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ReproNeuro 解凍播種および MEA 測定
表１. 製品内容
取扱説明書
①
凍結細胞バイアル
3.0×106 cells × 1
Version 1.2
②
練習用バイアル
細胞なし、1 mL × 1
品番：RCESDN001
③
Thawing Medium
30 mL × 1
④
Maturation Medium
40 mL × 1
実験操作の重要ポイント
⑤
Additive A
520 μL × 1
1.
⑥
Coating solution
150 μL × 1
2.
本製品の細胞を解凍播種する前に、共培養用のグリア細胞および
共培養用培地をご準備ください。（グリア細胞の培養方法、コンデ
保存条件：① Liquid Nitrogen、②〜⑥ 20℃
ィションメディウムの調製については本文末の参照プロトコルをご覧く
注 1. ReproNeuro はドライシッパーにて輸送されます。製品を受け取り
ださい。）本製品 1 キットに含まれる細胞、試薬類を用いて MED
ましたら可能な限り早く、凍結細胞バイアルを液体窒素保管容器に移し
プローブ約 9 枚へ播種し、21 日間培養することが可能です。
てください。
初めて本製品の細胞を解凍播種する場合は、ステップ 4.1.から
4.7.に関して、事前に添付の練習用バイアルと Thawing
製品内に含まれない試薬、培養器具、および機器
Medium（30 mL のうちの 10 mL）を用いて解凍操作を確認し
・リン酸緩衝⽣理的⾷塩⽔ (PBS, カルシウム, マグネシウム不含)
てください。
[SIGMA, Cat. D5652-10L]
3.
凍結細胞バイアルは液体窒素で保管してください。
4.
細胞を解凍する際は液体窒素保管容器から細胞を取り出した後、
5.
・ Penicillin/Streptomycin [Life Technologies Corporation
(Gibco), Cat. 15140]
⼀度安全キャビネット内で蓋を 1/4 程開け、バイアル内部の圧⼒を
・ 0.01 % ポリ-L-リジン (PLL) 溶液 [Sigma, Cat. P4832]
解放してください。このとき、蓋は完全に開けきらないようにしてくださ
・ MEA 測定機器：MED64-Basic [アルファメッドサイエンティフィック]
い。
構成
細胞の解凍から培地への移⾏は 2 分以内、さらに播種までは 40
・MED64 メインアンプ [Cat. MED-A64MD1]
分以内に⾏なってください。操作に時間がかかると、⽣存率が著しく
・MED64 ヘッドアンプ [Cat. MED-A64HE1]
低下します。
・MED 温度制御付コネクター [Cat. MED-CP02H]
Preparing
Thawing
Centrifugation
・MED コネクターカバー [Cat. MED-CC01]
Seeding
2min
・計測用 PC システム [Cat. MED-D0T]
40min
・Mobius Spike Sorter [Cat. MED-MS64MR12]
・電極ディッシュ：MED プローブ [アルファメッドサイエンティフィック, Cat.
MEA 測定用細胞培養スケジュール
3
day -1 0
Step A
Coating
Step B
Thawing
Step C
Medium
change
Step D
Assay
MED-P515A]
7
10
14
day -1
21
・直径 10 cm シャーレ [IWAKI, Cat. 36-3411]
・クローニングリング [IWAKI, Cat. RING-05]（あらかじめオートクレ
ーブ等で滅菌しておきます）
day 0
day 3
day 7
day 14
以下は共培養用の細胞・試薬となります。
day 10 - 21
・グリア細胞 (ラット)
・トリプシン [Wako, Cat. 201-18841]
・コンディションメディウム (グリア細胞培養上清)
グリア細胞の培養方法、コンディションメディウムの調製については本文
末の参照プロトコルをご覧ください。
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1
1.
MED プローブのコーティング（細胞播種前日）
キャップを緩めて準備しておきます。マイクロピペット（p-1000）を
ＭＥＤプローブは使用前に、血清入りの培地（グリア細胞用培養
安全キャビネット内に準備し目盛りを 1000 μL にセットします。チッ
培地：参照プロトコル参照）を 1 mL 程度プローブ内に入れ、⼀
プを使いやすい場所にセットしておきます。
晩 37℃でインキュベーションすることをお勧めします。その後、培地を
注 2. 細胞の解凍は上記の準備がすべて終わってから始めるようにしてく
除去し滅菌⽔で数回洗浄後コーティング作業にすすみます。
ださい。解凍操作に時間が掛かると細胞の⽣存率や状態が悪化します。
1.1. 下記のコーティング作業の前に付属の Coating Solution を 4℃冷
蔵庫に移し、解凍します（約 2 時間）。
4.
細胞の解凍
1.2. 0.01 % PLL 溶液の 3 倍希釈溶液(PBS) を 5 mL 準備します。
初めて本製品の細胞を解凍する場合は練習用バイアルを用いて解凍操
1.3. ステップ 1.2.で調製した PLL 溶液を直径 10 cm シャーレに入れた
作（ステップ 4.1.-4.7.）の練習をおこなってください。この場合はチューブ
MED プローブ内に 500 μL 加えます。
A (Thawing Medium) のみ、練習用に 10 mL とりわけてご準備くださ
い。チューブ B は不要です。
4.1. 凍結細胞バイアル（以下、バイアル）を運ぶための容器（以下、
細胞運搬用容器）を準備し、液体窒素を適量入れておきます。
4.2. バイアルを液体窒素保管容器から取り出し、直ちに液体窒素の入っ
た細胞運搬用容器に移し、安全キャビネットの近くまで持ってきま
す。
1.4. MED プローブの入ったシャーレを 37℃ CO2 インキュベーターに移し、
4.3. バイアルを安全キャビネット内に移し、蓋を 1/4 程度開け、バイアル
内部の圧⼒を解放し、再度、蓋を閉め直します。
2 時間インキュベートします。
1.5. 新しい 15 mL チューブに 5 mL の PBS を加え、Coating Solution
の全量 (150 μL) を添加します。
注 3.
バイアルを安全キャビネット内に入れてからバイアルの蓋を閉め直す
まで 1 分以内に実施してください。
1.6. MED プローブをインキュベーターから取り出し、PLL 溶液をウェルから
取り除きます。
注 4．蓋は完全に開けきらないでください。蓋を開け切るとコンタミネーショ
ン等の原因になることがあります。
1.7. MED プローブに PBS を 1 mL 加え、取り除くことを 2 回くり返します。
1.8. Coating solution 希釈溶液を 500 μL 加え、37 ℃ CO2 イン
キュベーターに移し、オーバーナイトでインキュベートします。
4.4. 直ちにバイアルをウォーターバスで加温します。バイアルを円を描くよう
に揺すりながら 90 秒間加温し、その後、ウォーターバスから取り出し、
急いで安全キャビネットに移します。
注 5. ウォーターバスで加温する時間は 90 秒を厳守してください。90 秒
2.
Maturation Medium の調製
では半分程度解凍された状態です。時間超過により細胞が完全に解凍
2.1. 520 µL の Additive A を Maturation medium に添加して調
製します。調製済みの培地は 4 ℃で保管し、3 週間以内にご使
用ください。再凍結はおこなわないでください。
してしまうと細胞の⽣存率が著しく悪化しますのでご注意ください。
4.5. バイアルに付着した⽔滴をふき取った後に、バイアル内の細胞全量を、
デカンタでチューブ A に素早く移します。
注 6. ステップ 4.4.から 4.5.まで 120 秒以内におこなってください。（ウォ
3.
培地の加温
ーターバス 90 秒、デカンタ 30 秒）
3.1. 15 mL チューブに Thawing Medium を 10 mL 分注します（チ
ューブ A）。
4.6. さらに、バイアルに残った細胞を回収するために、チューブ A の培地 1
mL を空になったバイアルに加えて、バイアルを洗い、チューブ A に戻
3.2. 50 mL チューブに、ステップ 2.1.で調製した Maturation Medium
を 20 mL 分注します（チューブ B）。
します。
4.7. チューブ A を 400× g で 5 分間（室温）遠心します（遠心条件
3.3. 37 ℃のウォーターバスでチューブＡとＢを 15 分以上、加温します。
3.4. チューブ A だけを安全キャビネット内に移し、すぐに操作ができるように
は厳守してください）。
4.8. 遠心している間にチューブ B をウォーターバスから安全キャビネットに
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2
移します。
す。
4.9. 遠心が終了したらチューブ A を安全キャビネットに移します。細胞ペレ
注 9. 0.5×106cells/cm2 以下の密度では良好な電位結果を得ること
ットを吸引しないように培地上清をアスピレーターで注意深く取り除
が困難ですのでご注意下さい.
きます。
5.6. Maturation Medium 1 mL を MED プローブ内のクローニングリン
注 7. 細胞のペレットは目視しにくいので、吸い込まないように注意してくだ
グの周囲に静かに入れます。クローニングリングがずれたり倒れたりし
さい。
ないようご注意ください。
4.10. チューブ B から Maturation Medium をチューブ A に 1 mL 移し、
細胞ペレットを分散させるために目盛りを 1000 μL にセットしたマイ
クロピペット（p-1000）で 3 秒に 1 回の速度でマイルドに 4 回ピ
ペッティングします。
4.11. さらに、2 mL の Maturation Medium を加え、約 1.0x106
cells/mL の細胞懸濁液を作ります。
注８.
細胞の解凍から播種までの時間を最小化するために、敢えてセ
5.7. シャーレの蓋をして 37℃ 5% CO2 インキュベーターに移して 1 時間
静置します。
ルカウントはしておりません。
注 10. 細胞の解凍ステップ 4.1.から細胞播種ステップ 5.7.までを 40 分
5.
神経細胞播種（MED プローブ）
以内でおこなってください。
MED プローブ１枚あたりの神経細胞量と培地量
number of cells
5
1 × 10 cells
cell volume medium
100 μL
6.
1 mL
共培養用培地の添加
共培養用培地は用事調製とし、使用直前に調整して下さい。
5.1. ステップ 4.11.で調製した細胞懸濁液をディスポーザブルピペット（5
6.1. コンディション Medium（10% FBS 含有）と Maturation
mL）で 4 回、懸濁します。泡が出ないように、1 回 5 秒程度かけ
Medium を 1:1 で混合して 5% FBS 含有の共培養用培地を調
てゆっくりピペッティングします。
整します。調整した共培養用培地を 37℃のウォーターバスであたた
5.2. あらかじめコーティングしておいた MED ブローブをインキュベーターから
取り出し、安全キャビネットに移します。
めます。
注 11．以下の作業は 1 シャーレ（1MED プローブ）ずつインキュベータ
5.3. MED プローブ内のコーティング溶液をアスピレーターで取り除きます。
ーより取り出して実施して下さい。
5.4. コーティング液を取り除いた MED プローブの中心にピンセットでクロー
6.2. ステップ 5.7.で 1 時間インキュベートした MED プローブを安全キャビ
ニングリングを⽴てます。リングの設置面がなめらかであることを確認
ネット内に移し、ピンセットで中央に設置していたリングをつまんで垂
してください（MED プローブとの間に隙間があると細胞がもれ出して
直に上に持ち上げて除去します。（リングは洗浄、滅菌により再利
しまいます）。
用可能です。）
5.5. リングに細胞懸濁液を 100 μL 加えて、細胞を播種します。リングの
6.3. 5 %FBS 含有共培養用培地を MED プローブのウェルのへりから、
上でチップ先端に液玉をつくるようにしてゆっくりと滴下して下さい。
P1000 ピペットを用いて静かに 1 mL 加えます。（すでに 1 mL の
Maturation Medium が入っているので、最終的には 2.5 %FBS
含有の培地 2 mL で培養することになります。）
6.4. 使用時まで、37℃ 5 % CO2 インキュベーターに静置します。
7.
グリア細胞の播種
ラット胎児の海馬より採取したグリア細胞を培養して⼀ヶ月ほどのも
細胞のリング内への播種密度は、約 1.0~1.5×106cells/cm2 で
のを用意します。グリア細胞の採取、培養方法については参照プロ
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8.2. 必要量の 2.5 ％ FBS 含有共培養用培地を 15 mL チューブに
トコルをご覧ください。
7.1. トリプシン溶液をあらかじめ 37℃のウォーターバスであたためておきま
す。
分注し、予め 37 ℃のウォーターバスで 15 分以上加温し、安全キ
ャビネットに移しておきます（MED プレート 1 枚あたり 1 mL 必要で
7.2. インキュベーターからグリア細胞のシャーレを取り出し、安全キャビネッ
す）。
8.3. 37℃ 5% CO2 インキュベーターから細胞を培養しているプレートを
ト内に移します。
7.3. 培養上清を滅菌チューブに回収し、使用時まで 37℃のウォーターバ
スであたためておきます。
取り出し、安全キャビネットに移します。P1000 ピペットを使用して
培地の半量弱（700 μL）を取り除きます。
7.4. シャーレにあたためたトリプシン溶液を適量加えます（グリア細胞の
培養容器サイズによってトリプシン量は調整して下さい）。
8.4. P1000 ピペットを使用して、新しい 2.5 ％ FBS 含有共培養用培
地 1 ｍL を、チップの先をウェルの壁に添わせるようにして、ゆっくりと
7.5. シャーレを 37℃ 5 % CO2 インキュベーターに 3 分間静置します。
加えてください。液の添加スピードの衝撃で細胞が剥がれることがあ
7.6. シャーレを安全キャビネット内に移し、P1000 ピペット等を用いて、剥
ります。
8.5. プレートを 37 ℃ 5 % CO2 インキュベーターに戻します。プレートを
離した細胞を 15 mL チューブに回収します。
7.7. 400 × g で 5 分間遠心します。
安全キャビネットから出す時間（ステップ 8.3.〜8.4.）は 15 分以
7.8. 上清をアスピレーターで吸引除去し、適量の培地を加え、血球計測
内にして下さい。
盤等を用いて細胞数を計測します。
7.9. 細胞濃度が 5×104 cells/mL になるようにあたためておいた 7.3 の
培地を加えて調製します。
解凍播種後の細胞の状態
１．播種直後
7.10. P200 ピペット等を用いて、60 μL のグリア細胞懸濁液を下図のよ
うに播種します（播種細胞数３.0×103）。
ほとんどの細胞がシングルセルです。細胞が電極上に密に接着して
います。グリア細胞も丸い形状です。
このとき、まず MED プローブの電極中心上に⼀滴、次に電極周囲
に⼀滴ずつ 6~8 回ほど滴下し、最後にまた電極中心に⼀滴入れ
電極中心
て下さい。
MED プローブ
電極の周囲
8.
培地交換
day 3、day 7、day 14 に培地交換をおこないます。培地交換は半量
です。共培養用培地は用事調製とし、使用直前に調整して下さい。
8.1. コンディション Medium（10 % FBS 含有）と Maturation
Medium を 1:3 で混合して、2.5% FBS 含有共培養用培地を
播種方法に問題がなければ播種後 30 分程度で接着し、24 時間
後には神経線維が伸⻑しはじめます。
調整します。
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4
参照プロトコル
２．播種 3 日後
3 日後には神経線維が伸張している様子がほとんどの細胞で確
認され、周囲にもアストロサイト様のグリア細胞が観察されます。
グリア細胞の調整方法
＜必要試薬および培養器具＞
・ラット海馬由来神経細胞※注 12
電極周囲
・MACS Neuro Medium [Miltenyi Biotec, Cat. 130-093-570]
・MACS NeuroBrew-21 (x50) [Miltenyi Biotec, Cat.
130-097-263]
・Penicillin/Streptomycin [Wako, Cat. 168-23191]
・L-Glutamine [Invitrogen Corporation, Cat. 21051-024]
・Fetal Bovine Serum (FBS) [Wako, Cat. 517-87425]
・ポリ-D-リジン臭化⽔素塩酸 (PDL) [Sigma, Cat. P7886]
・12 ウェルプラスチックシャーレ [IWAKI, Cat.3815-012]
グリア細胞
・0.22 μm シリンジフィルター [TPP, Cat. 99722]
・テルモディスポシリンジ [TERUMO, SS-10SZ]
注 12．ラット胎児からの海馬由来神経細胞の採取の方法につきましては、
アルファメッド社の下記サイトにある、海馬由来神経細胞の初代培養をご
参考ください。
http://www.amedsci.com/support/support.html
＜グリア細胞用基本培地の調製方法＞
３．播種 10~14 日後
１． MACS Neuro Medium 500mL から 22 mL を 50 mL 遠沈
播種 10 日目ごろから測定が可能です。
管に取り出します。
２． 50 mL 遠沈管に L-Glutamine 40.7 mg を加えよく溶解しま
す。
14 日目電極中心
３．試薬が完全に溶解したら全溶液をフィルターに通し、22 mL 中 20
mL 取り、元の MACS Neuro Medium ボトルに戻します。
４．さらに Penicillin/Streptomycin を 5 mL、MACS
NeuroBrew-21 (x50) を 10 mL 加えたものを基本培地として
使用します。
＜グリア細胞培養方法＞
１．グリア細胞用基本培地に FBS を 10 %添加したものをグリア細胞
培養培地とします。
２．ポリ-D-リジン臭化⽔素塩酸 (PDL) を滅菌蒸留⽔に溶解させ、
0.005 %（50 μg/mL）PDL 溶液を調製し、12 ウェルをコート
して 37℃のインキュベーターで約 1 時間静置後、滅菌蒸留⽔で 2
回洗浄しておきます。
３． 0.005 ％ PDL 溶液であらかじめコートした 12 ウェルに培養培地
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5
指導、情報提供
を 4 mL 入れます。
４．ラット胎児より採取、調整した海馬由来神経細胞（海馬由来の
神経細胞、グリア細胞が混在しています）を密度が 3.0×104
東北⼯業⼤学⼯学部知能エレクトロニクス学科
鈴⽊郁朗講師
cell/cm2 となるように播種します。
５． 10-14 日後に培地を 2/3 量交換します。これ以降の培養から神
経細胞がいなくなりほとんどグリア細胞だけになります。
協⼒
アルファメッドサイエンティフィック株式会社
６．初回の培地交換以降は 1 週間毎に 2/3 量の培地交換を⾏いま
す。
７．播種後約 1 ヶ月培養したグリア細胞を共培養用に用いることをお勧
めします。
８．培養 1 ヶ月目ごろの培養上清をコンディションメディウムとして使用し
ます。全溶液をシリンジを用いて 0.22 μm フィルターに通して数
mL ずつ分注したものを－20℃にて冷凍保存します。
コンディションメディウムは、培養期間中(21 日間)に MED プローブ
1 枚あたり約 750 μL 使用しますので、実験のスケールに合わせて
ご準備下さい。
よくある質問
Q1. 解凍時間が 90 秒より⻑いとどうなりますか？
A1. ウォーターバス内で細胞が完全に解凍されると、⽣存率および⽣着
率が著しく低下しますのでご注意ください。
Q2. ピペッティング後も細胞の凝集塊が多く認められますが、シングルセル
になるまでピペッティングを繰り返したほうがいいですか？
A2. ⽣存率および⽣着率が低下するため、ピペッティングを繰り返すことは
お勧め致しません。凝集塊がありましても培養が可能です。
Q3. 細胞の遠心をアングルローターの遠心機で⾏ってもいいですか？
A3. 細胞のロスをふせぐために、遠心機はスウィングローターのものをお勧
めします。
製品の使用について
本品は研究用ですので、治療・診断目的には使用しないで下さい。また
本品を当社からの許可なしに、第三者への販売や商業目的に使用するこ
とを禁じます。
株式会社リプロセル
Website: https://www.reprocell.com
E-mail: [email protected]
www.reprocell.com
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