤から細胞が押し出された。 を使って染色体分析して確認しておくのが賢明です。 ④ 高度の IUGR（ IUGR（Gosden and Brock, 1978） 1978）。 偽性モザイクであれば臍帯血の核型は正常で 偽性モザイクであれば臍帯血の核型は正常で、真性 モザイクでも 10% 10%~50%は正常です。羊水細胞と臍 50%は正常です。羊水細胞と臍 帯血で核型が違うのは、細胞の起源が違うからだと ６．染色体異常を疑うときの追加検査 思われます。 次の手段を場合に応じて使い分けます。 １）両親の血液リンパ球の染色体分析 ６）羊水細胞の再採取 羊水細胞が正常変異・均衡型構造異常 (相互転 ( 相互転 時間的余裕があれば、羊水を再採取して分析する 時間的余裕があれば、羊水を再採取して分析する 座・逆位) 座・逆位)・過剰マーカー染色体などを持ち、両親の ・過剰マーカー染色体などを持ち、両親の 方法は有効です。偽性モザイクであれば、同じ異常 染色体を分析して同じ異常を発見したら、胎児の染 染色体を分析して同じ異常を発見したら、胎児の染 が繰り返し出現することはありません。 色体異常は親から遺伝したもので、表現型は正常だ 注１．羊水の保存 と推定できます。羊水細胞が均衡型構造異常で両親 が染色体正常なら胎児の染色体異常は de novo（新 羊水を採取後にすぐに輸送できないときは遠沈管 生）で、胎児が表現型異常の確率は 生）で、胎児が表現型異常の確率は 6%~10％です。 10％です。 2 本に無菌的に分注して蓋を締めた後に直射日光・ [03d de novo 均衡型構造異常と表現型異常] 均衡型構造異常と表現型異常] をご参 紫外線を避け、垂直に立てて 4℃に保存します。凍 照ください。 らせないことが保存のコツです。この方法で 1~2 日 羊水細胞で不均衡型相互転座・不均衡型 保存しても、培養の成功率は落ちません。報告まで Robert Robertson 転座などを発見したら、両親の染色体分 転座などを発見したら、両親の染色体分 に要する日数は保存期間のぶんだけ長くなります。 析をします。親が均衡型構造異常を持つ割合はほぼ 析をします。親が均衡型構造異常を持つ割合はほぼ 注２． 再播種 50%です。 50%です。 15 コロニーを分析することを目標にしますが、6 コロニーを分析することを目標にしますが、6 ２）特殊分染法の追加による分析 コロニー以上を分析できれば通常の分析には充分で 羊水細胞染色体は G-バンド分析しますが、他のバ す。６コロニー以下のときはピペットの先で掻爬し す。６コロニー以下のときはピペットの先で掻爬し ンド分析・ ンド分析・FISH 析・FISH 分析を追加することによって情報 て、同じカバーガラス上に再播種して培養を続け、 が得られることがあります。20 番染色体の q11 領域 染色体標本を作ります。コロニーごとに分析できな に G-バンド分析で濃染する過剰領域を認め、C-バン いので、20 いので、20 細胞を分析します。 ド分析して陽性だったら、正常変異です。 ド分析して陽性だったら、正常変異です。 ３）臍帯血の染色体分析 文献 偽性モザイク・真性モザイクの鑑別に役立つこと Cremer M, Treiss T, Cremer T, Hager D, Franke があります。ただし、染色体異常の種類によっては WW: Characterization of cells of amniotic 3 07a in situ 法による羊水細胞培養 fluid by im immunological of Gosden C, Brock DJ: DJ: Morphology of rapidly intermediate sized filaments: Presence of cells adhering amniotic fluid cells cells in the aid to the of diagnosis of neural tube defects. defects. Lancet different different tissue identification origin. Hum Genet 59:373− 59:373−379, 1981. 1:919− 1:919−922, 1977. Elejalde BR, BR, Elejalde MM, Acuñ Acuña JM, Thelen D, Gosden C, Brock DJ: DJ: Amniotic fluid cell Trujillo C, Karrmann M: Prospective study of mor morphology in early antenatal prediction of amniocentesis between weeks 9 and 16 of abor abortion and low birth weight. Brit Med J gestation: gestation: Its feasibility, risks, complications 2:1186− 2:1186−1189, 1978. and use in early genetic prenatal diagnosis. 梶井 [2007 2007 年 11 月 9 日：改訂] 改訂] Am J Med Genet 35:188− 35:188−196, 1990. 4
© Copyright 2024 Paperzz
