1分子蛍光イメージングに最適なカメラとは

このページは浜松ホトニクス株式会社によるＰＲ記事です。１分子蛍光イメージングに最適なカメラとは
伊東克秀（浜松ホトニクス株式会社システム事業部）
１．はじめに
先日ある会議に参加した時に EM-CCD、sCMOS から
３．カメラによる１分子観察のおさらい
（１）１分子の画像例
II+EB-CCD まで、さまざまなカメラでの１分子観察の発表が
蛍光サンプルは「EGFP」をガラススライドに固定したもの
あった。１分子は観察できる総光子数に限りがあるため「単位
を使用した（図１）
。１分子はある一定の輝度で光りその後に退
時間の光子数」と「観察時間」とがトレードオフにある。観察
色する。１分子であり多分子でないことは退色の回数と輝度か
時間が短くても良ければ励起光強度を上げることで大抵のカメ
ら判別した（図２）
。
ラで観察できることは容易に想像できる。しかし観察時間を長
TIRF 照明
くしたい場合に、１分子および背景光の光子数や退色時間など、
励起光：45.0 W/cm2
最適なカメラを選択するのに必要となる具体的データや知見が
対物：油浸 100x NA1.5
カメラ：ORCA-Flash4.0
無い。
露光時間：33ms
本稿では「１分子蛍光イメージングに最適なカメラとは？」
スケール：1μm
という観点でカメラメーカーの技術者である筆者が実際に実験
を行いそこで得た知見を筆者の視線で書かせてもらうことにし
図１．EGFP の１分子の画像例（60x60 画素）
た。
紙面、
期限の関係から詳細についてはかなり省かせて戴く。
これらの実験は大阪大学産業科学研究所永井研究室の全反射
画像取得開始後、約 0.5 秒
蛍光顕微鏡をお借りし、新井由之先生のご協力を戴いたのでこ
後から励起光を照射。
こで感謝の意を表したい。尚、この内容は 2013 年 8 月の「少
数性生物学のトレーニングコース」の実習内容の一部ともなっ
ている。
２．実験装置（画素サイズとレンズ倍率）
図２．１分子の退色例（励起光：45.0 W/cm2）
実験は科学計測用 CMOS カメラ Flash4.0、
EM-CCD カメラ
ImagEM、II+Flash4.0 の 3 種類の代表的なカメラで行った。
（２）１分子の光子数と時間的変化
１分子観察の中でも最も良く行われる輝点のトラッキングにお
１分子観察において異なる励起光強度に対するカメラへの入
いては、フィッティングを用いて光学限界以下の位置精度での
射光子数を測定した（表２）
。励起光強度 45.0 W/cm2 の時に１
検出が行われることが多い。この実験においてもフィッティン
分子の光子数は約 330 フォトン/33ms となる。これらの光子が
グを考慮して、あえて１分子が数画素に広がるように、そして
直径 4～5 画素の円状に分布するため、最も光子数の多い画素
各カメラの対物上での画素サイズが揃うようにリレーレンズを
においても約 27 フォトン/33ms と暗い。この時の背景光は１
選択した（表１）
。
画素あたり約 3 フォトン/33ms から時間的に徐々に減っていく。
表２．励起光強度と１分子の光子数
表１．カメラとレンズ倍率
（３）１分子の退色時間
個々の１分子により退色時間がそれぞれ違うこともおさらい
しておく必要がある。数百個の分子に対する退色時間の平均、
すなわち平均退色時間を、異なる励起光強度に対して測定した
（図３）
。励起光が強ければ平均退色時間は速くなる。
ＰＲ記事精度、扱い易さ、コスト等の指標を含めて総合的に判断すべき
である。
今回の実験から観察時間を長くするという指標のみに着目し
た場合には II+Flash4.0 が良いことが判った。
観察時間を短くしたい例としては、超解像顕微鏡の PALM、
STORM がある。これらは強い励起光を使いフィッティングも
行うが、その場合は EXCESS ノイズの無い Flash4.0 が
EM-CCD よりも良いと言われている（文献：リンク）
。また別
図３．励起光強度による平均退色時間の例
の例としては、１分子方式の DNA シーケンサがあるが、この
方式ではフィッティングを行わず１画素以内に１分子を結像さ
４．カメラによる S/N 測定実験
せるため、こちらも Flash4.0 が適していると考えられる。
１分子がどのくらい認識できるかという指標をS/N で定義し
て各カメラの比較を行った（図４）
。S/N は数ピクセルに広がっ
６．新製品の紹介
た１分子の輝度分布の輝度積分値から、近傍の背景光部分の同
（１）科学計測用 CMOS カメラ ORCA-Flash4.0 V2
じ面積の輝度積分値を除き、背景光部分の標準偏差で割った値
科学計測用 CMOS カメラ ORCA-Flash4.0 において V2 モ
とした。148.3 W/cm2 では退色がわずか数フレームであり１分
デルが発売された。
V2 モデルの特徴はスロースキャンモードの
子か多分子かの判別が困難なためデータから除外した。１分子
搭載による更なる低ノイズ（0.9 electrons）が実現されたこと
トラッキングではその退色時間および画像の見え方から、45.0
である。扱い易さやコストも含めほとんどの蛍光イメージング
W/cm2 前後での励起光での観察が行われていると予想される。
に最適なカメラと考えている。
ImagEM には 1 分子観察に適したフォトンイメージングモー
（２）EM-CCD カメラ ImagEM X2
ドという機能もあるが今回は使用していない。
EM-CCD カメラ ImagEM シリーズにおいても X2 モデルが発
今回の結果から、II+Flash4.0 が他のカメラに比べ励起光が
売された。X2 の特徴は従来の 2 倍の 70 Hz の高フレームレー
弱い場合でも S/N の良いこと、すなわち観察時間をより長くで
トと更なる CIC ノイズの低減にある。ORCA-Flash4.0 で感度
きることが判った。しかし、この結果はあくまでも観察時間を
が足りない場合にはこちらがお勧めとなる。
長くできるという指標に対するものだけであり、カメラの選択
にはそれ以外に位置精度、扱い易さ、コストなどの指標も必要
になる。
ORCA-Flash4.0 V2
ImagEM X2
図５．新製品の紹介
（３）エジュケーションサイト
超解像顕微鏡やライトシート顕微鏡などのアプリケーション
に関するテクニックや文献等をまとめたエジュケーションサイ
図４．各カメラにおける励起光強度と S/N
ト（英語）を新たに開設したのでぜひご覧いただきたい。
５．まとめ
「１分子蛍光イメージングに最適なカメラとは？」という質
問に対しては、
「何を測定したかによって変わる。
」という答え
になる。さらに観察時間の長さ、フィティングを行うか、位置
浜松ホトニクス株式会社システム営業推進部
TEL : 053-431-0150 E-Mail: [email protected]

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