C6 Siti Fragili Comuni NET 2014 - e

Siti fragili comuni
-  si trovano in tutti gli individui sani
analizzati con una frequenza di
espressione variabile da individuo
ad individuo;
-  rappresentano un fenomeno inerente alla
struttura stessa della cromatina.
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I siti fragili comuni sono stati scoperti durante lo studio della sindrome dell’Xfragile. Infatti studiando individui sani e individui affetti, inibendo
parzialmente la replicazione del DNA, si osservò la presenza di lesioni non
casuali su tutti gli individui.
I siti fragili comuni rappresentano quindi una caratteristica intrinseca della
struttura cromatinica.
COSTRIZIONI SECONDARIE
I siti fragili comuni o costituzionali sono presenti come un
carattere costante in tutti gli individui, seppur con frequenze di
espressione diverse. Rappresentano quindi un fenomeno inerente
alla struttura stessa della cromatina.
La percentuale di metafasi che presentano CFRA può variare da
individuo a individuo e raramente sono state osservate frequenze
di espressione superiori al 30%.
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I SF comuni osservati più
frequentemente sono:
FRA3B
( 3p14)
FRA16D (16q23)
FRA7G
( 7q31)
FRA7H
( 7q32)
FRA6F
( 6q21)
FRAXB
( Xp22)
FRA7I
( 7q36)
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Localizzazione di alcuni Siti Fragili Comuni
in linfociti e fibroblasti
Debatisse et al., Trends in Genetics, 28 (1):22-32, 2012
The sites with the highest frequencies of breakage
in each cell type are boxed (major sites).
Note that most fragile
sites differ between
lymphocytes and
fibroblasts.
Exceptions are FRA16D
(16q23.2), a major site in
both cell types; FRA3B
(3p14.2), a major site in
lymphocytes but a minor
one in fibroblasts; and
7q31.1, a minor site in
both cell types.
Chromosomes ideograms
are a schematic
representation of bands
visible after Giemsa
staining and were taken
from:
http://
www.pathology.washingto
n.edu.
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Induzione citogenetica
•  Afidicolina inibitore della DNA polimerasi α e δ
•  5-azacitidina analogo della citosina incorporata nel DNA
•  BrdU analogo della timidina incorporata nel DNA
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SITI FRAGILI COMUNI
(In realtà estese regioni fragili )
•  presenti in tutti gli individui
•  componenti normali della struttura cromosomica
(costrizioni secondarie)
• 
regioni fragili (fino a 10 Mb)
•  nessun minisatellite associato
FRAGILITA ???
Analisi delle sequenze di alcuni siti fragili comuni
indotti da Afidicolina
Assenza di
sequenze
consenso
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Per i siti fragili comuni non è stata trovata alcuna espansione di trio dinucleotidi in grado di spiegare la fragilità…
E’ stato quindi usato un approccio che guardasse alla strutturale
tridimensionale di queste regioni piuttosto che alla struttura
primaria…
…ed è emerso che queste estese regioni mantengono delle
caratteristiche che sono altamente condivise:
• 
• 
• 
• 
Regioni ricche in AT e particolarmente flessibili
Ricche in elementi ripetuti
Colocalizzano con sequenze MAR
Sono spesso regioni a replicazione tardiva o ritardata
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Flessibilità
Regioni ricche in AT
Bend.it – TwistFlex – FlexStab
Misurano la flessibilità come variazione
dell’angolo di twist tra coppie di basi
adiacenti della doppia elica
Identificano mediante un algoritmo le
sequenze flessibili (100 bp - <1000 bp)
 A/T rich
 AT rich
 TA rich
Bend.it fornisce un grafico in cui sono
indicati I picchi di maggiore flessibilità

Interferenza con il processo di replicazione del DNA
Favorisce il ripiegamento in strutture secondarie
Ostacola l’attività della Topoisomerasi
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Elementi ripetuti interspersi
Percentuale elevata di elementi LINE, SINE, MIR, MER, LTR e TRASPOSONI
Formazione di strutture intra-molecolari stabili in grado di
- interferire con la replicazione
- produrre delezioni in presenza di meccanismi di riparo
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Regioni di attacco alla Matrice
MAR - Matrix Attachment Region
MARwiz
Rallentamento della replicazione del DNA
MAR – Potenziali origini di replicazione
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Modello proposto per l espressione
dei siti fragili comuni
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Il significato biologico ed evolutivo dei SF rimane enigmatico. Sono siti evolutivamente
conservati [dal lievito ai mammiferi] ma potenzialmente dannosi per l organismo…
Nell ultimo decennio è stato ipotizzato un ruolo meccanicistico svolto dai SF
nell insorgenza e nella progressione tumorale.
Coincidente localizzazione delle bande in cui sono presenti oncogeni e quelle in cui sono
mappati taluni SF (Sutherland 1985).
In seguito a trattamento con 16 mutageni e carcinogeni il 67% dei punti di rottura
cromosomica coincide con la localizzazione di SF (Yunis and Soreng, 1987).
I SF sono i siti di inizio e reintegrazione nell amplificazione genica intracromosomica
tramite cicli di rottura-fusione-ponte in condizioni di ipossia (Coquelle et al. 1997)
Di recente è stata analizzata la frequenza d espressione dei siti fragili comuni in pazienti affetti dal cancro al colon,
alla mammella, ai polmoni e al collo e testa. In tutti i casi è stato riscontrato un significativo aumento, presente anche
nei parenti di primo grado non affetti da neoplasia.
Ciò lascia intravedere la prospettiva di approntare dei test per misurare la suscettibilità genetica ad alcune forme
tumorali.
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Caratteristiche principali dei siti fragili comuni
• 
• 
• 
• 
• 
punti caldi per lo scambio tra cromatidi fratelli
siti di traslocazioni cromosomiche
siti di delezioni cromosomiche
siti di amplificazione genica (ciclo rottura-fusione-ponte)
siti di integrazione per virus e DNA plasmidico
Regioni normalmente stabili in coltura, ma in presenza di agenti
inibitori della replicazione, manifestano caratteristiche di DNA
altamente instabile e ricombinogeno
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Il cancro come malattia genica
•  Mutazioni a carico di due principali classi di geni:
Geni soppressori tumorali – ostacolano la crescita del tumore, la
loro perdita favorisce la progressione tumorale
Proto-oncogeni – geni cellulari la cui alterazione qualitativa o
quantitativa favorisce la tumorigenesi
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Ruolo meccanicistico dei SF nella trasformazione
tumorale
1. Siti preferenziali di integrazione di
virus oncogeni
Alterazione di proto-oncogeni cellulari
Interruzione di geni soppressori tumorali
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2. Delezione di geni soppressori tumorali
FRA3B
es. FRA3B e il gene FHIT
•  regione 3p14.2
•  sito fragile indotto dall afidicolina. E quello che ha la maggiore frequenza di espressione
nel genoma umano,
•  si estende per circa 500 Kb
•  sito d integrazione del papillomavirus-16 umano (HPV16)
Questa regione è deleta in omozigosi in diverse forme tumorali, compresa una traslocazione
reciproca con il cromosoma 8 presente nel carcinoma renale familiare (hRCC).
Coincidenza con un sito già caratterizzato dall integrazione di HPV-16 nel carcinoma della
cervice uterina.
Tutto ciò ha suggerito la presenza di un gene tumor-suppressor
Nella regione FRA3B è stato identificato il gene FHIT
(Fragile Histidine Triad)
Il locus FHIT ( 1.5 Mb) è composto da 10 esoni, l esone
5 si trova nella regione fragile deleta in omozigosi in
molte neoplasie.
L mRNA risulta assente o ridotto in molti tessuti
tumorali.
La proteina FHIT (16.8 kDa) è un enzima con attività di
diadenosina trifosfato idrolasi che scinde ApppA in ADP
e ATP in vitro.
Studi su interazioni proteina-proteina, linee cellulari
tumorali e topi knockout suggeriscono un ruolo della
proteina FHIT nella proliferazione cellulare e nell
apoptosi.
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Sono state sequenziate 870 kb del locus FHIT/FRA3B, dall esone 3 all esone 7 del gene. Il
locus è ricco in AT e ha poche sequenze Alu. Non sono presenti altre sequenze geniche.
Sono presenti regioni di alta flessibilità, considerate responsabili della fragilità cromosomica.
FRA16D (16q32.2)
Le rotture e le decondensazioni si estendono in una regione di almeno 1 Mb.
E tra i più grandi SF clonati fino a questo momento.
I marcatori presenti in FRA16D risultano deleti in tumori della prostata, della
mammella e ovarici indicando che la perdita di questa regione può essere
importante nello sviluppo o nella progressione di queste neoplasie.
Inoltre una traslocazione t(14q32;16q23) è stata osservata in più del 25% di tutti
i mielomi multipli.
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Il protooncogene MAF è stato identificato nella regione FRA16D, la sua espressione risulta
aumentata in seguito alla traslocazione presente in alcuni mielomi multipli.
Tre laboratori hanno identificatoin modo indipendentemente il gene FOR (WWOX o WOX1)
nella regione FRA16D.
La proteina codificata è un ossidoriduttasi in grado di prendere parte al processo di apoptosi
e di interagire con p53 e altre proteine coinvolte nella tumorigenesi.
FRA16D - WWOX
Regione deleta in diversi tipi di
tumori
Delezioni mappano all’interno del
gene WWOX
WWOX è stato classificato come gene soppressore tumorale probabilmente coinvolto nei
processi apoptotici
Topi KO per WWOX sviluppano tumori precocemente rispetto a topi di controllo
Sono in corso studi sulla funzione di questo gene come onco-soppressore, si conosce la
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funzione come ossidoreduttasi, ma non si sono ancora trovati interattori certi.
O'Keefe & Richards. Common chromosomal fragile sites and cancer: Focus on FRA16D. Cancer Letters, 232(1):37–47, 2006.
http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2005.07.041
Fig. 1. FRA16D associated DNA instability in cancer and the WWOX (FOR) gene.
Diagram represents the cytogenetic location of FRA16D and the corresponding locations
of loss-of-heterozygosity regions mapped in prostate and breast cancers; translocation
breakpoints in multiple myeloma and homozygous deletions in adenocarcinomas.
The location of the WWOX (FOR) gene including its 780 Kb intron is also depicted.
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FRA7G (7q31.1)
Le rotture indotte dall afidicolina si verificano in una regione di almeno 300 kb.E
presente in essa una sequenza retrovirale endogena.
Coincidente localizzazione con regioni delete in varie forme tumorali quali il carcinoma
del colon e l adenocarcinoma ovarico.
Presenza di un putativo gene soppressore tumorale. Nella regione sono presenti i geni
codificanti la caveolina 1 e la caveolina 2, Il primo gene è in grado di indurre apoptosi e
sopprimere la crescita in alcune linee tumorali ma non risulta alterato nelle linee
tumorali che presentano la delezione della regione FRA7G.
E stato identificato un gene che presenta omologia di sequenza con il gene murino della
testina.
Il gene è espresso in tutti i tessuti umani e risulta mancante o in quantità ridotta in alcune
neoplasie analizzate.
Resta ancora da analizzare il ruolo effettivamente svolto dal gene nella tumorigenesi.
L analisi di sequenza ha rivelato regioni ad alta flessibilità e bassa stabilità.
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FRA7H (7q32.3))
E stata identificata e sequenziata una regione di 161 kb.Sono state così riscontrati
numerosi tratti di DNA in grado di assumere strutture inusuali e sequenze con alta
flessibilità e bassa stabilità.
FRA6F( 6q21)
Si estende per circa 1200 bp, con due punti principali di rotture cromosomiche. La sequenza
è ricca di elementi ripetuti e regioni ad alta flessibilità. Presenta delezioni in varie forme di
leucemia e tumori solidi (Parkin gene).
FRAXB (Xp22.3)
Localizzato in Xp22.3. Si estende su una regione genomica di almeno 500 kb in cui mappano tre
geni conosciuti, uno dei quali codifica per la steroide sulfatasi microsomiale
Sono state riscontrate delezioni a carico della regione fragile in vari tumori primari e linee
cellulari tumorali
FRA7I (7q36)
Presente sul cromosoma 7 in posizione q35, è stato caratterizzato da poco tramite FISH e
sembra estendersi per più di 2 Mb.
A monte del SF si trova il gene PIP (prolactin-inducible protein) sopra-espresso nell 80%
dei tumori alla mammella primari e metastatici.
FRA9E (9q32)
Si estende per ben 9 Mb.E localizzato in 9q32.33.1.
Nella stessa regione è situato il gene PAPPA (pregnancy-associated plasma protein-A)
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Che presenta LOH nel 50% dei tumori ovarici
Geni presenti all interno di siti fragili
comuni coinvolti in processi tumorali
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3. Amplificazione di proto-oncogeni
Amplificazione selettiva di una regione
intracromosomica tra due siti fragili adiacenti
mediata dal ciclo di rottura-fusione-ponte
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FRA7I e il gene PIP
Duplicazione di PIP
FRA7I
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Quindi…
• 
• 
• 
I siti fragili comuni sono estese regioni di fragilità che arrivano a coprire anche diverse
Mb del genoma
Rappresentano una caratteristica strutturale del cariotipo [costrizioni secondarie] e la
loro conservazione fa supporre un loro ruolo biologico importante
Non si conosce la causa della fragilità in queste regioni, ma è stato dato un ruolo
meccanicistico nello sviluppo tumorale
- Durkin SG, Glover TW 2007
Chromosome fragile sites.
Annu Rev Genet. 2007;41:169-92.
Referenze
- Lukusa T, Fryns JP 2007
Human chromosome fragility.
Biochim Biophys Acta. 2008 Jan;1779(1):3-16.
- Glover TW 2006
Common fragile sites.
Cancer Lett. 2006 Jan 28;232(1):4-12. Epub 2005 Oct 17. Review.
- Freudenreich CH 2007
Chromosome fragility: molecular mechanisms and cellular consequences
Front in Biosc. 2007;12:4911-4924.
- Debatisse M et al. 2011
Common fragile sites: mechanisms of instability revisited.
Trends in Genetics, 28 (1):22-32, 2012.
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