好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた同定方法の開発

Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006. p. 89 97
Vol. 22, No. 2
受賞総説
好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた
同定方法の開発
（平成 18 年度日本微生物資源学会奨励賞受賞）
後藤慶一
三井農林株式会社食品総合研究所
〒426-0133 静岡県藤枝市宮原 223-1
Classification of aerobic endospore-forming bacteria and development of an
identification method based on DNA sequences
Keiichi Goto
Mitsui Norin Co., Ltd., Food Research Laboratories
223-1 Miyahara, Fujieda, Shizuoka 426-0133, Japan
Recent large-scale food poisoning related incidents have raised consumer awareness and demand for greater food safety. Food companies have introduced various monitoring and methods of control, and continuous action is being taken to
ensure the safety of food. Against this background, test methods for detection and discrimination of microbes have progressed; however, there has long been a need for a rapid and accurate method to identify various microbes. Thus, since
1997, my colleagues and I have been in the process of developing an identification method for aerobic endospore-forming
bacteria, which is more rapid, accurate, unified, and time-efficient than previous methods.
For a number of years, contamination and spoilage by aerobic endospore-forming bacteria has been a serious quality
issue in the food industry. However, the taxonomy of the bacteria is very complex, there are many genera and species,
and it is difficult to find differential characteristics among the bacteria for accurate identification. Accordingly, we evaluated and developed an identification method based on the 16S rDNA sequence using many strains.
A description is presented here of the taxonomic transition of the bacteria and some examples of the development of
this identification method.
はじめに
が困難となった．近年，分子生物学の進歩に伴い，特
好気的もしくは通性嫌気的に生育し，胞子という休
定の菌種を同定するための簡易法が提供されるように
眠細胞を栄養細胞の中に形成する細菌（以下好気性有
なったが，依然として数多くの菌種に対応した簡易な
胞子細菌）は古くから人とのかかわりが深く，納豆
同定法は報告されていなかった．このような背景のも
などの発酵食品や有用物質の生産などに有効利用され
と，分類指標の一つであり，様々な長所を備えた 16S
る半面，人の疾病や食品などの腐敗・劣化に関与す
rRNA 遺伝子（以下 16S rDNA）の塩基配列に着目し，
る．いずれの場合でも，その現象に結びつく菌種を同
正確で迅速な好気性有胞子細菌の同定法の開発を試み
定，あるいは分類することは学術的にも産業的にも重
た．
要なことであるが，1990 年以降，好気性有胞子細菌
本総説では，好気性有胞子細菌の分類体系を概説し
も他の細菌群と同じく，飛躍的に属や種の数が増加し
た後，1997 年より開発を行った 16S rDNA 塩基配列
たことにより，形態や生理・生化学的性状による同定
に基づく好気性有胞子細菌の同定法について
属および
E-mail: [email protected]
属の事例をもとに紹介する．
あわせて，その手法の応用例と今後の課題について
─ 89 ─
好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた同定方法の開発
後藤慶一
属に的を絞って説明する．なお，今
Enterococcus
でこそ 16S rDNA の塩基配列に基づく菌種の同定は
Carnobacterium
Streptococcus
一般的な技術であるが，本開発は，16S rDNA 塩基配
Lactobacillales
Aerococcus
Lactobacillus
列（あるいはその部分配列）が菌種の同定に有効であ
Leuconostoc
るか否かの検証を数多くの菌種・菌株を用いて行った
Bacilli
Tunicibacter
Caryophanon
ものである．
Planococcus
Listeria
Staphylococcus
好気性有胞子細菌の分類体系
好気性有胞子細菌は，
門，
目に分布しており，
Sporolactobacillus
綱の
Paenibacillus
Thermoactinomyces
属（短桿菌）
Alicyclobacillus
属（球菌）などの胞子を形成しな
Mycoplasma
Mycoplasmatales
Entomoplasma
いグラム陽性細菌と同じ系統群に属する（図 1）
．表
Anaeroplasmatales
Spiroplasma
Acholeplasma
現形質として，好気性もしくは通性嫌気性で，胞子を
Acholeplasmatales
Anaeroplasmatales
Anaeroplasma
形成する点で共通しているが，それ以外の形質は様々
Mollicutes
や
Bacillales
Bacillus
Peptostreptococcus
Clostridium
である．
Eubacterium
Lachnospira
して，Bergey s Manual of Systematic Bacteriology
Acidaminococcus
Peptococcus
Volume 2（1986）および Approved Lists of Bacterial
Names（1989）に，
Syntrophomonas
Thermoanaerobacterium
属（34 種）
，
属（1 種）および
Halobacteroides
属（1 種）の
Halanaerobium
属（総計 68 種），1 種が
属
（総計 2 種）に追加され，数年のうちに菌種の数が約
2 倍となった．しかしながら，好気性もしくは通性嫌
気性で胞子を形成する条件を満たせば
Thermotoga
図 1 16S rDNA 塩基配列に基づく
門の分子
系統樹（矢印は好気性有胞子細菌の分布位置を示
す．）
属に
属としてまとめられた（Wisotzkey
分類されたため，好熱性，好冷性，好アルカリ性，好
酸性，形態も様々な菌種が
Halanaerobiales
Thermodesulfobium
3 属 36 種が紹介されていた．1992 年には，新たに 34
種が
Clostridiales
Heriobacterium
Clostridia
1990 年以前，好気性有胞子細菌に相当する細菌と
., 1992）
．続いて，
属に分類されて
，
，
などの菌種が，16S rDNA に基づく解析結
いた．また，これらの分類は主に形態や生理・生化
学的性状，菌体成分の違いに基づいて行われたため
果に基づき，新たに
に，同定対象菌株の帰属が難しかった場合でも，往々
れた（Ash
にして既知菌種に同定され，結果として，個々の菌種
も不均質な集団であった
が非常に多様な性状を有する菌株の集団となった（特
分類学的な整理が行われ，新たに
に
や
よび
属としてまとめられることと
Takagi
., 1993; Shida
なった（以前
や
くして，
など）
（Nakamura, 1993;
., 1995）
．ほぼ時を同じ
属が非常に不均質な集団であること
., 1977; Ash
., 1991; Farrow
ような背景のもと，
., 1994）
．この
属は周辺の属を含めて分
., 1993; Shida
., 1997）．そして最
や
の
属お
と同定されて
いた菌株の多くがこれらの属に移行した）
（Shida
., 1996; Heyndrickx
が GC 含量の分析結果および 16S rRNA の塩基配列に
基づく分子系統解析の結果により指摘された（Fox
属としてまとめら
の菌種からなる
., 1997）
．その後も，好熱性
属（Nazina
好・耐アルカリ性の菌種からなる
（Heyndrickx
., 1998）などが次々に
., 2001），
属
属か
子系統分類学的に再分類されることとなった．
ら分割された．このような再分類の結果，好気性有胞
まず初めに，
子細菌は以前に比べて整理され，2006 年 8 月現在 40
，
が 16S rDNA に基づく系
属 342 種が本細菌として認められている．しかしなが
統樹でひとつの系統をなし，非常に特徴的なω-環
ら，再分類の過程で対象に含められなかった菌種が系
状脂肪酸を主要菌体脂肪酸成分として有することか
統間に散在し，系統ごとに検討度合いが様々で，また
ら，これら 3 種が
属の基準が各々で異なることなどから，好気性有胞子
および
属から分割され，新たに
─ 90 ─
Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006
Vol. 22, No. 2
細菌の分類は依然として一部雑然としている感がある
（図 2）
．すなわち，形態や生理・生化学的性状と分子
系統との間には関連があるものの，人為的な要因によ
Bacillus
りまとまりに欠ける部分が見られ，今後，より高次の
分類群も視野に入れた検討が必要と考えられる．
Bacillus, Marinibacillus
Jeotogalibacillus, Sporosarcina
属の 16S rDNA 高度可変領域（HV 領域）に
Geobacillus
基づく同定法の開発
Anoxybacillus
Bacillus
すでに述べたとおり，表現形質に基づく好気性有胞
子細菌の同定は困難を伴う．そこで，近年，飛躍的
Bacillus
な進歩を遂げた分子生物学的手法，中でも DNA 塩基
Virgibacillus, Oceanobacillus
配列解析を本細菌の同定に応用することを思案した．
Amphibacillus, Bacillus
Filobacillus, Gracilibacillus
Parabacillus
DNA を用いる長所として，① DNA は 4 種類のオリ
ゴヌクレオチドからなる物質である，②生物学的な誤
Bacillus
差が生じない，③客観的である，④再現性に優れてい
Sporolactobacillus
る，⑤情報の共有が可能であることが挙げられる．ま
Bacillus
Ureibacillus
た，対象とする遺伝子として，塩基配列データが蓄積
Brevibacillus
されている 16S rDNA に着目した．16S rDNA を用
Aneurinibacillus
いる長所として，① rRNA 遺伝子は必須遺伝子である，
②塩基配列中に保存されている領域が比較的多く，系
Paenibacillus
統間で比較することが可能である，③ 16S rDNA は
Thermobacillus
解析する上で適当なサイズである，④最も豊富にデー
タベースに登録されていることが挙げられている．一
Paenibacillus
方で，16S rDNA 塩基配列は菌種間で極めて類似しす
ぎており，種の同一性の指標には適さないとの報告が
あった（Fox
., 1992）．しかしながら，その知見
Thermoactinomyces
には未決定塩基や誤った配列が多く含まれる精度が低
Alicyclobacillus
Sulfobacillus
い登録データも用いられ，また種内での塩基配列の保
存性も十分に検討されたものではなかった．以上を踏
まえ，精度の高い塩基配列データを用いることにより，
16S rDNA の同定指標としての再評価を
属
図 2 16S rDNA 塩基配列に基づく好気性有胞子細菌（抜
粋）の分子系統樹（斜線で塗りつぶした系統は複数
の属から構成される系統を示す．）
（71 種）に着目して行った（実験方法の詳細は Goto
., 2000 を参照されたい）
．その結果，全ての 16S
HV 領域の塩基配列の保存性を調べたところ，各菌株
rDNA 塩基配列は各基準株に特有のものであり，その
は基準株と 100％の相同性で一致した．従って，HV
比較によりこれらの菌株が区別できることが示された
領域の塩基配列は非常に種特異的であり，その配列の
（図 3A）
．しかしながら，塩基配列が非常に類似した
場合もあり，その比較により区別を行うには精度の高
比較により
属細菌を種レベルで同定，ある
いはグルーピングすることができることが示された．
い塩基配列を用いなければならないこともわかった．
属への 16S rDNA 高度可変領域（HV 領
一方，多くの種で 16S rDNA 塩基配列を比較した
結果から，多変位領域 V1 および V2 を含む 70 ∼ 300
域）に基づく同定法の応用
付近の領域が（表 1，図 4），全ての基準株に共通した
属で検証した HV 領域による同定法を
属に応用するため，
最も変異に富んだ領域であることが明らかとなり（以
下この領域を HV 領域と称す）
，この領域だけでもそ
れぞれの基準株を識別することができた（図 3B，ほと
（Basonym:
）と名づけられた菌株を中
心に収集し，HV 領域の解析を試みた．その結果，
株のほとんどは
んどの菌株間の相同性は 90％以下）．そこで，種内の
─ 91 ─
以外の菌種とクラス
─ 92 ─
"MOJAVENSIS !"
"VALLISMORTIS !"
"SUBTILIS8
"ATROPHAEUS !"
"AMYLO LIQUEFACIENS8
"LIC HENIFORMIS8
"PUMILUS 8
"CARBONIPHILUS!"
"SMITHII:
"OLERONIUS8
"SPOROTHERMODURANS 5
"COAGULANS $
"BADIUS8
"PSYCHROPHILUS$
"GLOBISPORUS 8
"PASTEURII8
"INSOLITUS8
"SPHAERICUS$
"FUSIFORMIS -
"MARINUS !"
"INFERNUS 5
"METHANOLICUS 8
"NIACINI!"
"CIRCULANS$
"BENZOEVORANS$
"LENTUS !"
"FIRMUS 8
"WEIHENSTEPHANENSIS!"
"MYCOIDES !"
"THURINGIENSIS$
"CEREUS $
"ANTHRACIS8
"PSEUDOMYCOIDES!&
"PSYCHROSACCHAROLYTICUS !"
"HALMAPALUS 8
"HORIKOSHII
"COHNII8
"FASTIDIOSUS8
"SIMPLEX $
"MEGATERIUM$
"FLEXUS!"
"STEAROTHERMOPHILUS!"
"THERMOLEOVORANS :
"KAUSTOPHILUS 8
"THERMOGLUCOSIDASIUS !"
"PALLIDUS:
"THERMOAMYLO VORANS ,
"AZOTOFORMANS$
"SALEXIGENS9
"HALODENITRIFICANS !"
"HALOPHILUS!"
"DIPOSAURI8
"HALOALKALIPHILUS 8
"PSEUDOALCALIPHILUS8
"ALCALOPHILUS 8
"HALODURANS!"
"GIBSONII8
"CLAUSII8
"PSEUDOFIRMUS 8
"LAEVOLACTICUS$
"NAGANOENSIS !"
"VEDDERI:
"CLARKII:
"AGARADHAERENS8
"THERMOCLOACAE:
"THERMOSPHAERICUS8
"HORTI$
"CHITINOLYTICUS !"
"EHIMENSIS!"
"TUSCIAE:
"SCHLEGELII:
!LICYCLOBACILLUS ACIDOCALDARIUS 8
0.01
(B)
4
"AMYLOLIQUEFACIENS !4##
4
"VALLIS MORTIS$3-4
"MOJA VENSIS)&/4
"ATROPHAEUS*#-
4
"SUBTILIS )!-
4
"LICHENIFORMIS )!-
4
"PUMILU S)!-
4
"WEIHENSTEPHANENSIS 4$3-
"MYCOID ES!4##
4
"THURINGIENSIS )!-
4
"PSEUDOMYCOIDES
.22,"
4
"CEREUS*#-
"ANTHRACIS 3TERNE8
4
"LAEVOLACTICUS )!-4
"THERMOCLOACAE$3-
4
"AZOTOFORMANS )&/
4
"NAGANOENSIS!4##
4
"HALOALKALIPHILUS$3-4
"CLARKII$3-
4
"VEDDERI$3-
4
"AGARADHAERENS $3-
4
"PSEUDOALCALIPHILUS4$3-
"ALCALOPHILUS)!-
4
"HALODURANS !4##
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"HALMAPALUS$3-
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"
4
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4
4
"KAUSTOPHILUS )!-
4
"THERMOLEVORANS !4##
4
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"STEAROTHERMOPHILUS)!-
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"STEAROTHERMOPHILUS$3-
"STEAROTHERMOPHILUS$3-
4
"MEGATERIUM*#-
"MEGATERIUM$3-
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"MEGATERIUM)!-
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"MEGATERIUM$3-
"MEGATERIUM$3-
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"ALCALOPHILUS $3-E
"ALCALOPHILUS $3-E
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"MOJAVENSIS $3-A
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"ATROPHAEUS )&/
"ATROPHAEUS )&/
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"SUBTILIS)!-
"SUBTILIS$3-
"SUBTILIS$3-
"SUBTILIS$3-
"SUBTILIS)!-
"SUBTILIS)!-B
"SUBTILIS)!-B
"SUBTILIS.)'
"SUBTILIS.)'
"SUBTILIS.)'
4
"AMYLO LIQUEFACIENS!4##
"AMYLO LIQUEFACIENS)!-C
4
"LIC HENIFORMIS)!-
"LIC HENIFORMIS$3-
"LIC HENIFORMIS$3-
4
"PUMILUS )!-
"PUMILUS )&/D
"PUMILUS )&/D
"PUMILUS )&/D
"PUMILUS )&/D
"PUMILUS )&/
4
"SIMPLEX )&/
4
"PSYCHROSACCHAROLYTICUS !4##
0.005
0.005
0.005
(C)
図 3 16S rDNA および HV 領域の塩基配列に基づく分子系統樹
A：16S rDNA 塩基配列に基づく系統樹．系統樹は 1,057 塩基の比較に基づき，NJ 法により構築した．アウトグループとして
IFO 15652T を用いた．
枝上のローマ数字はブーツストラップ値を示す．括弧内にアクセッション番号を記した．
B：HV 領域に基づく系統樹．系統樹は 219 塩基の比較に基づき，NJ 法により構築した．アウトグループとして
IFO 15652T を用いた．枝上のロー
マ数字はブーツストラップ値を示す．括弧内に菌株番号を記した．
C：選抜した系統の HV 領域に基づく系統樹．
クラスター，
クラスター，
クラスターおよび
（現
）クラスターを示す．デンドログラムは NJ 法により構築した．アウトグループとして，それぞれ
，
，
および
を用いた．枝上のローマ数字はブーツストラップ値を示す．括弧内の数値（％）は基準株に対しての DNA 類似度を示す．矢
印はグルーピングに留まる菌株（
および
）を示す．
0.01
(A)
好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた同定方法の開発
後藤慶一
Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006
Vol. 22, No. 2
ターを形成した（図 5）．そこで，これら
の
ら，HV 領域はそれぞれの種で良く保存されており，
種の同一性を DNA-DNA 類似度の試験により確かめ
属（同時に
たところ，ほとんどの菌株は誤同定されていたもので
属も）にお
いても非常に有効な同定指標であることが示された
あることがわかった．過去にこのような誤同定が多
（Goto
., 2004）
．
かった理由には，特に表現形質が現れにくい細菌の
同定が難しいこと，また
属への 16S rDNA 高度可変領域（HV
属細菌の鑑別
領域）に基づく同定法の実用
性状が乏しいことなどが挙げられる．一連の結果か
表 1 V1 ∼ V9 領域の 28 種間における塩基保存性
可変領域
あった．直接的な病原性はないものの，一部の菌種
保存性されている塩基数
V1（69-100：32 塩基）
V2（181-228：48 塩基）
V3（415-478：93 塩基）
V5（809-838：30 塩基）
V6（986-1017：32 塩基）
V7（1099-1148：50 塩基）
V8（1223-1279：57 塩基）
V9（1396-1465：70 塩基）
V1 ∼ V9: variable regions (Neefs
属細菌は好熱性，好酸性の有胞子
細菌で，2000 年以前は 3 種が記載されているのみで
（主として
0（ 0％）
12（25％）
66（71％）
24（80％）
24（75％）
36（72％）
32（56％）
63（90％）
）は異臭を発生して食品
の腐敗を引き起こすため，食品業界では重要管理菌
として取り扱われている．これまで分離株の同定は
主に糖の資化性をもとに行われてきたが，反応が弱
いために人為的な誤同定が生じたり，また株レベル
の性状のばらつきが大きく同定できなかったりした
ために（最近になるまで知られていなかった），腐敗
原因の究明や制御法を講じるに当たっての大きな支
., 1993)
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属細菌 71 種の基準株由来 16S rDNA 塩基配列の多重配列解析に基づ
く共通塩基配列
ベースとなる塩基配列には
を用いた．保存されていない部位および
ギャップは “-”で示した．下線は HV 領域増幅用のプライマー部位を示す．灰色
で塗りつぶした領域が HV 領域に相当．その他の変異領域について，5 および 3 末
端側領域は登録情報の不足，また 450 ∼ 490 および 840 ∼ 920 領域は主として
および
の塩基挿入あるいは欠失によるものであり，全てに共通
した変異領域ではない．
─ 93 ─
好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた同定方法の開発
後藤慶一
4
"REVIBACILLUSAGRI$3-
"REVIBACILLUSAGRI$3-
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;"REVIBACILLUSBREVIS=$3-
"REVIBACILLUSBREVIS$3-4
"REVIBACILLUSBREVIS$3-
"REVIBACILLUSBREVIS$3-
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"REVIBACILLUSCHOSHINENSIS$3-
"REVIBACILLUSFORMOSUS$3-4
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"REVIBACILLUSLATEROSPORUS$3-4
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"REVIBACILLUSBORSTELENSIS$3-4
"REVIBACILLUSBORSTELENSIS$3-
4
"REVIBACILLUSINVOCATUS.#)-"
"REVIBACILLUSCENTROSPORUS
$3-4
4
!NEURINIBACILLUSMIGULANUS$3-
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;"REVIBACILLUSBREVIS=$3-
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!NEURINIBACILLUSANEURINILYTICUS$3-4
;"REVIBACILLUSBREVIS=.#)-"
!NEURINIBACILLUSTHERMOAEROPHILUS$3-4
;"REVIBACILLUSBREVIS=$3-
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"REVIBACILLUSSP$3-
"REVIBACILLUSSP$3-
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"ACILLUSMETHANOLICUS.#)-"4
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"ACILLUSOLERONIUS$3-4
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"ACILLUSSUBTILIS)!-4
図 5 属細菌および
属細菌
の HV 領域の塩基配列に基づく系統樹
系統樹は 239 塩基の比較に基づき，NJ 法により構築した．枝上
には 70％以上のブーツストラップ値を示した．［］は誤同定の
菌株に付記した．
0.01
A. mali
1997 輸入果汁（日本）
Alicyclobacillus genomic species 1
2000 土壌（極地付近）
2003 コンポスト（日本）
A. sendaiensis
製品中で増殖
する可能性あり
Alicyclobacillus genomic species 2
2002 土壌（日本）
1998 土壌（南極付近）
A. acidocaldarius subsp. rittmannii
A. acidocaldarius subsp. acidocaldarius
A. hesperidum subsp. aigle
1971 土壌（アメリカ）
2005 土壌（南極付近）
A. hesperidum subsp. hesperidum
2000 土壌（南極付近）
A. sacchari
2005 土壌（日本）
グアイアコール
産生
1987 土壌+変敗飲料（ドイツ）
2005 輸入飲料原料（日本）
2002 変敗飲料（日本）
A. acidoterrestris
A. fastidiosus
A. acidiphilus
A. contaminans
!-C6
2005 土壌（日本）
A. contaminans
2003 輸入変敗飲料（日本）
A. pomorum
A. disulfidooxidans
A. cycloheptanicus
A. kakegawaensis
2005 土壌（日本）
A. kakegawaensis
A. shizuokaensis
A. herbarius
A. herbarius
1996 土壌（アメリカ）
1987 土壌（ドイツ）
2005 土壌（日本）
2002 輸入ハーブ（日本）
2005 土壌（日本）
!-C7
B. tusciae
B. subtilis
図 6 16S rDNA 塩基配列に基づく
属細菌および関連菌種
の分子系統樹，ならびに分離源
w-C6 は w-cyclohexyl 環状脂肪酸，w-C7 は w-cycloheptyl 環状脂肪酸を示す．
←で示した菌種は筆者らによって報告を行った菌種．
─ 94 ─
Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006
Vol. 22, No. 2
手法がより簡便で迅速な方向に改良されることを期待
障となっていた．そこで，HV 領域による同定法を
し，本総説を締めくくる．
属細菌へ応用し，食品製造の TPO に
適うか否かを検討した．その結果，他の好気性有胞子
細菌と同様に，HV 領域は
謝辞
属の同定
指標として非常に有効であることが示された（Goto
今回の奨励賞受賞に際し，終始ご指導賜りました東
., 2002a, 2002b, 2002c）．また，HV 領域を同定指
京大学分子細胞生物学研究所の横田明博士をはじめ
標として用いることにより，誤同定が無くなり，ま
とし，岡山大学の稲垣賢二博士，
（株）海洋バイオテク
た数多くの
属の新種を見出すことが
ノロジー研究所の笠井宏朗博士，埼玉大学の定家義
でき（Goto
., 2002a, 2002b, 2003, 2007; Matsubara
人博士，東京農業大学の山里一英博士，理化学研究所
., 2002），腐敗性や製品での増殖特性の分布も明
バイオリソースセンターメンバー各位および東京大学
らかとなってきた（図 6）．さらに，同一種内の 16S
分子細胞生物学研究所バイオリソーシス研究分野メン
rDNA や
バー各位に心より感謝致します．
の塩基配列の多様性（それぞれの遺伝
子に基づく系統は稀に一致しない）と表現形質の多様
また，三井農林（株）の田中裕子氏（旧姓加藤），浅
性の関連性などが示唆されてきた（Goto
原未佳氏（現理化学研究所），藤田理英子氏，餅田薫
., 2006）．
これらの分子と表現形質と腐敗特性との相関について
氏をはじめ，一連の研究の手助けをして頂いた人々に
はこれからも追求していく予定であるが，HV 領域に
深く感謝の意を表します．
よる
属細菌の同定法は正確性および
迅速性の面で従来の技術を大きくしのぎ，実用面で利
文献
用可能であることが示された．
Ash, C., Farrow, J.A.E., Wallbanks, S. & Collins, M.D.
(1991). Phylogenetic heterogeneity of the genus
おわりに
revealed by comparative analysis of small-
平成 8 年度より，16S rDNA の塩基配列の比較
subunit-ribosomal RNA sequences. Letters in Appl.
による好気性有胞子細菌の同定法の開発を行っ
Microbiol. 13: 202-206.
た．一連の検討の結果，
属，
し，
Ash, C., Priest, F.G. & Collins, M.D. (1993). Molecular
属（
identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow,
属などを含む）をはじめと
属（
む），
属，
属（Goto
含
Wallbanks and Collins) using a PCR probe test.
属および
Proposal for the creation of a new genus
属
を
. Antonie van Leeuwenhoek 64:
., 2002d）について 16S
253-260.
rDNA，さらにはその高度可変領域（HV 領域）が同
定指標として有効であることを検証してきた．さらに，
Farrow, J.A.E., Wallbanks, S. & Collins, M.D. (1994).
Phylogenetic interrelationships of round-spore-
乳酸菌やグラム陽性球菌，さらにはグラム陰性桿菌
（Kato
forming bacilli containing cell walls based on lysine
., 2006）などにも本手法を応用し，実績を
and the non-spore-forming genera
上げてきていることから，本手法は極めて広範の細菌
,
の同定に利用可能であることが示唆されている．
, and
,
. Int. J.
Syst. Bacteriol. 44: 74-82.
本手法では塩基配列を決定して相同性検索を行う流
れとなるため，汎用性の面で様々な分野へ普及するに
Fox, G.E., Pechman, K.J. & Woese, C.R. (1977).
は課題が残されているが，様々な種を対象とした同定
C o m p a r a t i v e c a t a l o g u i n g o f 16S r i b o s o m a l
の場合，DNA 塩基配列の比較が現時点では最も正確
ribonucleic acid: molecular approach to procaryotic
systematics. Int. J. Syst. Bacteriol. 27: 44-57.
な手法であり，実際に国内外で利用されている．ア
メリカの FDA でも微生物の同定は分子生物学的な手
Fox, G.E., Wisotzkey, J.D. & Jurtshuk, P., Jr. (1992).
法により実施することが望ましいとのコメントがプレ
How close is close: 16S rRNA sequence identity
スリリースされ，日本でも日本薬局方や衛生試験法で
may not be sufficient to guarantee species identity.
Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 166-170.
本手法を包含する形で記載されるようになってきてお
り，遺伝子解析の流れはこれからさらに実用面に導入
Goto, K., Omura, T., Hara, Y. & Sadaie, Y. (2000).
されていくものと予想される．今後，ハードの面で本
Application of the partial 16S rDNA sequence as
─ 95 ─
好気性有胞子細菌の分類とその遺伝情報を用いた同定方法の開発
後藤慶一
An, S.-Y., Kasai, H. & Yokota, A. (2007). Proposal of
an index for rapid identification of species in the
genus
six novel moderately-thermophilic, acidophilic,
. J. Gen. Appl. Microbiol. 46: 1-8.
endospore-forming bacteria:
Goto, K., Matsubara, H., Mochida, K., Matsumura, T.,
sp. nov.,
Ha ra , Y., N i wa , M. & Ya ma sa t o , K. (2002a ).
sp. nov.,
sp. nov., a novel
sp. nov.,
bacterium containing w-cycloheptane fatty acids,
sp. nov.,
isolated f rom herbal tea. Int. J. Syst. Evol.
sp. nov., and
sp. Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 52: 109-113.
Microbiol. (in press).
Goto, K., Tanimoto, Y., Tamura, T., Mochida, K., Arai,
D., Asahara, M., Suzuki, M., Tanaka, H. & Inagaki,
Heyndrickx, M., Lebbe, L., Vancanneyt, M., Kersters,
K. (2002b). Identification of thermoacidophilic
K., De Vos, P., Logan, N.A., Forsyth, G., Nazli, S.,
bacteria and a new
Ali, N. & Berkeley, R.C.W. (1997). A polyphasic
genomic
species isolated from acidic environments in Japan.
reassessment of the genus
Extremophiles 6: 333-340.
reclassification of
Stauffer
Goto, K., Mochida, K., Asahara, M., Suzuki, M. &
,
(Meier-
. 1996) a s
comb. nov., and emended
Yokota, A. (2002c). Application of the hypervariable
region of the 16S rDNA sequence as an index for
description of
the rapid identification of species in the genus
, and
corrig.,
. Int. J. Syst.
Bacteriol. 47: 808-817.
. J. Gen. Appl. Microbiol. 48:
Heyndrickx, M., Lebbe, L., Kersters, K., De Vos, P.,
243-250.
Forsyth, G. & Logan, N.A. (1998).
Goto, K., Kato, Y., Asahara, M. & Yokota, A. (2002d).
: a
Evaluation of the hypervariable region in the 16S
new genus to accommodate
rDNA sequence as an index for rapid species
(Proom and Knight 1950). Emended description of
identification in the genus
. Int. J. Syst. Bacteriol.
. J. Gen.
48: 99-106.
Appl. Microbiol. 48: 281-285.
Goto, K., Mochida, K., Asahara, M., Suzuki, M., Kasai,
Kato, Y., Asahara, M., Arai, D., Goto, K. & Yokota, A.
(2005). Reclassification of
H. & Yokota, A. (2003).
and
sp. nov., a novel thermo-acidophilic, endospore-
as later subjective synonyms
forming bacterium that does not possess w-alicyclic
of
fatty acids, and emended description of the genus
and of
as a later subjective
. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:
synonym of
1537-1544.
Matsubara, H., Goto, K., Matsumura, T., Mochida, K.,
A. (2004). Reclassification of
I wa k i , M., N i wa , M. & Ya ma sa t o , K. (2002).
strains NCIMB 13288 and DSM 6472 (=NRRL
NRS-887) as
. J. Gen.
Appl. Microbiol. 51: 287-299.
Goto, K., Fujita, R., Kato, Y., Asahara, M. & Yokota,
sp. nov. and
sp. nov., a new thermo-
sp. nov. Int. J. Syst. Evol.
acidophilic w-alicyclic fatty acid-containing
bacterium isolated from acidic beverages. Int. J.
Microbiol. 54: 419-427.
Syst. Evol. Microbiol. 52: 1681-1685.
Goto, K., Mochida, K., Kato, Y., Asahara, M., Ozawa,
C., Kasai, H. & Yokota, A. (2006). Diversity of
Nakamura, L.K. (1993). DNA relatedness of
Migula 1900 Strains and proposal of
isolated from fruit juices and their
sp. nov., nom. rev., and
raw materials, and emended description of
sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 43: 20-25.
. Microbiol. Cult. Coll.
22: 1-14.
Nazina, T.N., Tourova, T.P., Poltaraus, A.B., Novikova,
E.V., Grigoryan, A.A., Ivanova, A.E., Lysenko, A.M.,
Goto, K., Mochida, K., Kato, Y., Asahara, M., Fujita, R.,
─ 96 ─
Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2006
Vol. 22, No. 2
Petrunyaka, V.V., Osipov, G.A., Belyaev, S.S. &
(1996). Proposal for two new genera,
Ivanov, M.V. (2001). Taxonomic study of aerobic
gen. nov. and
thermophilic bacilli: description of
Syst. Bacteriol. 46: 939-946.
Shida, O., Takagi, H., Kadowaki, K., Nakamura, L.K. &
gen. nov., sp. nov. and
K o m a g a t a , K . (1997) . T r a n s f e r o f
sp. nov. from petroleum reservoirs and
transfer of
gen. nov. Int. J.
,
,
,
,
,
,
,
, and
,
and
to
the new combinations
,
,
to the genus
and emended description of the
as
genus
,
. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:
289-298.
,
Takagi, H., Shida, O., Kadowaki, K., Komagata, K. &
and
Udaka, S. (1993). Characterization of
. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:
with descriptions of
433-446.
sp. nov.,
sp. nov.,
Neefs, J.-M., Van de Peer, Y., De Rijk, P., Chapelle, S.
sp. nov., and B
& De Wachter, E. (1993). Compilation of small
sp. nov. Int. J.
Syst. Bacteriol. 43: 221-231.
ribosomal subunit RNA structures. Nucleic Acids
Wisotzkey, J.D., Jurtshuk, J.R.P., Fox, G.E., Deinhard,
Res. 21: 3025-3049.
G. & Poralla, K. (1992). Comparative sequence
Shida, O., Takagi, H., Kadowaki, K., Udaka, S.
analyses on the 16S rRNA (rDNA) of
Nakamura, L.K. & Komagata, K. (1995). Proposal of
sp. nov.,
nov., nom rev., and
,
sp.
, and
and proposal for creation
sp. nov.,
of a new genus,
nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 93-100.
Syst. Bacteriol. 42: 263-269.
Shida, O., Takagi, H., Kadowaki, K. & Komagata, K.
─ 97 ─
gen. nov. Int. J.

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