Il Challenge Test Integrato

Il Challenge Test Integrato
un nuovo modello di valutazione quantitativa del rischio Listeria nei prodotti RTE
Marco Romani
Direttore Scientifico Chelab Silliker Italy
21 maggio 2014
Chelab Silliker Symposium
Challenge Test
Growth Potential:
Maximum Growth Rate:
Studio realistico
Microbiologia
g predittiva
p
Calcoli soltanto con dati a t=0
No fase latenza, fase stazionaria
No interazione LAB - L.m.
AFSSA guide, november 2008
2
Proposta Chelab-Silliker
Effetto Anti-Listeria
Challenge
test GP
Interazione
LAB – L. m.
Challenge
test MGR
Integrated Challenge
test
3
Proposta Chelab-Silliker:
Challenge Test Integrato
Perché integrato?
Partendo dall’interazione tra la flora lattica indigena e L.monocytogenes
Prende in considerazione tutti i p
parametri di crescita di entrambe le popolazioni
p p
microbiche
Growth
Rate
Studio realistico
Fase
latenza
Fase
stazionaria
4
Proposta Chelab-Silliker:
Challenge Test Integrato
Perchè Challenge Test?
E’ una prova di laboratorio risultati sperimentali
Questi dati sperimentali vengono utilizzati per effettuare una
predizione
di i
attraverso
tt
un calcolo
l l
Utili
Utilizzo
d
della
ll microbiologia
i
bi l i
predittiva
5
Challenge Test integrato
Numero di lotti: almeno 3
Numero di unità campionarie per lotto: 3
Scelta dei ceppi: mix di ceppi (alimentari , ATCC, ambientali)
Preparazione dell’inoculo:
condizionare il mix ceppi in TSB per 1 settimana a 8°C
Determinazione della caratteristiche chimico-fisiche al tempo 0
Preparazione delle unità campionarie: alimento omogeneo o no
6
Challenge Test integrato
P
Procedura
d
di inoculo:
i
l
i
inoculare
l
le
l unità
ità campionarie
i
i con il mix
i di ceppii
Concentrazione inoculo: 30- 50 UFC/g
g di prodotto
Condizioni di stoccaggio: 12°C fino alla fase stazionaria della flora lattica e
di L.m.
Analisi microbiologiche:
C t giornaliera
Conta
i
li
di
di:
- L. monocytogenes (ISO11290-02:2005)
- Lactobacillus spp.
pp ((ISO15214:1998))
Fino al raggiungimento
d ll fase
della
f
stazionaria
t i
i
7
Challenge Test integrato
Dati sperimentali: conta giornaliera (t, Log UFC/g) 
Combase DMfit
Parametri di crescita a 12°C
Fase latenza (giorni)
Tasso di crescita (Log/giorni)
Media di 9 dati
Fase stazionaria
(giorni , Log UFC/g)
Dati predittivi:
estrapolazione del tasso di crescita e della fase lag ad altre temperature
(4-8°C) attraverso software predittivi e calcoli matematici
Caratterizzazione della flora lattica:
Al termine del test , agar well test  effetto anti-Listeria
8
Challenge Test integrato
Calcoli:
Predire la massima concentrazione di
L.monocytogenes
x ogni profilo
tempo-temperatura
p
p
Validazione del modello: comparazione statistica con i dati sperimentali
Modello di valutazione quantitativa del rischio
9
Challenge Test integrato:
paté di fegato
3 unità campionarie x 3 lotti 9 UC
Temperatura incubazione: 12°C
mix di ceppi di L. monocytogenes :1,6 Log UFC/g
Conta
C
t giornaliera:
i
li
L. monocytogenes (ISO11290-02:2005)
Lactobacillus spp. (ISO15214:1998)
Combase DMfit
LAB
Fase
latenza
(giorni))
(g
12°C
1,05
LAB
LAB
Growth
Fase staz.
Rate
(Log
((Log/giorni)
gg
)
g)
UFC/g)
1,70
LAB
Fase staz.
(giorni)
L.m.
Fase
latenza
(giorni))
(g
5,22
1,26
8,96
L.m.
L.m.
Growth
Fase staz.
Rate
(Log
((Log/giorni)
gg
)
g)
UFC/g)
0,66
3,22
L.m.
Fase staz.
(giorni)
4,79
media di 9 dati
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
10
Dati sperimentali e predittivi
LAB
Fase
latenza
(giorni)
12°C
1 05
1,05
LAB
LAB
Growth
Fase staz.
Rate
(Log
(Log/giorni)
UFC/g)
1 70
1,70
LAB
Fase staz.
(giorni)
L.m.
Fase
latenza
(giorni)
5 22
5,22
1 26
1,26
8 96
8,96
SSSP software (LAB)
4°C
8°C
LAB
Growth Rate
(Log/giorni)
0,37
0 92
0,92
L.m.
L.m.
Growth
Fase staz.
Rate
(Log
(Log/giorni)
UFC/g)
0 66
0,66
3 22
3,22
L.m.
L
m
Fase staz.
(giorni)
4 79
4,79
Combase predictor (L.m.)
Growth rate 
rapporto
4°C
8°C
L.m.
L
Growth Rate
(Log/giorni)
0,15
0 33
0,33
Fase latenza stato fisiologico = 1/10(Growth Rate x fase latenza)
LAB
Fase latenza
(giorni)
L.m.
Fase latenza
(giorni)
4,78
4
78
1,95
5,62
5
62
2,52
4°C
8°C
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
11
Procedimento per ottenere i
dati predittivi
GRpred 4°C : GRpred 12°C = GRsper. 4°C : GRsper. 12°C
x
Baranyi & Roberts:
Stato fisiologico= 1/10 GR x fase latenza
GR4°C x fase lag 4°C = GR12°C x fase lag 12°C
x
Validazione del modello
3 Challenge test x 3 lotti
4 giorni 4°C
4 C + 4 giorni 8
8°C
C + 4 giorni 12
12°C
C
Concentrazione L.m. e LAB al t=0
+
12°C
4°C
8°C
LAB
Fase lag
(gg)
LAB
Growth
Rate
(Log/gg)
L.m.
Fase lag
(gg)
L.m.
Growth
Rate
(Log/gg)
1,05
4,78
1 95
1,95
1,70
0,37
0 92
0,92
1,26
5,62
2 52
2,52
0,66
0,15
0 33
0,33
12°C
LAB
Fase staz.
(Log UFC/g)
LAB
Fase staz.
(gg)
L.m.
Fase staz.
(gg)
8,96
5,22
4,79
Max concentrazione
sperimentale di L.m.
Comparazione
statistica
Max cocentrazione
predittiva di L.m.
Differenza di giorni = 0,43
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
13
Step del calcolo
Gli step del calcolo predittivo dipendono dalla presenza o meno dell’effetto
anti-Listeria
Effetto anti-Listeria:
Agar well test +
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
Concentrazione critica
della flora lattica
(>300.000.000 UFC/g)
14
Step
p del calcolo
Step del calcolo in presenza dell’effetto anti-Listeria
1. Tempo della flora lattica per raggiungere la fase stazionaria
2.
Tempo di crescita di L. monocytogenes
3.
Max concentrazione di L. monocytogenes
?
? ?
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
15
Procedimento
1. Tempo della flora lattica per raggiungere la fase stazionaria
LAB t=0
(Log UFC/g)
2,94
LAB
Fase lag
4°C
4
C (gg)
4,78
LAB
Fase lag
8°C
8
C (gg)
1,95
LAB
Growth
rate 8°C
8C
LAB
Growth rate
12°C
12
C
(Log/gg)
(Log/gg)
0,92
1,70
LAB fase staz.
12°C
(Log CFU/g)
8,96
0,78 gg : 4,78 gg = 0,16 frazione fase lag 8°C
0,16 x 1,95 gg = 0,32 gg estensione della fase lag a 8°C
4 gg– 0,32 gg = 3,68 gg tempo di crescita a 8°C
3,68 gg x 0,92 Log/gg = 3,39 Log crescita a 8°C
3,39 Log + 2,94 Log UFC/g = 6,33 Log UFC/g concentrazione dopo 8 gg
8,96 Log UFC/g – 6,33 Log UFC/g = 2,63 Log crescita a 12°C
2,63 Log : 1,70 Log/gg = 1,55 gg tempo di crescita a 12°C
4 gg (4°C) + 4 gg (8°C) + 1
1,55
55 gg (12°C) = 9,55
9 55 gg
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
16
Procedimento
2 Tempo di crescita di L.
2.
L monocytogenes :
Tempo
p di crescita
(gg)
L.m. LAB
Differenza di
giorni
9 55 gg
9,55
0 43 gg
0,43
9 55 gg – 0,43
9,55
0 43 gg = 9,12
9 12 gg
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
17
Procedimento
3. Max concentrazione di L. monocytogenes
L.m.
tt=0
0
L.m.
Fase lag
4°C
4
C (gg)
L.m.
Fase lag
8°C
8
C (gg)
(Log UFC/g)
L.m.
Growth
rate 8°C
8C
L.m.
Growth rate
12°C
12
C
(Log/gg)
(Log/gg)
L.m.
Tempo di
crescita
12°C
(gg)
1,60
5,62
2,52
0,33
0,66
9,12
1,62 gg : 5,62 gg = 0,29 frazione della fase di latenza a 8°C
0,29 x 2,52 gg = 0,73 gg estensione della fase di latenza a 8°C
4 gg – 0,73 gg = 3,27 gg tempo di crescita a 8°C
3,27 gg x 0,33 Log/gg = 1,08 Log crescita a 8°C
1,08 Log + 1,60 Log UFC/g = 2,68 Log UFC/g concentrazione dopo 8 gg
9,12 gg – 8 gg = 1,12 gg tempo di crescita a 12°C
1,12 gg x 0,66 Log/gg = 0,74 Log crescita a 12°C
2 68 Log
2,68
L UFC/g
UFC/ + 0,74
0 74 L
Log = 3,42
3 42 L
Log UFC/
UFC/g= 2.630
2 630 UFC/
UFC/g
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
18
Validazione del modello
Dati
Dati
predittivi sperimentali Differenza
(Log UFC/g) (Log UFC/g)
1° lotto A
3,42
3,74
-0,31
1° lotto B
1
3 33
3,33
3 72
3,72
-0 39
-0,39
1° lotto C
3,47
4,15
-0,68
2° lotto A
3,61
3,90
-0,29
2° lotto B
3 54
3,54
3 80
3,80
-0,26
0 26
2° lotto C
3,46
3,95
-0,49
3° lotto A
3,42
3,52
-0,10
3° lotto
l tt B
3 39
3,39
3 70
3,70
-0,31
0 31
3° lotto C
3,21
3,51
-0,30
3,43
3,78
-0,35
media
0 12
0,12
0 20
0,20
0 16
0,16
Dev.stand.
D
t d
Challenge
test
t-Test
Differenza statistica 95%
-0,47
Intervallo di confidenza (95%) = media ± 2,31 x DS / V n
-0 23
-0,23
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
19
Shelf life
Listeria assente/25 g
Listeria assente /125 g
Tempo
(gg)
L.m.
(Log UFC/g)
Tempo
(gg)
L.m.
(Log UFC/g)
0
-1,4
14
0
-2,1
21
1
-1,4
1
-2,1
2
-1,4
2
-2,1
3
-1,4
3
-2,1
4
-1,4
4
-2,1
5
-1
1,31
31
5
-2
2,01
01
6
-0,98
6
-1,68
7
-0,65
7
-1,35
8
-0,32
8
-1,02
9
0,34
9
-0,36
9,12
9,
0,42
0,
9,12
9,
-0,28
0, 8
Studio presentato a IAFP Symposium, Marsiglia 2013
20
Applicazioni pratiche
C
Campione:
i
patè
tè di fegato
f
t
Giorno di produzione: 29 marzo 2012
scadenza:15 aprile 2012
prelievo: 4 aprile 2012
Dopo 6 giorni di shelf life:
L. monocytogenes:
presenza di L.
L monocytogenes in 25 g (EN ISO 11290-01)
11290 01)
L. m. <10 CFU/g  sensibilità del metodo 10 CFU/g
(EN ISO 11290-2)
L. m. = 1,66 CFU/g  sensibilità del metodo 1 CFU/g
CBT:
(EN ISO 4833
4833, 2003) 500.000
500 000 CFU/g
dati storici CBT = flora lattica = 500.000 UFC/g
Valore reale
21
Precisazioni
I seguenti calcoli sono stati eseguiti soltanto con i dati
sperimentali ottenuti dai challenge tests condotti a:
 4°C
 8°C
 12°C
LAB
Fase lag
(gg)
LAB
Growth Rate
(Log/gg)
LAB
Fase staz.
(Log UFC/g)
LAB
Fase staz.
(gg)
L.m.
Fase lag
(gg)
L.m.
Growth Rate
(Log/gg)
L.m.
Fase staz.
(Log UFC/g)
L.m.
Fase staz.
(gg)
4°C
2.82
0.34
8.39
20.41
4.09
0.11
2.87
19.12
8°C
1.21
0.85
8.56
8.59
2.42
0.37
3.09
7.5
12°C
12
C
0 65
0.65
1 47
1.47
87
8.7
5 13
5.13
1 24
1.24
07
0.7
3 14
3.14
4 41
4.41
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
22
°
1
Simulazione
Condi ioni di stoccaggio:
Condizioni
stoccaggio
da t=0 a t=5 gg  4°C
Rimanente shelf life  8
8°C
C
Data
D
t lla concentrazione
t i
d
della
ll flora
fl
lattica
l tti
e di L.m. al 6° giorno di shelf life
Quale sarà la max concentrazione di
L. monocytogenes a 8°C?
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
23
Calcolo predittivo
4 8
48°C
C
In via cautelativa,
cautelativa si assume che L.
L monocytogenes = 9 UFC/g
L. m. : Log 9 UFC/g = 0,95 Log UFC/g (sensibilità del metodo 10 UFC /g)
LAB: Log 500.000 UFC/g = 5,70 Log UFC/g
8°C
LAB
Fase lag
(gg)
LAB
Growth Rate
(Log/gg)
LAB
Fase staz.
(Log CFU/g)
LAB
Fase staz.
(gg)
L.m .
Fase lag
(gg)
L.m .
Growth Rate
(Log/gg)
L.m.
Fase staz.
(Log CFU/g)
L.m.
Fase staz.
(gg)
1.21
0.85
8.56
8.59
2.42
0.37
3.09
7.5
 A 8°C L.m. raggiunge la fase stazionaria 1,09 gg prima della flora lattica
8,56 Log UFC/g – 5,70 Log UFC/g = 2,86 Log  crescita della flora lattica
2 86 Log/ 0,85
2,86
0 85 Log/gg = 3
3,37
37 gg crescita della flora lattica
3,37 gg– 1,09 gg = 2,28 gg  L. m. Tempo di crescita
2,28 gg x 0,37 Log/gg = 0,84 Log crescita L. m.
0,84 Log + 0,95 Log UFC/g =1,79
1,79 Log UFC/g = 62 UFC/g  Max conc. L.m. 8
8°C
C
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
24
Calcolo predittivo
4-8
8° C
Sensibilità del metodo L.m.
L m 1 UFC/g
4°C
8°C
L.m. UFC/g
g
Log UFC
C/g
LAB UFC/g
Tempo (gg)
Dati predittivi
t=0:
L. m. = 0,56 UFC/g
LAB = 12.900 UFC/g
Valori reali
t = 6 gg:
L. m. = 1,66 UFC/g
LAB = 500.000 UFC/g
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
Dati predittivi
t = 8,28 gg:
L m.
L.
m = 12 UFC/g
25
Metodo del growth potential
4-8
8°C
C
Se non fosse stato attuato il Challenge Test integrato…
Metodo del growth potential:
Growth Potential: 1,31
1 31 Log
0,95 Log UFC/g + 1,31 Log = 2,26 Log UFC/g  182 UFC/g
0 22 Log UFC/g + 1
0,22
1,31
31 Log = 1
1,53
53 Log UFC/g  33,88
33 88 UFC/g
(sensibilità del metodo 10 UFC/g)
(Sensibilità del metodo 1 UFC/g)
Max concentrazione di
L monocytogenes
L.
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
26
Metodo del Max growth rate
4-8
8°C
C
Se non fosse stato attuato il Challenge Test integrato…
Metodo del Max Growth Rate :
0,37 Log/gg x 11gg = 4,07 Log crescita di L. monocytogenes
4,07 Log + 0,95 Log UFC/g = 5,02 Log UFC/g  105.000 UFC/g
(sensibilità del metodo 10 UFC/g)
4 07 Log + 0
4,07
0,22
22 Log UFC/g = 4
4,29
29 Log UFC/g 19.500
19 500 UFC /g
(
(sensibilità
ibilità d
dell metodo
t d 1UFC/g)
1UFC/ )
max concentrazione di
y g
L. monocytogenes
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
27
°
2
Simulazione
Condizioni di stoccaggio:
da t=0 a t=5 gg  4°C
Rimamente shelf life  12°C
Data
D
t lla concentrazione
t i
d
della
ll flora
fl
lattica
l tti
e di L.m. al 6° giorno di shelf life
Quale sarà la max concentrazione di
L. monocytogenes a 12°C?
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
28
Calcoli predittivi
4 - 12
12°C
C
In via cautelativa,
cautelativa si assume che L.
L monocytogenes = 9 UFC/g
L. m. : Log 9 UFC/g = 0,95 Log UFC/g (sensibilità del metodo 10 UFC /g)
LAB: Log 500.000 UFC/g = 5,70 Log UFC/g
12°C
LAB
Fase lag
g
(gg)
LAB
Growth Rate
(Log/gg)
LAB
Fase staz.
(Log UFC/g)
LAB
Fase staz.
(gg)
L.m .
Fase lag
g
(gg)
L.m .
Growth Rate
(Log/gg)
L.m.
Fase staz.
(Log UFC/g)
L.m.
Fase staz.
(gg)
0.65
1.47
8.7
5.13
1.24
0.7
3.14
4.41
 A 12
12°C
C L.m.
L m raggiunge la fase stazionaria 0
0,72
72 gg prima della flora lattica
8,70 Log UFC/g – 5,70 Log UFC/g = 3,00 Log  crescita della flora lattica
3 00 Log
3,00
L /1
1,47
47 Log/gg
L /
= 2,04
2 04 gg  tempo
t
di crescita
it della
d ll flora
fl
lattica
l tti
2,04 gg – 0,72 gg = 1,32 gg  tempo di crescita di L.m.
1,32 gg x 0,7 Log/gg = 0,93 Log crescita di L.m.
0 93 Log
0,93
L + 0,95
0 95 L
Log UFC/g
UFC/ = 1,88
1 88 L
Log UFC/g
UFC/
76 UFC/g
UFC/ Max
M conc. L.m.
L
12°C
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
29
Calcolo predittivo
4 - 12°C
Sensibilità del metodo 1 UFC/g
g
4°C
12°C
L m UFC/g
L.m.
Log UFC//g
L
LAB UFC/g
Time (gg)
REAL VALUES
PREDICTED VALUES
t=0:
L. m. = 0,26 UFC/g
LAB = 3.100 UFC/g
t = 6 gg:
L. m. = 1,66 UFC/g
LAB = 500
500.000
000 UFC/g
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
PREDICTED VALUES
t = 7,32 gg:
L. m. = 14 UFC/g
30
Metodo del growth potential
4 - 12
12°C
C
Se non fosse stato attuato il Challenge Test integrato…
Metodo del growth potential:
Growth Potential: 1,73 Log
0,95 Log UFC/g + 1,73 Log = 2,68 Log UFC/g  480 UFC/g (sensibilità del metodo 10 UFC/g)
0 22 Log UFC/g + 1
0,22
1,73
73 Log = 1
1,95
95 Log UFC/g 
89 UFC/g
(sensibilità del metodo 1 UFC/g)
Max concentrazione di
L. monocytogenes
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
31
Metodo del Max growth rate
4 - 12
12°C
C
Se non fosse stato attuato il Challenge Test integrato…
Metodo del Max Growth Rate:
0,70 Log/gg x 11gg = 7,70 Log crescita L. monocytogenes
7,70 Log+0,95 LogUFC/g=8,65 Log UFC/g 450.000.000 UFC/g (sensibilità del metodo 10 UFC/g)
7,70 Log+0,22 LogUFC/g=7,92 Log UFC/g 83.000.000 UFC/g
(sensibilità del metodo 1 UFC/g)
Max concentrazione di
L. monocytogenes
Dati mostrati a IAFP Symposium, Varsavia 2012
32
Step del Calcolo
Step
p del calcolo in assenza dell’effetto anti-Listeria
1. Max concentrazione di L. monocytogenes ≈ metodo del MGR
Log UFC/g
Flora lattica
?
33
Applicazioni pratiche
Insalata RTE
Condizioni di stoccaggio
azienda
1 gg 6°C
Supermercato/consumatore
7 gg 12°C
Quale sarà la massima concentrazione di L.m. alla fine della shelf life?
L.m supererà il limite di 100 UFC/g al termine della shelf life?
Challenge
Test
Ch ll
T t integrato
i t
t
34
Step del calcolo
1. Max concentrazione di L. monocytogenes
L.m. t=0
(Log UFC/g)
1,54
L.m. fase
latenza 6°C
L.m. tasso
crescita 6°C
L.m. tasso
crescita 12°C
(gg)
(Log/gg)
(Log/gg)
assente
0,27
0,80
1,54 Log UFC/g + 0,27 Log = 1,81 Log UFC/g concentrazione L.m. dopo il 1° gg
8 gg – 1 gg = 7 gg (tempo di crescita L.m. a 12°C)
7 gg x 0
0,80
80 Log/gg = 5,59
5 59 Log crescita L.m.
L m a 12°C
12 C
1,81 Log UFC/g + 5,59 Log = 7,40 UFC/g concentrazione finale
Valore sperimentale 6-12°C
6 12 C  7,08 Log UFC/g
sovrastima
0,32 Log
35
Shelf life
Listeria assente /25 g
Listeria assente /125 g
Temperatura
((°C)
C)
Tempo
(gg)
L.m.
(Log UFC/g)
Temperatura
((°C)
C)
Tempo
(gg)
L.m.
(Log UFC/g)
6
0
-1,4
6
0
-2,1
12
1
,
-1,13
12
1
,
-1,83
12
2
-0,33
12
2
-1,03
12
3
0,47
12
3
-0,23
12
4
1 27
1,27
12
4
0 57
0,57
12
4,91
2,00
12
5
1,37
12
5,79
2,00
La reale shelf life è inferiore a 8 giorni!
36
Shelf life
Insalata RTE
Pseudomonas spp. attività
antilisteria
37
Sviluppi futuri
Applicare il Challenge Test integrato a:
Prodotti con una flora lattica non omogenea
- affettati
Prodotti stoccati a temperature variabili
38
Conclusioni
1 Modello realistico ed accurato
1.
2. Data la concentrazione dei batteri lattici e di L. monocytogenes in
qualsiasi momento della shelf life, è possibile stabilire:
 Max concentrazione di L. monocytogenes
 Tempo per raggiungere 100 UFC/g di L.m.
L m  shelf life
 Max concentrazione giornaliera di L.m. per non superare 100 UFC/g
3. Modello può essere applicato a matrici omogenee o no con:


Growth Potential > 0,5
0 5 Log UFC/g
Flora antagonista con o senza attività anti-Listeria
39
GRAZIE PER L
L’ATTENZIONE
ATTENZIONE
Marco Romani
[email protected]
0574-4791
40

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