ı. sınıf tıbbi mikrobiyoloji laboratuvar föyleri - E

I. SINIF
TIBBİ MİKROBİYOLOJİ
LABORATUVAR FÖYLERİ
2014-2015
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-1
Mikrobiyoloji Laboratuvarında Kullanılan Araç ve Gereçler
Dersin Amacı
Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçlerin tanıtılması
ve kullanım amaçlarının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Tutum
Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçleri sıralar.
Bu araç ve gereçlerin ne amaçla kullanıldığını açıklar.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçler
Giriş
Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında en sık kullanılan araç ve gereçler aşağıda sıralanmıştır.
1. Deney tüpleri: Serolojik deneyler, besiyeri hazırlanması, santrifüj ve çeşitli amaçlar için
kullanılan farklı boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde cam veya ısıya dayanıklı
plastikten yapılmış malzemelerdir.
Şekil 1-1. Tüpler
2. Plastik santrifüj tüpleri: 1.5, 2, 15, 50ml hacimlere sahip kapaklı tüplerdir.
Şekil 1-2. Plastik santrifüj tüpleri
1
3. Pipet: Çeşitli boyutlarda ve kapasitede olan, istenilen miktarda sıvıyı alarak başka bir yere
aktarmada kullanılan, ince, uzun, üzeri dereceli silindir şeklinde malzemelerdir.
Şekil 1-3. Pipet
4. Otomatik pipetler: Özellikle mikro yöntemlerle çalışıldığında çok küçük hacimleri
aktarmaya ve dağıtmaya yarayan pipetlerdir.
Şekil 1-4. Otomatik pipetler
5. Otomatik pipet ucu: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan plastik uçlardır.
Şekil 1-5. Otomatik pipet uçları
6. Mezür: Çeşitli boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde üzeri dereceli cam veya plastikten
yapılmış kaplardır. Sıvı maddelerin ölçümünde kullanılır.
Şekil 1-6. Mezürler
2
7. Pastör pipeti: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan, uç kısmı ince cam veya plastik
pipetlerdir.
Şekil 1-7. Pastör pipeti
8. Balon: Geniş küre şeklinde gövdesi ve dar silindir şeklinde boynu bulunan, tabanı düz cam
malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin hazırlanmasında
kullanılır.
Şekil 1-8. Çeşitli boyutlardaki balonlar
9. Beher: Silindir şeklinde, su bardağını andıran, çeşitli hacimlerde olabilen cam veya plastik
kaplardır.
Şekil 1-9. Çeşitli boyutlardaki beherler
10. Erlenmayer: Kısa silindir şeklinde boynu, koni şeklinde gövdesi olan geniş ve düz tabanlı
cam malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir.
Şekil 1-10. Çeşitli boyutlardaki erlenmayerler
3
11. Şişeler: Çeşitli boyut ve hacimlerde olabilen ve çeşitli amaçlarla kullanılabilen cam
malzemelerdir (örneğin damlalıklı şişe, hemokültür şişeleri, koyu renkli şişeler,...)
Şekil 1-11. Çeşitli boyutlardaki şişeler
12. Tüp Taşıyıcıları (sporlar): Çeşitli büyüklükteki tüpleri taşımaya yarayan araçlardır.
Şekil 1-12. Tüp taşıyıcıları (sporlar)
13. Eküvyon çubuğu (Silgiç): Uçlarına su emici (hidrofil) pamuk sarılmış steril çubuklardır.
Çeşitli vücut bölgelerinden inceleme örneklerinin alınması ve bazı ekimlerin yapılmasında
kullanılır.
14. Eküvyonlu Tüp: Genellikle inceleme örneği alınmasında kullanılan, içerisinde tek bir
eküvyon bulunan steril tüplerdir.
Şekil 1-13. Eküvyon çubuğu ve eküvyonlu tüp
15. Özeler: Daha çok sıvı ortamlardan örnek alıp ekim yapmaya yarayan aletlerdir. Uç kısmı
platin veya tungsten gibi kolay ısınıp soğuyan ve oksitlenmeyen telden yapılmış ya da tek
kullanımlık steril plastik malzemelerdir. Genellikle ucu halka şeklindedir. Standart
bakteriyolojik öze 0,01ml sıvı alır. Ucunda halkalı tel yerine düz tel bulunan, batırma
kültürü yapmaya, tek koloniden örnek almaya ve katı ortamlardan örnek alıp aktarmaya
4
yarayan iğne özeler, genellikle mantar ekimlerinde kullanılan ve ucu L şeklinde kıvrılmış
olan çengel özeler de mikrobiyolojide sıkça kullanılan malzemelerdir.
Şekil 1-14. Plastik ve metal uçlu özeler
16. Petri kutuları: Katı besiyeri hazırlanmasında ve antibiyogram yapılmasında kullanılan geniş
yuvarlak, yaklaşık 2cm derinlikte, birbirine geçen kapak ve alt kısımdan oluşan cam veya
plastik malzemelerdir.
Şekil 1-15. Petri kutusu
17. Lam: Direkt inceleme ve boyama için preparat hazırlanmasında kullanılan dikdörtgen
şeklinde ince camlardır.
18. Lamel: Genellikle 2x2 cm boyutlarında çok ince camdan yapılmış malzemelerdir. Çeşitli
amaçla kullanılabilen farklı şekilleri de olabilir.
Şekil 1-16. Lam ve lameller
19. Şale: İçerisinde boyanacak preparatların (lamların) tek tek yerleştirilebildiği camdan
yapılmış özel boya kaplarıdır.
Şekil 1-17. Şale
5
20. Gram Boyama Seti: Gram boyamada kullanılan boyaları içeren boya setidir.
Şekil 1-18. Gram boyama seti
21. Anaerobik Kavanoz: Anaerobik ve mikroaerofilik bakterilerin üretilmesinde kullanılır.
Şekil 1-19. Anaerobik kavanoz
22. Desikatör: Maddelerin nem almasını önleyen, katı maddelerin kurutulması ya da
besiyerlerinin mikroaerofilik ya da anaerobik ortamda inkübe edilmesini sağlayan camdan
yapılmış kapağı bulunan bir nevi kavanozdur.
Şekil 1-20. Desikatör
23. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı: Çözeltileri homojen şekilde karıştırmaya yarayan alettir.
Şekil 1-21. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı
6
24. Vorteks: Deney tüpü içerisindeki sıvıyı girdaplayarak homojen bir şekilde karıştırmaya
yarayan alettir.
Şekil 1-22. Vorteks
25. Etüv: Mikroorganizmaların üretilmesi için kullanılan, istenilen ısıya ayarlanabilen, sıcak
hava dolaplarıdır.
Şekil 1-23. Etüv
26. Santrifüjler: Tüp içerisinde bulunan yoğunlukları farklı maddeleri birbirinden ayırma amacı
ile kullanılan cihazlardır.
Şekil 1-24. Santrifüj
27. pH metre: pH değerlerinin ölçülmesinde kullanılan aletlerdir.
Şekil 1-25. pH metre
7
28. Güvenlik kabineti: Çalışan kişiyi ve çalışılan örneği korumaya yarayan çalışma ortamlarıdır.
Şekil 1-26. Güvenlik kabineti
29. Distile Su Cihazı: Saf (distile) su elde edilmesinde kullanılır.
Şekil 1-27. Distile su cihazı
30. Hassas Terazi: Çok küçük miktarlardaki maddelerin ölçümlerini yapılabilen terazidir.
Şekil 1-28. Hassas terazi
31. Hücre kültür malzemeleri: Hücre kültürü yapılırken kullanılan pleytler, flasklar gibi
malzemelerdir.
Şekil 1-29. Hücre kültür malzemeleri
8
32. Thermocycler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işleminde denaturation, annealing
(primerlerin bağlanması) ve extention (zincirin uzaması) aşamalarını otomatik olarak
yürütebilen programlanabilir bir cihazdır.
Şekil 1-30. Thermocycler cihazları
33. UV illuminatör ve kamera: Floresan boyalı ürünlerin görüntülenmesini sağlar.
Şekil 1-31. UV illuminatör
34. Elektroforez tankı ve güç kaynağı: Agaroz veya poliakrilamit jellerine yüklenen ürünlerin
elektroforetik yüklerine göre ayrıştırılmasına olanak sağlayan bir sistemdir.
Şekil 1-32. Elektroforez tankı
35. Buzdolabı ve Derin Dondurucular: Buzdolabı ısıya dayanıksız hasta örneklerinin,
besiyerlerinin ve bazı kimyasal maddelerin muhafaza edildiği dolaplardır. Derin
dondurucular ise dondurularak muhafaza edilmesi gereken malzemelerin ve
mikroorganizmaların uzun süre saklanması için kullanılır.
9
36. Pastör Fırını: Yüksek sıcaklıklara dayanabilen malzeme ve gereçlerin kuru sıcak hava ile
sterilizasyonlarında kullanılır.
Şekil 1-33. Pastör fırını
37. Bek: LPG ile çalışan, küçük ocaklar olup, yakma, alevden geçirme ve steril alan sağlamada
kullanılır.
Şekil 1-34. Bek
38. Filtreler: Çeşitli sıvı maddelerin süzülerek steril edilmesinde kullanılan aletlerdir.
Şekil 1-35. Filtre
39. Otoklav: Basınçlı buharla sterilizasyon yapmaya yarayan bir cihazdır.
Şekil 1-36. Otoklav
10
40. Benmari: İstenilen ayardaki ısı derecelerinde sıcak su elde etmeğe ve suyu bu derecelerde
sabit tutmaya yarayan aletlerdir.
Şekil 1-37. Benmari
41. Ultraviyole Lambası: Oda havasının ve yüzeylerin sterilizasyonunda kullanılan ultraviyole
ışını salan lamba sistemidir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Laboratuvarda gösterilen alet ve malzemeleri inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
11
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-2
Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri-1
A-Mikrobiyolojide Kullanılan Besiyerleri ve Ekim Yöntemleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan besiyerlerinin öğrenilmesi
Besiyerlerine ekim yöntemlerinin öğrenilmesi
Bakterilerin besiyerlerinde oluşturdukları koloni tiplerinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Besiyerlerinin adlarını sayar.
Besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılan temel maddeleri sayar.
Besiyerlerinin özelliklerini açıklar.
Besiyerlerini kullanım amaçlarına göre gruplandırır.
Besiyerlerini fiziksel özelliklerine göre sınıflandırır.
Ekim yöntemlerini sıralar.
Koloni tiplerini özellikleri ile birlikte sıralar.
Besiyerlerini tanıyıp ayırır.
Ekim yöntemlerini uygular.
Koloni tiplerini değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Temel ya da basit besiyeri
Zenginleştirilmiş besiyeri (Kanlı agar, Çikolatamsı agar)
Özgül besiyeri (Lowenstein-Jensen besiyeri)
Seçici besiyeri (Selenit F besiyeri)
Ayırıcı besiyeri (EMB agar, Kanlı agar)
Ayıraçlı besiyeri (Şekerli besiyerleri, Fenol kırmızılı besiyerleri)
Öze
Eküvyonlu çubuk
Pipet
Tüpte sıvı besiyeri
Tüpte yatık katı besiyeri
Tüpte dik hazırlanmış katı besiyeri
Anaerobik kavanoz
S tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
R tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
M tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
12
Giriş
Mikroorganizmaların laboratuvar şartlarında üretilmeleri, saf olarak elde edilmeleri,
çeşitli özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi için besiyeri
adı verilen çeşitli besleyici ortamlar kullanılır. Besiyerlerinde hidrojen alıcı ve verici maddeler,
karbon kaynağı, azot kaynağı ve mineraller üretilecek mikroorganizmanın ihtiyacı olduğu
kadar mevcut olmalıdır.
Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan
Temel Maddeler
Su: Besiyeri hazırlanırken distile (saf) su ya da deiyonize su kullanılmalıdır.
Peptonlar: Çeşitli proteinlerin pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri
sonucunda suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagüle olmayan polipeptid,
dipeptid ve aminoasit gibi maddelerden oluşur. Besiyerine eklenen bu maddelerin karışımı
bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır.
Kimyasal maddeler ve tuzlar: Besiyerine eklenecek olan maddeler kimyasal olarak saf
olmalıdır. Bu maddeler uygun çözücülerde çözülerek besiyerine eklenir.
Kan: Besiyerlerinin zenginleştirilmesi amacıyla tavşan, koyun veya at kanı kullanılabilir.
Besiyerine eklenecek olan kanlar steril ve pıhtılaşmamış olmalıdır.
Serum: Koyun, tavşan, at gibi hayvanlardan steril olarak alınan kan 750 xg’de 5 dakika
santrifüj edilerek serum kısmı ayrılır ve buzdolabında saklanarak kullanılır.
Haben sıvısı: Sirozlu hastaların periton boşluğunda toplanan sıvıdır. Steril şartlarda toplanır
ve buzdolabında saklanır.
Maya özütü: Çeşitli vitaminler ve aminoasitler içerdiğinden zenginleştirici olarak kullanılır.
Mikroorganizmaların Laboratuvarda üretilebilecekleri besleyici ortamlar iki çeşittir.
A-Canlı ortamlar
1. Embriyonlu yumurta
2. Hücre kültürleri
3. Deney hayvanları
B-Cansız ortamlar
Besiyerlerinin Sınıflandırılması
Besiyerleri biçimlerine göre katı, sıvı, yarı katı ve yarı sıvı besiyerleri olarak ayrılırlar.
Besiyerlerinin katılaştırılmasında en çok kullanılan madde agar-agar'dır. Bir çeşit deniz
yosunundan elde edilen bu maddeyi mikroorganizmaların çoğu parçalayamaz. Bu madde
yaklaşık 42°C'de donar ve mikroorganizmaların üretilme derecelerinde erimez. Agarın %1.5 3 oranlarında sıvı ortamlara katılması ile katı besiyerleri, %0.3 - 0.5 oranlarında kullanılması
ile yarı katı besiyerleri elde edilebilir.
Kullanılış amaçlarına ve kimyasal yapılarına göre başlıca besiyeri grupları şunlardır:
13
1-Kimyasal Yapıları Bilinen Sentetik Besiyerleri
Saf kimyasal maddelerden hazırlanırlar. Eritici olarak saf su ya da iyonsuzlaştırılmış su
kullanılır. Özellikle mikroorganizmaların metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini
saf olarak elde etmek amacıyla kullanılırlar.
Sadece inorganik maddeler içerenlere basit sentetik besiyeri, buna ek olarak aminoasitler
gibi organik maddeler içerenlere de kompleks sentetik besiyerleri adı verilir.
2-Genel üretim besiyerleri
Güncel Laboratuvar çalışmalarında kullanılan, normal vücut florasında bulunan veya patojen
özellikler gösteren mikroorganizmaların çoğunun üretilebildiği besiyerleridir. Sıvı yada katı
biçimde hazırlanan bu besiyerleri üreticilik özelliklerine göre ikiye ayrılırlar.
a-Temel yada basit besiyerleri
Bunlarda başlıca pepton+tuz (peptonlu su) ya da et suyu+pepton+tuz (buyyon) gibi
maddeler ve su bulunur. Buyyona agar eklemek suretiyle elde edilen katı besiyerine jeloz adı
verilir. Bu ortamlar birçok mikroorganizmanın üremesi için elverişlidir.
b-Zenginleştirilmiş besiyerleri
Temel besiyerine kan, serum, haben sıvısı, glukoz, yumurta gibi daha besleyici maddelerin
eklenmesi ile elde edilen besiyerleridir (kanlı agar, çikolatamsı agar gibi). Basit
besiyerlerinde üremeyen bazı mikroorganizmalar bu besiyerlerinde üretilebilirler.
Şekil 2-1. Kanlı agar
Şekil 2-2. Çikolatamsı agar
3-Özel besiyerleri
Üremede güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmesi için özel olarak hazırlanan
besiyerleridir. Bu besiyerlerine belirli maddeler ve ayıraçlar konularak bazı
mikroorganizmaların üremeleri sağlanırken diğerlerinin üremeleri engellenmiştir.
a-Özgül besiyerleri
Yalnız bir çeşit ya da sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi için hazırlanan besiyerleridir.
(Mycobacterium tuberculosis`in üretilmesinde kullanılan Löwenstein-Jensen besiyeri gibi).
Şekil 2-3. Löwenstein-Jensen besiyeri
b-Seçici besiyerleri
14
Bazı mikroorganizmaların üremelerini önleyici maddeler içeren, bu suretle karışık
bulundukları ortamlardan belirli mikroorganizmaların seçilerek üretilmelerini sağlayan
besiyerleridir (dışkıdaki Salmonella`ların çoğaltılmasını sağlayan Selenit F besiyeri gibi). Bu
besiyerleri temel ya da zenginleştirilmiş katı ya da sıvı besiyerlerine bir kısım bakterilerin
üremesini önleyen antibiyotikler, kimyasal maddeler, boyalar konularak hazırlanırlar.
c-Ayırıcı besiyerleri
İçerdikleri ayıraçlar aracılığı ile benzer bakterilerin ayrı görünümde koloniler oluşturmalarını
sağlayarak karışık bakterileri birbirinden ayırmaya yarayan besiyerleridir (Laktoza etkili
bakterileri etkisizlerden ayırmaya yarayan Eozin Methylene Blue (EMB) agar, hemoliz yapan
ve yapmayanları ayırmada kullanılan kanlı agar gibi).
Şekil 2-4. EMB besiyeri
d-Ayıraçlı besiyerleri
Mikroorganizmaların metabolizmalarına bağlı biyokimyasal özelliklerini incelemek amacıyla
besiyerlerine çesitli maddeler ve mikroorganizmaların bu maddeleri değişikliğe uğrattıklarını
gösteren ayıraçlar eklenerek hazırlanan besiyerleridir (şekerli besiyerleri, fenol kırmızılı
besiyerleri gibi).
Ekim Yöntemleri
İçerisinde mikroorganizma bulunduğu bilinen ya da mikroorganizma bulunup
bulunmadığı araştırılacak olan ortamlardan ekim aletleri ile alınan örneklerin belirli kurallar
çerçevesinde besiyerlerine aktarılması işlemine ekim denir. Ekimleri yapılacak örnekler ya
doğrudan doğruya hastalardan alınan hastalık örnekleridir ya da daha önce üretilmiş olan
bakteri kültürleridir.
Ekim yapılacak materyal sıvı ise öze, pipet, eküvyonlu çubuk; katı ise öze kullanılarak
ekim yapılır. Ekim yapılmadan önce ve sonra çalışılacak bankonun üzeri antiseptik eriyiklerle
silinmeli ve daima güvenlik kabinetinde çalışılmalıdır.
1-Tüpte sıvı besiyerine ekim: Tüp içerisindeki besiyerine ekim yapılırken tüp eğik olarak
tutulur. Ekim materyali öze ile alınmış ise öze tüpe yavaşça sokulur ve özedeki materyal
bırakılır. Materyal katı ise önce öze tüp duvarına dairesel hareketlerle sürülerek daha sonra
yavaşça sıvı besiyeri ile karıştırılarak ezilir. Pipetle alınan sıvı materyal besiyerine damlatılarak
ekim yapılır. Eküvyonlu çubuklar besiyerine daldırılır ve tüp kenarına bastırılarak içeriğinin
tüpteki besiyerine geçmesi sağlanır.
15
Şekil 2-5. Tüpteki sıvı besiyerineekim
2-Tüpte yatık katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal hiç bir yere değdirilmeksizin
tüpteki besiyerinin alt noktasına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılır ve aynı
doğrultuda geri çekildikten sonra besiyerinin yüzeyinde zikzaklar çizilerek yayılır.
Şekil 2-6. Tüpte yatık besiyerine ekim
3-Tüpte dik hazırlanmış katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal tüpteki besiyerinin
dip kısmına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılıp aynı doğrultuda çıkarılarak
ekim yapılır.
4-Plak besiyerine ekim:
a-Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim: Bu ekim yönteminde amaç bakterilerin katı
besiyerine seyreltilerek ekilmeleri, bu şekilde besiyerine tek tek düşmelerinin sağlanması ve
böylece birbirinden ayrı koloniler elde edilmesidir. Bu amaçla petri kutusundaki katı besiyeri
dört bölge olarak düşünülür. Öze ile alınan materyal ilk bölgede bir noktadan başlayıp sık
zikzaklar çizilerek ekilir ve ikinci ekim sahasına geçilir. Birinci bölgeden ikinciye doğru daha az
sıklıkta zikzaklar çizilir. Üçüncü bölgede zikzaklar daha da seyrek olmalıdır. En son dördüncü
bölgede bir-iki zikzak yapılarak ekim tamamlanır. Bu ekim yönteminde, her ekim sahasına
geçmeden önce besiyeri 90 derece açıyla döndürülerek yeni ekim sahasına geçilir. Her ekim
sahasına geçildiğinde öze sterilize edildikten sonra veya farklı öze kullanılarak ekim yapılır.
16
Eküvyonlu çubuk ile materyal alınmış ise önce bu pamuklu çubuk ilk ekim sahasına sürülür.
Daha sonra öze ile yukarıdaki işlemlere devam edilir.
Şekil 2-7. Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim
b-Plak besiyerine yaygın ekim: Antibiyotik duyarlılık testleri, faj tiplendirme deneyleri gibi
amaçlar için bakterilerin plak besiyerinin yüzeyine homojen olarak dağıtılması suretiyle
yaygın ekim yapmak gerekir.
Ekim yapılacak plak yüzeyine örnekten pastör pipeti ya da otomatik pipet ile birkaç
damla damlatılır. Örnek eküvyonlu çubuk ya da öze yardımı ile besiyerinin ortasında bir çizgi
şeklinde yayılır. Steril bir cam çubuk ya da eküvyonlu çubuk ile besiyerinin ortasına kadar sık
zikzaklar çizilir. Daha sonra aynı işlem besiyerinin diğer yarısında da uygulanır. Besiyeri 90
derece çevrilerek yapılan işlemler tekrarlanır. Böylece besiyerinin her tarafına homojen
olarak ekim yapılmış olur.
Şekil 2-8. Plak besiyerine yaygın ekim
Ekim yapılan besiyerleri üretilecek mikroorganizma için gerekli optimum sıcaklık
derecelerine ayarlanmış etüvlerde ve uygun atmosferik şartlarda inkübasyona bırakılır.
Aerop ve fakültatif anaerop mikroorganizmaların üretilmesinde normal atmosferik koşullar
yeterlidir. Anaeroplar ve mikroaerofilik mikroorganizmaların üretilmesi için kapakları sıkıca
kapatılabilen cam ya da çelik silindir seklinde kaplar (anaerobik jar) kullanılır. Ekim yapılmış
plaklar bu kaplara yerleştirilir ve yanlarına özel gaz karışımı sağlayan ticari kitler koynularak
ağızları kapatılır ve uygun sıcaklıktaki etüvlere yerleştirilir.
17
Koloni Tipleri
S (smooth=düz) tipi koloni: En sık görülen şekildir. Yuvarlak, düz kenarlı, kabarık, düz yüzeyli,
nemli ve homojen kolonilerdir.
R (rough=pürtüklü) tipi koloni: S tipi koloni yapan bakterilerin eski kültürlerinde ve uygunsuz
koşullarda üretimi ile meydana gelen koloniler bu tipte olabildiği gibi bazı tür bakteriler doğal
olarak R tipi koloni yaparlar. Yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları girintili ve çıkıntılı,
basık görünümdedirler. S tipi koloni, R tipi koloni şekline dönerse virülansı azalır.
M (mucoid) tipi koloni: Bir kısım bakterilerde hücre çeperlerinin dış tabakasında polisakkarit
ve bazen polipeptid yapısında, az veya çok miktarda kapsül maddesi bulunur. Bu kapsüllü
bakterilerin uygun ortamlarda (serumlu, habenli, kanlı, vs) sümüksü görünüşlü, yapışkan ve
akıcı koloniler oluşturdukları görülür. Uygunsuz koşullarda bu bakteriler S tipi koloni
oluştururlar.
L tipi koloni: Besiyerinin dip kısmına doğru uzanan kolonilerdir. Hücre duvarını kaybeden
bakteriler (L formu) bu tip koloniler oluştururlar.
Şekil 2-9. S tipi koloni
Şekil 2-10. R tipi koloni
Şekil 2-11. M tipi koloni
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1-Besiyeri gruplarına örnek olarak getirilen besiyerlerini incelenip adlarını, besiyeri grubunu
ve ne amaçla kullanıldığını yazınız.
2- Katı ve sıvı besiyerlerine verilen numunelerden uygun bir şekilde ekim yaparak yaptığınız
ekimi şematize ederek çiziniz.
a) Tek koloni
b) Homojen ekim
18
c) Sıvı besiyerine ekim
d) Yatık besiyerine ekim
4- Laboratuvara hazır olarak getirilen kültürlerde koloni görünümlerini değerlendirerek,
hangi tip koloni olduğunu çiziniz.
a)
Tarih
b)
c)
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA: Klinik Mikrobiyoloji
Manual of Clinical Mikrobiology (Çev Edit. AC Başustaoğlu). Dokuzuncu baskı.
Atlas Kitapçılık, Ankara, 2009, cilt 1, s.187-190.
2. Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, Đzmir,
2009, s.97-123.
3. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A: Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim
Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 2003, s.44-54.
4. Winn Jr. W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G,
Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostik Microbiology, Sixth edition,
Lippincott Williams and Wilkins, s.29-38.
19
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-3
Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri-2
Mikrobiyolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerinin öğrenilmesi
Basit boyama ve Gram boyama yöntemlerinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bilgi
Bu dersi alan öğrenciler;
Bakteri boyalarını sıralar.
Basit boyama yönteminin basamaklarını sıralar.
Gram boyama yönteminin basamaklarını sıralar.
Basit boyama yöntemini basit boyama kılavuzuna uygun şekilde
uygular.
Gram boyama yöntemini Gram boyama kılavuzuna uygun şekilde
uygular.
Basit boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak
değerlendirir.
Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik
olarak değerlendirir.
Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Gram boyama seti
Mikroskop
Lam
Öze
Bek
Gram pozitif kok (Örn; Stafilokok ya da Streptokok) üremiş kültür
plakları
Gram negatif basil (Örn; E. coli) üremiş kültür plakları
Giriş
Mikrobiyolojik tanıda morfolojik incelemeler büyük değer taşır. İyi bir incelemenin en
azından tanıya doğru yönlendirici değeri vardır. Morfolojik incelemelerden olan boyama
işlemi, bakterilerin identifikasyonu ve sınıflandırılmalarında önemli bir işlemdir. Bunlar içinde
en sık kullanılanlar şunlardır;
20
1. Basit boyama
2. Gram boyama
3. Asido rezistan boyama (Ehrlich - Ziehl-Neelsen boyama)
4. Metilen mavisi boyama
5. Giemsa boyama
6. Çini mürekkebi boyama
7. Laktofenol pamuk mavisi boyama
8. Spor boyama
9. Kapsül boyama
10. Neisser boyama
Bütün boyama işlemlerinden önce preparatın hazırlanıp, uygun yöntemle tespit edilmesi
gerekir.
Preparatın Hazırlanması: Preparatlar doğrudan hastalık örneklerinden, kültürlerden ya da
deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanır. Bunun için temiz lamlar kullanılır.
Sıvı materyalden preparat hazırlanıyor ise öze ya da otomatik pipet yardımı ile bir damla
örnek alınarak lamın orta kısmına bırakılır. Öze yardımı ile dairesel hareketler ile küçük bir
bozuk para büyüklüğünde yayılır. Bakteri kolonisi ya da katı bir klinik materyalden preparat
hazırlarken önce bir damla steril serum fizyolojik lamın ortasına damlatılır. Örnek öze ile
alınarak damlanın kenarında ezilir. Dairesel hareketlerle sıvı ile karışması sağlanır. Preparat
oda ısısında kurumaya bırakılır.
Tespit Yöntemleri: Preparatın tespit edilmesinde amaçlanan, üzerindeki materyalin lama
yapışmasını sağlamaktır. Üç yöntemle tespit işlemi yapılabilir:
1. Havada kurutularak tespit: En az güvenilir olanıdır. Hazırlanan preparat 2-18 saat
bekletilmelidir.
2. Alevde tespit: En çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan sonra
materyalli yüzü yukarı gelecek şekilde bir ucundan tutulur. Lamın alt yüzü yanmakta olan
alevin mavi kısmına, yukarıdan aşağıya doğru yavaş yavaş hareket ettirilerek yalatılır.
3. Kimyasal maddeler ile tespit: Alevde tespit edildiğinde morfolojisini kaybedebilecek
materyali (protozoa, lökosit, eritrosit, epitel hücresi vs.) tespitte kulanılır. Etil alkol (8-10
dakika), metil alkol (3 dakika) ve aseton (5 dakika) tespit işleminde en çok kullanılan
kimyasallardır. Bu maddeler hazırlanan preperatın üstüne, materyal bulunan kısmını
kaplayacak şekilde dökülerek kullanılır.
Basit Boyama
Bu yöntemde, boyama için genellikle tek bir boya kullanılır ve mikroorganizmaların
morfolojileri gözlenir.
1. Preparat hazırlanıp tespit edilir.
2. Metilen mavisi, safranin veya kristal viyole gibi boyalardan birisi ile 1 dakika boyanır.
21
3. Su ile yıkanır.
4. Havada kurutulur.
5. İmmersiyon objektifi ile incelenir.
Bu boyama sonucu bakteriler, metilen mavisi ile mavi, safraninle pembe/kırmızı, kristal viyole
ile mor/lacivert boyanır.
Gram Boyama
Bakterilerin hücre duvar yapılarındaki farklılıklara dayalı bir boyama yöntemi olup, bakterileri
gram pozitif ve gram negatif olarak sınıflayan bir boyama yöntemidir.
Gram Boyama Becerisi Öğrenim Rehberi
ARAÇLAR: Gram boyama seti, lam, su, penset, incelenecek hasta örneği ya da bakteri
kültürü
BASAMAK
NO
1
BASAMAKLAR
Preparatı hazırlayınız. (Bakınız; preparatın hazırlanması)
Preparatı uygun yöntem ile tespit ediniz. (Bakınız; Tespit yöntemleri)
3
Preparat yatay konumda iken üzerine kristal viyole dökerek1 dakika
bekletiniz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile boya tamamen akıncaya kadar yıkayınız.
4
Preparat yatay konumda iken üzerine lügol dökerek 1 dakika bekletiniz.
5
Preparatın üzerindeki lügol solüsyonunu dökünüz.
6
Preparatın üzerine damla damla aseton – alkol dökerek dekolorizasyon
(renksizleştirme) yapınız. Bu işlemi kristal viyole tamamen akana kadar
sürdürünüz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız.
2
7
9
Preparat yatay konumda iken üzerine safranin (zıt boya) dökerek 30 saniye
bekletiniz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız.
10
Preparatı oda ısısında kurutunuz.
11
Preparatı immersiyon objektifi ile inceleyiniz.
8
Bu boyamayla gram pozitif bakteriler mor, gram negatif bakteriler pembe boyanır.
22
Boyaların hazırlanışı:
Metilen mavisi
Kristal viyole
Lugol
Aseton – alkol
Safranin
:1,5 gr metilen mavisi, 100 ml %95’lik etil alkol
:1 gr kristal viyole, 10 ml %96’lık etil alkol, 100 ml saf su
: 1 gr kristal iyot, 2 gr potasyum iyodür, 300 ml su
:1:1 oranında %95’lik etil alkol ile %100’lük aseton karışımı
:%1’lik sudaki eriyiği
Asido Rezistan Boyama
Özellikle Mycobacterium'lar olmak üzere Nocardia'lar gibi hücre duvarlarında bol miktarda
lipid içeren mikroorganizmaların boyanmasında kullanılan bir yöntemdir. Bu boyama
yönteminde asit-alkole dirençli boyanan bakteriler kırmızı (karbolfuksin ile), diğer bakteriler
ve zemin mavi (metilen mavisi ile) boyanır.
Metilen Mavisi Boyama
Özellikle dışkı örneklerinde polimorfonükleer lökositlerin ve mikroorganizmaların
gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Polimorfonükleer lökositler, bakteriler ve diğer hücreler
mavi gözlenir.
Giemsa Boyama
Protozoa (Plasmodium vs.) türlerinin ve kan hücrelerinin gözlenmesi amacıyla uygulanır.
Parazitler mavi-mor renkte ve kırmızı çekirdekli olarak gözlenir. Beyaz kan hücrelerinin
çekirdekleri mor, sitoplazmaları mavi renkte görülür. Eritrositler ise açık kahverengi olarak
gözlenir.
Çini Mürekkebi Boyama
Çini mürekkebi ile boyama, en sık Cryptococcus neoformans’ ın kapsülünün gözlenebilmesi
amacıyla uygulanır. Çini mürekkebi kapsülü boyamadığından, siyah zemin üzerinde mayayı
çevreleyen açık renkli kapsül gözlenir.
Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama
Küf mantarlarının tanınması amacıyla uygulanır. Mavi boyanmış hifa ve spor morfolojileri
incelenir.
23
Spor Boyama
Spor yapan bakterilerin, sporlarının varlığını ve yerleşimini gözlemek için kullanılan bir
boyama yöntemidir. Bu yöntemle bakteri kırmızı (safranin ile), içindeki spor yeşil (malaşit
yeşili ile) boyanır.
Neisser Boyama
Corynebacterium diphteriae'larda bulunan metakromatik cisimcikleri boyamada kullanılan bir
boyama yöntemidir. Bakteriler sarı, metakromatik cisimcikler kahverengi boyanır.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Masalarda bulunan besiyerlerde üremiş bakteri kolonileri, basit ve gram boyama
yöntemiyle boyanıp mikroskopta incelendikten sonra şekil (kok, basil) ve renkleri (mor,
pembe) belirterek çizilecek.
Boyama: Basit boyama
Bakteri:…………………
Şekil:………………
Renk:………………
Boyama: Gram boyama
Bakteri: S. aureus
Şekil: ………………………
Renk:……………………
Tarih
Boyama: Gram boyama
Bakteri:E.coli
Şekil:…………………..
Renk:………………….
Laboratuvar görevlisinin imzası
NOT: Diğer boyama yöntemleri daha sonra yapılacak olan ilgili laboratuvar saatlerinde
uygulamalı olarak gösterilecektir.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü baskı. Barış yayınları, İzmir, 73-76.
2. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 5561.
3. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH,Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical
Microbiology. Klinik Mikrobiyoloji. Cilt 1. 9th ed.,Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, 183184.
24
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-4
Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon
Dersin Amaçları
Sterilizasyon ve dezenfeksiyon yöntemlerinin öğrenilmesi
Sterilizasyon kontrol yöntemlerinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Sterilizasyon ve dezenfeksiyon ile ilgili tanımları açıklar.
Sterilizasyon ile dezenfeksiyon arasındaki farkı açıklar.
Sterilizasyon yöntemlerini gruplandırır.
Sterilizasyon yöntemlerinin önemli özelliklerini sıralar.
Sterilizasyonun işlem basamaklarını sıralar.
Sterilizasyonun kontrol yöntemlerini sıralar.
Dezenfeksiyon yöntemlerini gruplandırır.
Dezenfektanları sıralar ve önemli özelliklerini sayar.
Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (öze vb.)
sterilizasyonunu yapar.
Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (Laboratuvar masası vb.)
dezenfeksiyonunu yapar.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Bu uygulamada öğrencilere Merkezi Sterilizasyon Ünitesi
tanıtılacaktır.
Sıvı sabun
Kağıt havlu
Alkol bazlı solüsyon
Çamaşır suyu
Eldiven
Maske
Bone
Otoklav
Pastör fırını
Yıkama cihazları
Etilen oksit sterilizasyon cihazı
Giriş
Bulaşıcı hastalıkların yayılması, besin maddeleri ve diğer materyallerin bozulması ve
hastane enfeksiyonlarının önlenmesinde, sterilizasyon ve dezenfeksiyonun önemi yaklaşık
150 yıldan beri bilinmektedir.
25
Dezenfeksiyon ve Sterilizasyon ile İlgili Önemli Terimler
Sterilizasyon
Dezenfeksiyon
Dekontaminasyon
Antisepsi
Asepsi
Germisid
Sterilant
(kimyasal)
Yüksek düzey
dezenfektan
Orta düzey
dezenfektan
Düşük düzey
dezenfektan
Mikrobiyostatik
Ortamın, bir madde ya da cismin mikroorganizmaların tüm canlı ve aktif
şekillerinden (patojen, saprofit, spor veya vejetatif) kabul edilebilir
sterilite güvence düzeyini sağlayacak ölçüde arındırılması işlemidir
Bir cismin veya maddenin patojen (hastalandırıcı nitelikteki)
mikroorganizmalarından arındırılması işlemidir. Bu işlem ile bakteri
sporları dışındaki tüm formlar (bakteri, mantar, protozoon gibi tüm
mikroorganizmaların vejetatif şekilleri ve viruslar) yok edilir.
Patojenik mikroorganizma sayısının koruyucu bir giysi olmaksızın
kullanım için güvenli seviyesine indirgenmesidir.
Vücut yüzeylerindeki (deri, mukoza gibi) ve çeşitli yaralardaki patojen
mikroorganizmaların, kimyasal maddeler kullanılarak yok edilmesi
işlemidir. Hastayla bağlantılı olarak; canlı bir dokunun veya derinin
dezenfeksiyonudur
Patojen mikroorganizmalardan arındırılmış bir ortam anlamına
gelmektedir
Mikrorganizmaları öldüren ajanlar
Sterilizasyonu sağlayabilen kimyasal
Çoğu bakteriyel endosporlar hariç mikrobiyal patojenlerin tümünü
öldüren dezenfektan
Bakteriyel endospor dışında tüm mikrobiyal patojenleri öldüren
dezenfektan
Vejetatif bakteriler ve zarflı virüsleri öldüren dezenfektan
Mikroorganizmaların üremelerini önleyen madde ya da etmenlere
mikrobiyostatik maddeler, bu etkiye de mikrobiyostatik etki denir.
Merkezi Sterilizasyon Ünitesi
Merkezi Sterilizasyon Ünitesi (MSÜ) kirli alan, temiz alan ve steril alandan oluşur.
Şekil 4-1. Merkezi Sterilizasyon Ünitesi alanları
26
Şekil 4-2. Kirli alan
Şekil 4-3. Temiz alan
Şekil 4-4. Steril alan
27
Sterilizasyon
Şekil 4-5. Sterilizasyon işlem basamakları
I. Fiziksel Yö nteml er il e Steril iza syo n
A.
I s ı ile yapılan sterilizasyon
1. Kuru ısı ile sterilizasyon
a) Yakma ve alevden geçirme
b) Kuru sıcak hava ile sterilizasyon
2. Nemli ısı ile sterilizasyon
a) Buharla sterilizasyon
i. Basınçlı buharla sterilizasyon
ii. Basınçsız buharla sterilizasyon
iii. Akım halindeki buharla sterilizasyon
b) Sıcak su ile sterilizasyon
i. Kaynatma
ii. Tindalizasyon
iii. Koagulasyon
B. Süzme (filtrasyon) ile sterilizasyon
1. Mekanik olarak süzme
2. Adsorbsiyon yoluyla süzme
C. Işınlama ile sterilizasyon
1. Ultraviyole ışınları ile yapılan sterilizasyon
2. Gama ve x ışınları ile yapılan sterilizasyon
II. Kimyasal Maddeler ile Sterilizasyon
A. Sıvı ortamlara kimyasal maddeler eklenerek yapılan sterilizasyon
1. Timol
2. Kloroform
B. Gazlar ile yapılan sterilizasyon
1. Etilen oksit
2. Beta propiolakton
28
Kuru Sıcak Hava ile Sterilizasyon: Kuru sıcak hava ile sterilizasyon için Pastör fırını adı verilen
elektrikli sterilizasyon aleti kullanılır. Üzerlerinde fırının ulaştığı ısıyı takip etmeye yarayan
termometre bulunur. Kuru sıcak hava ile;
• Cam ve metalden yapılmış malzemeler (tüp, balon, petri kutusu, pipet, penset vb.),
• Nemin içlerine ulaşamaması nedeniyle nemli hava ile sterilize edilemeyen yağlar
(vazelin, parafin vb.),
• Süzgeç kağıtları ve buna benzer nitelikte, yüksek ısıda bozulmayacak malzemeler
sterilize edilir.
Besiyerleri ve sıvılar kuru sıcak hava ile steril edilmezler.
Genel olarak kuru sıcak hava ile sterilizasyon için malzemeler; 175°C'de bir, 165°C'de iki, 150
°C'de üç ve 120°C’de 8 saat tutulmalıdır.
Şekil 4-6. Pastör fırını
Basınçlı Buhar ile Sterilizasyon
Otoklav: Bu yöntemde temel ilke, doymuş ve basınç altındaki su buharında, 100°C'nin
üzerinde sterilizasyondur. Bu amaç için otoklav denilen aletler kullanılır. Otoklav ile
sterillemede; 1 atmosfer basınç altında 121°C'de 15-20 dakika ya da 115°C'de 30 dakika
bekletmek yeterlidir.
Otoklavda daha çok besiyerleri, çözeltiler, kullanılmış petriler vs. steril edilir.
Basınçlı buharla sterilizasyon kullanılamadığı durumlar şunlardır:
• Yüksek ısı ve neme duyarlı aletler (krom kaplama, optik aletler, vs.)
• Buharın penetre olamayacağı maddeler (yağ, pudra vs.)
Şekil 4-7. Değişik şekillerde dizayn edilmiş otoklavlar
29
Gazlar ile Yapılan Sterilizasyon
Etilen Oksit: Etilen oksit 10.8°C'nin altında sıvı, üzerindeki ısılarda ise gaz halinde bulunan bir
maddedir. Saf halde iken çok toksik, iritan ve patlayıcı olduğundan belli oranlarda
karbondioksit ile karıştırılarak kullanılır.
Etilen oksit çok etkin bir jermisit olup, sporları da öldürür. Hücre sitoplazmasındaki çeşitli
maddelerle kimyasal bileşikler yaparak etki gösterir. Oldukça penetran özelliktedir, kağıt ve
polietilenden yapılmış olan ambalajları geçerek, iç kısımda paketlenmiş olan aletleri steril
ederken, sterillenen madde ve aletlerin niteliğini bozmaz.
Şekil 4-8. Etilen oksit sterilizatörü
Sterilizasyonun Denetlenmesi
Isı ile yapılan sterilizasyonda; ısının derecesi ile yeterli sürede uygulanıp, uygulanmadığı ve
steril edilmek istenen malzemelerin her yerine ulaşıp, ulaşmadığı sterilizasyon üzerine etkili
faktörlerdir. Sterilizasyonun tam olabilmesi için otoklav ve pastör fırınlarının düzenli olarak
bakımı yapılmalıdır. Ayrıca yapılan sterilizasyon işleminin etkili olup, olmadığını anlamak için
de çeşitli denetleme mekanizmaları geliştirilmiştir:
1. Browne sterilite kontrol tüpleri denilen ve içlerinde 115°C'de 25 dakikada, 121°C'de
15 dakikada ve 160°C'de 1 saatte renk değiştiren sıvılar bulunan tüpler, otoklav ya
da pastör fırınının ortasına yerleştirilir. Sürenin sonunda tüp içindeki sıvının renginin
kırmızıdan yeşile dönmesi sterilizasyonun sağlıklı olduğunu gösterir.
2. Otoklavlar için yapılmış özel ilaçlı yapışkan bantlar bulunmaktadır. Steril edilmek
istenen paketin üzerine yapıştırılan bu bantların, sterilizasyon süresi sonunda renk
değiştirmesi, bu paketin otoklavlandığını, bazıları da sterilizasyonun derecesini
gösterir.
3. Bacillus stearothermophilus ve Bacillus subtilis gibi sporları 121°C'de 12 dakikada
ölen bakterilerin sporları uygun tüpler içinde otoklavın ortasına yerleştirilir.
Sterilizasyon süresi sonunda otoklavdan çıkarılan bu tüplerin içine sporların üremesi
30
için uygun olan tiyoglukolatlı buyyon ilave edilir. Tam sterilizasyon sağlandı ise;
sporların ölmüş olması ve besiyerinde herhangi bir üreme olmaması gerekir.
Dezenfeksiyon
I.
Fiziksel Yöntemler ile Dezenfeksiyon
A.
Sıcak su ile dezenfeksiyon: Ucuz, kolay, güvenilir bir yöntemdir. Üç şekilde
uygulanabilir:
1. Kaynar su ile dezenfeksiyon: 100°C’de vejetatif şekiller birkaç dakikada ölürler.
2. 75–100°C’de sıcak suda tutma ile dezenfeksiyon.
3. Pastörizasyon: 63–65°C arasında en az 30 dakika tutma ile dezenfeksiyon.
B.
UV ışınları ile işleme tabi tutma:
II.
Kimyasal Yöntemler ile Dezenfeksiyon
A. Anorganik Bileşikler
1. Asit ve alkaliler: H2SO4, HNO3, HCl, KOH, NaO, vb.
2. Ağır madenler ve tuzlar: CuSO4, HgCI2, AgNO3, vb.
3. Oksidan maddeler: %3 oranında H2O2 ve 1/1000 oranında KMnO4, vb.
4. Halojenler ve bileşikleri: Klor, brom ve iyot germisittir.
5. Kireçli maddeler
B. Organik Bileşikler
1. Organik metal bileşikleri: Çoğunlukla Hg ve Ag bileşikleridir.
2. Fenoller ve alkoller
a) Alkoller
b) Klorheksidin
3. Deterjanlar: Yüzey aktif maddelerdir.
a) Anyonik bileşikler: Sabunlar büyük moleküllü yağ asitlerinin Na ve K tuzlarıdır.
b) Noniyonik bileşikler: Polieterler ve poligliserol esterleri bu gruptadır.
c) Katyonik bileşikler: En çok bilineni benzalkonyum klörür (Zefiran), stilpiridiyum
klorür ve diaperen klorürdür.
C. Gaz dezenfektanlar
1. Kükürtdioksit
2. Formaldehit: Formalin formaldehitin %40 lık çözeltisidir.
3. Etilen oksit
4. Kloroform
5. Boyalar: Malaşit yeşili, brillant yeşili, kristal viole, metilen mavisi, rivanol
31
Tablo 4-1. Yaygın olarak kullanılan dezenfektanlar ve kullanım alanları
Dezenfeksiyon
seviyesi
Yüksek /
Sterilizasyon
Yüksek /
Sterilizasyon
Hastane
uygulamaları
Germisidler
Kullanım dilusyonu
Glutaraldehid
% 2-3,2
Hidrojen peroksit
% 3-25
Klor
100-1000 ppm
bağışık klorin
Yüksek
İzopropil alkol
% 60-95
Orta
Fenol bileşikleri
% 0,4-5
Orta
Cerrahi aletler
İyodoforlar
30-50 ppm serbest
iyodin
Orta
Tıbbi cihazlar
Dörtlü amonyum
bileşikleri
% 0,4- 1,6 akışkan
Düşük
Gıda hazırlama
sahaları ve yerler
Endoskoplar
Kontakt lensler
Bazı yarı kritik
cihazlar
Küçük alan
yüzeyleri
Dezenfeksiyon ve Antisepsi Uygulama Yöntemleri
El antisepsisi
Ellerin 15-20 saniye süreyle sabunla yıkanmasıyla mevcut mikroplar, lipit içeren kir tabakası
ile birlikte, lipit yapısının erimesi ve akması ile ortamdan uzaklaştırılırlar. Bu tür el yıkama
işlemine hijyenik el yıkama adı verilir. Hijyenik el yıkama ile günlük yaşantı için yeterli
antisepsi sağlanır. Hastanelerde doğrudan hasta ile ilişkisi olan sağlık personelinin %3
heksaklorofenli, %5 krezollü sabunlar ile el yıkamaları daha etkin bir önlemdir. Hijyenik el
yıkama ile geçici floranın tamamı, kalıcı floranın ise bir kısmı ortadan kaldırılmış olur.
Hijyenik el yıkamasından sonra, antiseptik maddelerle yapılan el yıkamasında ise
mikroorganizmaların öldürülmesi ya da gelişmelerinin durdurulması amaçlanır. Bu tür el
yıkama yöntemine cerrahi el yıkama yöntemi adı verilir. Cerrahi el antisepsisi için önerilen
çeşitli yöntemler içinde en etkililerinden biri; ellerin önce %5 krezollü veya %3
heksaklorofenli sabun ya da emülsiyonlarla 7 dakika sabunlanıp, fırçalanmasından sonra 3
dakika süre ile %70'lik etil alkolle muamele edilmesidir. Önerilen bir diğer yöntem ise
klorheksidinin deterjan içindeki %4'lük kremi ile ellerin 2-3 dakika fırçalanıp, yıkanmasıdır.
Deri antisepsisi
Çeşitli cerrahi girişimlerden önce, cerrahi girişim yapılacak olan bölgedeki derinin antisepsisi
gereklidir. Bu amaçla önce deri çok kirli ise sabunlu su ile yıkanmalı, sonra çeşitli
antiseptiklerle muamele edilmelidir. Kullanılan antiseptiklerin başında iyot tentürü gelir.
Bunun yanısıra alkol, alkol iyot, merthiolat, mersol gibi antiseptikler de kullanılabilir.
32
Yara antisepsisi
Toz, toprak gibi maddelerle kirlenmiş yaralardaki yabancı cisimler temizlenir ve yara bölgesi
sabunlu su ile yıkanarak kaba kirleri giderilir. Daha sonra %1 benzalkonyum klorür ve %3
hidrojen peroksit ile yıkanır. Ayrıca yara, iyot tentürü, %0.1 merthiolat veya alkol ile de
silinebilir.
Suların dezenfeksiyonu
Bu amaçla klor ve klor verici maddeler kullanılır. Şehir şebekesi suları gibi, büyük
miktarlardaki suyun dezenfeksiyonunda klorinatör denilen cihazlarla su içerisine gaz halinde
klor verilir. Etkin bir klorlamada, klorlama işleminden 1 saat sonra klorlanmış suda litrede 0.2
mg bağımsız klor bulunması gerekir.
Laboratuvar dezenfeksiyonu
Çalışma alanları (banklar) dezenfeksiyon için, her çalışma günü sonunda %5 fenol, %5 krezol,
%3 lizol gibi dezenfektanlardan birisi ile temizlenmelidir. Virüs laboratuvarlarında ise, bu
maddelerin viruslara etkisi az olduğundan ayrıca %1-3 sodyum veya kalsiyum hipoklorit ile
silinmelidir.
Kullanılan tüm mikroplu ekim ve materyaller otoklavlanmalıdır.
Döşeme ve duvarlar, hastane uygulamasındaki gibi, önce sabunlu su ile iyice fırçalanmalıdır.
Daha sonra %3-5 fenol veya %5 krezol eriyikleri ile silinebilir. Fayans ve yağlı boya duvarlara
da aynı işlem uygulanabilir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Sterilizasyon ve dezenfeksiyonda kullanılan alet ve malzemeleri inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2005). Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. 11. baskı. Barış Yayınları
Fakülteler Kitabevi, İzmir, 189-226.
2. Poyraz Ö (1998). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kılavuzu. T.C. Cumhuriyet Üniversitesi
Yayınları No:68, Sivas, 30-38.
3. Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe
Üniversitesi Yayınları, Ankara, 15-23.
4. Cengiz T (2001). Mikrobiyoloji Pratik Kitabı. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, 3. baskı.
Antıp A.Ş. Yayınları, Ankara, 33-54.
33

Download Report