Illumina MiSeq Interview: Jacques Corbeil 微生物病原体における薬剤耐性突然変異の迅速検出 ラバル大学のCorbeil博士は、MiSeq® 次世代シーケンサーとNextera® XT DNAサンプル調製キット を用い、微生物病原体における低頻度変異の解析を行っています。 Jacques Corbeil博士は、カナダ・ケベック州にあるラバル大 学中央病院（CHUL：Centre Hospitalier Université Laval）医 学部感染症研究所において医療ゲノミクスの教授およびカナダ 政府研究教授として勤務されています。 Corbeil博士の研究室では、次世代シーケンサーを用い、細菌 やウィルス感染の際に見られるような宿主病原体相互作用の解 明に取り組んでいます。感染のメカニズムを分子レベルで解明 することにより、診断の向上、および新しい治療法やワクチン の開発への貢献を目指しています。 先生の研究が目指すものは何でしょうか？ Jacques Corbeil（JC）：私はこれまでの研究生活のほとん どを、特にHIVにおける宿主と病原体の関係の研究に費やして きました。最近では、寄生虫のリーシュマニア、細菌の肺炎球 菌など、公衆衛生の面で重要な微生物に対しても興味を持つよ うになりました。メタゲノム解析の経験もあり、この時は主に 抗生物質がヒトのマイクロバイオームにおよぼす影響について 分析しました。さらに、北極と南極のバクテリアマットを比較 し、両者で共通する細菌や異なる細菌、そしてそれらの機能の 類似点についての調査も行いました。 Jacques Corbeil博士（Ph.D）。国際学術誌に発表した論文は88にのぼります。 宿主病原体相互作用を解明するため、感染症および診断の分野で精力的に 研究を行っています。 MiSeqシステムによってご自身の研究がどのように前進したと お考えですか？ これまで Nextera XT キットと MiSeq を使用してどのような サンプルをシーケンスしましたか？ JC：MiSeqは我々のように微生物を対象にしている研究室に JC：ケベック州の公衆衛生研究所と共同で、HIVに感染した人 の血漿を調べました。pol 遺伝子の3つのタンパク質（逆転写 適したサイズですね。我々が相手にしているのは、数十億塩基 対にのぼるヒトゲノムよりもずっと小さい数百万塩基対という ゲノムです。MiSeqはアウトプットが非常に高いため、一度に 20、24、あるいは96といった数の微生物をシーケンスできま す。そのおかげで、血液、鼻咽頭検体、あるいは脳脊髄液中の 微生物について、薬剤耐性突然変異を調べたり、野生型と薬剤 耐性型の動態を解析したりできます。MiSeqでは非常に深い深 度でシーケンスができますから、低頻度突然変異の検出も可能 です。例えば、Nextera XTキットを使うと、ある箇所の特定の 1塩基対について調べることができます。その箇所を30,000× でシーケンスすると、 1∼2%といった低頻度で存在する変異 を容易に検出できます。そして、その変異がシーケンスのエ ラー、または PCR 増幅や他の実験プロセスによって導入され たバイアスによるものではなく、本当に存在する変異だという 確信を持てます。 MiSeqの登場で、実験のスケールが変 わりました。サンガー法でのシーケン スでは、 50/50 の変異…… 25/75 の変 異を検出できることもありましたが、 MiSeqで検出できるような、全体の約 2% しか存在しないという低頻度の変 異を捉えることは不可能でした。 酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼ）をシーケンスし、変異 のモニタリングを行いました。特定の遺伝子型と薬剤耐性との 相関をもとに、患者に投与すべき薬剤について情報を提供する ことができました。例えば、ジドブジン抵抗性の HIVに感染し ていると分かった人には、他の薬剤を推奨しました。 以前はどのような手法を使っていましたか？ その手法とMiSeqシステムを比べていかがでしょうか？ JC：サンガー法でシーケンスしていましたが、大変な手間で した。中には、あまりにも大変なので採用しなかったアプリ ケーションもあります。MiSeqの登場で、実験のスケールが変 わりました。サンガー法でのシーケンスでは、50/50の変異、 つまり野生型が 50%、変異型が50%という変異ならば検出で きました。 25/75 の変異を検出できることもありましたが、 MiSeqで検出できるような、全体の約2%しか存在しないとい う低頻度の変異を捉えることは不可能でした。 病原体を検出するため、最も頻度の高い変異の有無を調べる qRT-PCRアッセイも開発しましたが、PCRで調べられるのは 既知の変異のみです。 MiSeq は感度が高く、定量性もあるの で、既知の変異全てを検出するだけでなく、新しい変異につい ても知見を得られます。これは非常に重要なポイントです。 MiSeqによって、我々の実験の進め方は本当に変わりましたし、 以前はできなかったプロジェクトにも取り組めるようになり ました。微生物学の世界は大きな影響を受け始めていますね。 新しいテクノロジーは新たな知見をもたらしますし、それこそ 我々が今追い求めているものです。 Illumina MiSeq Interview: Jacques Corbeil Nextera XTキットをご使用になった経験についてお聞かせ願 えますか？ JC：Nextera XTキットを使った実験は最初から上手くいきま した。再現性もあり、我々のワークフローにマッチしていま す。実験のスピードは大幅に向上しました。Nextera XTキット を使うことで、これまで数日かかっていたステップがわずか半 日で終わるようになりました。 96 サンプルの処理が、たった 4 時間で終わります。研究室のメンバーはこのキットを非常に 気に入っていますよ。 まずは1名の患者さんから5∼10検体を採取してシーケンスする 小規模なプログラムから開始します。そこから大体の見通しを立 てたのち、HiSeq®システムに移行して200∼300名の患者さんか ら検体を採取してシーケンスするということが簡単にできます。微 生物学においては、 レトロスペクティブ研究からのスケールアップ が容易なのです。マイクロバイオームに関しては、MiSeqから始め てHiSeqで1もしくは2ランのシーケンスを行えば非常に早く研究 を終えることができます。 MiSeqシステムで得られるデータの質についてはいかがですか？ JC ：データ品質は優れています。仕様どおりの結果が得られま す。現在MiSeqのアウトプットは10億塩基対超ですが、それがこ の夏の終わり頃には70億塩基対になり、2012年の終わり頃には 150億塩基対に到達すると期待されています。そうなれば、我々 は微生物に関する実験のほとんどをMiSeqだけで行えるようにな るでしょう。 これまでに使用した他の次世代シーケンサーと比較してMiSeq システムはどうでしたか？ JC ：メタゲノム解析のプロジェクトで454 を使い、北極で採 取した細菌をシーケンスしました。454はMiSeqより長いリー ドが得られますが、ホモポリマーの伸長に問題がありました。 これは連続して試薬を添加するケミストリーに共通の問題点で すが、イルミナのSBSケミストリーではそういう問題は経験し ていません*。我々は主に未知の微生物を相手にしていますか ら、間違ってシーケンスされてもそれを正す術がありません。 真のde novoシーケンスを行うためには、システム上大きな問 題を抱えている手法を使うわけにはいきません。だからこそ、 HiSeqやMiSeqのようなシステムを使えるというのは、我々に とって非常に喜ばしいことなのです。 公衆衛生サーベイランスにおける病原体の検出や微生物のシー ケンスについて、 MiSeq はどのような変化をもたらし得るで しょうか？ JC：MiSeqは公衆衛生サーベイランスにおいても役に立つと思い ます。なぜならこれから出現するかもしれない新しい世代の変異 イルミナ株式会社 実験のスピードは大幅に向上しました。 Nextera XTキットを使うことで、これま で数日かかっていたステップがわずか半 日で終わるようになりました。96サンプ ルの処理が、たった4時間で終わります。 を解析できるからです。インフルエンザのH1N1型のように、あ る微生物で新しい型が出現したかどうかを確認でき、治療法を検 討することができます。Nextera XTキットとMiSeqを使えば、変 異の監視をかなり迅速に行えます。例えば、肺炎球菌による呼吸 器感染を防ぐため児童にワクチンを接種しますが、肺炎球菌には 92の血清型があって、その同定には抗体が用いられます。我々は 遺伝子型の情報を利用して陽性の血清型を確認する、PCRマイク ロアレイ解析を考案しました。しかしこの解析法は完全なもので はなく、特異的に認識できるのは51の血清型のみでした。2001年 にプレベナー7が発売されると、このワクチンに含まれる型の肺 炎球菌は見られなくなりましたが、代わりに他の型が見られるよ うになりました。新しいワクチンであるプレベナー13には、再流 行を防ぐため従来のワクチンに含まれていた型が含まれているほ か、新たに出現した型も含まれています。現在、私はPCRマイク ロアレイで血清型を同定する代わりに、シーケンスによって血清 型と遺伝子型の照合を行い、新たな型の肺炎球菌の出現をモニタ リングしようと考えています。 また現在、HiSeqシステムを用い、抗生物質を投与された時に患 者のマイクロバイオームで起こる変化を、好気性菌叢および嫌気 性菌叢の両方について調査しています。 今現在、シーケンサーの導入を検討している研究者に対して何か アドバイスはありますか？ JC ：シーケンサーを選ぶ際には、装置を試してみるか、あるい は実際に装置を動かしているラボへ見学に行き、自分の実験にど の程度適しているか確かめるのが一番です。販売元の言うことを 鵜呑みにしてはいけません。イルミナのことを言っているわけで はないですよ。イルミナの装置は素晴らしいと思っています。ま あ、本当かどうか証明されるまで宣伝文句を信じないのが科学者 の常ではありますけれどね。 MiSeqシステムの詳細については以下まで。 www.illuminakk.co.jp/miseq * Sequencing by synthesis（SBS）ケミストリーは、イルミナの全ての次世代 シーケンサーシステムで用いられているテクノロジーの基盤となっています。 代理店 〒108-0014 東京都港区芝5-36-7 三田ベルジュビル 22階 Tel (03) 4578 - 2800 Fax (03)4578 -2810 www.illuminakk.co.jp 本製品の使用目的は研究に限定されます。 © 2013 Illumina, Inc. 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