家畜代謝試験（２－４－２） １．適用範囲 （ １ ）農 薬（ 当 該 農 薬 の 植 物 代 謝 物 等 を 含 む 。）が 残 留 し た 飼 料 の 用 に 供 さ れ る 農 作 物 及 び 稲 わ ら 等 の 農 作 物 の 副 産 物（ 以 下「 飼 料 作 物 等 」と い う 。）を 家 畜（ 家 き ん を 含 む 。以 下 同 じ 。）に 給 与 し た 場 合 の 当 該 農 薬 の 家 畜 体 内 に お け る 代 謝 を定性的、定量的に明らかにするための放射性同位元素で標識した被験物質 （ 以 下 「 標 識 被 験 物 質 」 と い う 。） を 用 い た 家 畜 代 謝 試 験 を 対 象 と す る 。 （ ２ ） 本 試 験 に 係 る 指 針 は OECD テ ス ト ガ イ ド ラ イ ン 503 「 家 畜 代 謝 」 (2007 年 1 月 8 日 採 択 )に 準 拠 す る 。 た だ し 、 当 該 ガ イ ド ラ イ ン の 対 象 で あ る 農 薬 使 用 のうち、 「 農 薬 の 家 畜 へ の 直 接 投 与 」及 び「 農 薬 に よ る 畜 舎 内 の 処 理 」に 係 る 規定は含まない。 ２．目的 （１）家畜の組織、臓器、乳及び卵（食用のものに限る。以下「食用の組織等」 と い う 。） 並 び に 排 泄 物 中 の 標 識 被 験 物 質 由 来 の 放 射 性 同 位 元 素 を 含 む 成 分 （ 以 下 「 残 留 放 射 性 物 質 」 と い う 。） の 性 質 及 び そ れ ら の 総 濃 度 （ Total Radioactive Residue 。 以 下 「 TRR 」 と い う 。） を 推 定 す る こ と 。 （２）食用の組織等中における残留物の主要成分を同定し、家畜残留試験におけ る 分 析 対 象 物 質（ 規 制 対 象 化 合 物 及 び 暴 露 評 価 対 象 化 合 物 と 考 え ら れ る も の ） を明らかにすること。 （３）反すう動物及び家きんにおける農薬の代謝経路を明らかにすること。 （ ４ ）残 留 物 が 脂 溶 性（ 脂 肪 組 織 、乳 脂 肪 又 は 卵 黄 に 分 布 す る 性 質 。以 下 同 じ 。） か否かの根拠を提供すること。 （５）畜産物に残留する農薬の成分をヒトが摂取する可能性がある場合に、農薬 の 家 畜 体 内 へ の 吸 収 、分 布 、代 謝 及 び 排 泄 を 説 明 す る た め の 情 報 を 得 る こ と 。 ３．一般的な留意事項 （１）動物代謝試験（２－３－１）のデータ等を家畜代謝試験のデータの代替に することはできない。ただし、その結果を家畜代謝試験を設計する際に参考 とする場合又は家畜代謝試験で残留成分の特徴付けや同定が十分にできなか -1- った場合には、家畜代謝試験の補完として当該試験データを使用することが できる。 （２）実施した家畜代謝試験データを、家畜残留試験（３－２－１）に関するデ ータの一部として利用する場合は、実際に起こりえる飼料からの摂取量と同 程度の投与量を用いた試験（反すう動物の場合は個体、家きんの場合は投与 群）のデータが必要である。その際に食用の組織等中の残留濃度が定常状態 に達しないと考えられる場合は、投与期間を延長する必要がある。特に、乳 及び卵中の残留濃度が定常状態に達していない場合、当該試験データを家畜 残留試験（３－２－１）の一部として利用することについては十分な科学的 根拠が必要である。 ４．試験の実施が必要な条件 飼料作物等の作物残留試験（３－１－１）において、有効成分及び主要代謝 物が定量限界以上残留した場合に本試験の実施が必要である。定量限界は、原 則 と し て 0.01 ～ 0.05 mg/kg （ 牧 草 の 基 準 値 が 適 用 さ れ る 飼 料 作 物 等 の 場 合 は 、 水 分 含 量 を 10% に 換 算 し た 場 合 に 0.01 ～ 0.05 mg/kg と な る 濃 度 ） を 目 途 に 設 定 するものとする。 ５．試験方法 （１）被験物質 ① 被験物質 被 験 物 質 は 、原 則 は 農 薬 の 有 効 成 分 等（ 以 下「 親 化 合 物 」と い う 。）と し 、 親化合物と植物体中の代謝物等との混合物であってはならない。植物体中 の主たる代謝物が動物中での代謝物としても存在することが明らかな場合 は、原則として当該代謝物を投与する追加試験は必要ない。ただし、植物 体中の主たる代謝物が飼料作物等中の総残留の大部分を占める場合等にあ っては、当該代謝物を用いた家畜代謝試験を求める場合がある。 ② 標識位置 ア 残留する成分を追跡できるように、安定した位置を選定する。 イ 複数の環を持つ構造又は重要な側鎖が存在し、かつ、これらが開裂す る可能性がある場合は、それぞれの環又は側鎖を標識し、標識被験物 質ごとに試験を実施する。開裂しないことが予想される場合は、その 科学的根拠を示すことにより、該当する試験を省略してもよい。ただ し、開裂することが明らかになった場合は、開裂した部分を追跡する 試験を追加要求する場合がある。 -2- ③ 標識に使用する放射性同位元素 ア 標 識 に 使 用 す る 放 射 性 同 位 元 素 は 通 常 14C と す る 。 イ 分子内に炭素原子が存在しない場合や不安定な炭素側鎖しか存在しな い 場 合 は 、 32P 、 35S 等 も 利 用 可 能 で あ る 。 3H は 生 体 内 分 子 中 の 水 素 と の 置換が起こる可能性があることから原則として使用しない。不安定な側 3 鎖への標識あるいは H 標識体を用いた試験のデータはその残留放射性 物質が全て同定され、かつ、供試した農薬に由来することが確認されて いる場合にのみ使用することができる。 ウ な お 、質 量 分 析 法（ 以 下「 MS 」と い う 。）又 は 核 磁 気 共 鳴 法（ 以 下「 NMR 」 と い う 。）に よ る 代 謝 物 の 同 定 を 目 的 と し て 、安 定 同 位 体 13C 、15N 、2D（ 置 換 性 の な い も の に 限 る 。） を 併 用 し て も よ い 。 ④ 比放射能 投与する被験物質の比放射能は、食用の各組織等中の総残留量として 0.01 mg/kg の 定 量 が 可 能 と な る よ う 設 定 す る 。 （２）投与 ① 投与方法 被験物質が確実に投与されるよう、強制経口投与により行う。 ② 投与量 ア 家畜代謝試験に用いる投与量は、最大残留濃度の作物を飼料として与 え た 場 合 に 予 想 さ れ る 摂 取 量（ 以 下「 予 想 飼 料 最 大 負 荷 量 」と い う 。）と 同等のレベルとする。ただし、各組織における残留物の特徴付け、同定 の た め に 十 分 な 残 留 量 を 得 る た め 最 低 で も 供 与 飼 料 中 濃 度 と し て 10 mg/kg を 投 与 す る 。 イ 投与量の計算は全て飼料の乾物重ベースとする。予想飼料最大負荷量 の算出方法は家畜残留試験（３－２－１）にしたがう。 ウ 投与量が不十分で、残留物の特徴付け及び同定のために十分な放射性 物質濃度が得られなかった場合は追加試験を行う。追加試験では、比放 射能の増加、最適なと殺時間の設定、過剰投与等を検討し、十分な放射 性物質濃度を得られるよう試験設計をする必要がある。 ③ 投与日数 反すう動物及び非反すう動物は５日間以上、家きんは７日間以上、毎日 投与する。 （３）供試動物及び試料採取 ① 供試動物 -3- ア 供試する動物種は、反すう動物においては泌乳山羊、家きんにおいて は産卵鶏とする。 イ 供試個体数は標識被験物質ごとに以下のとおりである。ただし、科学 的に必要と考える時は、個体数を増やすこと。なお、非反すう動物を用 いる場合は、反すう動物の個体数に準じる。 （ア）泌乳山羊：１頭 （ イ ）産 卵 鶏 ： 10 羽（ 複 数 の 投 与 量 で 実 施 す る 際 に は 、各 投 与 群 あ た り 10 羽） ウ 対照群は必要ない。 エ 動物代謝試験と反すう動物又は家きんの家畜代謝試験で代謝が顕著に 異 な る 場 合 （ 例 え ば 、 以 下 の 場 合 ） は 、 非 反 す う 動 物 (豚 )の 代 謝 試 験 が 必要になる場合がある。 （ア）代謝経路が異なる場合 （イ）主要な残留物が異なる場合 （ウ）毒性学上の懸念が知られている基本構造を持つ代謝物が生じる場合 オ 順化期間は、投与開始時に、乳量及び産卵数が適切に維持されるよう に設定する。 カ 以下の理由により、組織等中の残留放射性物質濃度が低くなり、組織 等への分布が検出されない、又は親化合物と代謝物の相対的な量の比較 を困難にする可能性があるため、被験物質を供試動物に事前投与しては ならない。 （ア）代謝酵素が誘導される可能性がある。 （イ）事前投与された被験物質の残留により、動物体内における分布が変 化し、各組織等に存在する親化合物及び代謝物の比放射能が変わる可 能性がある。 ② 動物試料の採取 ア と殺時期の決定に当たっては次の事項に考慮する。また、と殺時期の 根拠となった情報を報告書に記載する。 （ ア ） 一 般 的 な と 殺 時 期 （ 例 え ば 最 終 投 与 後 １ 、 ３ 、 ６ 、 ９ 、 12 時 間 な ど）と動態学的情報 （ イ ） と 殺 時 期 は 、 原 則 最 終 投 与 の ６ ～ 12 時 間 後 と す る が 、 最 終 投 与 後 の 24 時 間 を 超 え て は な ら な い 。 ま た 、 親 化 合 物 の 寄 与 を 過 大 評 価 す る こ と を 避 け る た め 、 Tmax（ 投 与 後 、 被 験 物 質 等 の 濃 度 が Cmax （ 被 験 物 質 等 の 最 高 濃 度 ）に 達 す る ま で の 時 間 ）よ り 前 の と 殺 は さ け る こ と 。 （ウ）代謝物の同定及び特徴付けに十分な残留放射性物質濃度を確保する -4- こと。 （エ）と殺時点における残留放射性物質濃度が十分でないと予想される場 合は、動態学的情報から組織中最大濃度を推定し、と殺時期の妥当性 を検証する。なお、組織等への分布が速やかな場合には、組織中最大 濃 度 は Tmax 近 傍 で 生 じ る 。 Tmax は 、 供 試 動 物 の 血 液 試 料 を 分 析 す る こ とで得ることができる。また、多くの場合、経口投与における動態学 的挙動は、ラット、反すう動物、大部分の家きんにおいて類似してい ることが知られているため、実験動物における動態学的情報や全身オ ートラジオグラフィーの結果等を参考として用いてよい。 イ 排泄物、乳及び卵は、可能であれば毎日 2 回採取する。 ウ と殺時には少なくとも以下の組織を採取する。 （ ア ） 筋 肉 (反 す う 動 物 で は 腹 腰 部 及 び 脇 腹 の 筋 肉 、 家 き ん で は 脚 及 び 胸 の筋肉) （イ）肝臓（山羊及び家きんでは臓器全部、牛及び豚では肝臓の異なる葉 部の代表的部分） （ウ）腎臓（反すう動物のみ） （エ）脂肪（反すう動物及び豚では腎周囲脂肪、腸間膜大網膜脂肪及び皮 下脂肪、家きんでは内臓脂肪及び皮下脂肪） エ 採取した臓器について病理検査を行う。異常があった場合には記録し 報告書に記載する。 （４） 試料の分析 ① 残留放射性物質の同定及び特徴付け ア 家 畜 代 謝 試 験 で は 、食 用 の 組 織 等 中 に 存 在 す る TRR の 少 な く と も 90 % について、付録 1 に従い、同定及び特徴付けを行う。ただし、次のよう な理由で同定が困難な場合は、各残留成分の濃度を明らかにし、特徴付 けのみを行い、同定が困難な理由及び特徴付けの結果を報告書に記載す る。 （ア）個々の残留放射性物質の量が非常に少ない場合 （イ）残留放射性物質が生体成分に取り込まれている場合 （ウ）標識被験物質が容易に代謝され、非常に低濃度の多成分として存在 している場合 イ 代謝物の構造が他の登録農薬の有効成分又は代謝物と同じであると同 定された場合、当該成分について入手可能な情報を収集する。 ② 分析対象組織 ア 採取した全ての組織及び臓器等及び排泄物について残留放射性物質濃 -5- 度 を 定 量 す る 。 家 き ん の 場 合 、 1 羽 ご と の 試 料 の 分 析 が 困 難 で あ れ ば 10 羽分の試料を混合してもよい。乳についても分析が困難な場合は同一日 に採取した同一個体の乳は混合してもよい。乳は脂肪画分と水溶性画分 を分離し、それぞれの画分の残留放射性物質濃度を定量する。 イ 組織中残留物が微量であること等により特徴付けが十分に行えない等 の場合には、排泄物中の残留物の特徴付けや同定が必要な場合もある。 ウ 筋肉及び脂肪の残留放射性物質濃度は採取部位ごとに定量する。異な る 部 位 (例 え ば 、 腹 部 及 び 脇 腹 の 筋 肉 )で の 残 留 濃 度 が ほ ぼ 同 じ 場 合 は 、 代謝物を分析する前に同一組織の各部位の試料を混合してもよい。ただ し、その際には混合試料中の各部位の混合比を供試動物中の各部位の比 率と同等とすること。部位によって残留濃度が明らかに異なる場合は、 それぞれ部位ごとに残留放射性物質の特徴付け及び同定を行う。 ③ 分析方法 ア 分 析 に 供 さ れ る 試 料 は 、 均 質 化 し た の ち 、 放 射 能 測 定 を 実 施 し 、 TRR を算出する。また、投与した放射性物質すべての行方が解明されなけれ ばならない。 イ 想定される残留物の性質に応じ、極性その他の特性が異なる溶媒を組 み 合 わ せ た 一 連 の 溶 媒 系 （ 水 溶 性 の 溶 媒 を 含 む 。） を 用 い て 組 織 等 か ら 残 留 物 を 抽 出 す る 。得 ら れ た 抽 出 液 に 含 ま れ る 残 留 物 を 抽 出 性 残 留 物 、抽 出 残渣に含まれる残留物を非抽出性残留物と定義する。 ウ 抽出性残留物および非抽出性残留物は付録１にしたがって同定、特徴 付けを行う。 （５）試料の保存 ① 代 謝 試 験 の 試 料 は 原 則 -18 ℃ 以 下 で 保 存 す る 。 他 の 条 件 で 保 存 し た 場 合 は、当該条件を記録するとともにその妥当性を説明する。 ② 組織等の採取からの期間、分析用試料の調製及び保存期間における試料 中の残留物の安定性を確認しなければならない。 ③ 試験期間中に採取した組織等及び分析用試料（抽出物を含む）を適切な 条件下で保存し、採取後 6 ヶ月以内に分析された試料については保存安定 性に関するデータは原則必要ない。 ④ 試料採取後 6 ヶ月以内に分析を終了できなかった場合には、試料採取か ら当該試料を用いた最後の分析が終了するまでの保存安定性を証明しなけ ればならない。保存安定性の検証に使用する組織等は実際に試料として保 存されたものとする。例えば、組織等からの抽出物を試料として保存する 場合には、その抽出物中での安定性を確認する。 -6- ⑤ 他の知見から有効成分の安定性が疑われる場合は、採取後 6 カ月以内で あっても試験期間中における安定性を確認する。 ⑥ 家畜残留試験（３－２－１）等の分析法で用いられる抽出法が代謝試験 で用いられた抽出法と異なる場合には、ラジオバリデーションが必要とな ることがあるため、肝臓、乳とともに、特定の組織等に特定の代謝物が残 留している場合は、当該組織等を保存しておくこと。 ６．試験報告書に記載すべき事項 （１）概要・緒言 ① 試験の目的、試験設計及びその試験設計を採用した合理的理由 ② 当該試験の実施にあたって準拠したガイドラインや試験実施体制等に関 する情報、予期しなかった試験上の問題、それによる試験計画書からの逸 脱及び当該逸脱が試験結果へ及ぼした影響 ③ 結 果 の 概 要 （ 検 出 さ れ た 代 謝 物 及 び 想 定 代 謝 経 路 。（ 残 留 物 の す べ て の 構成成分（遊離体及び非抽出性画分）の同定及び定量に関する記述、当該 構 成 成 分 の 食 用 の 組 織 等 へ の 分 布 を 含 む 。）） ④ 結果の解析（分析した組織、乳及び卵中の残留物の性質に関する結論） ⑤ 試験上の問題点及び当該問題点を試験目的に照らした場合の妥当性の 評価 （２）材料及び方法 ① 被験物質 ア 被 験 物 質 の 化 学 名（ IUPAC 名 ）、一 般 名（ ISO 名 等 ）、企 業 の 開 発 名 、CAS 名及び番号、ロット番号、純度、構造式等（分析証明書を添付するこ と 。） イ 残留物を構成している親化合物及び代謝物の化学構造、それらの開発 名 又 は 実 験 名 （ 同 定 に お い て 使 用 し た 標 準 物 質 の 純 度 及 び NMR や MS の分析結果等の構造についての情報を記載している分析証明書があれ ば 添 付 す る こ と 。） ウ 投与製剤に関する情報（例えば、標識被験物質の投与時に使用した溶 媒 、 担 体 又 は 補 助 成 分 等 ）。 エ 標 識 被 験 物 質 の 化 学 的 純 度 、 放 射 化 学 的 純 度 、 比 放 射 能 （ MBq/mg）、 放射性同位元素の種類及びその由来。標識被験物質に含まれる放射性 同位元素で標識された不純物があれば、その化学構造に関する情報。 標 識 被 験 物 質 の 分 子 内 の 標 識 位 置 。 14C 以 外 の 放 射 性 同 位 元 素 の 選 択 し た場合、その妥当性及び分子内の標識位置の決定に関する根拠。 -7- オ 投 与 製 剤 の 比 放 射 能 （ MBq/mg）。 実 験 デ ー タ か ら 残 留 放 射 性 物 質 濃 度 （ mg/kg ） に 換 算 し た 計 算 例 。 組 織 及 び 臓 器 並 び に 各 種 ク ロ マ ト グ ラ ム の画分ごとの濃度を検証するために十分な情報。 カ その他標識被験物質に関連があると考えられるすべての追加情報（例 えば物理化学的性質等） ② 飼育条件及び供試動物の状態 ア 飼育環境（例えば、供試動物の収容条件）の詳細な情報 イ 供試動物の種、系統、年齢、体重、乳量及び産卵数並びに成長段階に 関する情報 ウ 試験中の供試動物の健康に関する情報。例えば、試験中の供試動物の 健康状態の所見、肝臓及び腎臓における変化又は所見（あらかじめ実 験動物の試験において報告されている場合） エ 報告された飼育条件が、試験計画書で定められた供試動物の取扱い方 法から逸脱した場合には、その説明及び採用した取扱い方法の根拠 ③ 投与 ア 標識被験物質を供試動物へ投与する際の媒体および投与方法 イ 投 与 量 （ mg/kg 体 重 ） と 予 想 飼 料 最 大 負 荷 量 （ mg/kg ） と の 関 係 ウ 1 日当たりの投与回数及び投与期間 エ 試験計画書で定めた投与量から逸脱した場合には、それに関する考察 又は根拠 ④ 組織及び臓器の採取 ア 泌乳山羊、産卵鶏及び豚以外の供試動物を選択した場合、その理由及 び妥当性に関する説明。反すう動物又は家きんのいずれかにおける代謝 試験が実施されなかった場合、その根拠又は説明。 イ 残留放射性物質を分析した組織及び臓器 ウ 食用の組織等及び排泄物の採取方法及び採取量 エ その他関連があると考えられるすべての追加情報 ⑤ と殺時期 ア 最終投与からと殺までの時間 イ と殺時期の根拠となる情報。なお、供試動物から直接得た情報又は実 験動物の動態学的情報を利用する場合には、当該情報の要約を記載する か、資料を添付する。 ⑥ 試 料 の 取 扱 及 び 保 存 安 定 性 （ 7． の （ 3） を 参 照 ） ア 採取した試料の取扱、搬出前の保存条件及び保存期間並びに搬出手順 イ 実験室での試料の保存条件及び期間 ウ 残留物の同定等までの分析用試料の保存条件及び期間 -8- ⑦ 残留放射性物質の分析に用いた分析法 ア 総残留の構成成分が遊離型、抱合型又は非抽出型かを決定するために 用いた分析法の性能 イ 採取した組織等中の残留物の分析法 ウ 酸化的燃焼分析又は液体シンチレーション分析法 エ 供試動物から検出した残留物の主要な構成成分の定量結果 オ 各試料における残留量測定のために使用した装置の詳細を含む分析条 件 カ 計 数 時 間 、 1 分 当 た り の 壊 変 率 （ dpm）、 検 出 し た 親 化 合 物 当 量 濃 度 、 感度、検出限界及び代表的な計算例 キ クエンチング補正を用いる放射能分析法の場合、クエンチング補正の 方法及びクエンチングを低減するために用いた方法。 ⑧ 残留放射性物質の抽出及び分画 ア 採 用 し た 抽 出 法 （ 分 画 法 を 含 む 。） と そ の 方 法 に 関 す る 考 察 及 び 根 拠 イ 非抽出性残留物の抽出又は抱合体から残留放射性物質を遊離させるた めに使用した加水分解条件及びそれらを利用した根拠 ウ 各抽出画分における遊離型又は抱合型の親化合物若しくは代謝物の比 率及び量 エ 溶媒抽出及び加水分解処理をした後に抽出残渣に残っている残留放射 性 物 質 量 の 推 定 値 （ TRR に 対 す る 割 合 （ %TRR ） 及 び 濃 度 （ 親 化 合 物 当 量 (mg/kg) ））。 オ 採取した組織及び臓器ごとの放射化学的抽出効率 カ 分画及び単離手順における放射性物質のロス及びロスを最小限に留め るために行った方策についての考察 キ 非抽出性残留放射性物質の大部分が生体成分へ組み込まれたか否か。 ク 各試料画分（水溶性、有機溶媒可溶性、加水分解による遊離等）にお け る 各 残 留 放 射 性 物 質 の 割 合（ %TRR ）及 び 濃 度（ 親 化 合 物 当 量 (mg/kg) ）。 ⑨ 残留放射性物質の特徴付け・同定 ア 特徴付け及び同定に用いた親化合物、すべての既知の代謝物及び想定 される中間体（これらの構造及び標準物質の純度）の詳細なリスト イ TLC ラ ジ オ オ ー ト グ ラ ム に お け る 分 析 対 象 物 質 及 び 標 準 物 質 の Rf 値 、 GC 及 び HPLC カ ラ ム に お け る 相 対 保 持 時 間 。 予 想 値 か ら の 逸 脱 又 は 差 異並びにこれらの問題を補正するために取られた措置についての考察 ウ 同 定 に 使 用 し た TLC 板 又 は オ ー ト ラ ジ オ グ ラ ム 等 の 画 像 及 び 質 量 ス ペ ク ト ル ス キ ャ ン な ど を 含 む HPLC/GC ク ロ マ ト グ ラ ム （ 分 析 用 標 準 物 -9- 質 の ク ロ マ ト グ ラ ム を 含 む 。） エ 代謝物を分離し特徴付け及び同定するために用いた補助的分析法（高 電圧電気泳動、イオン交換法、排除クロマトグラフィー、誘導体化等） 及 び 代 謝 物 の 最 終 的 な 同 定 を 行 う た め に 用 い た 機 器 分 析 法 （ MS 、 NMR 等）の詳細 オ 組織若しくは臓器又は分析した抽出画分から検出した放射性物質の割 合 （ %TRR ） 及 び 濃 度 （ 親 化 合 物 当 量 (mg/kg)） カ 非抽出性残留放射性物質を特徴付け又は同定するために用いられた方 法 キ 残留物の構成成分が次のいずれに該当するか報告しなければならな い。 （ア）遊離型残留物 遊離させるために化学的処理を必要とせず、有機溶媒によって通常抽 出可能なもの （イ）抱合型残留物 農薬由来成分とグルクロン酸、硫酸、アミノ酸、グルタチオン等の生 体由来成分との抱合体になっているもの。通常、酸、塩基又は酵素によ る加水分解によって抱合体を開裂させることにより、農薬由来成分が同 定される。 （ウ）非抽出性残留物 生体成分と共有結合している代謝物であって、極性又は非極性溶媒に よる抽出によって抽出できないもの。酸、塩基又は酵素による加水分解 によって抽出残渣から遊離できるものは、非抽出性残留物に分類する。 （エ）生体成分 農薬が分解され、同化サイクルの中に入り込み細胞成分の中へ組み込 まれた場合に当てはまる。当該生体成分が抽出されないものである場合 に は 、（ ウ ） の 非 抽 出 性 残 留 物 と 区 別 す る こ と は 困 難 で あ る 。 ク そ の 他 家 畜 の 代 謝 試 験 の 実 施 及 び TRR の 決 定 に 関 連 す る 追 加 情 報 （３）結果と考察 ① 試験計画 予期せぬ実験上の問題により試験計画書から逸脱した場合、当該逸脱に 関する考察。例えば、残留物の抽出、分画、特徴付けにおける問題が生じ た場合、非抽出性残留物に特殊な抽出法又は特徴付けを採用した場合の考 察。また、試験結果に対してこれらの逸脱が影響を及ぼした場合には、そ の考察。 - 10 - ② 代謝経路 可能であれば、供試動物中での代謝経路の詳細な考察及び代謝経路図。 動物代謝試験及び植物代謝試験の結果と本試験で得られた結果を比較考察 する。特徴付け・同定試験の結果に基づき、代謝物の化学構造及び名称 （ IUPAC 名 及 び CAS 名 、 CAS 番 号 を 含 む 。） の 表 を 添 付 し 代 謝 経 路 の 化 学 的意味付け（どのような化学反応によるか等）をしなければならない。推 定中間体及び推定代謝物も、その経路において明示しなければならない。 ③ 総残留の特徴付け、同定及び分布 ア 表又はグラフを用い、総残留のすべての主要な構成成分（遊離型、抱 合 型 及 び 非 抽 出 型 ） に つ い て 、 名 称 、 構 造 及 び 量 （ 割 合 %TRR 及 び 濃 度 （ 親 化 合 物 当 量 と し て (mg/kg））、 各 画 分 内 の 分 布 及 び 当 該 構 成 成 分 が 遊 離型、抱合型、非抽出性又は生体成分のいずれに該当するか。 イ 同定又は特徴付けができない主要な最終残留物の総量及び各画分への 分布に関する情報 ウ 統計学的処理（家畜の代謝試験における試料採取及び分析結果の生デ ー タ に 適 用 し た 統 計 学 的 検 定 の 代 表 例 を 含 め る こ と 。）。 ま た 、 放 射 性 物質の測定及びクロマトグラフィーにおける定量限界。 ④ 試験の妥当性を確保するためにとられた精度管理に関する措置及び事前 注意、その他家畜代謝試験に関する詳細な説明のために関連があると考え られるすべての追加情報 （４）結論 ① 供試動物において観察された代謝経路、メカニズム ② 採取された組織、卵及び乳における総残留量、構成成分及び分布 ③ 分析対象物質の抽出方法及び分析法。動物組織、臓器、乳、卵試料を用 いた当該分析法の妥当性検証結果。 ④ 家畜における動態及び代謝プロセスを完全かつ詳細に理解するための結 論 （５）添付資料 ７． ① 代表的クロマトグラム、スペクトル等（該当がある場合） ② 試験の実施にあたって参考とした試験報告書等のリスト 参考文献 （ １ ） OECD Guidelines for the testing of chemicals: Metabolism in Livestock (2007) - 11 - （ ２ ） OECD Guidelines for testing of chemicals: Residues in Livestock (2007) （ ３ ） OECD Guidance Document: Overview for Residue Chemistry Studies (2006) （ ４ ） OECD Guidance Document on the Definition of Residue (2006) （ ５ ） Commission of the European Communities (1997). Document 7030/VI/95-Rev.3 (22/7/1997) ; Appendix F: Metabolism and Distribution in Domestic Animals. （ ６ ) Food and Agriculture Organisation of the United Nations (2009) FAO Manual on the Submission and Evaluation of Pesticide Residues Data. （ ７ ） Food and Agriculture Organisation of the United Nations (2002) Submission and Evaluation of Pesticide Residues Data for the Estimation of Maximum Residue Levels in Food and Feed. Rome. （ ８ ）Food and Agriculture Organisation of the United Nations (1996). Guidelines on Pesticide Residue Trials to Provide Data for the Registration of Pesticides and the Establishment of Maximum Residue Limits, Section 2.1 Radiolabelled Studies (Metabolism Studies). Rome. - 12 - 付録１ 残留放射性物質の同定と特徴付け １．抽出性残留物の同定及び特徴付け （１）同定 ① 「同定」は残留放射性物質の構造決定をいう。同定は下記のいずれかの 方法で行う。 ア 構造既知の標準物質とのコクロマトグラフィーによる同定 イ MS 、 NMR な ど に よ る 構 造 決 定 に よ る 同 定 ウ コクロマトグラフィーの場合、例えば順相及び逆相のように独立した 二 種 の 系 を 用 い る こ と 。 逆 相 及 び 順 相 の TLC 又 は HPLC の 分 離 能 が 適 切 で あ る 場 合 は 、 MS 等 に よ る 追 加 の 確 認 は 要 求 し な い 。 ② 0.05 mg/kg 未 満 又 は TRR の 10 % 未 満 の 代 謝 物 に つ い て は 、 推 定 代 謝 物 を 標準物質として用いた一種のコクロマトグラフィーでの同定でもよい。 （２）特徴付け ① 「特徴付け」は同定の前段階で行われる残留放射性物質の特性の解明を いう。有機溶媒や水への易溶解性、中性、酸性、塩基性、極性、非極性、 非抽出性などがある。 ② 共通構造への変換又は特定試薬への反応性によって、分子内に存在する 部分構造を特定することも特徴付けに含まれる。 ③ 残留放射性物質の全てについて同定できない場合、同定されていない残 留放射性物質にどの程度の特徴付けが必要かは以下の要因により決まる ア 残留放射性物質の量 イ TRR に 対 す る 同 定 率 ウ 食品としての重要性 エ 毒性学上の懸念 オ 残留放射性物質を検出する分析法の能力 （３）その他 ① 非常に過剰な投与量で実施された代謝試験で、食用の組織等にほとんど 残留放射性物質が検出されなかった場合は、特徴付け、同定の必要性は低 い。 例えば、以下のような場合、最低限の特徴付け、同定で十分である。た だし、当該残留濃度において、毒性学上の特別な懸念がない場合に限る。 （ 例 ） 通 常 の 予 想 最 大 負 荷 量 が 飼 料 中 の 濃 度 と し て 0.01 mg/kg 以 下 で あ っ て 、 家 畜 代 謝 試 験 で 飼 料 中 濃 度 と し て 10 mg/kg 以 上 投 与 し 、 そ の 試 験 - 13 - の 結 果 、 食 用 の 組 織 等 中 の TRR が 0.1 mg/kg 以 下 で あ っ た 場 合 ② 代 謝 物 の 立 体 構 造 は 必 ず し も 決 定 す る 必 要 は な い 。た だ し 、毒 性 学 上 の 懸念がある場合は、立体異性体比を考慮しなければならない。 ③ 超 臨 界 流 体 抽 出 法 (SFE)、 マ イ ク ロ 波 抽 出 法 、 高 速 溶 媒 抽 出 法 (ASE)等 の新技術を利用可能な範囲で用いてできるだけ代謝経路を明らかにするこ と。 （４）代謝物の同定が必要な場合 ① 供試動物の各食用の組織等について特徴付け又は同定が必要となる残留 放射性物質濃度の閾値は表１のとおりである。 なお、濃度に基づく閾値は絶対的なものではなく、どの程度の同定又は 特徴付けで十分かを判断するための目安である。また、より低濃度で毒性 学上の懸念がある場合は同定や特徴付けが必要となる。 ② １つの代謝物が複数の抽出画分に存在する可能性があることに留意す る。 ③ 特定の残留放射性物質が多数の抽出画分に分かれる場合、各画分をクロ マトグラフィーにより分析し、各画分に含まれる当該物質の量を合計し、 同定あるいは特徴づけが必要か否かを判断する。 表１. 残留放射性物質の同定及び特徴付けの基準 %TRR 濃度(mg/kg) 必要となる特徴付け及び同定 <10 <0.01 同定等の必要なし。ただし、毒性学上の懸念がある 場合を除く。 <10 0.01 - 0.05 特徴付けを行う。標準物質が入手可能な場合、すで に実施された試験で同定がなされている場合など、 簡易にできる場合のみ、同一性の確認を行う。 <10 >0.05 TRR に 対 す る 同 定 率 を 考 慮 し つ つ 、 特 徴 付 け ・ 同 定を行うか否かを個別に決定する。 >10 <0.01 特徴付けを行う。簡易にできる場合のみ、同一性の 確認を行う。 - 14 - >10 0.01 - 0.05 代謝経路を特定するために必要な場合には、同定を 試みる。少なくとも特徴付けは必要。 >10 >0.05 技術的に可能な限り同定する。 >10 >0.05 「 2 非抽出性残留物の遊離」及び 図 1 にしたがっ 非抽出性放射性物質 て残留放射性物質の遊離、特徴付け等が必要。 ２． 非抽出性残留物の遊離 （１）残留放射性物質が家畜体内で非抽出性として検出されるのは以下の状況が 考えられる。 ① 生 体 内 分 子（ ア ミ ノ 酸 、 糖 等 ）へ 組 み 込 ま れ た 場 合 。こ れ は 、標 識 被 験 物質が生体成分の生合成に利用できるほど小さい炭素単位（1 個か 2 個） に分解された場合に起こる。 ② 生 体 内 分 子 の 特 定 の 部 分 と 強 固 に 結 合 し 、残 留 物 を 形 成 し て い る 場 合 。 これは化学反応（例えば、酸、塩基及び酵素による加水分解）によって遊 離させることができる。 ③ 組 織 へ の 物 理 的 な 抱 合 や 取 り 込 み が 起 こ っ て い る 場 合 。こ の 状 況 で 残 留 物を遊離させるためには組織の可溶化が必要となる。通常は強塩基を用い た還流処理によるが、界面活性剤の使用により、より穏やかな条件で残留 物を遊離させることも可能である。 （ ２ ） 非 抽 出 性 残 留 物 の 遊 離 の 一 般 的 手 順 を 以 下 に 示 す （ 図 １ を 参 照 ）。 ① 抽 出 後 、 残 渣 中 の 残 留 放 射 性 物 質 濃 度 が 0.05 mg/kg 又 は TRR の 10 % 以 上 の 場 合 に は 、 残 留 放 射 性 物 質 の 遊 離 を 試 み る （ 表 1 を 参 照 )。 遊 離 処 理 後 、 残 渣 中 の 非 抽 出 性 放 射 性 物 質 濃 度 が 0.05 mg/kg 未 満 か TRR の 10 % 未 満であった場合は、これ以上、遊離を行う必要はない。 ② 遊離した残留放射性物質を定量し、表 1 の基準を適用して同定及び特徴 付けを行う。特徴付けは、遊離した残留放射性物質のクロマトグラフィー での挙動と、親化合物及びその類似構造を持つ想定代謝物の標準品のクロ マトグラフィーの挙動を比較する。 ③ 一 連 の 遊 離 処 理 は 、連 続 的 に 行 う か 、あ る い は サ ブ サ ン プ ル ご と に 行 う 。 遊 離 処 理 に は 以 下 の も の が 含 ま れ る （ 図 1 参 照 ）。 穏 や か な 処 理 ほ ど 代 謝 物の構造は維持される。 ア 37 ℃ で の 弱 酸 又 は 弱 塩 基 に よ る 処 理 イ 界面活性剤での処理 - 15 - ウ 酵素処理 エ 6N の 酸 又 は 10N の 塩 基 を 用 い た 還 流 図１ 非抽出性残留物の特徴付け及び同定 非抽出性残留物 0.05 mg/kg 未 満 又 は TRR の 10 % 未 満 0.05 mg/kg 又 は TRR さらなる特徴付け の 10 % 未 満 に な る ま 不要（毒性学上の で同定又は特徴付け 懸念がある場合を 除く） 6N 酸 又 は 超音波処理 10N の 塩 基 を 界面活性剤又 弱酸又は弱塩 は超音波処理 基による処理 用いた還流 （室温） 酵素処理 最終加水分解 放射性同位元素 物理的に結合 代謝物及び抱 生成物 を含む糖、アミ した代謝物 合体 ノ酸等及びそれ らを含む抱合体 （３）非抽出性残留物が総残留量の大部分を構成すると考えられる場合には、残 留物が生体成分であるかどうかを確認することが望ましい。放射性同位元素 がアミノ酸、糖、フェノール化合物、ヌクレオチド等の内因性化合物に組み 込まれていることが判明した場合、さらなる特徴付け及び同定の必要性は低 い。一般に生体成分の生合成に利用できるほど農薬が小さな炭素単位に分解 されていることを意味する。このような場合、非抽出性残留物が表 1 の基準 を超えていても、同定及び特徴付けが必要ない場合がある。 14 た だ し 、 3H 標 識 や 分 子 中 の 不 安 定 な 位 置 を C 等 で 標 識 し た 場 合 又 は TRR の 相 当 な 部 分 (0.05 mg/kg 以 上 又 は 総 残 留 量 の 10 % 以 上 )を 占 め る 単 一 の 遊 離代謝物が同定されていない場合にはこの限りではない。 - 16 -
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