JP 2006-1936 A 2006.1.5 (57)【要約】【課題】有用な乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を提供する。【解決手段】本発明は、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こし得、細胞外に多重構造またはＶＬＰを形成し得る組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に関し、この多重構造は複数の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質から成っている。本発明はまた、乳頭腫ウイルスの存在を検知するための組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の使用を含み、予防的および治療的利用のためのワクチンの基礎をなし得る。【選択図】なし (2) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【特許請求の範囲】【請求項１】１以上の細菌発現された組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含む多重構造を調製する方法であって、下記の工程：（ｉ）組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を細菌細胞において発現させること、（ｉｉ）該細菌細胞から該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を変性条件で得ること、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を精製すること、および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で精製された１以上の該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質か 10 ら該多重構造を形成せしめること、を含む方法。【請求項２】工程（ｉｖ）における該多重構造の形成が塩の不存在で起きる、請求項１の方法。【請求項３】組換えＤＮＡ分子が配列番号２の５’ヌクレオチド配列を含む、請求項１の方法。【請求項４】組換えＤＮＡ分子が配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１の方法。【請求項５】組換えＤＮＡ分子が、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列と標準的条件でハ 20 イブリドし得るヌクレオチド配列を含む、請求項１の方法。【請求項６】組換えＤＮＡ分子を、乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の発現に関して正しい読み取り枠内でｐＴｒｃＨｉｓＢに挿入する、請求項１の方法。【請求項７】乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞中で発現せしめる、請求項１の方法。【請求項８】多重構造をワクチンに組み込む工程をさらに含む、請求項１の方法。【請求項９】 30 該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が融合タンパク質である、請求項２の方法。【請求項１０】複数の乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含む５量体構造であって、１以上の該乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が、ニッケルに結合し得るＮ末端アミノ酸配列を含む組換え融合タンパク質であり、そして細菌から変性条件で取得される、５量体構造。【請求項１１】各々の該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が、ニッケルに結合し得るＮ末端アミノ酸配列を含む組換え融合タンパク質であり、そして細菌から変性条件で取得される、請求項１０の５量体構造。【請求項１２】 40 全または各々の該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が、 (Ｈ is)６を含むＮ末端アミノ酸配列を有する、請求項１０または１１の５量体構造。【請求項１３】全または各々の該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が、配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１０または１１の５量体構造。【請求項１４】乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を誘発し得る、請求項１０または１１の５量体構造。【請求項１５】請求項１０の５量体構造を含む治療的または予防的ワクチン。 50 (3) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【請求項１６】さらにアジュバントを含む、請求項１５の治療的または予防的ワクチン。【発明の詳細な説明】【技術分野】【０００１】発明の分野本発明は、Ｌ１タンパク質乳頭腫ウイルスに関する。特に、本発明は、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質、および乳頭腫ウイルス感染を検知し、処置するためのその使用に関する。【背景技術】 10 【０００２】発明の背景乳頭腫ウイルスは、ヒト、ウシ、ヒツジ、イヌおよびネコを含む一連の宿主に感染する。より完全なリストとしては、 K. Syrjanen, L. Grissman および L. G. Koss 編集の乳頭腫ウイルスおよびヒトの疾患（ Springer Verlag, 1987 年発行）に掲載されている J. P. Sundberg による ” Papilloma Virus Infections in Animals"を参照。【０００３】ヒト乳頭腫ウイルスは、皮膚および粘膜の上皮の悪性過増殖病変をもたらす。ヒトに感染する７０の相違するウイルスタイプのうち、２０以上が肛門性器間の病変に関連している (de Villiers, 1989, J. Virol. 63, 4898-4903)。乳頭腫ウイルスはまた、種々の型の 20 癌に関連している。ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６および１８は、多くの頚部上皮内新生物および頚部癌に関連している ( Lancaster et al., 1987, Cancer Metast. Rev. 6, 665 3-6664 and Pfister, 1987, Adv. Cancer Res. 48, 113-147 )。【０００４】乳頭腫ウイルスは、８初期および２後期遺伝子までをコードする小さいＤＮＡウイルスである。後期遺伝子Ｌ１およびＬ２は、細胞内でカプシド中に集まる構造タンパク質をコードする (Galloway et al., 1989, Adv. Cancer Res.37, 125-171)。単一のウイルスカプシドは、３６０の５量体化のカプソメアからなるＴ＝７ｄの正二十面体であり、カプソメアの各々は主カプシドタンパク質Ｌ１の５分子を含有する（ Baker et al., 1991, Biophy s. J. 60, 1445-1456 and Finch et al., 1965, J. Mol. Bio. 13, 1-12)。小カプシドタ 30 ンパク質Ｌ２は、豊富なＬ１の約１０分の１存在する (Doorbar et al., 1987, J. Virol. 61, 2793-2799)。【０００５】ヒト乳頭腫ウイルスの in vitroでの繁殖は達成されておらず（ Taichman et., 1984, J. Invest. Dermatol. 83, 25) そして、ただ少量のＨＰＶタンパク質が感染組織から分離されている（ Androphy et al., 1987, Embo J. 6, 1989; Banks et al., 1987, J. Gen. Virol. 68, 1351; Firzlaff et al., 1988, Virology 164 467; Oltersdorf et al., 198 7, J. Gen. Virol. 68, 2933; Schneider-Gadicke et al., 1988, Cancer Res. 48, 2969 ; S e e d o r f e t a l . , E m b o J . 6 , 1 3 9 a n d S m o t k i n e t a l . , 1 9 8 6 , P N A S 8 3 , 4 6 8 0 )。しかし、Ｌ１タンパク質をコードする遺伝子は、組換えワクシニアウイルスを用いる真核発現 40 系において (Browne et al., 1988, J. Gen. Virol. 69, 1263-1273; Zhou et al., 1990, J . G e n . V i r o l . 7 1 , 2 1 8 5 - 2 1 9 0 a n d Z h o u e t a l . , 1 9 9 1 , V i r o l o g y 1 8 5 , 2 5 1 - 2 5 7 )、バキュロウイルス発現系において（ Park et al., 1993, J. Virol. Meth. 45, 303-318)および細菌発現系において（ Strike et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 543-555) クローン化され、発現されている。【０００６】Ｌ１タンパク質は主カプシドタンパク質であるので、乳頭腫ウイルス感染に対する保護ワクチンの開発のための基礎として用いられてきた。Ｚｈｏｕらは、ＨＰＶ１６のＬ１およびＬ２タンパク質についてのワクシニアウイルス二重組換え体を用いて、合成ＨＰＶ１６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）でマウスを免疫にした。ネズミ抗ＶＬＰ抗血清は、ＥＬＩＳ 50 (4) JP 2006-1936 A 2006.1.5 ＡによってＨＰＶ１６カプシドを、および免疫ブロット法でのバキュロウイルス組換えＨＰＶ１６Ｌ１およびＬ２タンパク質を認識した。しかし、ネズミ抗ＶＬＰ抗血清は、組換えＬ１融合タンパク質に対する抗ＨＰＶ１６Ｌ１モノクローナル抗体によって認識される２ペプタイドを認識しなかった (Zhou et al., 1992, Virology 189, 592-599)。ウイルス様粒子を用いて定義づけされたＨＰＶ１６の免疫活性エピトープは、組換えＨＰＶ１６Ｌ１融合タンパク質を用いて定義づけされたものとは顕著に異なっていることを、これらの研究者は結論している。【０００７】これらの問題を克服するために、ウイルス様粒子を用いてワクチンが開発された。組換えワクシニアウイルスによりコードされた組換えＬ１またはＬ１およびＬ２タンパク質か 10 ら細胞内でＶＬＰが形成される (Zhou et al., 1991,Virology 185, 251-257; Zhou et al ., 1991, Virology 181, 203-210 and International Patent Specification WO93/02184 )。合成ウイルス様粒子を用いるこれらのワクチンは、多くの欠点を有している。最初に、組換えＬ１またはＬ１およびＬ２遺伝子は、ワクチンの生産に適当でないワクシニアウイルスのベクターから発現される。第二に、ウイルス様粒子が細胞内で生産されるが、これは速度制限ステップである。第三に、ウイルス様粒子は細胞ＤＮＡと、共に細胞内で生産されることから、合体し、そしてＤＮＡ合体ウイルス様粒子はワクチンの使用のために適切でない。第四に、ウイルス様粒子は、その統合性および適切なエピトープ提示を保持する必要性から、部分的にのみ精製され得る。従って、ウイルス様粒子と結合しているタンパク質等はワクチンの製造を汚染する。第五に、組換えワクシニアウイルスからウイル 20 ス様粒子でもって商業規模でワクチンを製造する方法は、比較的高価につく。【０００８】同様の欠点が、患者の血清中の抗体の検出のため組換えワクシニアウイルスからつくられたウイルス様粒子の使用についてある。【発明の詳細な説明】【０００９】発明の概要本発明は、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が多重構造を細胞外に形成し、もとの乳頭腫ウイルスカプシドを認識する免疫応答を起こすとの驚くべき発見から得られたものである。 30 【００１０】本発明のひとつの目的は、免疫原性多重構造を形成できる組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を提供することにある。【００１１】ひとつの観点では、本発明は、 (Ｈ is)６を含むＮ末端アミノ酸配列を有する組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を提供する。 (Ｈ is)６は６個の連結したヒスチジン残基を意味する。【００１２】組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、下記のＮ末端アミノ酸配列を持ち得る。配列番号１： 40 【表１】【００１３】組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質はいかなる乳頭腫ウイルスからも誘導され得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の全体のまたは部分的アミノ酸配列で有り得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、乳頭腫ウイル 50 (5) JP 2006-1936 A 2006.1.5 スＶＬＰを認識する免疫応答をおこす１またはそれ以上のエピトープをコードするアミノ酸配列で有り得る。例示として、ＨＰＶ６ｂから誘導された組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質および組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は図１に示す。【００１４】組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質によりおこされる免疫応答は、抗体応答または細胞媒介応答を伴う抗体応答である。起きた応答は、組換えおよび／またはもとの乳頭腫ウイルスＶＬＰＬ１タンパク質を認識し得る。抗体応答は、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に対して抗体が生じ、そしてこれらの抗体が乳頭腫ウイルスＶＬＰＬ１タンパク質を認識するところにある。細胞媒介および液性の応答は、Ｔ細胞、大顆粒リンパ球、単核食細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、種々の組織細胞、血小板、補体、炎 10 症媒介体およびインタフェロン、インタロイキン、コロニ促進因子、癌壊死因子、形質転換成長因子を含むサイトカインを含み得る。細胞媒介および液性応答は、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質で生じ、そして成された結果である。適当な細胞媒介および液性応答の例は、遅延型過敏症である。【００１５】第二の点において、本発明は複数の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含む多重構造である；各組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は (Ｈ is)６を含むＮ末端アミノ酸配列を有する。１個またはそれ以上の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は上記のようなＮ末端アミノ酸配列を有し得る。【００１６】 20 多重構造はいかなる大きさでもよいが、望ましくは５量体構造である。多重構造はＶＬＰであり得る。用語ＶＬＰは乳頭腫ウイルス粒子および組換えＶＬＰを含む。多重構造は、望ましくは組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が実質的に精製された後に形成される。多重構造は適当な緩衝液中で細胞外で自己集合し得る。さらに、多重構造は乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を誘発できる。【００１７】本発明の第三の点は、第一点による組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子である。組換えＤＮＡ分子は、乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こすエピトープを含む該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の部分をコードし得る。他方、組換えＤＮＡ分子は、該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質または該組換え 30 乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の該部分をコードする同義的ＤＮＡ配列であり得る。組換えＤＮＡ分子は、該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質または該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の該部分をコードする配列と標準的な条件でハイブリダイズし得る配列をコードし得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子は、トリヌクレオチド配列ＣＡＴの６回反復を含む５ 'ヌクレオチド配列を有し得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子は、好ましくは、配列番号２：【表２】 40 を含む５ 'ヌクレオチド配列を有し得る。適当な組換えＤＮＡ分子を図１に示す。【００１８】本発明の第四点は、複数の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含む多重構造を製造する方法であり、該多重構造は乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を誘発し得、次のステップを含む。（１）組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を 50 (6) JP 2006-1936 A 2006.1.5 細菌から発現せしめる；（２）組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を実質的に精製する；および（３）細胞外に該多重構造を形成する。本方法は、 (Ｈ is)６を含むＮ末端アミノ酸配列を有する組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含む多重構造に使用し得る。Ｎ末端アミノ酸配列は、配列番号１：【表３】 10 を含み得る。【００１９】組換えＤＮＡ分子は、標準的クローニングおよび／またはＰＣＲ技法を用いてヒト乳頭腫ウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスなどの乳頭腫ウイルスＤＮＡの適当な供給源から構築され得る。組換えＤＮＡ分子は、発現ベクターをも含む。発現ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミドまたはウイルスであり得る。適切な発現ベクターは、（次の順序で）ＡＴＧ部位、 (Ｈ is)６ − ペプチドおよびクローニング部位をコードする。そこでは、乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質ＤＮＡ配列が正しい読み取り枠に挿入され、翻訳の結果、 (Ｈ is)６ − Ｌ１タンパク質の融合タンパク質が得られる。望ましい発現ベクターは、プラスミドｐＴｒｃＨｉｓＡ、ｐＴｒｃＨｉｓＢおよびｐＴｒｃＨｉｓＣのいずれかである 20 。好ましい宿主はエシェリキア・コリ (Ｅ． coli)である。【００２０】好ましい発現系は、エシェリキア・コリおよびプラスミドｐＴｒｃＨｉｓＢの細菌発現系である。組換えＤＮＡ分子の適当な宿主への挿入は、トランスフェクションおよび形質転換を含む適切な技術で達成される。望ましい組換えＤＮＡ分子は、ｐＴｒｃ６ｂＬ１を形成するために、正しい読み取り枠の方向において、ｐＴｒｃＨｉｓＢに挿入されたＨＰＶ６ｂＬ１タンパク質の完全なＤＮＡ配列である。組換えＤＮＡ分子ｐＴｒｃ６ｂＬ１は、好ましくはエシェリキア・コリ株ＤＨ５中に形質転換される。【００２１】発現後、発現系は破壊され得る。発現系が細胞系であるときは、グアニジニウム塩酸塩 30 を含む緩衝液中での音波処理などの適当な技術および試薬で細胞が溶解され得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、部分的にまたは完全に精製され得る。精製は、１またはそれ以上の適当なクロマトグラフィー技法を用いて達成され得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質はニッケルカラムのアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製され得る。追加の精製ステップに予備的ゲル電気泳動がある。【００２２】第五点として、本発明は、乳頭腫ウイルスの存在を検知する方法を提供する。本方法は、乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に対する抗体を用いてサンプル中の乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の存在を検知し得る。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは他のイムノアッセイ法が用いられる。本方法は次のステップを含み得る。 40 （１）乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含有している可能性のあるサンプルでマイクロタイタープレートのウエルをコートする。（２）組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に対する抗血清を加えて、乳頭種ウイルスＬ１タンパク質 -抗体複合体を形成せしめる。（３）検出試薬で乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質 -抗体複合体の存在を検知する。【００２３】ステップ（１）に関し、サンプルの添加に先立って、マイクロタイターのウエルを最初に組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に対する抗血清でコートできる。検出試薬は、適当な標識と結合した抗体および他の適当なリガンドであり得る。適当な標識には、ホース 50 (7) JP 2006-1936 A 2006.1.5 ラディッシュペルオキシダーゼなどの適当な酵素標識、放射活性アイソトープまたは蛍光分子がある。【００２４】第六点として、本方法は、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を用いて、サンプル中の乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に特異な抗体の存在を検知するための方法を提供する。【００２５】本方法でＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは他のイムノアッセイ法が用いられる。この方法は次のステップを含み得る。（１）乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質でマイクロタイタープレートのウエルをコートする。 10 （２）乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に特異な抗体を含有している可能性のあるサンプルを加え、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質−抗体複合体を形成せしめる。（３）検出試薬で組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質−抗体複合体の存在を検知する。【００２６】第七点として、サンプル中の乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の存在を検知するためのキットを提供し、そして該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に対する抗体を含む。【００２７】第八点として、本発明は、サンプル中の乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に特異な抗体の 20 存在を検知するためのキットを提供し、そして該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含む。【００２８】第九点として、本発明は、該組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を含有する予防的または治療的ワクチンを提供する。このワクチンは、ＩＳＣＯＭＳ、アラム、フロインド不完全アジュバント、フロインド完全アジュバント、クイルＡ、他のサポニン類、水酸化アルミニウムアルガムリンおよび百日咳原などの適当なアジュバントを含み得る。他方、組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質がアジュバントなしで免疫原性であるときは、ワクチンはアジュバントを含み得ない。【００２９】 30 図面の簡単な説明図１は、ＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号３）およびＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図２は、ＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質凝集体の５量体構造の電子顕微鏡写真である。本発明の種々の望ましい具体例について述べる。これらの具体例において、特殊な乳頭腫ウイルス、ワクチンおよび組換えＤＮＡ分子の構築は例示としてのみ言及されていることに注意すべきである。【００３０】 40 実験的実施例１： HPV6b L1 HEXAHISタンパク質の製造 pTRC6bL1の構築 HPV6bのＬ１開放読み取り枠を、プライマーとして： GCGGATCCAGATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATG および CGCCCGGGTTACCTTTTAGTTTTGGCCTCGCTTACGTTTTAGG を使用したポリメラーゼ連鎖反応により臨床的単離体からクローン化した。【００３１】得られた１ .５ kb ＰＣＲ生産物をＢ amＨ１およびＳ ma１で開裂し、プラスミド pTRCHIS 50 (8) JP 2006-1936 A 2006.1.5 B(Ｉ nvitrogen)内に製造したＢ amＨ１／クレノウ平滑末端Ｅ co Ｒ１部位にクローン化した。得られたＬ１組換えプラスミドは pTRC6bL1であり、タンパク質配列： Met.Arg.Gly.Ser.His.His.His.His.His.His.Gly.Met.Ala.Ser.Met.Thr.Gly.Gly.Gln.Gln. Met.Gly.Arg.Asp.Leu.Tyr.Asp.Asp.Asp.Lys.Asp.(HPV6b L1 aas 1-520)をコードする。【００３２】 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質をコードする細菌の成育アンピシリン (最終濃度１００ μ g／ ml)含有２ＹＴブロス (トリプトン１６ mg、酵母１０ mg、ＮａＣｌ５ mg)１０ mlに、グリセロール・ストックからの白金耳一杯 (loopful)の細菌 (エシェリキア・コリＤＨ５ )１０ μ lを接種した。培養物を、１２０ rpmで酸素供給しながら３７℃で６時間インキュベートした。 10 【００３３】アンピシリン (最終濃度１００ μ g／ ml)含有２ＹＴブロス２００ mlに６時間１０ ml培養物を接種した。培養物を、１２０ rpmで酸素供給しながら３７ ℃ で一晩インキュベートした。【００３４】アンピシリン (最終濃度１００ μ g／ ml)含有２ＹＴブロス８００ mlに一晩２００ ml培養物を接種した。培養物を、１２０ rpmで酸素供給しながら３７ ℃ で吸光度が６００ nmで０ . ６ − ０ .８Ｏ .Ｄ .単位に到達するまで (通常２ − ３時間 )インキュベートした。 HPV6b L1 HE XAHISタンパク質は、４ − ６時間０ .５ mＭＩＰＴＧを添加することにより誘導した。【００３５】 20 細菌を遠心 (Beckman JA14ローター、２０ ℃ で５０００ rpm、１０分遠心 )によりペレット化した。ペレットを、細菌ペレットを５０ ml遠心管中で再懸濁することにより、リン酸緩衝化食塩水５０ mlで洗浄した。洗浄細菌を、遠心 (Beckman TJ-6、２０ ℃ で３０００ rpm 、１０分遠心 )により再ペレット化した。上清を廃棄した。ペレットを必要になるまで − ２０℃または−７０℃で貯蔵した。【００３６】 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質の精製細菌をグアニジニウム溶解緩衝液 (６Ｍグアニジニウム塩酸塩および５ .８ ml／リットルの溶液Ａ [１７７ mＭＮａＨ２ＰＯ４および５ＭＮａＣｌ ]、ＨＣｌを使用してｐＨ７ .８ )５０ mlに再懸濁し溶解した。懸濁液を２分間３０％出力で超音波処理した。細胞残骸を 30 遠心 (Beckman JA21ローター、４ ℃ で１００００ rpm、３０分遠心 )してペレット化した。 H PV6b L1 HEXAHISタンパク質含有上清を保持した。 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質を続いて、必須２工程精製工程で精製した。【００３７】 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質含有上清を BIORAD ECONO系を使用したニッケルカラム (２ . ６ cm× ６ cm)に４ ℃ で掛けた。上清を掛ける前に、カラムをＮＡ緩衝液１ ml／分で徹底的に洗浄した。ＮＡ緩衝液は６Ｍ尿素、尿素添加前にＨＣｌでｐＨ７ .８にした５ .８ ml／リットルの溶液Ａ [１７７ mＭＮａＨ２ＰＯ４および５ＭＮａＣｌ ]、９４ ml／リットルの溶液Ｂ [２００ mＭＮａ２ＨＰＯ４および５ＭＮａＣｌ ]から成る。上清をニッケルカラムに１ ml／分で掛けた。カラムに掛け過ぎになり、非結合タンパク質がカラムから洗い 40 出されない場合、１０ mlフラクションを回収した。上清を掛けた後、カラムを１ ml／分の流速でＮＢ緩衝液で洗浄した。ＮＢ緩衝液は６Ｍ尿素、尿素添加前にＨＣｌでｐＨ４ .０にした１００ ml／リットルの溶液Ａ [１７７ mＭＮａＨ２ＰＯ４および５ＭＮａＣｌ ] から成る。カラムを表１の方法に従いＮＢ緩衝液で洗浄し、そこではｐＨ勾配の減少が汚染タンパク質を除去した。溶出液の１０ mlフラクションを回収した。【００３８】 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質含有フラクションを、ドット・ブロット、 ELISAまたは SDS PAGEで測定した。フラクションを同定した後、ｐＨが一様になるまで１００％ＮＢ緩衝液で、カラムの洗浄を続けた。次いでカラムをＮＡ緩衝液で洗浄した。 (カラムを２０％エタノール中で保存した。) 50 (9) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【００３９】 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質含有フラクションをプールし、５リットルの dＨ２Ｏまたは１０ mＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７ .５に対して一晩４ ℃ (または室温で２時間 )で透析した。次いで、タンパク質を８：２アセトン対サンプル比でアセトンにより、２時間、−７０ ℃ または一晩、 − ２０ ℃ で沈殿させた。タンパク質 − アセトン溶液を遠心した（ Beckman TJ-6、４ ℃ で３０００ rpm、２０分）。上清を廃棄した。ペレットを窒素ガス流下５分間乾燥させ、残ったアセトンを除去した。【００４０】ペレットを ddＨ２Ｏ１ mlおよび４ × 充填溶媒 [０ .５ＭトリスｐＨ６ .８、グリセロール０ .８ ml、１０％ＳＤＳ w/v １ .６ ml、ＤＴＴ１％ w/v ０ .１ｇ、０ .１％ w/v ブロ 10 モフェノールブルー０ .２ mlおよび dＨ２Ｏ４ .４ ml]４ − ５ mlに再懸濁した。再懸濁ペレットを６５−７０℃で１５分間加熱し、全てのタンパク質の溶解を確実にした。【００４１】再懸濁液を１０％分離ゲル (４ .５ cm高４ cm直径 )および４％積層ゲル (４ cm高４ cm直径 ) 含有 BIORADO Prep Cellに掛けた。 Prep Cellは１２Ｗの一定圧で走らせた。【００４２】ゲルの前の色素が下から２ cmに達した場合、１ ml／分溶出速度で１０ mlフラクションを回収した。フラクションは HPV6b L1 HEXAHISについて、ドット・ブロット、直接 ELISAまたは SDS PAGE(Phast System)のいずれかで試験した。陽性フラクションを SDS PAGEで試験し、単一 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質バンドを有すると判明したものをプールした。プー 20 ルフラクションを ddＨ２Ｏ５リットルに対して透析し、グリシンを除去した。透析は一晩４ ℃ で、 ddＨ２Ｏを２回代えて行った。【００４３】透析 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質をアセトンで沈殿させ、ＳＤＳを除去した。８：２アセトン対サンプル比を、２時間、−７０℃または一晩、−２０℃において使用した。タンパク質 − アセトン溶液を遠心した (Beckman TJ-6、４ ℃ で３０００ rpm、２０分 )。上清を廃棄し、ペレットを窒素ガス流下５分乾燥させ、残ったアセトンを除去した。【００４４】次いで、タンパク質を選択し、濃度を測定した緩衝液に再懸濁できた。このタンパク質を続いて記載のように HPV6b L1 HEXAHISタンパク質の精製、１０ mＭトリスＨＣｌｐ 30 Ｈ７ .５に対する透析による尿素の勾配除去および得られる免疫沈降物の走査電子顕微鏡による試験によりカプソメア形成を証明した。図２は典型的な HPV6b L1 HEXAHISタンパク質凝集体の５量体構造を示す。【００４５】実施例２： HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する抗体産生の証明 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する抗体を産生させるために、マウス (Ｃ 57BI/6系 )に４週間の間隔で２回、表２の実験プロトコールに従って５０ μ gタンパク質／マウスを皮下注射した。２回目の注射の２週間後、マウスから採血した。血清を標準方法を使用して抽出血液から得た。【００４６】 40 血清は３つの異なる抗原を使用して HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する抗体の産生を試験した。【００４７】血清はヒト乳頭腫ウイルス HPV6Bカプシド調製物に対して試験した。血清を、ＲＩＰＡ緩衝液 (２０ mＭトリス − ＨＣｌｐＨ７ .６；２ mＭＥＤＴＡ；５０ mＭＮａＣｌ；１％デオキシコレート；１％トリトンＸ − １００；０ .２５％ＳＤＳ；１％アプロチニン；および１ mＭＰＭＳＦ )中で１／２００に希釈し、ＨＰＶ６Ｂカプシド調製物に対して試験した。抗体−抗原沈殿を１０％ＳＤＳＰＡＧＥで流し、免疫複合体の個々の成分に分けた。 HPV6b L1タンパク質の存在が、ウサギ抗 − HPV6b L1抗体で検出された。 HPV6b L1 タンパク質の存在は、抗 − HPV6b L1抗体がマウスにおいて 6b L1 HEXAHISタンパク質に対 50 (10) JP 2006-1936 A 2006.1.5 して産生されたことを示唆する。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ群が陽性結果となった。【００４８】血清を、バキュロウイルスから産生された HPV6b L1についてウエスタン・ブロット分析でまた試験した。陽性結果は、抗 − HPV6b L1抗体が、マウスにおいて HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対して産生されたことを示唆する。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦ群が陽性結果となり、水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用した場合、最も良い結果が得られた。対照群Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは陰性結果であった。【００４９】血清は、標準技術を使用して、ドット・ブロットおよび ELISAでウシ乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に対して試験した。最も良い結果が、Ｄ群マウス (すなわち、アルミニウム 10 をアジュバントとして使用した場合 )由来の血清で達成され、ＯＤ読み取りは０ .９６であった。これに、ＯＤ読み取り０ .７０のＣ群 (すなわち、フロインド完全アジュバント添加 )由来の血清、ＯＤ読み取り０ .３４のＥ群 (すなわち、アルガムリン添加 )由来の血清、次いでＯＤ読み取り０ .２４のＢ群 (すなわち、１％ＳＤＳ中で沸騰および冷却 )由来の血清およびＯＤ読み取り０ .３４のＡ群 (アジュバントなし )由来の血清が続く。全ての対照群はＯＤ読み取り０ .０５を有した。【００５０】３つの異なった抗原に対する血清の試験は、 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質が免疫原性であり、抗原としてアジュバント存在下または非存在下で使用した場合、抗 − HPV6b L1抗体を産生することを示した。 20 【００５１】実施例３： HPV6b L1 HEXAHISタンパク質によるマウスにおける遅延型過敏症の証明 (および抗体産生確認) 遅延型過敏症は細胞媒介免疫応答およびある液性免疫応答を含む。マウス (BALB/c系 )を、表３に概説の種々の条件下で HPV6b L1 HEXAHISタンパク質で処理 (腹腔内注射 )した。１１日目、耳を、皮内注射で HPV6b L1 HEXAHISタンパク質または他の HEXAHISタンパク質を投与した。耳の厚さを１３および１４日目に測定した。１４日目に陽性の反応があったマウスを殺し、耳の組織を試験した。【００５２】本実施例により、アジュバント無しの HPV6b L1 HEXAHISタンパク質は、５０ μ g／マウ 30 スの初期投与量で良好な遅延型過敏症を誘発するが、５ μ g／マウスでは誘発しないことが証明された。しかしながら、マウスは遅延型過敏症応答を誘発するために、百日咳原処置が必要であった。【００５３】３つの実施例に関して、実施例１の方法で発現および単離した HPV6b L1タンパク質はカプソメア凝集体を形成し、別のアジュバント無しの HPV6b L1タンパク質カプソメア凝集体は、抗体応答および細胞媒介応答を産生する免疫原性であることが示される。従って、 HP V6b L1 HEXAHISタンパク質は、中和抗体の誘導によりヒト乳頭腫ウイルス感染の予防のために、またはＬ１タンパク質特異的細胞媒介免疫性の導入の存在領域を処置するために設計されたワクチンの好適な主成分として働く。実施例１から３は、調製物の免疫原性を証 40 明する例として HPV6b L1タンパク質を使用しているが、本実施例のように、本発明はこの例に限定されず、任意の乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質が使用できる。【００５４】実施例４： HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する抗体が HPV6b-L1ウイルス − 様粒子 (ＶＬＰＳ )を認識する証明プレートのウェルを、ＰＢＳ中、ｐＨ７ .２のエシェリキア・コリ産生 HPV6b L1 HEXAHI S、バキュロウイルス産生 HPV6 VLP-L1ならびに対照としてバキュロウイルスおよびエシェリキア・コリ調製物 (細胞発酵上清 )のいずれかで０ .２ μ gタンパク質／ウェルでコートし、一晩室温でインキュベートした。一回の洗浄をｐＨ７ .２のＰＢＳで行った。非特異的結合をプレートを１％ (w／ v)カゼインで、１時間室温でインキュベートすることにより阻 50 (11) JP 2006-1936 A 2006.1.5 止した。【００５５】ウサギ HPV6b L1 HEXAHIS抗血清を、 (２個づつ調製した )HPV6b L1 HEXAHIS、 HPV VLP-1 、バキュロウイルス調製物対照およびエシェリキア・コリ調製物対照でコートした各ウェルに添加し、連続してプレートの下の方へ 1/2希釈した。インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ − ８に対する血清を陰性対照として使用した。 HPV VLP-L1に対する血清を HPV VLP-L1プレートで陽性対照として使用した。プレートを１時間室温でインキュベートし、次いで、０ .０５％ (v／ v)トゥイン２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７ .２で３回洗浄した。ヤギ − ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルに添加し、プレートを前記のようにインキュベートおよび洗浄した。抗血清の抗原に対する特異的結合をＴＭＢを使用して測定した。反応は 10 ５分後０ .５ＭＨＣｌを使用して停止させた。【００５６】結果実験の結果は表４に示す。 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する抗体と結合した HPV6b L1 HEXAHISタンパク質および HPV6 VLP-L1の両方は、 HPV6b L1 が、 HPV VLP-L1で示される１個またはそれ以上のエピトープをインビボで正確に示すことを示唆する。 HPV6 L1タンパク質に対する血清はまたバキュロウイルスまたはエシェリキア・コリのウェルで陰性であり、反応の特異性を示唆する。これは HPVL1 HEXAHISの、ウイルスと相互作用し、有効に中和できる抗体の誘導に好適なワクチン免疫原としての使用の支持を提供する。更に、本実施例は、ウェルにおける種々のタンパク質のコーティングにより証明された、乳頭腫 20 ウイルスＬ１タンパク質の検出のための免疫検定および組換え HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する抗体の使用の支持を提供する。 HPV6b由来抗原の何れかを含むウェルは陽性結果であった。この実施例はまた、組換え HPV6b L1 HEXAHISタンパク質でのウェルのコーティングにより証明された乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質に特異的な抗体の検出のための免疫検定およびインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ − ８に対する血清および HPV6b L1 HEXAHIS タンパク質に対する血清の使用の支持を提供する。この場合、 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質に対する血清を含むウェルは陽性結果となるが一方インフルエンザウイルスに対する血清は陰性である。【００５７】実施例５：多重構造抗体複合体の形成を証明する ELISA捕獲検定 30 ウエスタン・ブロットおよび ELISA実験を前記のようにまたは標準方法に従って行った。 ELISA捕獲検定は以下の方法に従って行った： (１ )ＶＬＰに特異的なモノクローナル抗体 (moＡ b ８ )をマイクロタイタープレートのコーティングに使用した； (２ )HPV VLP L1タンパク質を添加し、好適な条件下でインキュベートし、０ .１％トゥイン２０含有ＰＢＳ、ｐＨ７ .４で洗浄した； (３ )種々の動物 (表５のカラム１に示す )における種々の免疫原に対する抗体 (表５のカラム２に示す )を添加した；および (４ )好適な検出抗原 (ウサギ抗血清の場合、ヤギ − 抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲートを使用した )を添加し、多重構造／ＶＬＰ − 抗体複合体を検出した。 40 【００５８】結果ウェル当たりの捕獲組換え乳頭腫ウイルス HEXAHISの量を表５に示す。これらの実験は、組換え乳頭腫ウイルス L1 HEXAHISタンパク質に対する抗血清は、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を誘発することを証明する。Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こす乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質の活性には、適切なエピトープの正しい提示を必要とする。ＶＬＰを形成しない組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を惹起しない。組換えＧＳＴ乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質、組換えＭＳ２乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質および変質乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は 50 (12) JP 2006-1936 A 2006.1.5 、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こさない。今まですべてのＶＬＰは、乳頭腫ウイルスＬ１またはＬ１およびＬ２遺伝子の発現で細胞内に生産される。本発明の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こす１またはそれ以上のエピトープを正しく提示する。本発明の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質は、多重構造またはＶＬＰを細胞外に形成し得る。組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質から形成されたＶＬＰの多重構造は、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こす１またはそれ以上のエピトープを正しく提示すると、思われている。従って、本発明は、Ｌ１タンパク質を含む乳頭腫ウイルスＶＬＰを認識する免疫応答を起こし得る多重構造またはＶＬＰを細胞外に形成し得る組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質を提供する。なお、この多重 10 構造は、複数の組換え乳頭腫ウイルスＬ１タンパク質からなっている。【００５９】多重構造またはＶＬＰが細胞外に形成し得るとの事実は、細胞内ＶＬＰ形成に関連する多くの問題を克服する。これらの問題には、低いＶＬＰ濃度、ＶＬＰ中へＤＮＡが合体する可能性および精製に伴うＶＬＰの完全性を損なう可能性がある。【００６０】【表４】 20 30 (13) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【表５】 10 20 30 (14) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【表６】 10 20 30 40 (15) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【表７】 10 (16) JP 2006-1936 A 2006.1.5 【表８】 10 20 30 40 【００６１】説明文表２ａ各群のマウスは４匹のマウスを含むｂ 6b L1 HEXAHISタンパク質をマウス当たり５０ μ gタンパク質で投与した表３ａ群は４から６匹の Balb/Ｃマウス (６８ − １０２ )を含むｂＬ１は 6b L1 HEXAHISタンパク質を意味し、ＩＲＲは不適切な HEXAHISタンパク質を意 50 (17) JP 2006-1936 A 2006.1.5 味するｃＰＢＳはリン酸緩衝化食塩水およびＣＦＡは完全フロインドアジュバントであるｄ 6b L1 HEXAHISタンパク質を最大容量２ μ l中１０ μ gで投与したｅ３０ μ gの百日咳原を添加したｆ耳測定 (μ m× １０ ) 表５ＮＤ：技術的に測定できない図１ＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号３）、ＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す 10 図２ HPV6b L1 HEXAHISタンパク質凝集体の５量体構造の電子肉眼図【図面の簡単な説明】【００６２】【図１−１】図１は、ＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号３）およびＨＰＶ６ｂＬ１ＨＥＸＡＨＩＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。【図１−２】図１−１の続きである。【図１−３】図１−１の続きである。【図２】図２は、 HPV6b L1 HEXAHISタンパク質凝集体の５量体構造の電子肉眼図である。【図１−１】【図１−２】 20 (18) 【図１−３】【図２】 JP 2006-1936 A 2006.1.5 (19) JP 2006-1936 A 2006.1.5 フロントページの続き (51)Int.Cl. ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/09 テーマコード（参考） (2006.01) (2006.01) Ｇ０１Ｎ 33/569 ＬＧ０１Ｎ 33/574 Ａ (2006.01) Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者ジャン・ゾーアメリカ合衆国６０１５３イリノイ州メイウッド、サウス・ファースト・アベニュー２１６０番ロヨラ・ユニバーシティＦターム(参考) 4B024 AA01 AA14 BA32 CA02 CA07 DA06 EA04 GA11 HA03 HA14 4B064 AG32 CA02 CA12 CA19 CC24 CE02 CE03 CE12 CE20 DA01 DA15 4C085 AA03 DD62 DD86 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA01 DA86 EA22 EA29 EA31 EA52 FA74 GA01 GA15 GA26