4日目資料(2006/08/28)

Table of Contents 今日の流れ
生物情報科学実験Ⅰ
∼ショットガンアセンブリ∼ Day4

ゲノム配列解読法
{

全ゲノムショットガン法
コンティグの作成
課題提出方法
東京大学大学院新領域創成科学研究科特任助手
笠原雅弘
([email protected])
ゲノム配列の解読

理想の世界
{

「ゲノム配列解読機」に１本の染色体を投入
↓
何時間か待つと染色体の全配列を出力
Sanger 法 (1/2)

一本鎖 DNA が鋳型
primer/ddNTP/dNTP を加え伸張
実際の世界
{
{
そもそも１本の染色体（１分子）から
塩基配列を解読することはできない
１回の読み取りでは 1000塩基対が限度
1
Sanger 法 (2/2)

質量の違いで分離、色を見る
Sanger 法を使う際の制約

多コピーの鋳型が必要(ex: 0.1μg)
{

プライマーが必要
{
全ゲノムショットガン法
(Whole genome shotgun method)

読みたい配列の先頭数十塩基（２５程度）
を知っている必要がある
Whole Genome Shotgun Sequencing 概略
ゲノム
ゲノム配列をランダムに細かく裁断し
断片配列を非常にたくさん読む方法
{

全く同じ配列を持った一本鎖ＤＮＡを
大量に用意する必要がある
読まれた断片配列はコンピューター処理に
より統合処理を行う
Sanger 法を使う場合、断片配列はベク
ター配列にクローニングされる
{
Pyrosequencing 法等、クローニングを経な
いシークエンシング技術も最近は出てきてい
る
2
Whole Genome Shotgun Sequencing 概略
ゲノム断片
Whole Genome Shotgun Sequencing 概略
ゲノム断片
リード
リード
読まれていない
部分
Whole Genome Shotgun Sequencing 概略
リード
Overlap-Layout-Consensus

Contigs (コンティグ)
コンティグ間ギャップ
Shotgun assembler の基本パターン
Overlap phase
Consensus phase
consensus
sequence
Scaffolds (スキャッフォルド/Supercontigs/スーパーコンティグ)
Layout phase
タイリングパス（ゲノム配列を覆
うようなリード列）を求める
3
Original genome
U1
今日の課題
R
U2
R
U3
Shotgun reads

Overlap を計算してContig を作る
{
Overlap-layout-consensus モデルで言うと
ころの、Overlap, layout をこなす
Ideal overlap graph
Real overlap graph
オーバーラップの計算

単純な方式
両鎖リードを使ったアセンブル

両鎖を使ったアセンブル
{
全てのリードの対に関して
Overlap alignment を実行する
Ａ
Ｂ
{
非常に遅い
Ｃ
Ａ
Ｂ
Ｃ
相補鎖を生成する
シードによる絞り込み方式
{
少なくとも１つのシードを共有している
リードの対に対してのみ
Overlap alignment を実行する
※アセンブルすると２つの相補的な contig 配列ができあがることに注意
Ｃ
Ｂ
Ａ
Ａ
Ｂ
Ｃ
4
HashTable を使った候補絞り込み
アラインメントの工夫(1/2)
アラインメントの工夫(2/2)
オーバーラップ情報の保存
※課題プログラム中では
areTheTwoReadAlreadyTried
変数が該当します
5
Original genome
U1
R
U2
R
U3
Contig を作る
Shotgun reads

Contig を作るためには
{
{
Ideal overlap graph
リードを繋げていけば良い
どのような条件で繋げて良いのだろう？
基本リード
Real overlap graph
タイリングパスと包含リード
ゲノム配列

包含されるリードを除外しても
ゲノム配列をリードで覆うことができる
Ｃ
Ｂ
Ａ
Ｄ
Ａ→Ｂ→Ｃ
⇒
観察
Ｄ
6
観察
観察
ゲノム配列

包含されるリードを除外すると
「前進」するリードの列が見えてくる
最小前進タイリングパスと
短いリピート配列

ゲノム配列
短いリピート配列を乗り越える
{
各リードから「最も前進距離が短いリード」を
Best overlap として有向Edgeを張る
必須課題4-1

課題URL

課題 web ページから Overlap.zip をダウンロードし、
ComputeOverlaps.java を実装せよ
去年のショットガンシークエンシング実習において
得られた断片配列が課題 web ページから入手できる
のでそれを使うこと
次スライドの注意点を良く読むこと
ソースプログラム、Read flow graph の画像ファイル、
Overlap graph の画像ファイルを提出せよ
{

A
R
B
反復配列Ｒがリード長より短かけれ
ば両者が混じることはない

C
R
D
※長いリピート配列に対しては別種
のアルゴリズムが必要であるが今
回の演習には含まれない

http://mlab.cb.k.u-tokyo.ac.jp/~mkasa/upbsb2006/
7
注意点
GraphVizによる表示
全く同じ長さのリードがあった場合に、除外する
リードが相補鎖同士整合性がとれるようにする

B と D を残したりしないように！B/B か D/D を残す
ComputeOverlaps.
showReadFlowGraphByGraphVizメソッド
でグラフを表示できる
{
Ｃ
Ｂ
Ｄ
{
Ａ
Ａ
Ｄ
Ｂ
{
Ｃ
OverlapGraph

リードをノード（点）とし、オーバーラップを
エッジ（矢印）としたグラフ構造
結果は C:¥temp に jpeg ファイルとして出力
される
リードフローグラフは
readflowgraph.jpeg
オーバーラップグラフは
overlapgraph.jpeg
ReadFlowGraph

リードをノード（点）とし、ベストオーバー
ラップをエッジ（矢印）としたグラフ構造
8
必須課題 4-2

応用課題 4-3
最小前進タイリングパス法は短いリピート配列
があっても正しくタイリングパスを生成すること
ができる
{
{

Overlap alignment を計算する際に、
共通しているシード周辺のみの対角線を
計算するように動的計画法を書き換えよ
配列1
リピート配列の長さが大きくなってくると正しくタイリ
ングパスを生成できない場合があるが具体例を一
つ挙げて論ぜよ
プログラムを書く必要は無い

対角線の幅は
「シード以外も100%のマッチ率で塩
基アラインした場合の重なり塩基数」
×0.1 + 11 とせよ。
シード
配列2
応用課題 4-3 の注意
・banded alignment と言う
DP空間
0.1 はシークエンシングエラー許容パ
ラメータ、11 は確率的なゆらぎを許
容するための定数項である
ベクターと挿入断片の位置関係
シードが、同じ組のリードにおいて、
２カ所以上で共有される場合に注意
配列1
MCS(Multi cloning site) に
ＤＮＡ断片が挿入される
複数の対角線をチェッ
クする必要がある
配列2
DP空間
9
Mate pair (paired end)

Scaffolding
ベクターに組み込んだ、断片配列の両端
はゲノム上で近い位置の逆鎖にある

Mate pair の関係を使うと contig を関連
づけることができる
ゲノム配列
Contigs

課題提出について
Contig 間に飛んでいる mate pair を利
用して Scaffold を生成せよ

URL
http://www.tigr.org/tdb/benchmark/
から、微生物ゲノムの全ゲノムショットガン
データをダウンロード可能

report4 として提出すること
必須課題〆切
残念ながら実習データには mate pair が無い

応用課題〆切
{

{
{
Brucella suis が最もアセンブルしやすいの
で、それを選ぶと良い
合計100MBytes 以内で好きなもの(ファイ
ル)を提出してください
B
Shotgun
reads
Mate pair
チャレンジ課題 4-4
A
{
{
{

http://mlab.cb.k.u-tokyo.ac.jp/~mkasa/upbsb2006/
９月１日１４時４５分
９月８日１０時００分
提出方法は基礎(Java)コースと同じ
{
分からない場合には質問
10

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