II.SINIF
TIBBİ MİKROBİYOLOJİ
LABORATUVAR FÖYLERİ
2014-2015
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-1
Mikrobiyoloji Laboratuvarında Kullanılan Araç ve Gereçler
Dersin Amacı
Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçlerin tanıtılması
ve kullanım amaçlarının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Tutum
Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçleri sıralar.
Bu araç ve gereçlerin ne amaçla kullanıldığını açıklar.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçler
Giriş
Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında en sık kullanılan araç ve gereçler aşağıda sıralanmıştır.
1. Deney tüpleri: Serolojik deneyler, besiyeri hazırlanması, santrifüj ve çeşitli amaçlar için
kullanılan farklı boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde cam veya ısıya dayanıklı
plastikten yapılmış malzemelerdir.
Şekil 1-1. Tüpler
2. Plastik santrifüj tüpleri: 1.5, 2, 15, 50ml hacimlere sahip kapaklı tüplerdir.
Şekil 1-2. Plastik santrifüj tüpleri
1
3. Pipet: Çeşitli boyutlarda ve kapasitede olan, istenilen miktarda sıvıyı alarak başka bir yere
aktarmada kullanılan, ince, uzun, üzeri dereceli silindir şeklinde malzemelerdir.
Şekil 1-3. Pipet
4. Otomatik pipetler: Özellikle mikro yöntemlerle çalışıldığında çok küçük hacimleri
aktarmaya ve dağıtmaya yarayan pipetlerdir.
Şekil 1-4. Otomatik pipetler
5. Otomatik pipet ucu: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan plastik uçlardır.
Şekil 1-5. Otomatik pipet uçları
6. Mezür: Çeşitli boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde üzeri dereceli cam veya plastikten
yapılmış kaplardır. Sıvı maddelerin ölçümünde kullanılır.
Şekil 1-6. Mezürler
2
7. Pastör pipeti: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan, uç kısmı ince cam veya plastik
pipetlerdir.
Şekil 1-7. Pastör pipeti
8. Balon: Geniş küre şeklinde gövdesi ve dar silindir şeklinde boynu bulunan, tabanı düz cam
malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin hazırlanmasında
kullanılır.
Şekil 1-8. Çeşitli boyutlardaki balonlar
9. Beher: Silindir şeklinde, su bardağını andıran, çeşitli hacimlerde olabilen cam veya plastik
kaplardır.
Şekil 1-9. Çeşitli boyutlardaki beherler
10. Erlenmayer: Kısa silindir şeklinde boynu, koni şeklinde gövdesi olan geniş ve düz tabanlı
cam malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir.
Şekil 1-10. Çeşitli boyutlardaki erlenmayerler
3
11. Şişeler: Çeşitli boyut ve hacimlerde olabilen ve çeşitli amaçlarla kullanılabilen cam
malzemelerdir (örneğin damlalıklı şişe, hemokültür şişeleri, koyu renkli şişeler,...)
Şekil 1-11. Çeşitli boyutlardaki şişeler
12. Tüp Taşıyıcıları (sporlar): Çeşitli büyüklükteki tüpleri taşımaya yarayan araçlardır.
Şekil 1-12. Tüp taşıyıcıları (sporlar)
13. Eküvyon çubuğu (Silgiç): Uçlarına su emici (hidrofil) pamuk sarılmış steril çubuklardır.
Çeşitli vücut bölgelerinden inceleme örneklerinin alınması ve bazı ekimlerin yapılmasında
kullanılır.
14. Eküvyonlu Tüp: Genellikle inceleme örneği alınmasında kullanılan, içerisinde tek bir
eküvyon bulunan steril tüplerdir.
Şekil 1-13. Eküvyon çubuğu ve eküvyonlu tüp
15. Özeler: Daha çok sıvı ortamlardan örnek alıp ekim yapmaya yarayan aletlerdir. Uç kısmı
platin veya tungsten gibi kolay ısınıp soğuyan ve oksitlenmeyen telden yapılmış ya da tek
kullanımlık steril plastik malzemelerdir. Genellikle ucu halka şeklindedir. Standart
bakteriyolojik öze 0,01ml sıvı alır. Ucunda halkalı tel yerine düz tel bulunan, batırma
kültürü yapmaya, tek koloniden örnek almaya ve katı ortamlardan örnek alıp aktarmaya
4
yarayan iğne özeler, genellikle mantar ekimlerinde kullanılan ve ucu L şeklinde kıvrılmış
olan çengel özeler de mikrobiyolojide sıkça kullanılan malzemelerdir.
Şekil 1-14. Plastik ve metal uçlu özeler
16. Petri kutuları: Katı besiyeri hazırlanmasında ve antibiyogram yapılmasında kullanılan geniş
yuvarlak, yaklaşık 2cm derinlikte, birbirine geçen kapak ve alt kısımdan oluşan cam veya
plastik malzemelerdir.
Şekil 1-15. Petri kutusu
17. Lam: Direkt inceleme ve boyama için preparat hazırlanmasında kullanılan dikdörtgen
şeklinde ince camlardır.
18. Lamel: Genellikle 2x2 cm boyutlarında çok ince camdan yapılmış malzemelerdir. Çeşitli
amaçla kullanılabilen farklı şekilleri de olabilir.
Şekil 1-16. Lam ve lameller
19. Şale: İçerisinde boyanacak preparatların (lamların) tek tek yerleştirilebildiği camdan
yapılmış özel boya kaplarıdır.
Şekil 1-17. Şale
5
20. Gram Boyama Seti: Gram boyamada kullanılan boyaları içeren boya setidir.
Şekil 1-18. Gram boyama seti
21. Anaerobik Kavanoz: Anaerobik ve mikroaerofilik bakterilerin üretilmesinde kullanılır.
Şekil 1-19. Anaerobik kavanoz
22. Desikatör: Maddelerin nem almasını önleyen, katı maddelerin kurutulması ya da
besiyerlerinin mikroaerofilik ya da anaerobik ortamda inkübe edilmesini sağlayan camdan
yapılmış kapağı bulunan bir nevi kavanozdur.
Şekil 1-20. Desikatör
23. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı: Çözeltileri homojen şekilde karıştırmaya yarayan alettir.
Şekil 1-21. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı
6
24. Vorteks: Deney tüpü içerisindeki sıvıyı girdaplayarak homojen bir şekilde karıştırmaya
yarayan alettir.
Şekil 1-22. Vorteks
25. Etüv: Mikroorganizmaların üretilmesi için kullanılan, istenilen ısıya ayarlanabilen, sıcak
hava dolaplarıdır.
Şekil 1-23. Etüv
26. Santrifüjler: Tüp içerisinde bulunan yoğunlukları farklı maddeleri birbirinden ayırma amacı
ile kullanılan cihazlardır.
Şekil 1-24. Santrifüj
27. pH metre: pH değerlerinin ölçülmesinde kullanılan aletlerdir.
Şekil 1-25. pH metre
7
28. Güvenlik kabineti: Çalışan kişiyi ve çalışılan örneği korumaya yarayan çalışma ortamlarıdır.
Şekil 1-26. Güvenlik kabineti
29. Distile Su Cihazı: Saf (distile) su elde edilmesinde kullanılır.
Şekil 1-27. Distile su cihazı
30. Hassas Terazi: Çok küçük miktarlardaki maddelerin ölçümlerini yapılabilen terazidir.
Şekil 1-28. Hassas terazi
31. Hücre kültür malzemeleri: Hücre kültürü yapılırken kullanılan pleytler, flasklar gibi
malzemelerdir.
Şekil 1-29. Hücre kültür malzemeleri
8
32. Thermocycler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işleminde denaturation, annealing
(primerlerin bağlanması) ve extention (zincirin uzaması) aşamalarını otomatik olarak
yürütebilen programlanabilir bir cihazdır.
Şekil 1-30. Thermocycler cihazları
33. UV illuminatör ve kamera: Floresan boyalı ürünlerin görüntülenmesini sağlar.
Şekil 1-31. UV illuminatör
34. Elektroforez tankı ve güç kaynağı: Agaroz veya poliakrilamit jellerine yüklenen ürünlerin
elektroforetik yüklerine göre ayrıştırılmasına olanak sağlayan bir sistemdir.
Şekil 1-32. Elektroforez tankı
35. Buzdolabı ve Derin Dondurucular: Buzdolabı ısıya dayanıksız hasta örneklerinin,
besiyerlerinin ve bazı kimyasal maddelerin muhafaza edildiği dolaplardır. Derin
dondurucular ise dondurularak muhafaza edilmesi gereken malzemelerin ve
mikroorganizmaların uzun süre saklanması için kullanılır.
9
36. Pastör Fırını: Yüksek sıcaklıklara dayanabilen malzeme ve gereçlerin kuru sıcak hava ile
sterilizasyonlarında kullanılır.
Şekil 1-33. Pastör fırını
37. Bek: LPG ile çalışan, küçük ocaklar olup, yakma, alevden geçirme ve steril alan sağlamada
kullanılır.
Şekil 1-34. Bek
38. Filtreler: Çeşitli sıvı maddelerin süzülerek steril edilmesinde kullanılan aletlerdir.
Şekil 1-35. Filtre
39. Otoklav: Basınçlı buharla sterilizasyon yapmaya yarayan bir cihazdır.
Şekil 1-36. Otoklav
10
40. Benmari: İstenilen ayardaki ısı derecelerinde sıcak su elde etmeğe ve suyu bu derecelerde
sabit tutmaya yarayan aletlerdir.
Şekil 1-37. Benmari
41. Ultraviyole Lambası: Oda havasının ve yüzeylerin sterilizasyonunda kullanılan ultraviyole
ışını salan lamba sistemidir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Laboratuvarda gösterilen alet ve malzemeleri inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
11
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-2
Besiyerleri ve Boyalar
A-Mikrobiyolojide Kullanılan Besiyerleri ve Ekim Yöntemleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan besiyerlerinin öğrenilmesi
Besiyerlerine ekim yöntemlerinin öğrenilmesi
Bakterilerin besiyerlerinde oluşturdukları koloni tiplerinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Besiyerlerinin adlarını sayar.
Besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılan temel maddeleri sayar.
Besiyerlerinin özelliklerini açıklar.
Besiyerlerini kullanım amaçlarına göre gruplandırır.
Besiyerlerini fiziksel özelliklerine göre sınıflandırır.
Ekim yöntemlerini sıralar.
Koloni tiplerini özellikleri ile birlikte sıralar.
Besiyerlerini tanıyıp ayırır.
Ekim yöntemlerini uygular.
Koloni tiplerini değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Temel ya da basit besiyeri
Zenginleştirilmiş besiyeri (Kanlı agar, Çikolatamsı agar)
Özgül besiyeri (Lowenstein-Jensen besiyeri)
Seçici besiyeri (Selenit F besiyeri)
Ayırıcı besiyeri (EMB agar, Kanlı agar)
Ayıraçlı besiyeri (Şekerli besiyerleri, Fenol kırmızılı besiyerleri)
Öze
Eküvyonlu çubuk
Pipet
Tüpte sıvı besiyeri
Tüpte yatık katı besiyeri
Tüpte dik hazırlanmış katı besiyeri
Anaerobik kavanoz
S tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
R tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
M tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
12
Giriş
Mikroorganizmaların laboratuvar şartlarında üretilmeleri, saf olarak elde edilmeleri, çeşitli
özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi için besiyeri adı
verilen çeşitli besleyici ortamlar kullanılır. Besiyerlerinde hidrojen alıcı ve verici maddeler,
karbon kaynağı, azot kaynağı ve mineraller üretilecek mikroorganizmanın ihtiyacı olduğu
kadar mevcut olmalıdır.
Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan
Temel Maddeler
Su: Besiyeri hazırlanırken distile (saf) su ya da deiyonize su kullanılmalıdır.
Peptonlar: Çeşitli proteinlerin pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri
sonucunda suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagüle olmayan polipeptid,
dipeptid ve aminoasit gibi maddelerden oluşur. Besiyerine eklenen bu maddelerin karışımı
bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır.
Kimyasal maddeler ve tuzlar: Besiyerine eklenecek olan maddeler kimyasal olarak saf
olmalıdır. Bu maddeler uygun çözücülerde çözülerek besiyerine eklenir.
Kan: Besiyerlerinin zenginleştirilmesi amacıyla tavşan, koyun veya at kanı kullanılabilir.
Besiyerine eklenecek olan kanlar steril ve pıhtılaşmamış olmalıdır.
Serum: Koyun, tavşan, at gibi hayvanlardan steril olarak alınan kan 750 xg’de 5 dakika
santrifüj edilerek serum kısmı ayrılır ve buzdolabında saklanarak kullanılır.
Haben sıvısı: Sirozlu hastaların periton boşluğunda toplanan sıvıdır. Steril şartlarda toplanır
ve buzdolabında saklanır.
Maya özütü: Çeşitli vitaminler ve aminoasitler içerdiğinden zenginleştirici olarak kullanılır.
Mikroorganizmaların Laboratuvarda üretilebilecekleri besleyici ortamlar iki çeşittir.
A-Canlı ortamlar
1. Embriyonlu yumurta
2. Hücre kültürleri
3. Deney hayvanları
B-Cansız ortamlar
Besiyerlerinin Sınıflandırılması
Besiyerleri biçimlerine göre katı, sıvı, yarı katı ve yarı sıvı besiyerleri olarak ayrılırlar.
Besiyerlerinin katılaştırılmasında en çok kullanılan madde agar-agar'dır. Bir çeşit deniz
yosunundan elde edilen bu maddeyi mikroorganizmaların çoğu parçalayamaz. Bu madde
yaklaşık 42°C'de donar ve mikroorganizmaların üretilme derecelerinde erimez. Agarın %1.5 3 oranlarında sıvı ortamlara katılması ile katı besiyerleri, %0.3 - 0.5 oranlarında kullanılması
ile yarı katı besiyerleri elde edilebilir.
Kullanılış amaçlarına ve kimyasal yapılarına göre başlıca besiyeri grupları şunlardır:
13
1-Kimyasal Yapıları Bilinen Sentetik Besiyerleri
Saf kimyasal maddelerden hazırlanırlar. Eritici olarak saf su ya da iyonsuzlaştırılmış su
kullanılır. Özellikle mikroorganizmaların metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini
saf olarak elde etmek amacıyla kullanılırlar.
Sadece inorganik maddeler içerenlere basit sentetik besiyeri, buna ek olarak aminoasitler
gibi organik maddeler içerenlere de kompleks sentetik besiyerleri adı verilir.
2-Genel üretim besiyerleri
Güncel Laboratuvar çalışmalarında kullanılan, normal vücut florasında bulunan veya patojen
özellikler gösteren mikroorganizmaların çoğunun üretilebildiği besiyerleridir. Sıvı yada katı
biçimde hazırlanan bu besiyerleri üreticilik özelliklerine göre ikiye ayrılırlar.
a-Temel yada basit besiyerleri
Bunlarda başlıca pepton+tuz (peptonlu su) ya da et suyu+pepton+tuz (buyyon) gibi
maddeler ve su bulunur. Buyyona agar eklemek suretiyle elde edilen katı besiyerine jeloz adı
verilir. Bu ortamlar birçok mikroorganizmanın üremesi için elverişlidir.
b-Zenginleştirilmiş besiyerleri
Temel besiyerine kan, serum, haben sıvısı, glukoz, yumurta gibi daha besleyici maddelerin
eklenmesi ile elde edilen besiyerleridir (kanlı agar, çikolatamsı agar gibi). Basit
besiyerlerinde üremeyen bazı mikroorganizmalar bu besiyerlerinde üretilebilirler.
Şekil 2-1. Kanlı agar
Şekil 2-2. Çikolatamsı agar
3-Özel besiyerleri
Üremede güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmesi için özel olarak hazırlanan
besiyerleridir. Bu besiyerlerine belirli maddeler ve ayıraçlar konularak bazı
mikroorganizmaların üremeleri sağlanırken diğerlerinin üremeleri engellenmiştir.
a-Özgül besiyerleri
Yalnız bir çeşit ya da sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi için hazırlanan besiyerleridir.
(Mycobacterium tuberculosis`in üretilmesinde kullanılan Löwenstein-Jensen besiyeri gibi).
Şekil 2-3. Lowenstein Jensen besiyeri
14
b-Seçici besiyerleri
Bazı mikroorganizmaların üremelerini önleyici maddeler içeren, bu suretle karışık
bulundukları ortamlardan belirli mikroorganizmaların seçilerek üretilmelerini sağlayan
besiyerleridir (dışkıdaki Salmonella`ların çoğaltılmasını sağlayan Selenit F besiyeri gibi). Bu
besiyerleri temel ya da zenginleştirilmiş katı ya da sıvı besiyerlerine bir kısım bakterilerin
üremesini önleyen antibiyotikler, kimyasal maddeler, boyalar konularak hazırlanırlar.
c-Ayırıcı besiyerleri
İçerdikleri ayıraçlar aracılığı ile benzer bakterilerin ayrı görünümde koloniler oluşturmalarını
sağlayarak karışık bakterileri birbirinden ayırmaya yarayan besiyerleridir (Laktoza etkili
bakterileri etkisizlerden ayırmaya yarayan Eozin Methylene Blue (EMB) agar, hemoliz yapan
ve yapmayanları ayırmada kullanılan kanlı agar gibi).
Şekil 2-4. EMB besiyeri
d-Ayıraçlı besiyerleri
Mikroorganizmaların metabolizmalarına bağlı biyokimyasal özelliklerini incelemek amacıyla
besiyerlerine çesitli maddeler ve mikroorganizmaların bu maddeleri değişikliğe uğrattıklarını
gösteren ayıraçlar eklenerek hazırlanan besiyerleridir (şekerli besiyerleri, fenol kırmızılı
besiyerleri gibi).
Ekim Yöntemleri
İçerisinde mikroorganizma bulunduğu bilinen ya da mikroorganizma bulunup bulunmadığı
araştırılacak olan ortamlardan ekim aletleri ile alınan örneklerin belirli kurallar çerçevesinde
besiyerlerine aktarılması işlemine ekim denir. Ekimleri yapılacak örnekler ya doğrudan
doğruya hastalardan alınan hastalık örnekleridir ya da daha önce üretilmiş olan bakteri
kültürleridir.
Ekim yapılacak materyal sıvı ise öze, pipet, eküvyonlu çubuk; katı ise öze kullanılarak ekim
yapılır. Ekim yapılmadan önce ve sonra çalışılacak bankonun üzeri antiseptik eriyiklerle
silinmeli ve daima güvenlik kabinetinde çalışılmalıdır.
1-Tüpte sıvı besiyerine ekim: Tüp içerisindeki besiyerine ekim yapılırken tüp eğik olarak
tutulur. Ekim materyali öze ile alınmış ise öze tüpe yavaşça sokulur ve özedeki materyal
bırakılır. Materyal katı ise önce öze tüp duvarına dairesel hareketlerle sürülerek daha sonra
yavaşça sıvı besiyeri ile karıştırılarak ezilir. Pipetle alınan sıvı materyal besiyerine damlatılarak
ekim yapılır. Eküvyonlu çubuklar besiyerine daldırılır ve tüp kenarına bastırılarak içeriğinin
tüpteki besiyerine geçmesi sağlanır.
15
Şekil 2-5. Tüpteki sıvı besiyerineekim
2-Tüpte yatık katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal hiç bir yere değdirilmeksizin
tüpteki besiyerinin alt noktasına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılır ve aynı
doğrultuda geri çekildikten sonra besiyerinin yüzeyinde zikzaklar çizilerek yayılır.
Şekil 2-6. Tüpte yatık besiyerine ekim
3-Tüpte dik hazırlanmış katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal tüpteki besiyerinin
dip kısmına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılıp aynı doğrultuda çıkarılarak
ekim yapılır.
4-Plak besiyerine ekim:
a-Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim: Bu ekim yönteminde amaç bakterilerin katı
besiyerine seyreltilerek ekilmeleri, bu şekilde besiyerine tek tek düşmelerinin sağlanması ve
böylece birbirinden ayrı koloniler elde edilmesidir. Bu amaçla petri kutusundaki katı besiyeri
dört bölge olarak düşünülür. Öze ile alınan materyal ilk bölgede bir noktadan başlayıp sık
zikzaklar çizilerek ekilir ve ikinci ekim sahasına geçilir. Birinci bölgeden ikinciye doğru daha az
sıklıkta zikzaklar çizilir. Üçüncü bölgede zikzaklar daha da seyrek olmalıdır. En son dördüncü
bölgede bir-iki zikzak yapılarak ekim tamamlanır. Bu ekim yönteminde, her ekim sahasına
geçmeden önce besiyeri 90 derece açıyla döndürülerek yeni ekim sahasına geçilir. Her ekim
sahasına geçildiğinde öze sterilize edildikten sonra veya farklı öze kullanılarak ekim yapılır.
16
Eküvyonlu çubuk ile materyal alınmış ise önce bu pamuklu çubuk ilk ekim sahasına sürülür.
Daha sonra öze ile yukarıdaki işlemlere devam edilir.
Şekil 2-7. Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim
b-Plak besiyerine yaygın ekim: Antibiyotik duyarlılık testleri, faj tiplendirme deneyleri gibi
amaçlar için bakterilerin plak besiyerinin yüzeyine homojen olarak dağıtılması suretiyle
yaygın ekim yapmak gerekir.
Ekim yapılacak plak yüzeyine örnekten pastör pipeti ya da otomatik pipet ile birkaç damla
damlatılır. Örnek eküvyonlu çubuk ya da öze yardımı ile besiyerinin ortasında bir çizgi
şeklinde yayılır. Steril bir cam çubuk ya da eküvyonlu çubuk ile besiyerinin ortasına kadar sık
zikzaklar çizilir. Daha sonra aynı işlem besiyerinin diğer yarısında da uygulanır. Besiyeri 90
derece çevrilerek yapılan işlemler tekrarlanır. Böylece besiyerinin her tarafına homojen
olarak ekim yapılmış olur.
Şekil 2-8. Plak besiyerine yaygın ekim
Ekim yapılan besiyerleri üretilecek mikroorganizma için gerekli optimum sıcaklık derecelerine
ayarlanmış etüvlerde ve uygun atmosferik şartlarda inkübasyona bırakılır. Aerop ve fakültatif
anaerop mikroorganizmaların üretilmesinde normal atmosferik koşullar yeterlidir.
Anaeroplar ve mikroaerofilik mikroorganizmaların üretilmesi için kapakları sıkıca
kapatılabilen cam ya da çelik silindir seklinde kaplar (anaerobik jar) kullanılır. Ekim yapılmış
plaklar bu kaplara yerleştirilir ve yanlarına özel gaz karışımı sağlayan ticari kitler koynularak
ağızları kapatılır ve uygun sıcaklıktaki etüvlere yerleştirilir.
17
Koloni Tipleri
S (smooth=düz) tipi koloni: En sık görülen şekildir. Yuvarlak, düz kenarlı, kabarık, düz yüzeyli,
nemli ve homojen kolonilerdir.
R (rough=pürtüklü) tipi koloni: S tipi koloni yapan bakterilerin eski kültürlerinde ve uygunsuz
koşullarda üretimi ile meydana gelen koloniler bu tipte olabildiği gibi bazı tür bakteriler doğal
olarak R tipi koloni yaparlar. Yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları girintili ve çıkıntılı,
basık görünümdedirler. S tipi koloni, R tipi koloni şekline dönerse virülansı azalır.
M (mucoid) tipi koloni: Bir kısım bakterilerde hücre çeperlerinin dış tabakasında polisakkarit
ve bazen polipeptid yapısında, az veya çok miktarda kapsül maddesi bulunur. Bu kapsüllü
bakterilerin uygun ortamlarda (serumlu, habenli, kanlı, vs) sümüksü görünüşlü, yapışkan ve
akıcı koloniler oluşturdukları görülür. Uygunsuz koşullarda bu bakteriler S tipi koloni
oluştururlar.
L tipi koloni: Besiyerinin dip kısmına doğru uzanan kolonilerdir. Hücre duvarını kaybeden
bakteriler (L formu) bu tip koloniler oluştururlar.
Şekil 2-9. S tipi koloni
Şekil 2-10. R tipi koloni
Şekil 2-11. M tipi koloni
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1-Besiyeri gruplarına örnek olarak getirilen besiyerlerini incelenip adlarını, besiyeri grubunu
ve ne amaçla kullanıldığını yazınız.
2- Katı ve sıvı besiyerlerine verilen numunelerden uygun bir şekilde ekim yaparak yaptığınız
ekimi şematize ederek çiziniz.
a) Tek koloni
b) Homojen ekim
18
c) Sıvı besiyerine ekim
d) Yatık besiyerine ekim
4- Laboratuvara hazır olarak getirilen kültürlerde koloni görünümlerini değerlendirerek,
hangi tip koloni olduğunu çiziniz.
a)
Tarih
b)
c)
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA: Klinik Mikrobiyoloji
Manual of Clinical Mikrobiology (Çev Edit. AC Başustaoğlu). Dokuzuncu baskı.
Atlas Kitapçılık, Ankara, 2009, cilt 1, s.187-190.
2. Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, Đzmir,
2009, s.97-123.
3. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A: Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim
Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 2003, s.44-54.
4. Winn Jr. W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G,
Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostik Microbiology, Sixth edition,
Lippincott Williams and Wilkins, s.29-38.
19
B-Mikrobiyolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerinin öğrenilmesi
Basit boyama ve Gram boyama yöntemlerinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bilgi
Bu dersi alan öğrenciler;
Bakteri boyalarını sıralar.
Basit boyama yönteminin basamaklarını sıralar.
Gram boyama yönteminin basamaklarını sıralar.
Basit boyama yöntemini basit boyama kılavuzuna uygun şekilde
uygular.
Gram boyama yöntemini Gram boyama kılavuzuna uygun şekilde
uygular.
Basit boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak
değerlendirir.
Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik
olarak değerlendirir.
Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Gram boyama seti
Mikroskop
Lam
Öze
Bek
Gram pozitif kok (Örn; Stafilokok ya da Streptokok) üremiş kültür
plakları
Gram negatif basil (Örn; E. coli) üremiş kültür plakları
Giriş
Mikrobiyolojik tanıda morfolojik incelemeler büyük değer taşır. İyi bir incelemenin en azından
tanıya doğru yönlendirici değeri vardır. Morfolojik incelemelerden olan boyama işlemi,
bakterilerin identifikasyonu ve sınıflandırılmalarında önemli bir işlemdir. Bunlar içinde en sık
kullanılanlar şunlardır;
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Basit boyama
Gram boyama
Asido rezistan boyama (Ehrlich - Ziehl-Neelsen boyama)
Metilen mavisi boyama
Giemsa boyama
Çini mürekkebi boyama
20
7.
8.
9.
10.
Laktofenol pamuk mavisi boyama
Spor boyama
Kapsül boyama
Neisser boyama
Bütün boyama işlemlerinden önce preparatın hazırlanıp, uygun yöntemle tespit edilmesi
gerekir.
Preparatın Hazırlanması: Preparatlar doğrudan hastalık örneklerinden, kültürlerden ya da
deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanır. Bunun için temiz lamlar kullanılır.
Sıvı materyalden preparat hazırlanıyor ise öze ya da otomatik pipet yardımı ile bir damla
örnek alınarak lamın orta kısmına bırakılır. Öze yardımı ile dairesel hareketler ile küçük bir
bozuk para büyüklüğünde yayılır. Bakteri kolonisi ya da katı bir klinik materyalden preparat
hazırlarken önce bir damla steril serum fizyolojik lamın ortasına damlatılır. Örnek öze ile
alınarak damlanın kenarında ezilir. Dairesel hareketlerle sıvı ile karışması sağlanır. Preparat
oda ısısında kurumaya bırakılır.
Tespit Yöntemleri: Preparatın tespit edilmesinde amaçlanan, üzerindeki materyalin lama
yapışmasını sağlamaktır. Üç yöntemle tespit işlemi yapılabilir:
1. Havada kurutularak tespit: En az güvenilir olanıdır. Hazırlanan preparat 2-18 saat
bekletilmelidir.
2. Alevde tespit: En çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan sonra
materyalli yüzü yukarı gelecek şekilde bir ucundan tutulur. Lamın alt yüzü yanmakta olan
alevin mavi kısmına, yukarıdan aşağıya doğru yavaş yavaş hareket ettirilerek yalatılır.
3. Kimyasal maddeler ile tespit: Alevde tespit edildiğinde morfolojisini kaybedebilecek
materyali (protozoa, lökosit, eritrosit, epitel hücresi vs.) tespitte kulanılır. Etil alkol (8-10
dakika), metil alkol (3 dakika) ve aseton (5 dakika) tespit işleminde en çok kullanılan
kimyasallardır. Bu maddeler hazırlanan preperatın üstüne, materyal bulunan kısmını
kaplayacak şekilde dökülerek kullanılır.
Basit Boyama
Bu yöntemde, boyama için genellikle tek bir boya kullanılır ve mikroorganizmaların
morfolojileri gözlenir.
1.
2.
3.
4.
5.
Preparat hazırlanıp tespit edilir.
Metilen mavisi, safranin veya kristal viyole gibi boyalardan birisi ile 1 dakika boyanır.
Su ile yıkanır.
Havada kurutulur.
İmmersiyon objektifi ile incelenir.
Bu boyama sonucu bakteriler, metilen mavisi ile mavi, safraninle pembe/kırmızı, kristal viyole
ile mor/lacivert boyanır.
21
Gram Boyama
Bakterilerin hücre duvar yapılarındaki farklılıklara dayalı bir boyama yöntemi olup, bakterileri
gram pozitif ve gram negatif olarak sınıflayan bir boyama yöntemidir.
Gram Boyama Becerisi Öğrenim Rehberi
ARAÇLAR: Gram boyama seti, lam, su, penset, incelenecek hasta örneği ya da bakteri
kültürü
BASAMAK
NO
1
BASAMAKLAR
Preparatı hazırlayınız. (Bakınız; preparatın hazırlanması)
Preparatı uygun yöntem ile tespit ediniz. (Bakınız; Tespit yöntemleri)
3
Preparat yatay konumda iken üzerine kristal viyole dökerek1 dakika
bekletiniz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile boya tamamen akıncaya kadar yıkayınız.
4
Preparat yatay konumda iken üzerine lügol dökerek 1 dakika bekletiniz.
5
Preparatın üzerindeki lügol solüsyonunu dökünüz.
6
Preparatın üzerine damla damla aseton – alkol dökerek dekolorizasyon
(renksizleştirme) yapınız. Bu işlemi kristal viyole tamamen akana kadar
sürdürünüz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız.
2
7
9
Preparat yatay konumda iken üzerine safranin (zıt boya) dökerek 30 saniye
bekletiniz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız.
10
Preparatı oda ısısında kurutunuz.
11
Preparatı immersiyon objektifi ile inceleyiniz.
8
Bu boyamayla gram pozitif bakteriler mor, gram negatif bakteriler pembe boyanır.
Boyaların hazırlanışı:
Metilen mavisi
Kristal viyole
Lugol
Aseton – alkol
Safranin
:1,5 gr metilen mavisi, 100 ml %95’lik etil alkol
:1 gr kristal viyole, 10 ml %96’lık etil alkol, 100 ml saf su
: 1 gr kristal iyot, 2 gr potasyum iyodür, 300 ml su
:1:1 oranında %95’lik etil alkol ile %100’lük aseton karışımı
:%1’lik sudaki eriyiği
22
Asido Rezistan Boyama
Özellikle Mycobacterium'lar olmak üzere Nocardia'lar gibi hücre duvarlarında bol miktarda
lipid içeren mikroorganizmaların boyanmasında kullanılan bir yöntemdir. Bu boyama
yönteminde asit-alkole dirençli boyanan bakteriler kırmızı (karbolfuksin ile), diğer bakteriler
ve zemin mavi (metilen mavisi ile) boyanır.
Metilen Mavisi Boyama
Özellikle dışkı örneklerinde polimorfonükleer lökositlerin ve mikroorganizmaların
gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Polimorfonükleer lökositler, bakteriler ve diğer hücreler
mavi gözlenir.
Giemsa Boyama
Protozoa (Plasmodium vs.) türlerinin ve kan hücrelerinin gözlenmesi amacıyla uygulanır.
Parazitler mavi-mor renkte ve kırmızı çekirdekli olarak gözlenir. Beyaz kan hücrelerinin
çekirdekleri mor, sitoplazmaları mavi renkte görülür. Eritrositler ise açık kahverengi olarak
gözlenir.
Çini Mürekkebi Boyama
Çini mürekkebi ile boyama, en sık Cryptococcus neoformans’ ın kapsülünün gözlenebilmesi
amacıyla uygulanır. Çini mürekkebi kapsülü boyamadığından, siyah zemin üzerinde mayayı
çevreleyen açık renkli kapsül gözlenir.
Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama
Küf mantarlarının tanınması amacıyla uygulanır. Mavi boyanmış hifa ve spor morfolojileri
incelenir.
Spor Boyama
Spor yapan bakterilerin, sporlarının varlığını ve yerleşimini gözlemek için kullanılan bir
boyama yöntemidir. Bu yöntemle bakteri kırmızı (safranin ile), içindeki spor yeşil (malaşit
yeşili ile) boyanır.
Neisser Boyama
Corynebacterium diphteriae'larda bulunan metakromatik cisimcikleri boyamada kullanılan bir
boyama yöntemidir. Bakteriler sarı, metakromatik cisimcikler kahverengi boyanır.
23
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Masalarda bulunan besiyerlerde üremiş bakteri kolonileri, basit ve gram boyama
yöntemiyle boyanıp mikroskopta incelendikten sonra şekil (kok, basil) ve renkleri (mor,
pembe) belirterek çizilecek.
Boyama: Basit boyama
Bakteri:…………………
Şekil:………………
Renk:………………
Boyama: Gram boyama Boyama: Gram boyama
Bakteri: S. aureus
Bakteri:E.coli
Şekil: ………………………
Şekil:…………………..
Renk:…………………… … Renk:………………….
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
NOT: Diğer boyama yöntemleri daha sonra yapılacak olan ilgili laboratuvar saatlerinde
uygulamalı olarak gösterilecektir.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü baskı. Barış yayınları, İzmir, 73-76.
2. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 5561.
3. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH,Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical
Microbiology. Klinik Mikrobiyoloji. Cilt 1. 9th ed.,Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, 183184.
24
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-3
Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon
Dersin Amaçları
Sterilizasyon ve dezenfeksiyon yöntemlerinin öğrenilmesi
Sterilizasyon kontrol yöntemlerinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Sterilizasyon ve dezenfeksiyon ile ilgili tanımları açıklar.
Sterilizasyon ile dezenfeksiyon arasındaki farkı açıkla.r
Sterilizasyon yöntemlerini gruplandırır.
Sterilizasyon yöntemlerinin önemli özelliklerini sıralar.
Sterilizasyonun işlem basamaklarını sıralar.
Sterilizasyonun kontrol yöntemlerini sıralar.
Dezenfeksiyon yöntemlerini gruplandırır.
Dezenfektanları sıralar ve önemli özelliklerini sayar.
Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (öze vb.)
sterilizasyonunu yapar.
Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (Laboratuvar masası vb.)
dezenfeksiyonunu yapar.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Bu uygulamada öğrencilere Merkezi Sterilizasyon Ünitesi
tanıtılacaktır.
Sıvı sabun
Kağıt havlu
Alkol bazlı solüsyon
Çamaşır suyu
Eldiven
Maske
Bone
Otoklav
Pastör fırını
Yıkama cihazları
Etilen oksit sterilizasyon cihazı
Giriş
Bulaşıcı hastalıkların yayılması, besin maddeleri ve diğer materyallerin bozulması ve
hastane enfeksiyonlarının önlenmesinde, sterilizasyon ve dezenfeksiyonun önemi yaklaşık
150 yıldan beri bilinmektedir.
25
Dezenfeksiyon ve Sterilizasyon ile İlgili Önemli Terimler
Sterilizasyon
Dezenfeksiyon
Dekontaminasyon
Antisepsi
Asepsi
Germisid
Sterilant
(kimyasal)
Yüksek düzey
dezenfektan
Orta düzey
dezenfektan
Düşük düzey
dezenfektan
Mikrobiyostatik
Ortamın, bir madde ya da cismin mikroorganizmaların tüm canlı ve aktif
şekillerinden (patojen, saprofit, spor veya vejetatif) kabul edilebilir
sterilite güvence düzeyini sağlayacak ölçüde arındırılması işlemidir
Bir cismin veya maddenin patojen (hastalandırıcı nitelikteki)
mikroorganizmalarından arındırılması işlemidir. Bu işlem ile bakteri
sporları dışındaki tüm formlar (bakteri, mantar, protozoon gibi tüm
mikroorganizmaların vejetatif şekilleri ve viruslar) yok edilir.
Patojenik mikroorganizma sayısının koruyucu bir giysi olmaksızın
kullanım için güvenli seviyesine indirgenmesidir.
Vücut yüzeylerindeki (deri, mukoza gibi) ve çeşitli yaralardaki patojen
mikroorganizmaların, kimyasal maddeler kullanılarak yok edilmesi
işlemidir. Hastayla bağlantılı olarak; canlı bir dokunun veya derinin
dezenfeksiyonudur
Patojen mikroorganizmalardan arındırılmış bir ortam anlamına
gelmektedir
Mikrorganizmaları öldüren ajanlar
Sterilizasyonu sağlayabilen kimyasal
Çoğu bakteriyel endosporlar hariç mikrobiyal patojenlerin tümünü
öldüren dezenfektan
Bakteriyel endospor dışında tüm mikrobiyal patojenleri öldüren
dezenfektan
Vejetatif bakteriler ve zarflı virüsleri öldüren dezenfektan
Mikroorganizmaların üremelerini önleyen madde ya da etmenlere
mikrobiyostatik maddeler, bu etkiye de mikrobiyostatik etki denir.
Merkezi Sterilizasyon Ünitesi
Merkezi Sterilizasyon Ünitesi (MSÜ) kirli alan, temiz alan ve steril alandan oluşur.
Şekil 3-1. Merkezi Sterilizasyon Ünitesi alanları
26
Şekil 3-2. Kirli alan
Şekil 3-3. Temiz alan
Şekil 3-4. Steril alan
27
Sterilizasyon
Şekil 3-5. Sterilizasyon işlem basamakları
I. Fiziksel Yö nteml er il e Steril iza syo n
A.
I s ı ile yapılan sterilizasyon
1. Kuru ısı ile sterilizasyon
a) Yakma ve alevden geçirme
b) Kuru sıcak hava ile sterilizasyon
2. Nemli ısı ile sterilizasyon
a) Buharla sterilizasyon
i. Basınçlı buharla sterilizasyon
ii. Basınçsız buharla sterilizasyon
iii. Akım halindeki buharla sterilizasyon
b) Sıcak su ile sterilizasyon
i. Kaynatma
ii. Tindalizasyon
iii. Koagulasyon
B. Süzme (filtrasyon) ile sterilizasyon
1. Mekanik olarak süzme
2. Adsorbsiyon yoluyla süzme
C. Işınlama ile sterilizasyon
1. Ultraviyole ışınları ile yapılan sterilizasyon
2. Gama ve x ışınları ile yapılan sterilizasyon
II. Kimyasal Maddeler ile Sterilizasyon
A. Sıvı ortamlara kimyasal maddeler eklenerek yapılan sterilizasyon
1. Timol
2. Kloroform
B. Gazlar ile yapılan sterilizasyon
1. Etilen oksit
28
2. Beta propiolakton
Kuru Sıcak Hava ile Sterilizasyon: Kuru sıcak hava ile sterilizasyon için Pastör fırını adı verilen
elektrikli sterilizasyon aleti kullanılır. Üzerlerinde fırının ulaştığı ısıyı takip etmeye yarayan
termometre bulunur. Kuru sıcak hava ile;
• Cam ve metalden yapılmış malzemeler (tüp, balon, petri kutusu, pipet, penset vb.),
• Nemin içlerine ulaşamaması nedeniyle nemli hava ile sterilize edilemeyen yağlar
(vazelin, parafin vb.),
• Süzgeç kağıtları ve buna benzer nitelikte, yüksek ısıda bozulmayacak malzemeler
sterilize edilir.
Besiyerleri ve sıvılar kuru sıcak hava ile steril edilmezler.
Genel olarak kuru sıcak hava ile sterilizasyon için malzemeler; 175°C'de bir, 165°C'de iki, 150
°C'de üç ve 120°C’de 8 saat tutulmalıdır.
Şekil 3-6. Pastör fırını
Basınçlı Buhar ile Sterilizasyon
Otoklav: Bu yöntemde temel ilke, doymuş ve basınç altındaki su buharında, 100°C'nin
üzerinde sterilizasyondur. Bu amaç için otoklav denilen aletler kullanılır. Otoklav ile
sterillemede; 1 atmosfer basınç altında 121°C'de 15-20 dakika ya da 115°C'de 30 dakika
bekletmek yeterlidir.
Otoklavda daha çok besiyerleri, çözeltiler, kullanılmış petriler vs. steril edilir.
Basınçlı buharla sterilizasyon kullanılamadığı durumlar şunlardır:
• Yüksek ısı ve neme duyarlı aletler (krom kaplama, optik aletler, vs.)
• Buharın penetre olamayacağı maddeler (yağ, pudra vs.)
Şekil 3-7. Değişik şekillerde dizayn edilmiş otoklavlar
29
Gazlar ile Yapılan Sterilizasyon
Etilen Oksit: Etilen oksit 10.8°C'nin altında sıvı, üzerindeki ısılarda ise gaz halinde bulunan bir
maddedir. Saf halde iken çok toksik, iritan ve patlayıcı olduğundan belli oranlarda
karbondioksit ile karıştırılarak kullanılır.
Etilen oksit çok etkin bir jermisit olup, sporları da öldürür. Hücre sitoplazmasındaki çeşitli
maddelerle kimyasal bileşikler yaparak etki gösterir. Oldukça penetran özelliktedir, kağıt ve
polietilenden yapılmış olan ambalajları geçerek, iç kısımda paketlenmiş olan aletleri steril
ederken, sterillenen madde ve aletlerin niteliğini bozmaz.
Şekil 3-8. Etilen oksit sterilizatörü
Sterilizasyonun Denetlenmesi
Isı ile yapılan sterilizasyonda; ısının derecesi ile yeterli sürede uygulanıp, uygulanmadığı ve
steril edilmek istenen malzemelerin her yerine ulaşıp, ulaşmadığı sterilizasyon üzerine etkili
faktörlerdir. Sterilizasyonun tam olabilmesi için otoklav ve pastör fırınlarının düzenli olarak
bakımı yapılmalıdır. Ayrıca yapılan sterilizasyon işleminin etkili olup, olmadığını anlamak için
de çeşitli denetleme mekanizmaları geliştirilmiştir:
1. Browne sterilite kontrol tüpleri denilen ve içlerinde 115°C'de 25 dakikada, 121°C'de
15 dakikada ve 160°C'de 1 saatte renk değiştiren sıvılar bulunan tüpler, otoklav ya
da pastör fırınının ortasına yerleştirilir. Sürenin sonunda tüp içindeki sıvının renginin
kırmızıdan yeşile dönmesi sterilizasyonun sağlıklı olduğunu gösterir.
2. Otoklavlar için yapılmış özel ilaçlı yapışkan bantlar bulunmaktadır. Steril edilmek
istenen paketin üzerine yapıştırılan bu bantların, sterilizasyon süresi sonunda renk
değiştirmesi, bu paketin otoklavlandığını, bazıları da sterilizasyonun derecesini
gösterir.
3. Bacillus stearothermophilus ve Bacillus subtilis gibi sporları 121°C'de 12 dakikada
ölen bakterilerin sporları uygun tüpler içinde otoklavın ortasına yerleştirilir.
Sterilizasyon süresi sonunda otoklavdan çıkarılan bu tüplerin içine sporların üremesi
30
için uygun olan tiyoglukolatlı buyyon ilave edilir. Tam sterilizasyon sağlandı ise;
sporların ölmüş olması ve besiyerinde herhangi bir üreme olmaması gerekir.
Dezenfeksiyon
I.
Fiziksel Yöntemler ile Dezenfeksiyon
A.
Sıcak su ile dezenfeksiyon: Ucuz, kolay, güvenilir bir yöntemdir. Üç şekilde
uygulanabilir:
1. Kaynar su ile dezenfeksiyon: 100°C’de vejetatif şekiller birkaç dakikada ölürler.
2. 75–100°C’de sıcak suda tutma ile dezenfeksiyon.
3. Pastörizasyon: 63–65°C arasında en az 30 dakika tutma ile dezenfeksiyon.
B.
UV ışınları ile işleme tabi tutma:
II.
Kimyasal Yöntemler ile Dezenfeksiyon
A. Anorganik Bileşikler
1. Asit ve alkaliler: H2SO4, HNO3, HCl, KOH, NaO, vb.
2. Ağır madenler ve tuzlar: CuSO4, HgCI2, AgNO3, vb.
3. Oksidan maddeler: %3 oranında H2O2 ve 1/1000 oranında KMnO4, vb.
4. Halojenler ve bileşikleri: Klor, brom ve iyot germisittir.
5. Kireçli maddeler
B. Organik Bileşikler
1. Organik metal bileşikleri: Çoğunlukla Hg ve Ag bileşikleridir.
2. Fenoller ve alkoller
a) Alkoller
b) Klorheksidin
3. Deterjanlar: Yüzey aktif maddelerdir.
a) Anyonik bileşikler: Sabunlar büyük moleküllü yağ asitlerinin Na ve K tuzlarıdır.
b) Noniyonik bileşikler: Polieterler ve poligliserol esterleri bu gruptadır.
c) Katyonik bileşikler: En çok bilineni benzalkonyum klörür (Zefiran), stilpiridiyum
klorür ve diaperen klorürdür.
C. Gaz dezenfektanlar
1. Kükürtdioksit
2. Formaldehit: Formalin formaldehitin %40 lık çözeltisidir.
3. Etilen oksit
4. Kloroform
5. Boyalar: Malaşit yeşili, brillant yeşili, kristal viole, metilen mavisi, rivanol
31
Tablo 3-1. Yaygın olarak kullanılan dezenfektanlar ve kullanım alanları
Dezenfeksiyon
seviyesi
Yüksek /
Sterilizasyon
Yüksek /
Sterilizasyon
Hastane
uygulamaları
Germisidler
Kullanım dilusyonu
Glutaraldehid
% 2-3,2
Hidrojen peroksit
% 3-25
Klor
100-1000 ppm
bağışık klorin
Yüksek
İzopropil alkol
% 60-95
Orta
Fenol bileşikleri
% 0,4-5
Orta
Cerrahi aletler
İyodoforlar
30-50 ppm serbest
iyodin
Orta
Tıbbi cihazlar
Dörtlü amonyum
bileşikleri
% 0,4- 1,6 akışkan
Düşük
Gıda hazırlama
sahaları ve yerler
Endoskoplar
Kontakt lensler
Bazı yarı kritik
cihazlar
Küçük alan
yüzeyleri
Dezenfeksiyon ve Antisepsi Uygulama Yöntemleri
El antisepsisi
Ellerin 15-20 saniye süreyle sabunla yıkanmasıyla mevcut mikroplar, lipit içeren kir tabakası
ile birlikte, lipit yapısının erimesi ve akması ile ortamdan uzaklaştırılırlar. Bu tür el yıkama
işlemine hijyenik el yıkama adı verilir. Hijyenik el yıkama ile günlük yaşantı için yeterli
antisepsi sağlanır. Hastanelerde doğrudan hasta ile ilişkisi olan sağlık personelinin %3
heksaklorofenli, %5 krezollü sabunlar ile el yıkamaları daha etkin bir önlemdir. Hijyenik el
yıkama ile geçici floranın tamamı, kalıcı floranın ise bir kısmı ortadan kaldırılmış olur.
Hijyenik el yıkamasından sonra, antiseptik maddelerle yapılan el yıkamasında ise
mikroorganizmaların öldürülmesi ya da gelişmelerinin durdurulması amaçlanır. Bu tür el
yıkama yöntemine cerrahi el yıkama yöntemi adı verilir. Cerrahi el antisepsisi için önerilen
çeşitli yöntemler içinde en etkililerinden biri; ellerin önce %5 krezollü veya %3
heksaklorofenli sabun ya da emülsiyonlarla 7 dakika sabunlanıp, fırçalanmasından sonra 3
dakika süre ile %70'lik etil alkolle muamele edilmesidir. Önerilen bir diğer yöntem ise
klorheksidinin deterjan içindeki %4'lük kremi ile ellerin 2-3 dakika fırçalanıp, yıkanmasıdır.
Deri antisepsisi
Çeşitli cerrahi girişimlerden önce, cerrahi girişim yapılacak olan bölgedeki derinin antisepsisi
gereklidir. Bu amaçla önce deri çok kirli ise sabunlu su ile yıkanmalı, sonra çeşitli
antiseptiklerle muamele edilmelidir. Kullanılan antiseptiklerin başında iyot tentürü gelir.
Bunun yanısıra alkol, alkol iyot, merthiolat, mersol gibi antiseptikler de kullanılabilir.
32
Yara antisepsisi
Toz, toprak gibi maddelerle kirlenmiş yaralardaki yabancı cisimler temizlenir ve yara bölgesi
sabunlu su ile yıkanarak kaba kirleri giderilir. Daha sonra %1 benzalkonyum klorür ve %3
hidrojen peroksit ile yıkanır. Ayrıca yara, iyot tentürü, %0.1 merthiolat veya alkol ile de
silinebilir.
Suların dezenfeksiyonu
Bu amaçla klor ve klor verici maddeler kullanılır. Şehir şebekesi suları gibi, büyük
miktarlardaki suyun dezenfeksiyonunda klorinatör denilen cihazlarla su içerisine gaz halinde
klor verilir. Etkin bir klorlamada, klorlama işleminden 1 saat sonra klorlanmış suda litrede 0.2
mg bağımsız klor bulunması gerekir.
Laboratuvar dezenfeksiyonu
Çalışma alanları (banklar) dezenfeksiyon için, her çalışma günü sonunda %5 fenol, %5 krezol,
%3 lizol gibi dezenfektanlardan birisi ile temizlenmelidir. Virüs laboratuvarlarında ise, bu
maddelerin viruslara etkisi az olduğundan ayrıca %1-3 sodyum veya kalsiyum hipoklorit ile
silinmelidir.
Kullanılan tüm mikroplu ekim ve materyaller otoklavlanmalıdır.
Döşeme ve duvarlar, hastane uygulamasındaki gibi, önce sabunlu su ile iyice fırçalanmalıdır.
Daha sonra %3-5 fenol veya %5 krezol eriyikleri ile silinebilir. Fayans ve yağlı boya duvarlara
da aynı işlem uygulanabilir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Sterilizasyon ve dezenfeksiyonda kullanılan alet ve malzemeleri inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2005). Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. 11. baskı. Barış Yayınları
Fakülteler Kitabevi, İzmir, 189-226.
2. Poyraz Ö (1998). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kılavuzu. T.C. Cumhuriyet Üniversitesi
Yayınları No:68, Sivas, 30-38.
3. Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe
Üniversitesi Yayınları, Ankara, 15-23.
4. Cengiz T (2001). Mikrobiyoloji Pratik Kitabı. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, 3. baskı.
Antıp A.Ş. Yayınları, Ankara, 33-54.
33
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-4
Mikrobiyota
Dersin Amacı
Mikrobiyota bulunan mikroorganizmaların öğrenilmesi
Antibiyogram yönteminin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Mikrobiyotada bulunan mikroorganizmaları sayar
Mikrobiyota ve patojen mikroorganizmaların ayrımını yapar
Antibiyogram çeşitlerini öğrenerek antibiyogram testini yapar
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
%5 koyun kanlı agar
EMB
SDA
Öze
Transport besiyeri
Müller Hinton Broth
Müller Hinton Agar
Antibiyotik diskleri
Alkol
Pens
0,5 McFarland Tüpü
Eküvyonlu çubuk
Giriş
Sağlıklı insan vücudunda, vücuda zarar vermeden denge içinde yaşayan mikro-organizma
topluluklarına normal mikrobiyal flora denir. Mikroorganizmaların neden oldukları hastalık
etkenlerinin saptanması; bu bağlamda klinik örnek alınması, taşınması, gerektiğinde
saklanması, uygun ortamlara ekim yapılması, değerlendirme ve tedavide normal vücut
florasının bilinmesi gerekir.
Mikrobiyota
Mikrobiyal flora vücudumuzu örten deri ve dış çevre ile çeşitli bağlantılarla ilişkili olan
yüzey, boşluk ve organlar ile mukoza membranlarına yerleşmiştir. Flora üyeleri vücudun çeşitli
34
bölgelerinde yaş, cins, hormonal durum, beslenme ve sağlık alışkanlıklarına bağlı olarak
değişiklik gösterir. Mikrobiyal flora iki grupta ele alınır.
1- Kalıcı Flora: Belirli bölgelerde ve belirli yaşlarda genellikle değişmeyen, kısa süreli
ortadan kaldırılsa bile yeniden oluşabilen, genellikle sabit kabul edilen, süreklilik gösteren
mikroorganizma topluluğudur. Kalıcı floranın bozulan mikrobiyotayı yeniden oluşturma özelliği
vardır.
2- Geçici Flora: Kalıcı floranın yanında, çoğu hastalık oluşturmayan, bazen patojen
olabilen, belirli vücut bölgelerinde birkaç saatten birkaç haftaya kadar değişebilen sürelerde
kalan mikroorganizma topluluğudur. İnsan vücudunun dış ortamla temasta olmayan dışarıya
kapalı, vücut yüzeyi ile sıvı ve boşlukları flora üyeleri taşımazlar.
KALICI FLORANIN ÖNEMİ
Kalıcı flora üyeleri sağlığın korunmasında doğal direnç mekanizmalarından birini
oluşturmaktadır. Kalıcı floranın etkinlikleri şu şekilde sıralanabilir.
1- Bazı bağırsak flora üyeleri, K vitamini sentezi ve besinlerin emiliminde rol alırlar.
2- Mukoza ve deride bakteriyel interferans mekanizması ile patojen bakterilerin
kolonizasyonunu önlerler.
3- Besin maddeleri ve yerleşme yerleri için patojen bakteriler ile yarışırlar.
4- Bazı bakterilerin üremesini engelleyen bacterisoidin adlı maddeler salgılarlar.
5- Konak hücre yüzeyindeki reseptör ve diğer bağlanma yerleri için patojen mikroorganizmalarla yarışırlar.
Mikrobiyotanın kalıcı üyeleri bazı özel durumlarda (travma, immün yetmezlik gibi)
fırsatçı hastalık etkeni olarak değerlendirilmektedirler.
ANTİBİYOTİK KULLANMANIN FLORA ÜZERİNE ETKİSİ
Antibiyotiklere duyarlı mikrobiyota üyeleri canlılıklarını kaybederek yok olurken,
dirençli flora üyeleri çoğalmaya devam ederek popülasyona hâkim olurlar. Dolayısıyla floranın
dengesi bozulur ve bu durumda geçici flora olarak bulunan mikroorganizmalar patojen
davranabilirler. Örnek C. difficile psödomembranöz enterokolit oluşturur.
BAZI VÜCUT BÖLGELERİNİN FLORA ÜYELERİ
1Derinin Mikrobiyotası: Derinin dış ortamla sürekli temasta bulunması, deride
geçici flora üyeleri için yoğunluk, çeşitlilik ve bölgelere göre farklılık özelliklerini de
getirmektedir. Derideki florayı etkileyen etkenler başlıca etkenler; epidermisin kalınlığı, yağ ve
ter bezlerinin dağılımı, kılların dağılımı, derinin nem oranı, derinin üzerindeki anatomik deri
kıvrımları, deri üzerinde bulunan yağ asidi, lizozim vb. enzimlerin varlığı.
35
Deri flora üyelerinden S.aureus yüksek oranda hastalık nedeni olabilmekte, bunu KNS
takip etmektedir. Deri de ayrıca Propionibacteriım acnes, alfa hemolitik streptokoklar,
mayalar, nonpatojen mikobakteriler ve peptokoklar flora üyesi olarak bulunmaktadır.
2Ağız Ve Üst Solunum Yolları Mikrobiyotası: Doğum sırasında üst solunum
yolları sterildir. Ağız florası doğumdan 6–8 saat sonra oluşmaya başlar ve 4–12 saat sonra
viridans streptokoklar kalıcı floranın ilk ve yoğun üyesi olmaya başlar ve hayat boyu devam
eder. Yeni doğan, çocukluk ve erişkin dönemleri ile ağız hijyeni ve besleme alışkanlıkları ağız
florasını etkileyen evre ve faktörlerdir. Daha sonra dişler çıkmaya başlamadan önce aerobik ve
anaerobik stafilokoklar, Gram negatif diplokoklar ve difteroidler görülür. Dişler çıkmaya
başladıktan sonra ise viridans streptokoklar yeniden ağız florasını temel üyesi durumuna
gelirler. Anaerop streptokoklar, anaerobik laktobasiller, fusiform basiller ve bacteroidesler
normal ağız florasında yer alan bakterilerdir. Boğaz florasında hemoliz yapmayan
streptokoklar, neisserialar, stafilakoklar,
difteriodler,
A grubu dışı beta hemolitik
streptokoklar, peptostreptokoklar, haemophiluslar, koagülaz negatif stafilakoklar bulunur. A
grubu beta hemolitik streptokoklar, boğazda yüksek oranda hastalık nedenidirler. Alt solunum
yolları bronşiyol ve alveoller normal koşullarda flora taşımazlar.
3Sindirim Sistemi Mikrobiyotası: Doğum sırasında gastrointestinal sistem
sterildir. İlk beslenme ile flora oluşmaya başlar. Özofagusta mikrobiyota yoğunluğu azdır.
Tükürük ve yiyeceklerle taşınan mikroorganizmalar yer alır. Mide pH’ sı asit olduğundan mide
mikroor-ganizma sayısını minimum sayıdadır. Asidik ortam kolera ve bazı enterik
patojenlerden vücudu korur. Doğumda bağırsaklar sterildir. Anne sütüyle beslenen çocuklarda
laktobasiller ve laktik asit streptokokları yoğun olarak bulunurken, mama ile beslenen
yenidoğanlarda laktobasiller az, buna karşılık Gram negatif çomaklar özellikle koliform
bakteriler egemendir.
Mideden itibaren gastrointestinal sistemde yukardan aşağıya doğru gidildikçe
mikroorganizma yoğunluğu artar. Fekal florada %96–99 unu anaerop, %1–4 nü ise aerop ve
fakültatif anaerop bakteriler bulunur. Kolunun bir gram dışkısında 1011 mikrorganizma yer alır.
Gastrointestinal sistemin tümü ele alındığında mide için Helicobacter pylori, kalın bağırsak için
bacteroides türleridir.
4Üretranın Mikrobiyotası: Her iki cinste de aynı tip ve az sayıda olmak üzere
koagülaz negatif stafilakok, propionibacteriumlar, alfa hemolitik streptokoklar, bazı
mikobakteriler, kadında Candida albicans, Gardnerella vaginalis ve lactobacillus türleri
bulunur.
Vagina florası yaşa bağlı olmak üzere dört döneme ayrılır.
36
a. Doğumdan hemen sonra anne hormonlarını etkisi altında bulunan çocuğun vagina
florası annenin vaginal florasına benzer(aerop laktobasiller). Ortam pH’sı asit olup birkaç hafta
sürer.
b. Puberteye kadar glikojen olmadığından pH nötraldir. Gram pozitif ve Gram negatif
kok ile Gram negatif koliform basiller bulunur.
c. Puberteden menapoza kadar vajinal epitelinin glikojenden zengin yapısı ve aerop
ve anaerop laktobasillerin varlığı nedeniyle ortam tekrar asidik olur.
d. Menapozdan sonra laktobasiller azalıp pH yükselir ve karışık bakteri florası olu-şur.
Normal vajina florasında laktobasil, stafilakok, Gardnerella vaginalis, B grubu strepto-kok ve
bakteriodes türleri yer alır. Vagina flora üyeleri doğum sırasında yenidoğan bebeği infekte
edebilirler. Özellikle B grubu streptokoklar, yenidoğan sepsislerinde bu açıdan önemlidir.
5Göz Mikrobiyotası: Sağlıklı insanda göz konjunktivasında az miktarda bakteri
bulunur. Sıklıkla koagülaz negatif stafilakok, laktobasiller nadiren de S. aureus, haemophilus,
enterik bakteriler ile streptokoklar yer alır.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. %5 koyun kanlı agar, EMB, SDA besiyerlerine boğaz, burun, deri örneklerini ekiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Çotuk A. (2003) Genel Mikrobiyoloji Laboratuar Yöntemleri. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul.
3. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
37
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik -5
Antibiyotik Duyarlılık Testleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan antibiyotik testlerinin neden yapıldığının
ve çeşitlerinin ve yapılışlarının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Antibiyotik testlerinin çeşitlerini sayar
Niçin antibiyotik testi yapıldığını söyler
Testlerin yapılışını öğrenir
Beceri
Antibiyotik testlerinin değerlendirmesini yapar
Hangi testi nasıl kullanacağını bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Üreme olmuş örnek
Öze
Müller Hinton Broth
Müller Hinton Agar
Antibiyotik diskleri
Alkol
Pens
0,5 McFarland Tüpü
Eküvyonlu çubuk
Antibiyotik Duyarlılık Testleri
Antibiyotiklerin mikroorganizmalarla ilişkileri çeşitli yönlerden incelenmektedir. Bunlardan
başlıcaları şunlardır:
1- Antimikrobiklerin mikroorganizmalar üzerindeki etkinliklerinin ölçülmesi
2- Vücut sıvılarındaki antimikrobik etkinliğinin ölçülmesi
3- Sağaltım sırasında vücut sıvılarındaki antimikrobik maddenin hastalık etkeni
üzerindeki etkinliğinin saptanarak dozunun ayarlanması
4- Mikroorganizmaların antimikrobiklere karşı oluşmuş dirençliliğinin saptanması
38
5- Antimikrobiklerin mikroplar üzerindeki birlikte etkilerinin saptanması
Dilüsyon (sulandırım) yöntemlerinde kural; sıvı ya da katı besiyerleri içinde
antimikrobiklerin belirli sulandırımları yapılarak mikroorganizmalarla karşılaştırılmasıdır.
Antimikrobik maddenin hangı sulandırıma kadar mikroorganizma üzerinde etkili olduğu MIC
(Minimal inhibitör konsantrasyon), MCC (Minimal sidal konsantrasyon) ya da MBC (Minimal
bakterisidal konsantrasyon) yöntemleri ile saptanabilmektedir.
Sıvı besiyerlerinde mikroorganizmalarla antimikrobikler doğrudan doğruya ilişkide
bulunduklarından sonuçlar daha duyarlı olarak bulunmaktadır. Gerek antimikrobiklerin
etkinliklerinin araştırılmasında gerekse mikroorganizmaların dirençlerinin araştırılmasındaki
çalışmalarda kalite kontrolü yapmak için antimikrobiklere karşı dirençlilik durumları bilinen
standart mikroorganizmalardan yararlanmak gerekmektedir.
Mikroorganizmaların antibiyotiklere duyarlılıkları çeşitli yöntemlerle saptanır:
1- Katı besiyerinde yayılım (Difüzyon) (Kalitatif)
Disk difüzyon yöntemi (Kirby - Bauer Disk Difizyon Yöntemi)
2- Katı besiyerinde sulandırma (Dilüsyon) (Kantitatif)
3- Sıvı besiyerinde sulandırma (Kantitatif) MİK (Minimal inhibitor Konsantrasyon)
tayini.Mikrodilüsyon ve makrodilüsyon olmak üzere iki şekilde yapılabilir.
4- E testi (Kantitatif)
Kirby-Bauer Disk Difüzyon Yöntemi
Besiyeri: Mueller Hinton Agar
Ticaretten hazır olarak elde edilebileceği gibi laboratuvarlarda da hazırlanabilir. Besiyeri düz
tabanlı 90 mm iç çaplı petri kutularına 4 mm kalınlıkta dökülür. Hemen kullanılacak besiyerleri
katılaştıktan sonra yüzeylerinin kuruması için kapakları üstte ve hafif aralık olarak 35-37°C de
30 dakika tutulurlar. Hemen kullanılmayacak besiyerleri ise nem kaybının önlenmesi için
plastik torbalara doldurulup torbaların ağzı yapıştırıldıktan sonra buz dolabında bekletilirler.
Bu şekilde + 4 ile + 10 derecede 2 hafta süre ile bozulmadan saklanabilirler.
Bakteri yoğunluğunun standardizasyonu:
Antimikrobiklere karşı duyarlılığı ölçülecek olan mikroorganizmanın besiyerine standart
miktarda ekilmesi gerekir. Bunun için 0,5 numaralı Mac Farland bulanıklık standardı
kullanılır.Bu tüpün bulanıklığı 0,05 ml Ba Cl ve 9,95 ml H2 SO4 karışımının bulanıklığına eşittir ve
yaklaşık 108 Kob /ml bakteri yoğunluğuna karşılık gelir.Mac Farland 0,5 no.'lu tüpün arkasına
çizgiler çizilmiş bir kağıt konduğunda çizgiler net olarak görülmelidir (Şekil 1).
39
Şekil 5-1. Bulanıklığın ölçülmesi
Hazırlanan bulanıklık sıvısı bir deney tüpüne konur. Ağzı sıkıca bir lastik tıkaç ile kapatılır.
Oda derecesinde ve karanlıkta saklanmak koşulu ile 6 ay kullanılabilir. Kullanırken iyice
çalkalanmalıdır. Ekimi yapılacak bakterinin bulanıklığı bu karışımın bulanıklığına ayarlanarak
ekim yapılır. Bakteri ekimi için ucuna hidrofil pamuk sarılmış, kuru sıcak havada sterillenmiş
eküvyonlar hazırlanır.
Deneyin Yapılışı:
1- Duyarlılığı araştırılacak bakteri kültüründen 5-6 koloni seçilerek sıvı besiyerine aktarılır.
2- Bu kültür 4-5 saat inkübe edildikten sonra oluşan bulanıklık standart MacFarland No.0,5
bulanıklık tüpü ile karşılaştırılarak aynı bulanıklığın elde edilmesine kadar serum fizyolojik
ile sulandırılır.
3- Bir pamuklu eküvyon alınıp kültüre daldırılır. Sıvının fazlası ekivyonun tüp yüzeyine
bastırılarak burulması ile akıtılır. Eküvyon besiyerinin yüzeyine çevrile çevrile sürülerek tüm
yüzeye yaygın, homojen ekim yapılır.
4- Antimikrobik disklerinin seçilmesi: Tedavide kullanılan bir çok antibiyotik vardır. Bunların
bir kısmı mikroorganizmaların üzerinde aynı ya da benzer etki mekanizması ile etki ederler.
Bir kısmına ise bazı mikroorganizmalar doğal olarak direnç gösterir.Bunun için hastalık
materyeline ve ayrımı yapılan mikroorganizmaya göre gerekli görülen disklerin seçilerek
kullanılmaları gerekir.
5- Disklerin yerleştirilmesi: Besiyerinin yüzeyi kuruduktan sonra diskler belli bir plan
dahilinde, ince uçlu bir penset ile tutulup besiyeri yüzeyine bırakılarak üzerlerine hafifçe
bastırılıp yapışmaları sağlanır. Her defasında pensetin ucu alkole sokulup alevde yakılır.
Diskler besiyeri kenarından yaklaşık 15 mm ve birbirlerinden 25-30 mm uzaklıkta dizilirler.
Bu şekilde 90 mm lik bir petri kutusuna 6-7 si kenarda, biri ortada olmak üzere 7-8 disk
yerleştirilebilir.
40
6- Disklerin dizilmesinden itibaren en çok 15 dakika içinde besiyerleri 35°C lik etüvde
üremeye bırakılır. Bir gecelik inkübasyondan sonra disklerin etraflarında oluşan üremenin
olmadığı önlenim zonlarının çapları mm olarak ölçülerek not edilir. Ölçüm göz ile görülen
üremenin olmadığı önleme zonunun çapı alınarak yapılır.
7- Sonuçların değerlendirilmesi: Milimetre olarak yapılan zon ölçümleri çizelgedeki sınırlar
çerçevesi içerisinde incelenerek "dirençli, duyarlı ve orta derecede duyarlı" olarak
değerlendirilir. Burada dirençli sonucu, o mikroorganizmanın, söz konusu antibiyotiğin
sağaltımda kullanılan dozları ile elde edilen kan ve doku konsantrasyonlarına karşı dirençli
olduğu
anlamındadır.Duyarlı
sonucu,
mikroorganizmanın
antibiyotiğin
aynı
konsantrasyonlarına karşı duyarlı olduğunu gösterir. Orta derecede duyarlı sonucu ise
kullanılan antimikrobiğin daha yüksek dozlarda verilmesi halinde sonuç alınabileceği
anlamındadır.
Şekil 5-2. Kirby - Bauer Disk Difüzyon Yöntemi
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Kirby - Bauer Disk Difüzyon Yöntemi ile antibiyogram hazırlayınız.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Çotuk A. (2003) Genel Mikrobiyoloji Laboratuar Yöntemleri. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul.
3. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
41
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-6
Serolojik Tanı Yöntemleri
Dersin Amaçları
Serolojik tanı yöntemlerinin öğrenilmesi
En sık kullanılan serolojik test sonuçlarının yorumlanmasının
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Serolojik testlerin kullanım alanlarını açıklar.
Serolojik tanı yöntemlerini sıralar.
Serolojik tanı yöntemlerinin prensiplerini açıklar.
En sık kullanılan serolojik testlerin sonuçlarını yorumlar.
Lam aglütinasyon testlerini uygular.
Aglütinasyon testlerinin sonuçlarını değerlendirir.
Membrana bağlı immün test yöntemleri uygular.
Membrana bağlı immün test sonuçlarını değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Kontamine deney malzemelerini tıbbi atık kabına atar.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Brusella antikoru pozitif hasta serumu
Rose Bengal lam aglutinasyon testi antijeni
Lam
Brusella antikoru pozitif tüp aglutinasyon testi
Pozitif ve negatif örnekler içeren ELISA testi
Membrana bağlı immün test (Örneğin; Helicobacter pylori dışkıda
antijen testi gibi)
Giriş
Antijenlerle antikorlar arasındaki özgül reaksiyonlardan yararlanılarak yapılan
çalışmalara serolojik testler denir. Bu testlerde temel amaç, bilinmeyen bir reaktifi (örneğin;
antikor) bilinen bir reaktif (örneğin; antijen) kullanarak saptamaktır. Antijen veya antikordan
birinin sabit miktarları ile diğerinin sulandırımları in vitro koşullarda karşılaştırılarak kantitatif
sonuçlar elde edilebilir.
Serolojik testler bakteriyel, viral, fungal, paraziter hastalıkların tanısında, bakteri
serotiplerinin belirlenmesinde, otoantikorların tespitinde, ilaç düzeylerinin belirlenmesinde,
immün sistemin değerlendirilmesinde, malignensilerin tanısında ve doku uygunluk
antijenlerinin tespitinde kullanılabilmektedir. Serolojik testler serum, beyin omurilik sıvısı,
idrar, tükrük, gaita gibi klinik örneklerden çalışılabilir.
42
En Sık Kullanılan Serolojik Tanı Yöntemleri:
1. Presipitasyon
2. Aglutinasyon
a. Tam bakteri aglutinasyonu
b. Lateks aglutinasyonu
c. Koaglutinasyon
d. Direkt hemaglutinasyon
e. İndirekt (pasif) hemaglutinasyon (İHA)
3. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
4. Flouresan Antikor Tekniği
a. Direkt flouresan antikor (DFA) tekniği
b. İndirekt Flouresan antikor tekniği
c. Kompleman bağlayan IFAT
5. Western blot ya da immünblot
6. Membrana bağlı immün testler
7. Radioimmun assay (RIA)
8. Kompleman fiksasyon testi
Presipitasyon Testi
Presipitasyon testi, çözünür (soluble) haldeki antijenlerin özgül antikorlarla birleşmesi ve
kafes oluşturarak çözünür olmayan presipitin (çökelek) oluşturması esasına dayanır.
Şekil 6-1. Presipitasyon testi(http://en.engormix.com’dan alınmıştır)
Aglütinasyon Testi
Partikül halindeki antijenlerin özgül antikorlar ile reaksiyona girerek gözle görülebilir kümeler
oluşturması esasına dayanır. Bu test tüpte, lamda ya da özel karteksler üzerinde yapılabilir.
Partiküler antijen olarak, bakteri hücresi, eritrosit veya taşıyıcı partiküller (örneğin lateks
partikülleri) kullanılır.
Tam bakteri aglutinasyonu: Bakteri hücreleri partikül olarak kullanılır. Tüpte ya da lamda
uygulanabilir. Kullanılan bakteriler kültürde üretilmiş ve çeşitli kimyasal maddelerle muamele
edilerek öldürülmüştür. Bir dizi tüp alınır. Bu tüplerde hasta serumunun seri dilüsyonları
hazırlanır. Her tüpün üzerine standart miktarda bakteri süspansiyonu eklenir ve bir gece
43
etüvde inkübe edilir. Değerlendirmede, tüplerin çalkalanması ile oluşan “kar yağdı
manzarası” şeklinde partiküllerin varlığı testin pozitif olduğunu gösterir.
Şekil 6-2. Tüp aglütinasyon testi
Test lamda yapılıyorsa bir damla bakteri süspansiyonu lama damlatılır. Hemen yanına bir
damla hasta örneği konur. Her iki damla bir karıştırıcı (kürdan, plastik öze yada plastik
karıştırıcı çubuk) yardımı ile birleştirilerek karıştırılır. Lama rotasyonlar yaptırılarak örneğin
yavaşça karışması sağlanır. Genellikle 5-10 dakikalık süre sonunda gözle görülebilen
partiküllerin oluşması testin pozitif olduğunun göstergesidir.
Şekil 6-3. Lam aglütinasyon testi
Mikrobiyolojide en sık kullanılan tam bakteri aglutinasyon testleri;
Rose Bengal testi; Bruselloz tanısında kullanılır. Lam aglutinasyon testidir.
Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi); Bruselloz tanısında kullanılır.
Gruber Widal testi; Salmonelloz tanısında kullanılır. Lamda ya da tüpte uygulanabilir.
Weil-Felix testi; Riketsiya enfeksiyonları tanısında kullanılır. Lamda ya da tüpte uygulanabilir.
MAT (mikroaglutinasyon testi); Leptospira enfeksiyonları tanısında kullanılır.
Lateks aglutinasyon testi: 1 µm çapında, polistren yapıda lateks partikülleri kullanılır.
Genellikle lam ya da özel karteksler üzerinde yapılır. Antijen aranacaksa partiküller antikor
ile, antikor aranacaksa antijen ile kaplanır. 1+ ile 4+ arası değerlendirilir.
Şekil 6-4. Lateks aglütinasyon testi (http://www.rapid-diagnostics.org/tech-agglut.htm’
den alınmıştır).
44
Hemaglutinasyon testi: Partikül olarak eritrositler kullanılır. İki yöntem vardır.
1. Direkt hemaglutinasyon testi
2. İndirekt hemaglutinasyon testi
Direkt hemaglutinasyon testi: Bazı enfeksiyonlarda eritrosit yüzeyindeki antijenlere karşı
oluşan antikorların tespitinde kullanılır. Hızlı tanı sağlar. Özgüllük ve duyarlılıkları düşüktür.
Mikrobiyolojide en sık kullanılan direkt hemaglutinasyon testleri;
Soğuk aglutinasyon testi; M. pneumoniae enfeksiyonlarında, insan eritrositlerini soğukta
aglutine eden soğuk aglutininlerin tespitinde kullanılır.
Paul Bunnel testi; Epstein Barr Virus enfeksiyonlarında koyun ertrositlerini aglutine eden
heterofil antikorlar tespit edilir.
İndirekt (Pasif) Hemaglutinasyon (IHA) testi: Antikor saptanmasında kullanılan bir
yöntemdir. Bu test için genellikle 96 kuyucuklu U tabanlı pleytler kullanılır. Çeşitli antijenler
tannik asit ile eritrosit yüzeyine bağlanır (duyarlılaştırma). Hasta serumu üzerine
duyarlılaştırılmış eritrositler eklenir. Pozitiflik olduğunda hemaglutinasyon, negatiflik
olduğunda ise düğme gibi çökme olur.
Şekil 6-5. İndirekt Hemaglutinasyon Testi (http://openi.nlm.nih.gov’dan alınmıştır).
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Bu metod bir enzim ile bir antijenin veya bir antikorun konjugasyonu esasına dayanır.
Antikor ölçümü için bilinen antijenler mikrodilüsyon pleytlerine fikse edilir. Serum
dilüsyonları eklenir. Serumda antijene spesifik antikor varsa antijen ile birleşecektir. Daha
sonra peroksidaz veya alkalen fosfataz gibi bir enzimle işaretlenmiş antikorlar ile yeniden
inkübe edilir. Enzime spesifik substrat eklenerek renk değişimi spektrofotometrede
değerlendirilir.
45
Şekil 6-6. Ticari ELISA kitleri
Şekil 6-7.Otomatize ELISA cihazı
Şekil 6-8. 96 Kuyucuklu ELISA pleyti
Floresan Antikor Tekniği (İmmunofloresan Antikor Yöntemi, IFA)
İmmunoflouresan ankikor (IFA) yönteminde katı faz olarak lam (slide) kullanılır.
Konjugat florokrom boyası ile işaretlenir. En sık kullanılan boya fluorescein isothiocyanate
(FITC)’tır. Direkt ve indirekt floresan antikor testi şeklinde uygulanabilir. Floresan
mikroskobunda değerlendirilir.
Şekil 6-9. Cytomegalovirüs (CMV) IFA testi
Şekil 6-10. Antinükleer antikor IFA testi
Western Blot (WB) Yöntemi
Bu yöntemde bir mikroorganizmaya ait antijenlerin bantlar halinde nitroselüloz kağıt
membranlara geçirilmesi ile elde edilen stripler kullanılır. Striplerin üzerine hasta serumu
eklenir. Enzimle işaretli konjugat ve sonra substrat eklenir. Hasta serumunda antikor varlığı
koyu renkli bant oluşumu ile tespit edilir. Etkene özgül en az iki ve daha fazla bant oluşumu
pozitif kabul edilir.
46
Şekil 6-11. Borrelia western blot testi
Sık Karşılaşılan Serolojik Profillerin Yorumlanması
Hepatit A Virusu (HAV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı
Tablo 6-1. HAV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması
HAV IgM
+
+
-
HAV IgG
+
+
YORUM
Yeni kazanılmış enfeksiyon, akut faz
Geçirilmekte olan enfeksiyon
Geçirilmiş enfeksiyon, kazanılmış
bağışıklık
Hepatit B Virusu (HBV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı
Tablo 6-2. HBV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması
HBs Ag
Anti-HBs
Anti-HBc
IgM
-
Anti-HBc
IgG
-
+
-
+
+
-
+
-
+/+
-
+
+
-
+
-
-
+
+/47
YORUM
Erken akut enfeksiyon yada AntiHBc’nin oluşmamasına yol açan
immun bozukluk
Yeni kazanılmış enfeksiyon, akut faz
Kronik enfeksiyon
HBeAg(+): yüksek enfektivite
AntiHBe(+): düşük enfektivite
Aşıya bağlı bağışıklık
Geçirilmiş enfeksiyon, kazanılmış
bağışıklık
Düşük düzey HBV taşıyıcısı
HBsAg’nin kaybolması, anti-HBs’nin
+
+
+/-
saptanması arasındaki pencere
dönemi
Transfüzyon
Yalancı pozitiflik veya nonspesifik
reaksiyon
Kronik aktif hepatit
Farklı subtip enfeksiyonları
İmmun kompleks ayrışması
+/-
Hepatit C Virusu (HCV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı
Tablo 6-3. HCV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması
Anti-HCV
+
+
+
RIBA
+
+
HCV-RNA
+
YORUM
Geçirilmiş enfeksiyon, viremi yok
Yalancı pozitiflik nonspesifik reaksiyon
Aktif enfeksiyon, viremi var
HIV Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı
ELISA, HIV antikorlarının tespitinde tarama amacıyla en sık kullanılan yöntemdir. ELISA ile
reaktif sonuç tespit edildiğinde, test hastadan alınacak farklı bir örnekle tekrar edilir. İkinci
örnekte de reaktif sonuç görülürse anti-HIV antikorları western blot ya da immünblot
yöntemi ile araştırılır. Bu yöntemler ile pozitif sonuç alındığında anti-HIV antikorlarının pozitif
olduğu söylenebilir. HIV enfeksiyonu tanısında polimeraz zincir reaksiyonu da kullanılabilir.
Brusella Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı
Brusella enfeksiyonunun serolojik tanısında kullanılan aglutinasyon testleri;
Rose Bengal testi: Lam aglutinasyon testidir. Hızlı tarama amacı ile kullanılır. B. abortus S99
suşu boyalı antijen olarak kullanılır. Sonuçlar Wright testi ile doğrulanmalıdır.
Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi): Antijen olarak B. abortus S99 ya da B.
melitensis antijenleri kullanılır. Hem B. abortus hem de B. melitensis antikorları tespit
edilebilir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda
2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Rose Bengal testi kuvvetli pozitif olduğu halde, Wright
testi negatif veya zayıf reaksiyon gösteriyorsa “Blokan antikorlardan” şüphelenilir. Blokan
antikorların varlığı Coombs testi veya enzim immunoassay ile tespit edilir.
Spot test: Tam kanda çalışılan aglutinasyon testidir.
48
Brucella tanısında kullanılabilecek diğer serolojik testler; ELISA ile IgG ve IgM türü
antikorların tespit edilmesi, kompleman birleşme deneyi ya da radioimmunoassay olarak
sıralanabilir.
Ebstein Barr Virus (EBV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı
Enfeksiyöz mononükleoz geçiren insanların kanında iki çeşit antikor oluşur; EBV’e karşı
oluşan antikorlar ve heterofil antikorlar (Paul-Bunnel antikorları). Heterofil antikorlar
monospot test ya da Paul Bunnel testi ile değerlendirilebilir.
EBV antijenleri: Viral kapsid antijenleri (VCA), Erken (Early) antijenler, Nükleer antijen (EBNA
1-6), Lenfosit-determinant membran antijenleri (LYDMA), Latent membran proteinleri (LMP1, LMP-2)’dir.
Tablo 6-4. EBV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması
VCA-IgM
VCA-IgG
EA-IgG
EBNA
Monospot test
İmmün
olmayan
Yeni
enfeksiyon
-
+
+/+/+
Yakında
geçirilmiş
enfeksiyon
-/+
+
+
+/+
Eski
enfeksiyon
Reaktivasyon
+
+
-
+
+/+
-/+
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Rose Bengal testini uygulayarak değerlendiriniz.
2. Membrana bağlı immün test yaparak değerlendiriniz.
3. Size gösterilen testleri inceleyerek not ediniz.
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
49
Kaynaklar
1. US D (2006). Serolojik Tanı Yöntemleri. Hacettepe Universitesi Yayınları, Ankara; 10-68.
2. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller AM (2010). Vibrio ve Aeromonas. Tıbbi Mikrobiyoloji.
6th ed. Çeviren: Akgün Y, Atlas Tıp Kitapçılık Ltd Şti., Ankara, 317-323.
3. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller AM (2010). Kampilobakterler ve Helikobakterler. Tıbbi
Mikrobiyoloji. 6 th ed. Çeviren: Aydın F, Atlas Tıp Kitapçılık Ltd Şti., Ankara, 325-332.
50
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-7
Gr (+) Koklar
A- Stafilokok Türlerinin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Stafilokokların genel özelliklerinin öğrenilmesi
Stafilokokların laboratuvar tanısında kullanılan testlerin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Stafilokokların genel özelliklerini açıklar.
İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan Stafilokok türlerini sıralar.
Stafilokok türlerinin hangi hastalıklara neden olduğunu sıralar.
Stafilokokların Laboratuvar tanısında kullanılan testleri sıralar.
Staphylococcus aureus’un diğer stafilokoklardan ayrılmasında
kullanılan özellikleri sıralar.
Katalaz testinin kullanım amacını açıklar.
Koagülaz testinin kullanım amacını açıklar.
Katalaz testinin uygulama basamaklarını sıralar.
Koagülaz testinin uygulama basamaklarını sıralar.
Stafilokok kolonilerinin özeliklerini değerlendirir.
Katalaz testini uygular.
Katalaz testini değerlendirir.
Koagülaz testini uygular.
Koagülaz testini değerlendirir.
Kontamine deney malzemelerini tıbbi atık kabına atar.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Işık mikroskobu
Lam
Öze
%3 H2O2 (Hidrojen peroksit)
1/5 oranında sulandırılmış insan veya tavşan plazması
Staphylococcus aureus, Koagülaz negatif stafilokok ve streptokok
üremiş kültür plakları
Stafilokoklardan hazırlanmış Gram boyalı preperatlar
Eldiven
Tıbbi atık kabı
51
Giriş
Stafilokoklar Gram pozitif, kok morfolojisinde, 0.5-1.5 µm çapında, hareketsiz, fakültatif
anaerop, yüksek tuz konsantrasyonu (örneğin %10 sodyum klorid) içeren ortamlarda, 1840°C’de üreyebilirler. İnsanlarda bulunan 40 tür ve 24 alt tür tanımlanmıştır.
İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan türler:
1. Staphylococcus aureus
2. Staphylococcus epidermidis
3. Staphylococcus saprophyticus
4. Staphylococcus lugdunensis
5. Staphylococcus haemolyticus
Metisilin dirençli S. aureus (MRSA) hastanede yatan hastalarda ciddi enfeksiyonlara ve son
yıllarda sağlıklı insanlarda hastane dışında da enfeksiyonlara neden olmaya başlayan en
tehlikeli Stafilokok türüdür.
İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan stafilokok türlerinin yaptıkları hastalıklar Tablo 4’de
gösterilmiştir.
Tablo 7-1. Stafilokok türlerinin yaptığı hastalıklar
Stafilokok türü
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
S. lugdunensis
S. haemolyticus
Yaptığı hastalıklar
Besin zehirlenmesi, haşlanmış deri sendromu, toksik şok
sendromu, karbonkül, folikülit, impetigo, yara enfeksiyonu,
bakteriyemi, endokardit, pnömoni, ampiyem, osteomyelit,
septik artrit
Bakteriyemi, endokardit, cerrahi yara enfeksiyonu, idrar yolu
enfeksiyonu, kateter, şant, prostatik alet ve peritoneal
diyaliz fırsatçı enfeksiyonları
İdrar yolu enfeksiyonu, fırsatçı enfeksiyonlar
Endokardit, artrit, bakteriyemi, fırsatçı enfeksiyonlar, idrar
yolu enfeksiyonları
Bakteriyemi, endokardit, kemik ve eklem enfeksiyonları,
idrar yolu enfeksiyonları, yara enfeksiyonları, fırsatçı
enfeksiyonlar
Stafilokokların Laboratuvar Tanısı
Mikroskopi: Stafilokoklar katı besiyerinde üretildiklerinde üzüm salkımı şeklinde kümeler
yapan fakat klinik örneklerde tek tek veya küçük gruplarlar halinde görülen gram pozitif
koklardır.
52
Kültür: Stafilokoklar aerobik ve anaerobik koşullarda, seçici olmayan besiyerlerinde büyük,
beyaz - altın sarısı pigmentli, S tipi koloniler yaparak 24 saat içinde hızla üremektedir.
Nükleik asit bazlı testler: Stafikokların hızlı üremesi nedeniyle bu testler sadece tarama
kültürlerinde (hastalarda dirençli bakteriler açısından burun taşıyıcılığı taraması) oksasilin
direncini belirlemek için kullanılmaktadır.
İdentifikasyon: S.aureus’un tanımlanmasında nispeten basit biyokimyasal bir test olan
koagülaz testi sıklıkla kullanılmaktadır. Koagülaz negatif stafilokokların tanımlanması daha
karmaşık olup, ticari tanımlama sistemleri ya da nükleik asit sekanslama teknikleri ile türe
özgül genlerin gösterilmesini gerektirmektedir.
Katalaz Testi: Hidrojen peroksitin (H2O2) katalaz enzimi tarafından su ve oksijene
parçalanması esasına dayanır. Stafilokokların streptokoklardan ayrılması amacı ile kullanılır.
Bu test için bir lam üzerine birkaç damla %3’lük H2O2 [Hidrojen peroksit (%30) 1 ml, distile su
9 ml] damlatılır. Stafilokok şüpheli kolonilerden yada bakteri süspansiyonundan bir miktar
alınarak %3’lük H2O2 ile steril bir öze yardımı ile karıştırılır. Bu esnada hava kabarcıklarının
oluşması testin pozitifliği şeklinde yorumlanır.
Pozitif kontrol: Stafilokoklar, Negatif kontrol: Streptokoklar
Koagülaz Testi: S. aureus’un ayrımında kullanılan bir testtir. Koagülaz sayesinde bakteri fibrin
bir zırhla kaplanarak fagositozdan korunur. Serumun bakterisid etkinliğini de engeller.
Koagülaz deneyi lamda veya tüpte uygulanabilir.
Lam deneyinde temiz bir lam üzerindeki bir damla serum fizyolojik içinde katı besiyerinden
bol miktarda stafilokok alınarak süt görüntüsünde bir çözelti oluşturulur. Bu süspansiyon
üzerine bir damla 1/5 oranında sulandırılmış plazma damlatılır. 5 - 10 saniyede pıhtı
kümelerinin oluşması olumlu sonuçtur.
Tüp deneyi için 1/5 oranında sulandırılmış sitratlı insan veya tavşan plazması kullanılır. 1 ml
sulandırılmış plazma üzerine, 1 ml taze buyyon kültürü veya katı besiyerinden alınan koloniler
konur. Kontrol olarak plazma + steril buyyon kullanılır. 37 °C’de bekletilen tüplerde 1., 3., 6.
ve 24. saatlerde pıhtılaşma olup olmadığına bakılır.
Pozitif kontrol: S. aureus Negatif kontrol: S. epidermidis
Şekil 7-1. Solda katalaz negatif, sağda katalaz
pozitif test görünümü
53
Şekil 7-2. Solda koagülaz negatif, sağda
koagülaz pozitif test görünümü
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Laboratuvara hazır olarak getirilen preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz.
2. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden katalaz testi yaparak
sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz.
Bakteri:……………………..…..Bakteri:………………………
Sonuç: Pozitif
Sonuç: Negatif
3. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden koagülaz testi yaparak
sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz.
Bakteri:………………………….Bakteri:………………………..
Sonuç: Pozitif
Sonuç: Negatif
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Medical Microbiology. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6th ed.,
Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, 209 - 223.
2. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 55 - 61.
3. Tünger A., Çavuşoğlu C., Korkmaz M.: Mikrobiyoloji (2005). Dördüncü baskı. Asya Tıp Kitabevi,
İzmir, 71 - 83.
54
B- Streptokoklar ve Enterokok Türlerinin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Streptokokların genel özelliklerinin öğrenilmesi
Streptokok türlerinin ayırt edilmesinde kullanılan testlerin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bilgi
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Bu dersi alan öğrenciler;
Streptokok türlerinin hemoliz yapma özelliklerini sayar.
Alfa, beta ve gama hemoliz yapan streptokoklara örnek verir.
Streptokoklarının morfolojik özelliklerini söyler.
Streptokok türlerini diğer gram pozitif koklardan ayırt etmede
kullanılan özellikleri sayar.
Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerinin ne amaçla yapıldığını
söyler.
PYR ve CAMP testlerinin amacını söyler.
Safrada erime testinin amacını söyler.
Safra eskülin agarda üreme testinin amacını söyler.
Streptokok kolonilerinden Gram boyalı preparat hazırlayabilir.
Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerini yapabilir.
PYR ve CAMP testlerini yapabilir.
Safrada erime testini yapabilir.
Safra eskülin agarda üreme testini yapabilir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Gram boyama yöntemi ile hazırlanmış preparatda gram pozitif kok
zinciri ya da diplokok morfolojisindeki bakterileri tanımlar.
Kanlı agarda üremiş olan Streptokok kolonilerinin hemoliz türünü
değerlendirir.
Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerini değerlendirir.
PYR ve CAMP testlerini değerlendirir.
Safrada erim testini değerlendirir.
Safra eskülin agarda üreme testini değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Sıvı sabun
Kağıt havlu
Alkol bazlı solüsyon
Atık kapları
%70’lik etanol
Çamaşır suyu
55
Eldiven
Öze
Lam
Mikroskop
Gram boyama seti
%3’ lük hidrojen peroksit
%5 kanlı agar
Safra eskülin agar
0.04 U Basitrasin diski
1.25/23.75 µg trimetoprim-sülfametoksazol (SXT) diski
5 µg optokin diski
Ticari olarak hazırlanmış Pyrolidonyl-beta naphtilamid (PYR) emdirilmiş
kağıt şeritler ve ayıracı
%10’luk sodyum deoksikolat
Kanlı agara pasajlanmış S. pyogenes, S. agalactia, S.pneumonia, S. viridans,
E. feacalis, S. bovis izolatlarının taze kültürleri
Giriş
Streptopcoccus cinsine ait bakteri türleri katalaz negatif özellik gösterirler ve sıvı
besiyerinde zincirler oluşturan gram pozitif koklardır. Sınıflandırılmasında serolojik özellikleri
(Lancefield gruplaması: A’ dan V’ ye kadar), hemoliz özellikleri (alfa, beta, gama hemoliz) ve
biyokimyasal özellikleri kullanılmaktadır.
Klinik olgularda en sık karşılaşılan Streptokok türleri ve sınıflandırılma özellikleri Tablo 5’ te
verilmiştir.
Tablo 7-2. Sık karşılaşılan Streptokok türleri ve sınıflandırılması
Filogenetik Grup
Pyojenik
Streptokoklar
Tür
Lancefield Grup
Hemoliz Özellikleri
S. pyogenes
A
Beta
S. agalactiae
B
Beta
S. equisimilis
C
Beta
S. pneumoniae
O
Alfa
S. mitis
O
Alfa
S. oralis
Tanımlanmadı
Alfa
S. sanguis
H
Alfa
Mitis grup
56
Anginosus grup
S. gordonii
H
Alfa
S. anginosus
G, F (ve A)
Alfa
Alfa
S. intermedius
Salivarius grup
S. salivarius
K
Gama
S. bovis
D
Alfa veya gama
Bovis grup
Gama
S. mutans
Belirlenmedi
Mutans grup
Gama
S. sobrinus
Streptokokların Laboratuvar Tanısı
I.
Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması
a.
Makroskopik Değerlendirme ve Koloni Görüntüsü:
Streptokoklar çoğunlukla gri-beyaz renkte, ıslak ya da parlak özellikte küçük koloniler
oluşturmaktadırlar. Kanlı agardaki kolonileri alfa, beta veya non (gama) hemolitik olabilirler.
Resim 7-3. Hemoliz çeşitleri
57
b. Mikroskobik Değerlendirme ve Gram Boyama:
Gram boyalı preparatların mikroskobik incelemesinde Streptokoklar ve Enterokoklar gram
pozitif çiftler veya zincir şeklinde koklar; S. pneumoniae ise çoğunlukla Gram pozitif uzamış
görünümlü diplokoklar şeklindedir.
Şekil 7-4. Gram pozitif kok zincirleri ve Gram pozitif diplokoklar
c.
Lam Metoduyla Katalaz Testi:
Test edilecek bakterinin katalaz enzimi olup olmadığını araştırmaya yönelik bir test olup,
sıklıkla gram pozitif koklardan Stafilokok türlerinin Streptokok türlerinden fenotipik olarak
ayırt edilmesinde kullanılmaktadır.
Temiz bir lam üzerine test edilecek bakteri kolonisi aktarılır ve üzerine bir miktar %3’ lük
H2O2 damlatılır. Gaz kabarcığı oluşumu gözlenir. Kabarcık oluşumu testin pozitifliği yani
bakterinin katalaz enzimi varlığı lehinde yorumlanır.
II. Beta Hemolitik Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması:
a.
Pirolidonil-beta-naftilamid (PYR) Hidrolizi Testi:
S. pyogenes’ in diğer beta hemolitik Streptokoklardan ayırt edilmesinde kullanılan bu
test, bakteride PYR enzimi varlığının araştırılmasını temel almaktadır. L-pirolidonil-betanaftilamid PYR enzimi aracılığıyla Beta-naftilamidin ürününe hidroliz olur ve ilgili reaktif
eklendiğinde kırmızı renk alır.
S. pyogenes dışında Enterokokların, bazı hayvan kaynaklı Streptokok türlerinin ve diğer
bazı bakteri türlerinin de PYR testinin pozitif olduğu unutulmamalıdır.
58
Şekil 7-5. Pirolidonil-beta-naftilamid (PYR) hidrolizi testinin yapılışı
b. Basitrasin Duyarlılık Testi:
S. pyogenes, diğer A grubu Streptokoklar ve diğer beta hemolitik Streptokoklardan farklı
olarak basitrasine duyarlılık gösterir. S. pyogenes olabileceğinden şüphelenilen bakteriden 34 koloni alınarak kanlı agara pasajlanır ve 0.04 U Basitrasin diski plağa yerleştirilir. 35oC’ de
%5 CO2’ li ortamda bir gece inkübe edilir. Diskin etrafında bakteri üremesinin inhibe olması,
test edilen bakterinin basitrasine duyarlı olduğunu düşündürür.
Şekil 7-6. Basitrasin duyarlılık testinin yapılışı
c.
Christie Atkins Munch Peterson (CAMP) Testi:
S. agalactia’nın diğer beta hemolitik Streptokolardan ayırt edilmesi için yapılan bu test
S. aureus’ un yaptığı hemolizin S. agalactia tarafından artırılması esasına dayanmaktadır
(sinerjik lizis). Test edilecek suş ve S. aureus suşu kanlı agara 90o açıyla çizgi olarak ekilir.
36±1oC’ de bir gece inkübe edilir. S. aureus beta hemolizini ve CAMP faktörü diffüzyon
bölgesinde üçgen şeklinde artmış hemoliz görülmesi CAMP testinin pozitifliği şeklinde
yorumlanır.
59
Şekil 7-7 Christie Atkins Munch Peterson (CAMP) testinin yapılışı
III. Streptococcus pneumoniae ve Viridans Grubu Streptokokların Fenotipik Olarak
Tanımlanması:
a.
Optokin Duyarlılık Testi:
S. pneumoniae suşunun optokine duyarlı olduğu bilgisini temel alan bu test S.
pneumoniae’ nın diğer alfa hemolitik Streptokoklardan ayırt edilmesinde kullanılır. Test
edilecek organizmanın kültüründen birkaç koloni kanlı agara pasajlanır ve 5 µg optokin
içeren disk üzerine yerleştirilir. 35oC’ de %5 CO2’ li ortamda bir gece inkübe edilir. Diskin
etrafında bakteri üremesinin inhibe olması, test edilen bakterinin optokine duyarlı olduğunu
düşündürür. Optokine duyarlı S. mitis ve optokine dirençli S. pneumoniae suşlarının da
olabileceği unutulmamalıdır.
Şekil 7-8. Optokin duyarlılık testinin yapılışı
60
b. Tüp Metoduyla Safrada Erime Testi:
S. pneumoniae’ nın muhtemel tanısında kullanılmaktadır. Sodyum deoksikolat bir tür
safra tuzu olup hücre duvarına etki ederek hücrenin erimesine neden olmaktadır.
İki adet tüp içerisinde fizyolojik tuzlu suda (pH: 7.0) test edilecek bakteriden yoğun
bakteri süspansiyonu hazırlanır. Tüplerden birine %10’luk sodyum deoksikolat solusyonu
damlatılır diğerine (kontrol olarak kullanılacaktır) ise fizyolojik tuzlu su damlatılır. Tüpler
35oC’ de 3 saatte bir kontrol edilerek inkübe edilir. %10’luk deoksikolat damlatılmış olan
tüpdeki bakteri bulanıklığı kaybolmuş ve viskositesi artmış ise test edilen bakterinin safrada
erime özelliği olduğu şeklinde yorumlanır.
Şekil 7-9. Tüp metodu ile safrada erime deneyinin yapılışı
IV.
a.
Enterokoklar ve D Grubu Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması:
Safra Eskülin Agarda Üreme Testi:
Safra eskülin agar, Enterococcus ve grup D Streptokoklar (Streptococcus bovis) türlerini
diğer Streptokoklardan ayırt etmek amacıyla kullanılan seçici ve ayırıcı bir besiyeri türüdür.
Besi yerinde mevcut olan safra Enterococcus ve grup D Streptokoklar dışındaki
streptokokları ve diğer gram pozitif kokların üremesini baskılamaktadır. Besiyerinde mevcut
olan eskülin ise söz konusu mikroorganizma tarafından hidrolize edilerek eskületin ve
dekstroza ayrıştırılır. Eskületin yine besiyerinde kullanılan demir tuzu ile etkileşerek siyahkahve renk oluşumuna neden olmaktadır.
Şüphelenilen koloniler safra eskülin agara pasajlanıp uygun koşullarda inkübe
edildikten sonra siyah-kahve renk oluşturan kolonilerin gözlenmesi bakterinin safralı
ortamda üreyebildiği, eskülini hidroliz etme yeteneği olduğu ve Enterococcus ve
Streptococcus bovis olabileceği şeklinde yorumlanır.
61
Şekil 7-10. Safra eskülin agarda üreme testinin yapılışı
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Laboratuvara hazır olarak getirilen preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz.
2. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerini renk ve hemoliz oluşumu
yönünden inceleyiniz. Optokin, basitrasin ve CAMP deneylerini inceleyerek gördüklerinizi çiziniz.
3. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden katalaz testi yaparak
sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz.
4. Üreme görülen plaklardan Gram boyama yaparak sonucu değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz.
62
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Gram pozitif kok
Zincir şeklinde koklar
Katalaz negatif
Üzüm salkımı şeklinde
gram pozitif koklar
Katalaz pozitif
Stafilokok ?
Streptokok ?
Beta
hemoliz
Alfa
hemoliz
Basitrasin Duyarlılık Testi
Basitrasin
duyarlı ve
SXT
dirençli
PYR (+)
Basitrasin
dirençli ve
SXT
duyarlı
CAMP (+)
S.pyogenes
S.agalactia
(A grubu
(B grubu
Beta Hemolitik
Streptokok)
Beta
Gama
hemoliz
Optokin diski
Gram
pozitif
diplokok
Optokin
duyarlı
Safrada
erime (+)
S.pneumonia
Optokin
dirençli
Safra
eskülin
agara
ekim
Üreme ve
Üreme ve
siyah renk
yok
siyah renk
var
%6.5
NaCl’de
üreme
yok
PYR (-)
%6.5
NaCl’de
üreme
var
PYR (+)
Hemolitik
S. viridans?
63
Non-enterokok
D grubu Streptokok
Enterococcus
spp
Kaynaklar
1. Killian M (2002). Streptococcus and Enterococcus, (Ed: Greenwood D, Slack RBC and
Peutherer FF). Medical Microbiology 16th ed. Churchill Livingstore, Philadelphia. p. 174188.
2. Spellerberg B, Brandt,C. (2007). Streptococcus. Manual of Clinical Microbiology (Ed: Murray PR,
Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren: Özenci H. Washington,
D.C.American Society for Microbiology, 412-429.
3. Kimberle CC, Tsai-Ling L (2007). Ayraçlar, Boyalar ve Besiyerleri: Bakteriyoloji. Manual of clinical
microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren:
Başustaoğlu A, Güçlü AÜ). Washington, D.C.American Society for Microbiology,
64
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-8
Gram (-) Koklar
A- Moraxella ve Haemophilus
Türlerinin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Moraxella ve Haemophilus ’ların genel özeliklerinin öğrenilmesi
Moraxella ve Haemophilus ’ların laboratuvar tanısının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Moraxella ve Haemophilus ’ların genel özelliklerini açıklar.
Moraxella ve Haemophilus ’ların kültür özelliklerini açıklar.
Moraxella ve Haemophilus cinsi bakterileri diğer bakterilerden
ayıran özellikleri sayar.
Moraxella ve Haemophilus ’ların boyanmış preparatlarını
mikroskobik olarak değerlendirir.
X ve V faktörlerine olan gereksinimlerine göre Haemophilus türlerini
tanımlar.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Mikroskop
Moraxella ve Haemophilus üremiş kültür plakları
Moraxella ve Haemophilus ’a ait boyalı preparatlar
X, V ve XV faktörlerini içeren diskler
Süt anne fenomeni ile Haemophilus kolonileri olan kültür plakları
DNA içeren besiyeri, 1 N HCl
Lam
Fizyolojik tuzlu su
BOS santrifüj çökeltisi
%1’lik metilen mavisi boyası
Moraxella türleri
Moraxella’lar kısa basil, kokobasil ya da Moraxella catarrhalis’te olduğu gibi diplokok
şeklinde, gram negatif, aerobik ve hareketsiz bakterilerdir. Bu genus içindeki en önemli
patojen tür M. catarrhalis’tir. Üst solunum yolu florasında bulunmakla birlikte akut bronşit,
sinüzit, menenjit, endokardit, konjuktivit, otitis media ve pnömoni etkeni olabilirler.
65
Kanlı ve çikolatamsı agarda üreyebilirler. Gri-beyaz renkte, konveks, hemoliz
yapmayan, mat S tipi koloni oluştururlar. Agar yüzeyinde buz hokeyi topu gibi kaymaları
tipiktir. Oksidaz ve katalaz pozitiftirler. Nitrat redüktaz enzimi ile nitratı nitrite indirgerler.
Şekerleri oksidatif ya da fermantatif yolla kullanmayan (asakkarolitik), DNaz enzimi pozitif
olan bakterilerdir. Tanımlanması için karbonhidrat fermentasyon testleri de kullanılır. Çoğu
β-laktamaz üretir ve penisilinlere dirençlidir.
Haemophilus türleri
Gram negatif, küçük, kokobasil görünümünde, hastalık materyalinde bazen lökosit
içinde, kültürde ikişerli, çoklu gruplar veya zincirler oluşturan, hareketsiz, sporsuz
bakterilerdir. Taze izolatlarda ince bir kapsül bulundururlar. Pasajlarda kapsül kaybolur. Sulu
fuksin ile 2-10 dakikada iyi boyanırlar.
Basit besiyerinde üremezler. Üremesi için besiyerlerine üreme stimüle edici faktörlerden X
faktörü (protoporphyrin IX) ve V faktöründen (nikotinamid adenin dinükleotid, NAD) bir
veya her ikisinin eklenmesine ihtiyaç duyarlar. Su damlası şeklinde koloniler oluştururlar.
H. influenzae: Çocuklarda menenjit, pnömoni, bronkopnömoni, laringotrakeit, nazofarenjit
gibi hastalıklar oluşturabilirler. Bu bakteriler kapsüllerinin yapı değişikliklerine bağlı olarak
a,b,c,d,e,f diye adlandırılan 6 serotipe ayrılırlar. Bunlardan b serotipi invaziv olup
Haemophilus enfeksiyonlarının en sık nedenidir.
H. influenzae gibi kapsüllü bakterinin BOS'ta varlığından şüphelenilirse kapsül şişme
reaksiyonu yapılarak bu bakteriler saptanabilir.
Tablo 8-1. X ve V faktörü ihtiyacına göre bazı Haemophilus türleri
Tür
H. influenzae
H. aegypticus
H. haemolyticus
H. parainfluenzae
H. parasuis
H. parahaemolyticus
H. ducreyi
X
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
-
H. aegypticus: Bu bakteri halk arasında pembe göz olarak bilinen konjuktivit etkenidir.
H. ducrei: Yumuşak şankr etkenidir.
1. X ve V Faktörlerine Olan Gereksinimin Saptanması: Haemophilus türü bakteriler triptik
soy agar ya da kalp infüzyon agarı plak besiyerlerine bol miktarda ekilir. Besiyeri kurutulur.
66
Daha sonra X, V ve XV faktörlerini içeren üç disk, aralarında en az 20 mm olacak şekilde
besiyerinin üzerine bırakılır. Besiyeri 37°C'de, bir gece inkübe edilir. H. influenzae sadece XV
faktörü içeren diskin etrafında ürer.
2. Süt anne fenomeni (satellit üreme): Koyun ya da tavşan kanlı agara incelenecek olan
Haemophylus türü bakteri yaygın olarak ekilir. Aynı besiyerine (çizgi ekimi şeklinde ya da
belirli bölgelere) S. aureus ekilir. H. influenzae S.aureus kolonileri etrafında daha iyi üreme
gösterir.
Şekil 8-1. Süt anne fenomeni (satellit üreme)
3. DNAse (deoksiribonuclease) deneyi: Deoksiribonükleik asiti (DNA) parçalama özelliği olan
DNaz enzimi içeren bakteriler DNA içeren besiyerinde onu parçalayıp oligonükleotidler
oluştururlar. Bu test ile Neisseria'lar ile Moraxella'ları birbirinden ayırmak mümkündür.
DNA’lı plak besiyerine saf kültürden çizgi ekimi yapılır. 35°C’de 18-24 saat bekletildikten
sonra plak yüzeyine 1N hidroklorik asid (HCl) damlatılır. HCl bozulmamış DNA ile birleşerek
presipite olur. Bakteri DNaz yapıyorsa ekim çizgisinin çevresinde saydam bir zon oluşur, diğer
bölgeler opak görünüm alır. Besiyeri içine indikatör olarak toluidin mavisi konmuşsa DNaz
olumlu bakteriler ekim çizgisi çevresinde parlak pembe bir zon oluşturur. Negatif durumda
mavi renkli kalır.
4. Kapsül şişme reaksiyonu: Bu yöntem N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, K
pneumoniae gibi kapsüllü bakterilerin ön identifikasyonu amacı ile yapılmaktadır.
Temiz bir lam alınır, bir yanına bir damla sulandırılmış antiserum, diğer yanına bir damla
fizyolojik tuzlu su (kontrol) damlatılır. Her iki damlanın üzerine sırasıyla BOS santrifüj çökeltisi
ve bir damla %1’lik metilen mavisi boyası damlatılır. Her birinin üzerine temiz lamel kapatılır.
İmmersiyon objektifi veya 400 büyütme ile yapılan incelemede ortası maviye boyanmış
bakterilerin etrafındaki renksiz ya da soluk mavi renkli kapsülleri, kontrole göre daha belirgin
ve genişlemiş olarak görülürler.
5. ELEK testi: 10 ml agar içine 2 ml at serumu eklenir. Bir petriye dökülür ve katılaşmasına
yakın besiyerinin ortasına difteri toksini emdirilmiş bir filtre kağıdı yerleştirilir. Besiyeri
katılaşıp yüzeyi kuruduktan sonra test edilecek suşlar filtre kağıdına dik olacak şekilde
ekilirler. Testin çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için toksijenik olan ve olmayan iki suş;
pozitif ve negatif kontrol olarak ekilir. Plaklar 35°C’de 24-48 saat inkübe edilir. İnkübasyon
sonunda pozitif kontrol ve toksin yapan suşların ekim çizgisi ile anti toksin bulunan filtre
67
kağıdı arasında 45 derece açı yapacak şekilde presipitasyon çizgileri gözlenir. Toksin
yapmayan suşlarda presipitasyon gözlenmez.
Şekil 8-2. Elek immundifüzyon testi (http://brainboxes2.wikispaces.com’dan alınmıştır).
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Difteroid bakterileri Gram boyama yöntemi ile boyayarak inceleyiniz ve çiziniz.
2. DNAse testi yaparak testin sonucunu not ediniz.
3. X ve V faktörlerine olan gereksinimin saptanması ile ilgili testleri inceleyerek çiziniz.
4. Süt anne fenomenini (satellit üreme) inceleyerek çiziniz.
68
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2009). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Beşinci Baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi,
İzmir, 478-482.
2. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev. Edit.
Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, 343-351.
3. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Klinik Mikrobiyoloji
Manual of Clinical Mikrobiology. Dokuzuncu baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık,
Ankara, cilt 1, 485-515 / 770-803.
4. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı.
Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 73-85
69
B- Neisseria Türlerinin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Neisseria’ların genel özelliklerinin öğrenilmesi
Neisseria’ların laboratuvar tanısında kullanılan yöntemlerin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Neisseria’ların genel özelliklerini sıralar.
İnsanlarda hastalık etkeni olan Neisseria türlerini sayar.
Oksidaz testinin yapılış basamaklarını sıralar.
Oksidaz testinin yapılış amacını açıklar.
Gram boyanma yaparak preperatta Neisseria türü bakteri varlığını
değerlendirir.
Oksidaz testini uygulayarak sonucunu değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Sıvı sabun
Kağıt havlu
Eldiven
Neisseria gonorrhaoe üremiş kültür plakları
Neisseria gonorrhoae içeren örneklerden hazırlanmış preparatlar
Oksidaz ayıracı
Giriş
Neisseria türleri aerobik, hareketsiz, sporsuz, gram negatif bakterilerdir. Genellikle
birbirine komşu kenarları düzleşmiş, kahve çekirdeği şeklinde çiftler (diplokoklar) halinde
görünür.
İnsanlardan en sık izole edilen Neisseria türleri N. gonorhoeae, N. menengitidis, N.
lactamica, N. sicca, N. subflava, N. flavescens, N. mucosa, N. cinerae, N. denitrificans, N.
elongata, N.canis’tir. Bu ailede iki tür insanlarda patojendir. N. gonorhoea ve N. menengititis.
N. gonorrhoeae seksüel geçişli bir hastalık olan gonore etkenidir. Bu infeksiyon
genellikle erkekler ve kadınlarda genital mukozayı tutmaktadır fakat kolumnar epitelin
bulunduğu herhangi bir vücut bölgesini de etkileyebilir.
70
N. meningitidis sağlıklı bireylerde daha çok asemptomatik olarak taşınır. Duyarlı
şahıslarda kan akımına karışarak bakteriyemiye, kan beyin bariyerini aşarak menenjit
tablosuna neden olabilir.
Neisseria Türlerinin Laboratuvar Tanısı
Hastalardan örnek alınması
Gonore tanısı için erkeklerde üretral akıntı örneği alınır. Belirgin bir pürülan akıntı yoksa
pamuklu eküvyon anterior üretradan 2-3 cm içeriye sokulup yavaşça çevrilerek örnek alınır.
Kadınlarda ise servikal sürüntü örnekleri, üretral ve vajinal örneklere tercih edilir.
Menenjit tanısı için beyin omirilik sıvısı (BOS) alınmalıdır. Ayrıca kan, plevral sıvı, peteşi
aspirat sıvısından da inceleme yapılabilir. BOS 1 ml’den fazlaysa 1500 rpm’de 15 dak santrifüj
edilerek üstteki sıvı atılır dipteki çökelti tanı için kullanılır. Alınan örneklerden direk
mikroskobik inceleme için preparat hazırlanır ve kültür yapılır.
Direk Mikroskobik İnceme
Örnekler Gram boyama yöntemi ile boyanarak incelenir. Boyanan preparat immersiyon yağı
damlatılarak x100 büyütme ile incelenir. Nötrofiller içinde ve dışında gram negatif
diplokokların varlığı gonore için oldukça karakteristiktir.
Şekil 8-3. Hasta örneğinde gram
negatif diplokoklar
Şekil 8-4. Kültürde üreyen
Neisseria’lardan yapılan Gram boyama
preparatı
Kültür
Alınan örnekler Neisseria türlerinin sıcaklık değişimlerine çok duyarlı olmasından dolayı
laboratuvara hızlı bir şekilde ulaştırılmalıdır. En başarılı izolasyon hasta başı ekimlerde
görülmektedir. Üretral ve servikal örnekler çukolata agara ekilir. Genital bölge gibi floralı
bölgelerden alınan örnekler için selektif besiyerleri tercih edilir. Thayer-Martin, Modifiye
Thayer Martin, Martin Lewis, New York City veya GC-LECT besiyerleri Neisseria türleri için
kullanılan selektif besiyerleridir. Bu besiyerleri flora elemanlarını baskılamak için çeşitli
antibakteriyaller ve/veya antifungaller içerir. Tüm besiyerleri %3-5 CO2’ li ortamda 35°C’de
72 saat inkübe edilir. 24-48 saat inkübasyondan sonra küçük şeffaf, konveks, düzgün
koloniler oluşturur. Hemoliz ve pigment yapmaz.
71
Şekil 8-5. Kültürde üreyen Neisseria kolonileri
Oksidaz Testi
Neisseria’ların ayırıcı tanısında kullanılır. Sitokrom oksidaz oksidatif fosforilasyonla solunum
yapan bakterilerin kullandığı bir enzimdir. Oksidaz testi için oksidaz ayıracı (%1’lik dimetil
para fenilen diamin dihidroklorid ya da tetrametil para fenilendiamin dihidroklorid) kullanılır.
Bu solüsyondan kurutma kağıdına birkaç damla damlatılıp üzerine öze ile birkaç koloni
sürülür. 10 saniye içinde koyu mor renk görülürse test pozitiftir. Renk değişmiyorsa oksidaz
testi negatiftir. Bu testte E. coli standart suşu negatif, N. gonorrhoeae standart suşu pozitif
olarak kullanılır.
Şekil 8-6. Oksidaz testi (Sağdaki pozitif, soldaki negatif)
Karbonhidrat kullanım testi
Karbonhidratların kullanımı patojenik Neisseria’ların diğer saprofitik türlerden ayrılmasında
kullanılır. Belirli karbonhidratların kullanımı asit üretimi yoluyla indikatörün renginin
değişmesiyle gösterilir. Neisserialar karbonhidratları genellikle oksidatif olarak kullanır ve asit
oluşturur.
72
Tablo 8-2. Bazı Neisseria türleri ve karbonhidrat kullanım testi sonuçları
Tür
Glukoz
Maltoz
Laktoz
Sükroz
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
N. lactamica
N. cinerea
N. sicca
N. flavescens
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Neisseria türü bakteri üremiş kültür plaklarından Gram boyama yaparak inceleyiniz,
gördüklerinizi çiziniz.
2. Hasta örneklerinden hazırlanan preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz.
3. Neisseria türü bakteri üremiş kültür plaklarından ve Escherichia coli üremiş kültür
plaklarından oksidaz testi yaparak değerlendiriniz.
Tarih
Laboratuvar Görevlisinin İmzası
73
Kaynaklar
1. Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G, eds. (2011). Textbook of Diagnostic
Microbiology. 4th ed. W.B. Saunders Company, Maryland Heights (MO), p 376-394.
74
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-9
A-Nonfermentatif Gram Negatif Bakterilerin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Nonfermentatif gram negatif bakterilerin genel özelliklerinin ve
laboratuvar tanısının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Nonfermentatif gram negatif basillerin isimlerini sayar.
Nonfermentatif gram negatif basillerin özelliklerini sayar.
Tanı için incelenebilecek hasta örneklerini sayar.
Oksidasyon-fermentasyon testinin basamaklarını anlatır.
Sitokrom oksidaz aktivitesi testinin basamaklarını sayar.
İndol testinin basamaklarını sayar.
Nonfermentatif gram negatif basillerin mikroskobik incelemesini
yapar.
Oksidasyon-fermentasyon testini yapar ve sonucunu yorumlar.
Sitokrom oksidaz aktivitesi testini uygular ve sonucunu
değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Mikroskop
Lam
Öze
Bek alevi
Gram boya seti
Nonfermentatif basiller ekilmiş Kanlı ve EMB agar besiyeri plakları
Oksidasyon-fermentasyon testi besiyerleri
Hareket besiyeri
%1’lik tetrametil p-fenilen diamin dihidroklorid çözeltisi
Giriş
Nonfermentatif bakteriler karbonhidratları fermente edemeyen sadece oksidatif yolla
kullanabilen mikroorganizmalardır. Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrphomonas,
Burkholderia, Alcaligenes, Aeromonas, Flavobacterium gibi cinsler nonfermentatif gram
negatif basiller grubunu oluşturmaktadır.
Tanı için İncelenebilecek örnekler
İnceleme maddesi hastalığa göre değişmek üzere irin, yara ve yanık sürüntüleri, idrar,
balgam gibi örnekler olabileceği gibi BOS, torasentez sıvısı, parasentez sıvısı gibi steril vücüt
sıvıları da olabilir.
75
Sık Karşılaşılan Nonfermentatif Gram Negatif Basillerin
Mikrobiyolojik Tanımlama Testleri
1. Oksidasyon-Fermentasyon Testi
Bakterilerin glikozu hangi yolla parçaladıklarını gösterir. Fermentasyon yolunu kullananlar
anaerob ortamda, oksidasyon yolunu kullananlar ise aerob ortamda asit üretecekler ve
ayıraç olarak bulunan bromtimol mavisinin yeşil rengini sarıya dönüştüreceklerdir.
Testin yapılışı:
− Testi uygulamak için %0.02 pepton ve %1 karbonhidrat içeren OksidasyonFermentasyon (O-F) Besiyeri kullanılır.
− İncelenecek koloniler iki O-F besiyeri tüpüne iğne öze ile batırma şeklinde ekilir.
− Tüplerden birinin kenarından steril parafin yağı yavaşça sızdırılarak havayla teması
kesilir.
− Ekimler 37°C’de en fazla 4 gün takip edilip asit ortam oluşması gözlenir.
− Parafinli tüpün rengi sarıya dönmüşse bakteri üremiş ve fermentasyon ile ortamda
asit oluşturmuştur; parafinsiz tüpün rengi sarıya dönmüşse bakteri oksidasyon yolu
ile glikozu parçalamış ve ortamı asidik hale getirmiştir.
− Kontrol ekimleri: E. coli “fermentatif”, P. aeruginosa “oksidatif”, Moraxella
“asakkarolitik".
− Testin değerlendirilmesi: 3 durum gözlenebilir:
Kapalı tüp → Yeşil
Kapalı tüp → Sarı
Kapalı tüp → Yeşil
Üstü açık tüp → Sarı
Üstü açık tüp → Sarı
Üstü açık tüp → Yeşil
Aerob ve Oksidatif
Nonsakkarolitik
Fakültatif anaerob ve
Fermentatif
Şekil 9-1. Oksidasyon – fermentasyon testi ve değerlendirilmesi
76
2. Sitokrom oksidaz aktivitesi testi
Testin yapılışı:
− %1’lik tetrametil p-fenilen daimin dihidroklorid çözeltisi kullanılır.
− Beyaz filtre kağıdına çözeltiden damlatılır.
− Öze ya da tahta çubuk yardımıyla incelenecek koloniden çözeltinin üzerine sürülür.
− Sitokrom oksidaz aktivitesi olan bakteri yaklaşık 10 saniyede koyu mavi renk
oluşturur.
− Kontrol: E. coli “oksidaz negatif”, P. aeruginosa “oksidaz pozitif”.
Şekil 9-2. Oksidaz testi pozitif
Şekil 9-3. Oksidaz testi negatif
3. MacConkey Agarda Üreme
Nonfermentatif gram negatif basiller MacConkey agarda üreyemezler ya da toplu iğne başı
gibi küçük koloniler oluştururlar.
Şekil 9-4. MacConkey agarda üreme (lib.jiangnan.edu.cn’den
alınmıştır).
4.
Hareket testi
Nonfermentatif bakterilerin çoğu hareketlidir. Hareket besiyerine iğne öze ile ekim yapılır.
Bakteriler hareket besiyerinin yüzey kısmında üreyebilecekleri için testi değerlendirmek
güçtür. Bu nedenle besiyerine tetrazolyum eklenmesi faydalı olacaktır.
Şekil 9-5. Hareket testi
77
5.
İndol testi
Bakterilerin karbon kaynağı olarak triptofan aminoasidini kullanıp kullanmadıklarını gösterir
İndol testi
pozitif
İndol testi
negatif
Şekil 9-6. İndol testi
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Size verilen OF testini değerlendiriniz ve gördüklerinizi çiziniz.
2. Nonfermantatif gram negatif bakterileri Gram boyama yöntemi ile boyayarak
mikroskopta inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz.
3. Size verilen plaklardan oksidaz testi yaparak sonucu değerlendiriniz.
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
78
Kaynaklar
1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev Edit.
Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, s.333-341.
2. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical
Mikrobiology Dokuzuncu baskı. Çev Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, cilt 1,
s.734-802.
3. Tünger A, Çavuşoğlu C, Korkmaz M (2005). Mikrobiyoloji. Dördüncü Baskı. Asya Tıp
Kitabevi, İzmir, s. 173-178.
4. Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü Baskı. Barış Yayınları Fakülteler
Kitabevi, İzmir, s.465-474.
5. Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı.
Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, s. 100-105.
79
B- Aerop ve Fakültatif Anaerop Gram (-) Bakteriler
Dersin Amaçları
Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin incelenmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin isimlerini
söyleyebilir
Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir
Beceri
Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin izole edildiği
örneklerin isimlerini bilir.
Mikroorganizmaların tanımlanmasında hangi testi kullanacağını bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli
Malzemeler
Hazır preparatlar
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Rose Bengal Testi
Tüp
Pipet ve pipet ucu
Brucella antijenleri
Tüp aglütinasyon testi
ÖRNEKLERİN İNCELENMESİ
Brucella spp. ve Tanısı
-
Kokobasil görünümünde sporsuz, hareketsiz, organizmadan yeni ayrıldıklarında
mikrokapsülleri olan bakterilerdir.
-
Aerop ve mikroaerofilik bakterilerdir. B. abortus %5-10 CO2 li ortamda iyi ürerler
-
Özellikle serum, glikozlu besiyerinde üremeyi sever. Jelozdaki kolonileri küçük
yuvarlak kabarık saydam şebnem tanesi görünümünde kolonilerdir.
-
B. suis en çok ve en uzun süre, B. melitensis ise az ve kısa süre H2S oluşturur.
-
Brucella’ ların insanlarda yaptıkları hastalıklar bruselloz adı altında toplanır.
80
TANI :
Brucella bakterilerinin soyutlanması: Materyal olabildiğince
gönderilmelidir. Hemen ekilmeyecekse soğukta saklanmalıdır.
hızlı
laboratuvara
Besiyerleri: Brucella buyyonu ve agarı, Çikolatamsı agar, Kanlı jeloz, Antibiyotikli glikozlu
serumlu buyyon ve agar.
Brucella kültürleri için genel ilkeler:
1) Kan, BOS gibi içinde az miktarda bakteri bulunan materyaller çok miktarda besiyerine
ekilmelidir.
2) Tüm ekimlerin çift yapılarak birinin %5-10 CO2’li ortamda inkübe edilmelidir.
3) İlk izolasyonda bakteriler yavaş ürediklerinden ekimler 30 gün bekletilmeden
çıkarılmamalıdır.
4) Genellikle hastalığın akut döneminde ya da aktivasyon döneminde elde edilme
olasılığı fazladır.
Brucella’ ların identifikasyonu: Kuşkulu kolonilerden gram preparatı ve katı besiyerlerine
ekimler yapılmalıdır saf kültürden aşağıdaki incelemeler yapılmalıdır.
-
H2S Üretimi: Bir yatık besiyerine ekim yapılır.Bakterinin kaç günde H2S yaptığına
bakılır. Brucella suis 3 gün ve daha çok B. abortus 2 gün, B. melitensis 1 gün ve daha
kısa sürede yapar.
-
Boyalarla birlikte üreme: Amaç thionin ve fuchsin gibi boyaların çeşitli
konsantrasyonlarını içeren besiyerlerinde Brucellaların üreyebilme özelliklerinin
araştırılmasına dayanır.
-
Crystensen üre agar: Besiyerinin yüzeyine saf kültürden çizgi ekimleri yapılır. B. suis
15-20 dk’da, B.abortus 2 saatten sonra üreaz etkinliğini göstererek besiyerinin
rengini kızartır. B. melitensis saatler sonra veya olumsuz sonuç verir.
-
Monospesifik antiserumlarla aglütinasyon: Lam aglütinasyonları yapılarak
B.melitensis’ i diğer ikisinden ayırt etmek mümkündür. B. suis bakterisini B.
abortus’tan ayırt etmek imkansızdır.
-
Hayvan deneyi: Doğrudan hasta kanından 5-10 ml kobayların peritonuna enjekte
edilerek yapılır. Brucella varsa hayvanlar ateş, septisemi, düşük yaparlar.
81
Şekil 9-7. Brucella spp.
Şekil 9-8. Brucella melitensis
Şekil 9-9. Brucella abortus
Serolojik tanı
Brucella tanısında büyük yer kaplamaktadır. (Rose Bengal ve Wright Testi, Brucella capt)
Rose Bengal testi:
Lam aglutinasyon testidir. Hızlı tarama amacı ile kullanılır. Antijen: Rose Bengal boyası ile
özel teknik ile boyanan Brucella abortus bakterilerinin tamponlu tuzlu sudaki standart
süspansiyonlarıdır.
Yapılışı: Test kartlarına bir kuyucuğa bir damla hasta serumu damlatılır. Rose bengal antijeni
iyice karıştırılarak serumun üzerine damlatılır ve bir kürdan ile iyice karıştırılır. Elde çevirmeli
hareketler yapılarak 4 dakika çevrilir. Sonuçta iri tanecikli çökelti oluşursa olumlu, ince
tanecikli çökelti oluşursa kuşkulu, homojen görüntü olumsuz olarak değerlendirilir.
82
Şekil 9-10. Rose Bengal testi
Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi):
Antijen olarak B. abortus S99 ya da B. melitensis antijenleri kullanılır. Hem B. abortus
hem de B. melitensis antikorları tespit edilebilir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır.
1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Rose Bengal
testi kuvvetli pozitif olduğu halde, Wright testi negatif veya zayıf reaksiyon gösteriyorsa
“Blokan antikorlardan” şüphelenilir. Blokan antikorların varlığı Coombs testi veya enzim
immunoassay ile tespit edilir.
Yapılışı:
1- Tüp taşıyıcısına 10 adet tüp sıralanır. Bunlardan birincisine 0.9 diğerlerine 0.5 er ml
fizyolojik tuzlu su dağıtılır.
2- Birinci tüpe hasta serumundan 0.1 ml konur. Yeni bir pipet ile birkaç kez
karıştırıldıktan sonra bu tüpten 0.5 ml ikinci tüpe aktarılır. Aynı pipet kullanılarak bu
kez aynı şekilde ikinci tüpten üçüncüye ve bu şekilde sondan bir önceki tüpe kadar
tüpten tüpe 0.5 er ml aktarılır. Bu tüpten 0.5 ml dışarı atılır. Son tüpe serum konmaz
(Antijen kontrol tüpü).
3- Antijen süspansiyonu iyice karıştırıldıktan sonra tüm tüplere (kontrol tüpü dahil) 0.5
er ml antijen dağıtılır. Bu işlemle tüpteki serum serum sulandırımları birer kat
artmıştır.
4- Tüpler çalkalanarak karıştırılır. 37oC de 48 saat bekletildikten sonra değerlendirilir.
5- Önce kontrol tüpünde aglütinasyon olup olmadığına bakılır. Sonra ilk tüpten
başlanarak tüpte aglutinasyon olup olmadığı kontrol edilir. İlk Tüp sulandırıma göre
1/80, 1/160, 1/320… şeklinde pozitiflik belirlenir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler
anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar
edilmelidir.
Brucella tanısında kullanılabilecek diğer serolojik testler; Spot test, ELISA ile IgG ve IgM
türü antikorların tespit edilmesi, kompleman birleşme deneyi ya da radioimmunoassay
olarak sıralanabilir.
83
Şekil 9-11. Wright testi
Şekil 9-12. Brucella capt testi
Haemophilus spp. ve Tanısı
Haemophilus influenza
-
Küçük kokobasil görünümünde hastalık materyalinde bazen lökositlerin içinde
kültürlerde ikişerli, çoklu gruplar oluşturabilen hareketsiz, sporsuz bakterilerdir. Yeni
soyutlanan bakterilerde küçük bir kapsül bulunur.
-
Basit besiyerlerinde üremezler, üremeleri için besiyerinde kanda da bulunan X faktörü
(protoporphyrin IX) ve V faktörünün (nicotinamide adenine dinucleotid )
bulunmasını gereksinirler. Bu maddeler kanın ısıtılması ve eritrositlerin parçalanması
ile açığa çıktıklarından normal taze kanlı agarda üremede güçlük gösterirler. En iyi
üredikleri besiyeri çikolatamsı jeloz olup bu besiyerinde koloniler küçük şebnem
tanesine benzeyen düzgün koloniler yapar.
84
Şekil 9-13. Haemophilus influenza
-
Plak yüzeylerine yapılan ekimlerden sonra çizgi halinde bir Staphylococcus aureus
ekimi yapılacak olursa H.influenza kolonileri çizgi boyunca daha büyük ve bol oluşur.
Süt anne veya satellit etki denilenilen bu etki Stafilokokların V faktörü sentezlemeleri
ile ilgilidir.
Şekil 9-14. Süt anne görüntüsü
-
H.influenza çoçuklarda menenjit, pnömoni,
nazofarenjit gibi hastalıklar oluşturur.
bronkopnomoni,
laringotrakeit,
-
H.influenza bakterileri kapsüllerinin yapı değişikliklerine bağlı olarak a,b,c,d,e,f, gibi 6
değişik serovara ayrılır
TANI : Olabildiğince çabuk incelenmeli ve bekletilirse oda ısısında bekletilmelidir.
Hemophylus bakterileri soğuğa ve kuruluğa karşı dayanıksızdır.
Direkt boyalı preparatlar: BOS’nın santrüfüj çökeltisinden yapılan preparatta lökositlerin
içinde ve dışında tipik Gram negatif bakteriler görülmeye çalışılır. Yeterli bakteri varsa
H.influenza type b antiserumu ile kapsül şişme testi ile tanıya gidilebilir.
85
Şekil 9-15. Haemophilus influenza’ nın boyalı preparatları
Ekimler : BOS gibi steril materyaller çikolatamsı agara bolca damlatılarak ekim yapılır. Karışık
flora içeren materyallerde ise bacitracin+kloxacillin içeren çikolatamsı plaklara ekim
yapılmalıdır. İlk izolasyonlarda süt anne fenomoni için koyun yada tavşan kanlı jeloz ya da
çikolatamsı besiyerine S.aureus ile birlikte ekilebilir. İlk izolasyonda tüm ekimler %5-10 CO2’ li
ortamda 37 0C de enkübe edilmelidir. Tipik koloniler 24-48 saat içinde oluşur.
X ve V faktöre ihtiyacın saptanması: H.influenza kolonileri triptikazlı soya buyyonda ezilip
sulandırılarak bu süspansiyon triptakazlı soya agarı veya kalp infüzyon agarı plak
besiyerlerine ekilir. Aralarında 20 mm kalacak şekilde hazır X,V ve X+V faktörlerini içeren
diskler konulur. H.influenza yalnızca X+V diskinin etrafında üreme gösterir.
Şekil 9-16. H.influenza kolonileri
Karbonhidrat fermentasyon deneyi: Bunun için ayrı ayrı glukoz, laktoz, sukrozdan %1
oranında ve ayrıca her birinden X ve V faktör içeren fenol kırmızılı buyyon besiyeri kullanılır.
Serolojik identifikasyon : Özel serovar monospesifik serumlar ile lamda kapsül şişme
reaksiyonları yapılabilir. Ko-aglütinasyon yöntemi ile de serovarları araştırılabilir. Floresanlı
antikor deneyleri doğrudan klinik materyallerden tanı konabilir.
86
Haemophilus parainfluenza
-
Normal üst solunum yolu florasında bulunur insanlarda endokarditlerden
soyutlanmıştır.
Haemophilus aegyptius
-
H.influenza’ ya benzer X ve V faktörüne ihtiyaç duyar bulaşıcı konjoktivitlere sebep
olur.
Haemophilus aphrophylus
-
Endokardit, beyin apseleri kolesistitlerden soyutlanmıştır. Dental plak florasında
bulunabilir.
Haemophilus ducrei
-
Küçük kokobasil görünümünde uç uca ikişerli veya zincir biçiminde hareketsiz,
sporsuz,kapsülsüz gram olumsuz bakteriler olup çoğu kez kutupsal boyanır.
-
Üreyebilmek için X faktörüne ihtiyaç duyarlar. Yumuşak yara (şankroid) adı verilen
cinsel ilişki ile bulaşan hastalık yaparlar.
Tanısı; Yara tabanı kazınarak örnek alınır. Şişmiş ganglionlar varsa ponksiyon ile irin alınıp
incelenmelidir. Preparatlar gram, giemsa veya sulu fuksin ile boyanır. Olguların %60-80 de
hücre içlerinde ve dışında uçuca ikişerli kokobasiller görülmesinin tanı değeri vardır.
Kültürleri oldukça zordur. Çikolatamsı agar veya vankomisin içeren çikolatamsı agara yapılan
ekimlerde 330 C de ve %5-10 CO2’ li ortamda inkübe edilirse koloniler 2-9 günde oluşur.
Şekil 9-17. Haemophilus ducrei
87
Bordetella pertussis ve Tanısı
-
Küçük ovoid hareketsiz, sporsuz çoğu kez tek tek bazen uçuca ikişerli görünümünde
gram negatif bakteriler olup ilk izolasyonlarında bir mikrokapsülleri bulunur. Kutupsal
boyanma eğilimindedirler.
-
En iyi üredikleri besiyeri Bordet-Gengou besiyeridir. Burada 48-72 saatte oluşan
koloniler düzgün saydam küçük civa damlası görünümdedir.
-
Boğmaca hastalığının etkenidir.
TANI:
Ekimler: Nazofarenks sürüntü örneği alınmalı ve bekletilmemelidir. En iyi yöntem plak
besiyerine öksürtülerek yapılan yöntemdir. Ekimler Bordet-Gengou plaklarına yapılır ve
koloniler 3-4 günde oluşur.
Şekil 9-18. Bordetella pertussis ekim görüntüleri
Boyalar: Gram boyama, florasanlı antikor boyaması ve homolog serum ile lam aglütinasyonu
yapılarak identifiye edilir.
88
Şekil 9-19. Bordetella pertussis
ELİSA: Soyutlanan bakterinin identifikasyonu için monoklonal antikorlar kullanılabilir.
Pertusis tokinine karşı antikorların saptanması ile erken tanı B.pertusis toksinine karşı Ig M ve
Ig G tipi antitoksik antikorları hastalığın erken dönemlerinde oluşur. ELİSA yöntemi ile bu
antikorlar tespit edilebilir ve erken tanı konabilir.
PCR: Doğrudan klinik materyallerden DNA sı tespit edilip çoğaltılabilir.
Francisella tularensis ve Tanısı
-
Çok küçük kokobasil, hareketsiz, sporsuz ve gram olumsuz olup zor boyanırlar.
Kutupsal boyanma gösterirler.
-
Genel kullanım besiyerlerinde üremezler. Francis besiyerinde küçük saydam damlacık
şeklinde koloniler oluşturur.
-
Çeşitli yabani hayvanlardan ve kemiricilerden bulaşmak sureti ile insanlarda tularemi
hastalığı yaparlar. İnsanlarda ülseroglandüler, oküloglandüler ve tifoid formları vardır.
89
Şekil 9-20. Tularemi lezyonu, ülseroglandüler ve mikroskopik görüntüsü
TANI:
Ekimler: İnceleme örneği olarak lenf ponksiyon sıvısı ve kan örneği alınabilir. Kültür için kanlı,
glikozlu ve sistinli besiyeri olan Francis besiyerine ekim yapılır. Ekimler 37 0C de 2-5 gün
tutulur. Tipik koloniler oluşunca spesifik antiserum ile lam aglütinasyonu yapılır.
Şekil 9-21. Francisella tularensis’in besiyeri görüntüsü
Hayvan deneyi: Kobaylara inokulasyon daha iyi sonuç verir.
90
Serolojik testler: Antikorlar ikinci haftadan başlayarak yükselir ve dört-yedinci haftalarda en
yüksek titreye ulaşır. Oluşan Ig G antikorları bir iki yıl daha kaybolmaz.
Legionella pneumophila ve Tanısı
-
Pleomorfizm gösteren sporsuz, kapsülsüz, tek veya birkaç kirpikleri ile hareketli bir
basildir.
-
Gram olumsuz olmakla birlikte güç boyanır.
-
Genel kullanım besiyerlerinde üremez. İsovitale eklenerek zenginleştirilmiş Mueller –
Hinton besiyeri, Feely –Gorman besiyeri, Charcoal yeast extract agar besiyeridir.İlk
izolasyonlarında %3 CO2 li ortamda üremeyi sever.
-
Solunum yollarında incelenecek materyal balgam ,trekeobronşial aspirasyon
sıvısı,plevra sıvısıdır.
TANI:
Ekimler: L.pneumophila’ yı üretmek zordur. %3 lük CO2’ li ortamda 3-5 günde toplu iğne başı
gibi konveks gri koloniler oluşur.
Serolojik testler: İndirekt floresan antikor deneyi ile serolojik tanı yapılabilir. Antikor
titresinin 1:128 den fazla olması ve iki hafta sonra titrenin belirgin artmasının tanı değeri
vardır.
Şekil 9-22. Legionella pneumophila
91
Gardnerella vaginalis
-
Küçük pleomorfizm gösteren sporsuz kapsülsüz, hareketsiz çomakçıklardır. Gram
olumlu olmakla birlikte bazen boyalarını bırakırlar.
-
Genel kullanım besiyerlerinde üremezler. Çikolatamsı jeloz ve insan kanlı agar
besiyerinde ürerler.
-
Kadınlarda non spesifik vaginosis denilen hastalığın etkeni olarak kabul edilen bu
bakteri normal vaginal flora da bulunabilir. Vaginitlerde çoğu kez Bacteriodes ve
peptococcus lar ile birlikte bulunur.
TANI:
Boyalar: Vaginal, serviks ve üretral salgılarda G.vaginalisin saptanması ile konur. Direkt
materyalin gram ve giemsa preparatlarında ilk göze çarpan lökositlerin azlığıdır. Vaginal
epitelyum hücrelerinin
üzerinde çok sayıda gram olumlu ve gram labil bakterilerin
yapıştıklarının ve arada gram olumlu laktobasillerin görülmesi tanı koydurucudur.
Ekimler: Üretilmeleri zordur. Genelikle vaginit yakınmalarını açıklayacak başka bir etken
bulunmamış ise ve mikroskopik incelemede yukarıdaki görünüm görülüyorsa G.vaginalis
tanısı için yeterlidir.
Şekil 9-23. Gardnerella vaginalis
92
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- Önceden hazırlanmış preparatları inceleyiniz.
2- Rose Bengal, Wright ve Brucella capt testlerini inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
93
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-10
Enterik Bakteriler
Dersin Amaçları
Enterobacteriaceae familyasının genel özelliklerinin öğrenilmesi
Enterobacteriaceae familyasında bulunan ve klinik önemi olan
bakterilerin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Enterobacteriaceae familyasındaki cinsleri sayar ve özelliklerini
sıralar.
Enterik bakterilerin izolasyonunda kullanılan besiyerlerini sayar.
Enterik bakterilerin besiyerlerindeki makroskopik görüntülerini
tanımlar.
Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan biyokimyasal
testleri sayar.
Gram boyama yöntemiyle boyanmış preparatlardaki enterik
basilleri mikroskopik olarak inceler.
Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan biyokimyasal
testlerin sonuçlarını değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Mikroskop
Lam
Lamel
Öze
Bek
Enterik bakteri (Örn; Escherichia coli, Klebsiella ve Salmonella ssp.)
üremiş kültür plakları
Mc Conkey/ Endo/ EMB (Eosine Methylene Blue), Selenit F / tetra
tiyonat Salmonella-Shigella(SS) agar
Triple Sugar Iron (TSI) Agar, İndol besiyeri, Metil red- Voges
Proskauer besiyeri ve Simmon's Citrate Agar, Hareket besiyeri,
Fenilalanin agar
Kovaks ayıracı, Metil Red ayıracı, Ferrik Klorür ayıracı
Giriş
Enterobacteriaceae klinik olarak önemli gram negatif basil izolatlarının yaklaşık
%80’ini ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarındaki klinik olarak önemli bakterilerin yaklaşık
%50’sini oluşturur. Septisemi olgularının neredeyse %50’sinden, üriner sistem
enfeksiyonlarının %70’inden fazlasından ve barsak enfeksiyonlarının önemli bir kısmından
94
sorumludur.
Enterik bakteriler toprakta, suda, bitkilerde yaygın olarak bulunduğu gibi insan ve
hayvanların barsaklarında normal flora elemanı olarak da yerleşirler. Nazokomiyal
enfeksiyonlardan sıklıkla izole edilirler. Salmonella serotip Typhi tifoya neden olur ve sadece
insanlarda bulunur. Bununla beraber Klebsiella pneumoniae suşları asemptomatik barsak
kolonizasyonundan, üriner sistem ve solunum sistemi enfeksiyonlarına, hatta fatal
pnömoniye, septisemiye ve menenjite varan enfeksiyonlara neden olur. Şigelloz etkeni olan
Shigella insanda diyarenin en önemli nedenlerinden birisidir. Yersinia enterocolitica ve bazı
Escherichia coli türleri (Enteropatojenik E.coli, Enterotoksijenik E.coli, Enterohemorajik E.coli
O157:H7) gastrointestinal enfeksiyon etkeni olan diğer patojen türlerdir. Menenjitlerden ve
üriner sistem enfeksiyonlarından sıklıkla izole edilen bakteri yine Escherichia coli' dir.
Citrobacter diversus ve Enterobacter sakazakii beyin apsesine neden olan Enterobacteriaceae
üyeleridir.
Enterobacteriaceae familyasının genel özellikleri:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Gram negatif basildirler.
Sporsuzdurlar.
Peritriş flajellalarıyla hareketli veya hareketsizdirler.
Mac Conkey agarda iyi ürerler.
Fakültatif anaeropturlar.
D-glikoz ve diğer şekerleri sıklıkla gaz oluşturarak fermente ederler.
Katalaz pozitiftirler ( Shigella dysenteriae tip 1 hariç).
Oksidaz negatiftirler.
Nitratı nitrite indirgerler ( Yersinia ve Erwinia hariç).
Şekil 10-1. Işık mikroskobu altında Gram boyama yöntemi ile boyanan gram negatif basillerin
görünümü.
Enterobacteriaceae familyasındaki cinslerin bazıları:
Escherichia
Klebsiella
Salmonella
Shigella
Serratia
Citrobacter
Enterobacter
95
Providencia
Proteus
Hafnia
Erwinia
Morganella
Edwardsiella
Yersinia
Dışkının Enterik Bakteriler Açısından İncelenmesi
Enterobacteriaceae suşlarının identifikasyonunda birçok farklı yaklaşım bulunmaktadır. Tüpte
yapılan biyokimyasal testler bütün klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılmıştır.
Ayrıca bilgisayar analizi yardımıyla yapılan identifikasyon yöntemleri ve moleküler yöntemler
de mevcuttur. Bakterilerin koloni morfolojisi, pigment oluşumu, hareketlilik gibi bazı
karakteristik özellikleri de tanı koymada yardımcıdır. Örneğin; Klebsiella türleri kapsülleri
nedeniyle mukoid koloni oluştururlarken, Proteus türleri kanlı agarda buğu tarzında yayılma
özelliği gösterirler. E. coli türlerinin bazıları EMB agarda mavi-yeşil metalik refle verirler.
Serratia türlerinin bazıları ise kırmızı pigment oluştururlar.
A
B
C
D
Şekil 10-2.
A: EMB besiyerinde mukoid koloni yapmış Klebsiella spp.
B: EMB agarda mavi-yeşil metalik refle veren E. Coli
C: Kanlı agarda buğu tarzında yayılma özelliği gösteren Proteus spp.
D: Kırmızı pigment oluşturan Serratia spp
96
Biyokimyasal Testler
İNDOL TESTİ: Bu test için triptofan içeren bir besiyeri kullanılır. Bakteri bu besiyerine ekilerek
37°C’lik etüvde bir gece bekletilerek değerlendirme yapılır. Bakteri triptofanaz aktivitesine
sahip ise besiyerine Kovacs ayıracı ilave edildiğinde yüzeyde kırmızı renkli bir halka oluşur ve
test pozitif olarak yorumlanır. İndol testi E. coli için pozitif, Klebsiella ve Enterobacter türleri
için negatiftir.
A
C
B
Şekil 10-3. A: İndol Besiyeri B: İndol Testi Negatif C: İndol Testi Pozitif
METİL KIRMIZISI TESTİ: Glukoz fosfatlı bir besiyeri kullanılır. Bakteri besiyerine ekildikten
sonra 37°C’lik etüvde 48 saat inkübe edilir. Bakteri ortamdaki glukozu kullanıyorsa, karışık
asit fermentasyonu son ürünleri nedeniyle metil kırmızısı damlatıldığında besiyerinin rengi
kırmızıya döner ve test pozitif olarak yorumlanır. Besiyeri sarı renkte kalırsa test negatiftir.
Metil Kırmızısı testi E. coli için pozitif, Klebsiella ve Enterobacter türleri için negatiftir.
A
B
C
Şekil 10-4. A: Metil Kırmızısı besiyeri B: Metil Kırmızısı Negatif C: Metil Kırmızısı Pozitif
VOGES-PROSKAUER TESTİ: Butilen glikol fermentasyonu yoluyla glukozu fermente eden
bakteriler tarafından, butilen glikol oluşumunda bir ara ürün olan asetoin üretimini tespit
etmek için kullanılır. Glukoz fosfatlı besiyerinde bakteri 48 saat inkübe edildikten sonra alfanaftol ve potasyum hidroksit damlatılır. On-on beş dakika içinde kırmızı renk değişiminin
olması diasetil oluşumunu gösterir ve test pozitif olarak yorumlanır. Renk değişimi olmazsa
test negatif kabul edilir. Voges-Proskauer testi E. coli için negatif, Klebsiella ve Enterobacter
türleri için pozitiftir.
97
SİTRAT TESTİ: Bakterinin sitratı tek karbon kaynağı olarak kulanma yeteneğini belirlemek için
kullanılır. Sitratın hücre içine alınımını sağlayan sitrat liyaz enzimine sahip bakteriler, iyi
bilinmeyen bir yolla alkali reaksiyon gerçekleştirirler. Bu test için Simmon' un Sitrat agarı
kullanılır ve ayıraç kullanılmaz. Besiyeri içindeki brom timol mavisi ayıracının, yeşil renginin
maviye dönmesi testin pozitif olduğunu gösterir. Sitrat testi E. coli için negatif, Klebsiella ve
Enterobacter türleri için pozitiftir.
A
B
Şekil 10-5. A: Sitrat Testi Pozitif B: Sitrat Testi Negatif
ÜREAZ TESTİ: Üreyi hidrolize eden bakterileri tespit etmek için kullanılır. Ürenin üreaz
enzimiyle hidrolizi sonucu amonyak ve karbondioksit oluşur. Amonyağın oluşması besiyerini
alkali yapar. Bu ortam Christensen' s urea agardaki indikatör madde olan fenol kırmızısının
rengini kırmızıya dönmesine neden olur. Üreaz testi Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis,
Providencia rettgeri türleri için pozitif, E.coli için negatiftir.
A
B
Şekil 10-6. A: Üreaz Testi Negatif B: Üreaz Testi Pozitif
HAREKET TESTİ: Hazırlanan yarı-katı bir besiyerine ekim yapılır ve 37°C’lik etüvde
inkübasyona bırakılır. Ertesi gün bakterinin hareket özelliği değerlendirilir. Ekim yerinin
etrafına doğru yayılan bulanıklık bakterinin hareketli olduğunu gösterirken, besiyerinin
berrak görülmesi bakterinin hareketsiz olduğunu gösterir. Klebsiella ve Shigella hareketsizdir.
Yersinia enterocolitica oda sıcaklığında hareketli olduğu halde, 37°C’de hareketsizdir. Bu
nedenle gerekli durumlarda farklı ısılarda besiyerini inkübe etmek gereklidir.
98
A
B
Şekil 10-7. A:Hareket testi pozitif, B: Hareket testi negatif
TRIPLE SUGAR IRON AGAR ( TSIA) = ÜÇ ŞEKERLİ DEMİRLİ BESİYERİ: Bakterinin glukoz, laktoz
ve sukrozu fermentatif olarak kullanıp kullanmadığını ve hidrojen sulfid (H2S) oluşturup
oluşturmadığını belirlemek için kullanılır. Besiyeri içindeki fenol kırmızısı asidifikasyonun
ayıracı, demir sülfat H2S gazının ayıracıdır. Bakterilerin fermentatif özelliklerinin gösterilmesi
yatık besiyerindeki karbonhidratların oranına bağlıdır. (10 kısım laktoz, 10 kısım sukroz, 1
kısım glukoz ) TSIA' ya ekim yapıldıktan sonra 8-12 saat sonra bakteri glukoz kullanmış ise
fermentasyon sonucu organik asitler oluşur ve fenol kırmızısının rengi sarıya dönüşür. Aynı
besiyerinin yatık kısmındaki bakteriler, glukozu oksijen karşısında respirasyon yoluyla
parçalarlar. Bu parçalanmada az miktarda organik asitler ortaya çıkar. Bunların da besiyerinin
rengini sarıya çevirmesi beklenirse de bakteriler aynı zamanda parçaladıkları proteinlerden
alkali ürünler oluştururlar. Bu ürünler yatık kısımda glukozun aerobik parçalanmasından
oluşan zayıf asit reaksiyonunu nötralize ederek alkali ortam oluşturur. Bu şekilde TSI' da
bulunan üç şekerden sadece glukozu parçalayanlar dipte asit (sarı), yatık kısımda alkali
(kırmızı) reaksiyon gösterirler. Bu parçalanma esnasında aynı zamanda gaz da oluşursa tüp
dibinde gaz kabarcıkları oluşur. Besiyerinde yüksek oranda bulunan laktoz ve sukrozun her
ikisini de parçalayan bakteriler hem dip hem de yatık kısmı sarıya çevirecektir.
H2S Oluşumu: TSIA' da kükürt kaynağı olarak sodyum tiyosülfat ve H2S ayıracı olarak ferrik
amonyum sülfat bulunmaktadır. Bakteri eğer kükürtlü bileşikleri parçalıyor ve H2S
oluşturuyor ise siyah renkli demir sülfit oluşacağı için besiyerinin rengi siyahlaşır. H2S
oluşumu SS besiyerinde siyah kolonilerin oluşumu şeklinde de gözlenebilir. Salmonella ve
Proteus türleri H2S pozitif bakterilerdir.
B
A
C
Şekil 10-8. Triple sugar iron (TSI) besiyerinde çeşitli reaksiyonlar A:H2S pozitif, gaz pozitif,
B:Alkali/ alkali reaksiyon, C: Asit/ asit reaksiyon)
99
Tablo 10-1. Enterobacteriaceae'nin biyokimyasal test paternleri
Citobacter
Arginine
±
Citrate
+
Dnase
−
Gas
+
Glukose
+
H2S
±
Đndole
±
Lysine
−
Motility
+
Ornithine
±
Phenylalanine
−
Sucrose
±
Urease
±
VP
−
MR
+
TSI
yüzey
Alk (A)
dip
AG
±
+
−
VP
TSI
Enterobacter Escherichia Klebsiella Morganella Proteus
±
−
−
−
−
+
−
±
−
±
−
−
−
−
±
+
+
±
±
±
+
+
+
+
+
+
−
−
−
−
+
+
−
±
±
+
+
±
±
−
+
+
+
±
−
+
+
±
−
±
+
+
−
−
−
+
+
±
−
±
+
+
−
−
±
+
±
−
−
−
+
+
+
−
−
A
Alk (A)
A
Alk
Alk
AG
AG
AG
AG
AG
: Değişken
: %90 pozitif
: %90 negatif
: Voges-Proskauer reaksiyonu
: Triple Sugar Iron agar (üç şeker )
A
G
Alk
MR
: Asit (sarı)
: Gaz
: Alkali
: Metil kırmızısı
100
Providencia
−
+
−
±
+
−
+
−
+
−
+
±
±
−
+
Alk
AG
Salmonella
±
±
−
±
+
±
−
+
+
+
−
−
−
−
+
Alk
A;G ±
Serratia
−
+
+
±
+
−
−
+
+
+
−
+
−
+
−
Alk (A)
A
Shigella
−
−
−
−
+
−
±
−
−
±
−
−
−
−
+
Alk
A
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- EMB agardaki bakteriyel koloni morfolojilerini inceleyiniz.
2- Bizmut sülfit agardaki kolonileri inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz.
3- SS agardaki kolonileri inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz.
4- IMVIC yapılan kültürleri inceleyiniz, sonuçları değerlendirerek çiziniz.
101
5- Üreaz kültürlerini inceleyiniz.
6- TSI agarları inceleyiniz, gördüklerinizi çiziniz, değerlendirme sonuçlarınızı yazınız.
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Farmer JJ, Boatwright KD, Janda JM (2009). Enterobacteriaceae: Giriş ve Tanımlama.
Manual of Clinical Microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller
A). 9th ed. Çeviren: Kayacan ÇB. Washington, D.C. American Society for Microbiology. 649687.
2. Murray PR, Rosenthall KS, Pfaller MA (2010). Medical Microbiology. Tıbbi Mikrobiyoloji.
6th ed. Çeviren: Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, 301-315.
102
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-11
Sporlu Bakteriler
Dersin Amacı
Hastalık oluşturan sporlu bakterilerin ve tanısında kullanılan
yöntemlerin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Sporlu bakterilerin neler olduğunu öğrenir
Tanısında kullanılan besiyerleri, testleri ve boyama yöntemini bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Hazır preparat
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Ekilmiş (Bacillus spp.) kanlı besiyeri
Giriş
Basillus cinsi, aerop yada fakültatif, spor oluşturan Gram pozitif çomakları içerir. Bu cins
içinde yer alan mikroorganizmaların çoğu hava, toprak ve suda saprofit olarak bulunur.
Gram Pozitif Çomaklar
A- Bacillus spp.
1-B. anthracis
2-B. cereus
Her iki türde insanlarda ve hayvanlarda hastalık oluşturan etkenlerdir.
B. anthracis
G(+) ve sporu basil ortasında ve basilin şeklini değiştirmeden yer almıştır. Kapsüllü
basillerdir. Katı besiyerinde kapsül yapısı kaybolur. Basiller Gram boyamada bambu kamışı
görünümündedir.
103
Genel kullanım besiyerlerinde kolayca üreyebilirler. Aerop ve anaerob üreme
özelliğindedir. Katı besiyerinde R tipi koloni yaparlar. Beyazımsı, düzensiz kenarlı ve
incelendiğinde ondüle saç görünümündedir. Bu görüntü B. anthracis için tipiktir.
Yarı katı besiyerinde dik ekim yapıldığında 24-72 h. içinde ters çam biçiminde üreme
özelliğindedir.
Yaptığı hastalık şarbondur. Deri, akciğer ve bağırsağa yerleşir. Septisemi yapma
özelliğindedir.
Tanı:
Gram boyama ile inceleme: Gram pozitif sporlu ve kapsüllü bakteriler görülür
Kültür: Koyun kanlı agar besiyerine ekim yapılır. 24 saatlik inkibasyonla üretilebilir.
Üreyen mikroorganizma Hareketi (-), Kapsül (+), Pen-G-duyarlı, B hemoliz (-) ise B. anthracis
tir. Hareket (+), kapsül (-) Pen-G-R ise B.cereus’ tur.
Şekil 11-1. Bacillus anthracis
B- Clostridium sp.
Clostridium genusu zorunlu anaerob bakterilerdir. Spor yapıları subterminal yerleşimli
ve bakteriden daha geniş olduğu için raket görünümlü bakterilerdir. İnsan GİS florası ve
doğada yaygın olarak bulunan bakterilerdir.
C. tetani:
Tetanus hastalığını yapan Clostridium türüdür. Zorunlu anaeroptur. Hastalığı
oluşturduğu tetanus exotoksini ile yapar.
104
Tanı:
- Daha çok klinik bulgularla yapılır.
- Kültürü yapılmak istenirse, kanlı besiyeri, kıymalı buyyon, tiyoglikolatlı sıvı besiyerine
ekilir.
- Gam inceleme yapılarak bakterilerin görülmesi
- Hayvan deneyi yapılır.
Not: Çoğunlukla mikst enfeksiyon oluşturur. (Çoklu bakteri çeşidi)
C.botulinum:
Besin zehirlenmesi,
Yara botulismusu,
Bebek botulismusu oluşturur
Tanı: Hasta serumu ve dışkıdan toksin araştırılması besin maddelerinden toksin
araştırılmasıyla yapılır. Dışkı ve besin maddelerinden kültür yapılır.
C.perfringens, C.septicum, C.Novyi, C.histolyticum, C.sporogenes
Gazlı gangren yapan organizmalardır.
Tanı:
-İnfeksiyon bölgesinde alınan materyaldir.
-Gram inceleme yapılarak
-Kültür yapılır. Bunun için;
1. Kıymalı buyyon
2. Tiyo besiyeri anaerob şartlarda 48-72 h. İnkübe edilir
3. Kanlı agar
35-370C inkübe edilir.
Sıvı besiyerinden örnek alınır ve Gram boyama yapılır. Gram (+) ve sporlu basillerin
görülmesi, hareket incelemesinde pozitif sonuç alınması, kanlı besiyerinde hemoliz (+) ve
kolonileri yarı saydam, grimsi- opak ve ince, ayrıca yayılma özelliği gösteren kolonilerin
Clostridium sp. olabileceği düşünülmelidir.
C. perfringens: Besin zehirlenmesinde etkendir.
105
C. difficile: Pseudomembranöz kolit yapar
Dışkı kültürü yapılarak C. difficile izalosyonu ile tanı konur.
Dışkıda toksin araştırılabilir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Hazır preparatları inceleyiniz ve çizim yapınız (Bacillus ve Clostridium).
2. Kanlı besiyerinde R tipi koloni oluşumunun inceleyiniz.
Basillus spp.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
106
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-12
Mikobakteri
Dersin Amaçları
Mycobacterium’ ların genel özelliklerinin öğrenilmesi
Mycobacterium’ ların tanısında kullanılan laboratuvar testlerinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Mycobacterium’ların genel özelliklerini sayar.
Mycobacterium cinslerini ve başlıca özelliklerini sayar.
Mycobacterium’ların mikrobiyolojik tanısı için uygun örnekleri
sıralar.
Mycobacterium’ların mikrobiyolojik tanısı için uygun örnek alımını
tarifler.
Homojenizasyon- dekontaminasyon basamaklarını sayar.
Mycobacterium’ların boyanması amacıyla kullanılan boyalarının
adlarını sayar.
Asido Rezistan Boyama (ARB) yönteminin basamaklarını sayar.
Mycobacterium kültür yöntemlerini sayar.
Lowenstein - Jensen besiyerinin özelliklerini sayar.
ARB boyama yapar.
ARB boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak
değerlendirir.
Mikroskobi sonucunu yorumlar.
Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Mikroskop
ARB ile boyanmış preparat
Hasta balgamından hazırlanmış preparat
ARB boya seti
Ekim yapılmamış Lowenstein - Jensen Besiyeri
M. tuberculosis üremiş Lowenstein - Jensen Besiyeri
Giriş
Mycobacterium’lar 1–4 x 0,2–0,4 µm büyüklüğünde hareketsiz, kapsülsüz, sporsuz, hafif
kıvrık veya düz, dallanabilen zorunlu aerop basiller olup, sporsuz bakterilerin en
dirençlilerindendir. En iyi üreme sıcaklığı 37°C'dir. 25°C'nin altında ve 42°C'nin üstünde
107
üremezler, hücre duvar yapısı diğer bakterilerden farklı olduğu için Gram ve birçok diğer
laboratuvar boyası ile kolay boyanmazlar.
Mycobacterium cinsinde 200 kadar farklı tür belirlenmiştir. Bunların bir kısmı saprofittir ve
hastalık oluşturmaz. M. leprae; lepra (cüzzam) hastalığının etkenidir, tüberküloz (verem)
hastalığının etkeni olan Mycobacterium tuberculosis kompleks ise M. tuberculosis, M. bovis,
M. africanum ve Mycobacterium microti türlerinden oluşmaktadır.
Mycobacterium tuberculosis
Tek tek, küçük zincirler veya küçük demetler halinde bulunabilirler. Kültürden hazırlanan
preperatlarda kokoid veya filamantöz biçimde görülebilirler.
Tüberküloz enfeksiyonu, başta akciğerler olmak üzere plevra, böbrek, deri, meninks, periton
gibi birçok organı tutabilir. Mikrobiyolojik tanı için; lezyonun lokalizasyonuna göre balgam,
mide yıkama suyu, eklem sıvıları, idrar, BOS, kan, dışkı, deri kazıntısı gibi örnekler direkt
mikroskobi, kültür, PCR, ELISA, kompleman fiksasyon testi, hemaglütinasyon testi veya
hayvan inokülasyonu ile incelenir. Tüberküloz tanısı, genellikle balgamın veya patolojik
materyalin yayma preparatlarda ve kültürlerde incelenmesi ile kesinlik kazanır. Bu nedenle
tüberküloz tanısında bakteriyoloji en başta yer alan yöntemdir.
Materyalin Alınması ve İşlenme Yöntemleri
Balgam: Sabahları aç karnına, ardışık günlerde, her gün bir örnek olmak üzere toplam üç
örnek verilmelidir. Balgam çıkarmadan önce ağız çevresi ve ağız içi temizlenmeli,
gerektiğinde dişler fırçalanmalıdır. Balgam çıkarılamıyorsa balgam yumuşatıcı ilaçlar verilir,
bol su içirilir. İndüklenmiş balgam örneği görünüm açısından tükrüğe benzer. Bu nedenle
örneğin yanlışlıkla reddedilmemesi için istem kağıdına “indüklenmiş balgam” notu
eklenmelidir.
Mide açlık suyu: Bebek ve küçük çocuklarda balgam yutulduğu için nazogastrik sonda ile
mide suyu alınarak incelenir. Bu amaçla mideye steril serum fizyolojik verilir. Bu sıvı içindeki
balgam parçacıkları steril kaba aktarılır. Örneğin pH’sı sodyum karbonat ile nötralize edilir.
Sabahları mümkün olan en erken zamanda ve üç gün üst üste örnek alınır.
İdrar: Mümkün olduğu kadar fazla miktarda (40 ml’den fazla), üç gün üst üste sabah ilk
yapılan (dolayısıyla gece uyku süresince mesanede birikmiş) idrarın orta akımından elde
edilmiş örnekler ve mesaneden kateter ile alınan idrar örneği kabul edilmelidir.
Biyopsi materyali: Mümkünse en az bir gram doku steril kap içinde tuzlu su veya diğer
sıvılara batırılmadan veya gazlı beze sarılmadan laboratuvara gönderilmelidir. Formalin
içinde teslim edilen örnekler yayma ve kültür için kabul edilmez.
Steril vücut sıvıları: Mümkün olduğu kadar fazla miktarda, steril kapaklı tüpte ya da steril
kapaklı enjektörde laboratuvara gönderilir.
108
Diğer örnekler: Aseptik koşullarda mümkün olduğu kadar çok materyal aspire edilmeli veya
alınmalıdır.
Kemik iliği / Kan: Steril serum fizyolojik ya da transport besiyeri içeren tüpte, mümkünse SPS
(sodium polyanethol sulfonate) (0,25–0,50 mg/ml) ya da heparin (0,2 mg/ml) içeren tüplere
örnek konulduktan sonra birkaç kez ters-düz edilir. EDTA’ lı tüpteki kan ve pıhtılaşmış kan
kabul edilmez. Direkt olarak BACTEC 13A kültür şişelerine ekim de etkili bir yöntemdir.
Örneklerin laboratuvara ulaştırılması ve işlenmesi ile ilgili bazı hususlar:
•
•
•
•
•
•
•
Tüm örnekler en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır.
Laboratuvara hızlı ulaştırılması mümkün değilse örnek buzdolabında 2-8°C’de
dondurulmadan saklanmalıdır.
Herhangi bir tespit edici ya da koruyucu madde eklenmemelidir.
Saprofit mikobakteriler bulunacağından musluk suyu ile temas ettirilmemelidir.
BOS, parasentez, torosentez gibi steril vücut sıvılarına homojenizasyondekontaminasyon işlemi yapılmasına gerek yoktur. Santrifüj edilip pellet ile işlem yapılır.
İdrar örnekleri önce 3500 rpm’de santrifüj edilip pellet ile işlem yapılır
Katı kıvamda gelen numuneler N-asetil-L-sistein (NALC) - NaOH eklenip parçalanır ve
daha sonra işlem yapılır.
Homojenizasyon - Dekontaminasyon
Balgam ve mide lavaj sıvısı gibi flora elemanlarıyla temas eden numunelere
dekontaminasyon ve homojenizasyon işlemleri uygulanmalıdır. Böylece az sayıda ve
homojen olarak dağılmamış Mycobacterium basilleri bir araya toplanacak, flora elemanları
uzaklaştırılmış olacaktır.
Uyulması gereken adımlar
• Numune miktarı kadar (1:1 oranda) %4’lük NaOH konulur. Örnek yoğun kıvamlı ise Nasetil-L-sistein eklenir. NaOH diğer canlı hücre ve bakterileri yok ederken M.
tuberculosis’e zarar veremez.
• Vortekslenir, oda ısısında 15 dakika beklenir.
• Tampon solusyonu (PBS) ile 40 ml’ye tamamlanır. Fosfat tamponu NaOH
konsantrasyonunu azaltır ve mikobakteri üremesi için uygun olan pH 6.8’i sağlar.
• 3500 rpm’de 15 dak santrifüj edilir
• Süpernatant dökülüp pellet üzerine 5 ml tampon solüsyonu konur.
• Vortekslenir.
Bu şekilde elde edilen karışım tüm tanı işlemlerinde kullanılabilir.
109
Bakteriyolojik İnceleme Yöntemleri
1. Mikroskobik Tanı
a. Balgamın veya patolojik materyalin hiç bir işleme tabi tutulmadan, varsa irinli veya
nekrozlu tanecikli kısımlarından lama yayılması ve doğrudan boyanarak basil araştırılması
(direkt preparat).
b. Balgamın veya patolojik materyalin işlenmesinden (homojenizasyon-dekontaminasyon)
sonra konsantre edilmiş sedimentin boyanarak basil araştırılması.
Her iki teknikte, lama ince bir tabaka halinde yayma yapılır, preparat havada kurutulur ve
alevden üç defa geçirilerek tespit edilir. Mycobacteriumlar’ın Gram boyanma özellikleri
yoktur. Preparatın boyanmasında genellikle Ehrlich-Ziehl-Neelsen metodu uygulanır, mavi
zemin üzerinde kırmızı basiller görülür. Kinyon yönteminde ise yeşil zemin üzerinde kırmızı
basiller görülür. Ayrıca preparatlar floresan boyama (Auramine–Rhodamine Floresan
Boyama) yöntemleriyle de incelenebilir.
Erlich-Ziehl-Neelsen (EZN) veya Asido Rezistan Boyama (ARB)
Lama fikse edilen basillere aşağıda gösterildiği sırayla boyama işlemi uygulanır .
Karbol fuksinle lam
tamamen kaplanıp, 5
dak kaynatılmadan
ısıtılır.
Suyla yıkanır .
Kuruduktan sonra
mikroskopta 1000’lik
büyütmede incelenir.
%3’lük HCl içeren asit-alkol
dökülüp 5–10 dak beklenir
Suyla yıkanır.
Metilen mavisi dökülür 1
dakika beklenir, suyla
yıkanır.
Şekil 12-1. Erlich-Ziehl-Neelsen (EZN) boyama yönteminin uygulanışı
110
Ehrlich-Ziehl-Neelsen tekniği ile aside dirençli bakteriler hariç, balgamda bulunan bakteriler
mavi renge boyanmışlardır. Cerahatli balgamlarda mavi renge boyanmış bol miktarda lökosit
vardır. Ayrıca epitel hücreleri ve fibrin görülebilir.
Her incelemeden sonra immersiyon objektifinin de iyice temizlenmesi gerekir. Bu duruma
dikkat edilmezse daha önceki numuneye ait basiller objektifle yeni lama aktarılarak
yanlışlıklara sebep olabilir.
Tablo 12-1. Mikroskopi sonucunun yorumlanması
Basil Sayısı
Sonuç
0
Asido-resistan basil görülmedi
Yaymanın tümünde 1–2 tane
1–2/300 alan
Saptanan basil sayısı verilir ve yeni
materyal istenir
Yaymanın tümünde 3–9 tane
1–9/100 alan
Seyrek veya + (1+) basil görüldü
Yaymanın tümünde 10'dan fazla
1–9/10 alan
Bir kaç tane veya ++ (2+) basil görüldü
Her immersiyon alanında
1 tane veya daha fazla
1–9/her alan
Çok veya +++ (3+) basil görüldü.
>9/her alan
++++ (4+) basil görüldü.
Mikroskopide basil türünü tayin etmek mümkün olmadığından inceleme sonucu: Asidorezistan basil görüldü veya görülmedi olarak rapor edilir.
2. Kültür
Bu amaçla geliştirilmiş birçok besiyeri vardır. Bunların çoğu semisentetiktir. En çok kullanılanı
Lowenstein-Jensen besiyeri’ dir. Bu besiyeri yumurta, patates, gliserol, çeşitli mineraller ve
malaşit yeşili içerir. Malaşit yeşili diğer bakterilerin üremesini engeller.
Numuneden pastör pipeti yardımıyla tüpteki yatık besiyerinin yüzeyine 3-4 damla damlatılır.
Besiyeri eğilip doğrultularak materyalin tüm yüzeye yayılması sağlanır. İlk gün yatay
konumda, ertesi gün dik konuma getirilerek inkübe edilmeye devam edilir. Ekilen kültürler
37°C’ ye ayarlı etüvde aerop koşullarda, 4-8 hafta takip edilmelidir. Jenerasyon zamanı
yaklaşık 18 saat olduğundan üreme en erken 2 haftada gözlenir. Ekilen örnekte 10-100
111
bakteri olması halinde üreme görülür. Oluşan koloniler krem rengi, kuru, buruşuk yüzeyli,
düzensiz kenarlıdır ( ekmek kırıntısı şeklinde).
Sıvı besiyerleri hem mikobakterilerin primer izolasyonu hem de sub-kültürlerinin yapılması
için kullanılabilirler. Günümüzde, mikobakterilerin izolasyonu için özenle hazırlanmış ticari
kültür sistemleri mevcuttur: MGIT (Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube) gibi basit
şişe ve tüpleri, yarı otomatize sistemler (BACTEC 460TB system; BD) ve tam otomatize
sistemler (BACTEC 9000MB ve BACTEC MGIT 960 vs ).
Şekil 12-2. Lowenstein - Jensen besiyerinde
üreyen M. tuberculosis kolonileri
Şekil 12-3. BACTEC MGIT 960 sistemi
görüntüsü
(ann-clinmicrob.com’dan alınmıştır).
3. Hayvan Deneyleri
Hayvan deneylerinde tüberkülin negatif beyaz kobaylar kullanılır. Geçmiş yıllarda tüberküloz
basillerini izole etmek için kobay inokülasyonları sıklıkla kullanılan bir yöntemdi. Günümüzde
kültür tekniğinin gelişmesi ve izoniazide dirençli basillerin kobayları hastalandırma özelliğini
kaybetmesi ve kobaylarda dissemine lezyonlara neden olan diğer mikobakterilerin ayırt
edilememesi gibi nedenlerden dolayı hayvan deneyleri büyük oranda terk edilmiştir.
Mycobacterium leprae
Birçok yönden M. tuberculosis'e benzeyen lepra basili düz veya hafif kıvrık, hareketsiz
sporsuz basildir. Doku kesitlerinden ve salgılardan yapılan preparatlarda bakteriler tek tek
görülebilmekle beraber çoğu kez lepra hücreleri de denilen mononükleer hücrelerin içlerinde
çalı demeti ve sigara dizisi biçiminde kümeler şeklinde görülürler. Ehrlich-Ziehl-Neelsen
yöntemi ile asido rezistan boyanırlar.
Lepranın tanısı, hastalık materyalinden yapılan preparatlarda Mycobacterium leprae'nın
görülmesi temeline dayanır. Kültür ve hayvan deneyi yoktur (kültürde üretilememiştir).
Lepralılar burun salgıları ile bol lepra basili çıkarırlar, bir pamuklu silgicin burun septum
mukozasına sertçe sürtülmesiyle alınan materyalden temiz lamlara yayılarak hazırlanan
preparatlar Aside rezistan boyama yöntemleriyle (Ehrlich-Ziehl-Neelsen metodu) boyanırlar.
Yapılan incelemelerde özellikle ‘globi’lerin (mavi zemin üzerinde toplu halde duran kırmızı
basiller) görülmesi kesin tanı değeri taşır.
112
Şekil 12-4. Hastalık materyalinde M. leprae’nın görünüşü (tr.wikipedia.org’dan alınmıştır).
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Örnek olarak mikroskoplara yerleştirilmiş olan Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyası ile boyanmış
preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz.
2. Hasta balgamından hazırlanmış preperatları Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ile
boyayarak immersiyon objektifi ile inceleyiniz.
3. Löwenstein- Jensen besiyerinde üremiş olan M. tuberculosis kolonilerini inceleyerek
şekillerini çiziniz.
Tarih
Laboratuvar Görevlisinin İmzası
113
Kaynaklar
1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev.
Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, 277-290.
2. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Klinik Mikrobiyoloji
Manual of Clinical Mikrobiology. Dokuzuncu baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas
Kitapçılık, Ankara, cilt 1, 543-572.
3. Tünger A, Çavuşoğlu C, Korkmaz M (2005). Mikrobiyoloji. Dördüncü Baskı. Asya Tıp
Kitabevi, İzmir, 220-231.
4. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim
Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 121-126.
114
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik- 13
Mikoloji
1-
Dermatofitlerin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Dermatofitlerin öğrenilmesi
Dermatofitlerin tanımlama yöntemlerinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Dermatofitleri tanımlar.
Dermatofitleri gruplandırır.
Dermatofitlerin enfeksiyon bölgelerini sayar.
Dermatofitleri hifa ve sporlarını sayar.
Materyallerin direkt mikroskobik incelemesini yapar.
Materyallerin ekimini yapar.
Agar blok yöntemini uygular.
Agar blok yöntemiyle hazırlanmış preparatların mikroskobik
incelemesini değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Dermatofit bulunan materyal
Steril bistüri
Potasyum hidroksit (KOH) solusyonu
Lam
Lamel
Mikroskop
Sabouraud Dekstroz Agar (SDA)
Dermatofit üremiş kültür plakları
Steril pleyt
Steril su
Agar blok yöntemiyle ekim yapılmış kültür plakları
Giriş
Dermatofitoz insan ve hayvanlardaki keratinize dokuların (saç, tırnak ve deri) fungal
enfeksiyonudur. Dermatofitoz etkeni olan mantarlara dermatofit adı verilmektedir.
Dermatofit grubu içerisinde üç farklı cins bulunur: Microsporum, Epidermophyton,
Trichophyton. Epidermophyton (tek tür içerir) deri ve tırnakta, Microsporum türleri saç ve
deride, Trichophyton türleri ise saç, deri ve tırnakta enfeksiyonlara yol açar. Bu mantarlar küf
fazında üreme gösterirler. Septalı hifa yapısına sahiptirler ve aseksüel spor oluştururlar. Bu
115
aseksüel sporlar dermatofit türlerini birbirinden ayırt etmek için en çok başvurulan kriterler
arasındadır.
Dermatofitleri Tanımlama Yöntemleri
I.
Örnek Alma
Enfekte bölge örnek alınmadan önce normal bakteriyel flora elemanlarının uzaklaştırılması
amacı ile % 70 alkol ile silinir. Steril bir keskin olmayan bistüri ile özellikle lezyonun
kenarlarından olacak şekilde kazıntı materyalleri toplanır. Enfekte saç penset yardımı ile
köklerinden koparılır. Tırnak için ise distal uçtan kazıntı materyali alınır. Örnekler steril bir
kap veya temiz bir kağıt parçası içerisine konularak Laboratuvara gönderilir.
II. Direkt Mikroskopik İnceleme
Kazıntı örnekleri temiz bir lam üzerine alınır. Üzerine bir damla %10-20’lik potasyum
hidroksit (KOH) solüsyonu damlatılır. Üzerine lamel kapatılarak oda sıcaklığında yaklaşık 20
dakika bekletilir. Preparat 400X büyütmede hifa ve artrokonidia varlığı açısından incelenir.
%10 KOH Hazırlanışı
Potasyum hidroksit
Gliserol
Distile su
10 g
20 ml
80 ml
Potasyum hidroksit distile su içine koyularak iyice çözünmesi sağlanır. Gliserol ilave edilip
iyice karıştırıldıktan sonra ağzı kapaklı şişede oda ısısında saklanır.
Epitel hücre
Mantar hifaları
Şekil 13-1. Deri kazıntı örneklerinin direk miroskopik inceleme görüntüleri
III.
Dermatofitlerin Kültürü
Kloramfenikol ve siklohekzimid eklenmiş Sabouraud dekstroz agar (Mikobiyotik agar)
kullanılır. Kloramfenikol bakterilerin, siklohekzimid ise saprofit küf mantarlarının üremesini
baskılar. Çengel öze yardımı ile alınan materyaller besiyerine gömülerek ekimleri yapılır.
25°C’lik etüvde 3-4 hafta süre ile inkübasyona bırakılır. Üreme gözlenen örnekler için
tanımlama işlemlerine geçilir.
116
IV.
Dermatofitlerin Tanımlanması
Tür tayinleri agar blok kültürlerinde görülen hifa ve spor yapıları ve SDA besiyerindeki
subkültürleri neticesinde oluşturdukları koloni morfolojileri ve pigmentasyonlarına göre
yapılır.
Trichophyton
Bu cinse ait türler pamuksu veya kadifemsi koloniler oluşturur. Koloniler değişik renklerde
görülebilirler (kırmızı, kahverengi, krem rengi, violet vs.). Genellikle az oranda, ince duvarlı
mekik şeklinde ve az bölmeli makrokonidia’lar ve çok miktarda mikrokonidya oluşturur.
makrokonidya
Şekil 13-2. Trichophyton türlerinin mikroskopik görünümü
(www.doctorfungus.org’dan alınmıştır).
Microsporum
Bu genusa ait türler karakteristik bol miktarda kalın duvarlı, çok bölmeli ve yüzeyleri düzgün
olmayan makrokonidyalar oluştururlar. Mikrokonidyalar ya hiç görülmez ya da çok az
görülür.
makrokonidya
Şekil 13-3. Microsporum türlerinin mikroskopik görünümü
(www.doctorfungus.org’dan alınmıştır).
117
Epidermophyton
Bu genusta patojen olarak sadece E. floccosum bulunmaktadır. Bu mantar türü karakteristik
uçları yuvarlak az bölmeli makrokonidya’lar oluştururken hiç mikrokonidya oluşturmaz.
makrokonidya
Şekil 13-4. Epidermophyton floccosum’un mikroskopik görünümü
(www.doctorfungus.org’ dan alınmıştır).
Agar Blok Kültürü
Agar blok kültürü ile üreyen mantarın spor ve hifa yapıları daha ayrıntılı olarak görülebilir.
Beş milimetre kalınlığında SDA besiyerinden 1cm2’lik bloklar kesilir. Cam petri içinde steril bir
lamın ortasına yerleştirilir.
Çengel seklinde kıvrılmış öze ile mantar kolonisinden bir miktar alınarak besiyerinin her bir
kenarının ortasına ekim yapılır.
Üzerine steril bir lamel kapatılarak petri kutusunun içerisine 1-2 mililitre steril su koyulur.
Etüve kaldırılarak bir hafta bekletilir.
Bu sürenin sonunda agar bloğu üzerindeki lamel alınarak bir damla laktofenol pamuk mavisi
boyası konulmuş lamın üzerine kapatılır. Hafifçe bastırılarak kenarları entellan ile kapatılır ve
mikroskopta incelenir.
Şekil 13-5. Agar blok kültürünün yapılışı.
118
Laboratuvarda Yapılacak işlemler
1. Hasta materyalinden örnek hazırlayarak mikroskopta inceleyiniz, gördüklerinizi çiziniz.
2. Mikobiyotik Agar (SDA) besiyerlerinde üremiş olan dermatofit türlerini inceleyerek
gördüklerinizin renklerini belirterek çiziniz.
3. Agar blok kültürü yöntemiyle hazırlanmış preparatları mikroskopta inceleyerek
gördüklerinizi çiziniz.
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Kern ME, Blevins KS (1997). Medical Mycology. A Self-Instructional Text. Second Edition.
F.A. Davis Cmpany, Philadelphia
2. Arıkan S (2003). Mantar Enfeksiyonlarında Tanı Yöntemleri. Tıbbi Mikrobiyoloji
Laboratuvar Eğitim Kitabı (Günalp A, Yılmaz Akyön Y, Pınar A), Hacettepe Üniversitesi
Yayınları, 140-164.
119
2- Fırsatçı ve Sistemik Mikoz Etkenlerinin Laboratuvar Tanısı
Dersin Amaçları
Dersin
Hedefleri
Bilgi
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Fırsatçı mantar enfeksiyonlarının öğrenilmesi
Fırsatçı mantar enfeksiyonlarının laboratuvar tanısının öğrenilmesi
Bu dersi alan öğrenciler;
Fırsatçı mantar enfeksiyonunu tanımlar.
Fırsatçı mantar enfeksiyonları etkenlerini sayar.
Fırsatçı mantar enfeksiyonlarının üreme koşullarını tarifler.
Sistemik mantar enfeksiyonunu tanımlar
Sistemik mantar enfeksiyonlarının etkenlerini sayar.
Sistemik mantar enfeksiyonlarının etkenlerinin üreme koşullarını
tarifler.
Üremiş kolonilerden mikroskopta incelemek için preperat hazırlar.
Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik
olarak değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Mikroskop
Lam
Öze
Bek
Gram boyama seti
Sistemik enfeksiyon etkeni üremiş kültür plakları
Fırsatçı enfeksiyon etkeni üremiş kültür plakları
Gram boyama ile hazırlanmış preperatlar
Giriş
Fırsatçı mantar enfeksiyonları, immün sistemi baskılanmış kişilerde önemli morbidite ve
mortalite nedenleri arasındadır. Bu enfeksiyonlar, normal flora üyeleri ya da doğada sıkça
bulunan mantarlar ile oluşur. En sık karşımıza çıkan fırsatçı mantar enfeksiyonu etkenleri
Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans, Blastoschizomyces
capitatus, Zygomycetes, Fusarium, Acremonium, Scedosporium, Scopulariopsis, Paecilomyces
ve Trichoderma türleridir.
Sistemik mantar enfeksiyonları ise doğa ve toprakta bulunan dimorfik mantarlar tarafından
oluşturulan, genellikle mantar sporlarının inhalasyon yolu ile alınması ile başlayan, akciğer
enfeksiyonunu takiben diğer organlara da yayılım gösteren, belirgin coğrafik dağılımı olan,
mantar enfeksiyonlarıdır. Sağlıklı insanlarda da görülebilirler. En sık görülen sistemik mantar
enfeksiyonu
ajanları
Coccidioidomycosis,
Histoplasmosis,
Blastomycosis
ve
Paracoccidioidomycosis’ tir.
120
Candida
Candida türleri tüm dünyada en sık fırsatçı mikoz etkeni olan mantarlardır. Candida maya
morfolojisinde bir mantardır. Candida cinsi içerisinde yüze yakın sayıda tür bulunur. Candida
albican senfeksiyonlarda en sık etken olan türdür.
Candida’ların Laboratuvar Tanısı
I.
Direkt Mikroskopik İnceleme
Klinik örneklerden preparat hazırlanarak fiske edilir. Daha sonra Gram boyama yöntemi ile
boyanarak 1000X büyütme ile incelenir. Kandidalar oval, yuvarlak tomurcuklanan maya
hücreleri şeklinde görülür. Birçok kandida türü bu yapılara ek olarak psödohif oluşturur.
Maya hücreleri
Psödohif
Şekil 13-6. Maya hücrelerinin direkt mikroskopik görüntüsü
II.
Kültür
Klinik örnekler Sabouraud dekstroz agar (SDA) besiyerine tek koloni ekim yöntemi ile ekilir.
Kültürler 30-35°C’lik etüvlere kaldırılarak 1 hafta süreyle inkübe edilirler. Kandidalar
genellikle krem renkli, yumuşak kıvamlı, kendilerine has kokuları olan koloniler oluştururlar.
Şekil 13-7. Candida kolonilerinin kültürdeki görünümleri
121
III.
a.
Kandidaların tür düzeyinde tanımlanması
Germ tüp testi
Germ tüp testi
0.5 ml Serum (insan, tavşan, dana)
Taze Candida kültürü
Serum örnekleri eppendorf tüp içine koyulur. Test edilecek kültürden bir öze dolusu alınarak
serum içerisine ilave edilir. Tüpler 37°C’de 2-3 saat inkübe edilir. Tüp içeriğinden bir damla
alınarak temiz bir lamın üzerine koyulur. Üzeri lamel ile kapatılıp 400X büyütmede uzun tüp
benzeri yapıların varlığı açısından incelenir.
Şekil 13-8. Germ tüp oluşumu
Şekil 13-9.Pozitif germ tüp testi
b. Mısırunlu tween 80 besiyerindeki morfolojik görünüm
Şekil 13-10. Mısırunlu tween 80 besiyerinde farklı spor yapılarının görünüşü
122
c.
Biyokimyasal identifikasyon
Bu amaçla karbohidrat fermentasyon ve asimilasyon testlerine dayanan hazır maya
tanımlama kitleri bulunmaktadır. Örneğin API 20C Yeast system, ID32C, Remel RapID vb.
sistemler rutin laboratuvarlarda en yaygın kullanılanlardır.
Şekil 13-11. RapID identifikasyon sisteminin görünümü
Aspergillus
Aspergillus doğada (toprak, çürümüş bitkiler, vb.) yaygın olarak bulunan bir küf mantarıdır.
Bu mantarlar yaygın ve lokal enfeksiyonlara neden olurlar. Ayrıca hipersensivite reaksiyonu
sonucu bronkopulmoner aspergilloz da oluşturabilirler. Enfeksiyonlarda en sık izole edilen tür
A. fumigatus’tur. Fırsatçı mikozlarda Candida türlerinden sonra en sık görülen Aspergillus
türleridir. Aspergillus türleri tarafından oluşturulan enfeksiyonlar ekzojen kaynaklıdır.
Aspergillus’ların Laboratuvar Tanısı
a.
Direkt Mikroskopik inceleme
Klinik örneklerden (balgam, bronşiyal lavaj, akciğer ve paranazal sinüs biyopsisi vb.) KOH
damlatma yöntemi ile nativ preperat hazırlanıp 400X’lük büyütmede incelenir. Mikroskopik
incelemede 45°’lik açı oluşturan septalı hifler (dikotom) görülmesi Aspergillus için tipiktir.
Şekil 13-12. Aspergillus hifalarının dokudaki görüntüsü (www.doctorfungus.org)
123
b.
Kültür
Örneklerin SDA’ya ekimleri yapılarak 30-37°C’de 7-21 gün inkübe edilir. Pamuksu, kadifemsi,
türlere göre farklı renkleri olan koloniler oluştururlar. Örneğin A. fumigatus kolonileri maviyeşil, A. flavus kolonileri çimen yeşili renktedir. Koloni özellikleri tür tanımlanmasında
kullanılan kriterlerden biridir.
Şekil 13-13. A. flavus koloni görünümü
(www.aspergillus.org.uk)
c.
Şekil 13-14. A. fumigatus koloni
görünümü (www.aspergillus.org.uk)
Aspergillus türlerinin tanımlanması
Oluşan kolonilerden küçük bir parça kesilerek lam üzerine koyulur. Üzerine bir damla
laktofenol pamuk mavisi damlatılır ve lamel kapatılır. Lamelin üzerine hafifçe bastırıldıktan
sonra 400X’lük büyütmede incelenir. Gerek görüldüğü takdirde agar blok kültürü yapılarak
daha ayrıntılı inceleme yapılır.
Mikroskopik incelemede septalı hif, konidyofor, vezikül ve fiyalidlerin yapıları incelenerek tür
tanımlaması yapılır.
Vezikül
Konidiyofor
Şekil 13-15. Aspergillus türlerinin mikroskobik görünümü
124
Şekil 13-16. Aspergillus türlerinin mikroskopik görünümleri (www.atsu.edu)
Zygomycetes
Doğada yaygın olarak bulunan küf mantarlarıdır, oluşturdukları enfeksiyonlara zigomikoz
denir. Bu sınıfta çok sayıda cins bulunur. Mucor, Rhizopus, Absidia en sık enfeksiyon
yapanlardır.
Zygomycetes’lerin Laboratuvar Tanısı
a. Direkt mikroskopik inceleme
İncelenecek örneklerden (paranazal sinus direnajı, akciğer biyopsisi, bronşiyal lavaj, balgam
vb.) KOH yöntemi ile nativ preperat hazırlanır ve 400X’lük büyütmede incelenir. Bu
incelemede seyrek septalı ya da septasız, dik açıyla dallanan hifler görülür. Dokular Gomori
metenamin gümüşleme yöntemi ile boyanıp vasküler invazyon, infarkt ya da nekroz alanları
tespit edilebilir.
Şekil 13-17. Zygomikoz etkenlerinin dokudaki görünümü
(www.humpath.com, www. Mycology.adelaide.edu.au)
125
b. Kültür
Zygomycetes sınıfı mantarların izolasyonu için örnekler SDA’ya ekim yapılır. Birkaç gün (24-96
saat) sonra petrinin tamamını kaplayan, tüylü, gevşek, beyaz-gri ya da kahverengi koloniler
oluşur. Koloniler besiyerinin tüm yüzeyini kaplar ve yüksekliği petri kutusunun kapağına
kadar ulaşabilir. Koloni rengine bakılarak cins ayırımı yapılamaz.
Şekil 13-18. Zigomikoz etkenlerinin koloni görünümü (www.alamofirendwater.com)
a.
Zygomycetes türlerinin Tanımlanması
Üreyen kolonilerden laktofenol pamuk mavisi ile hazırlanan preperatlar 400’lük büyütmede
incelenir. Septasız ya da seyrek septalı, düzensiz konturlu hifler, içlerinde sporongiyospor
bulunduran sporongiyumlar görülür. Bazı cinslerde (Rhizopus, Absidia ) rizoid (köksü yapılar)
bulunur.
Şekil 13-19. Zygomycetes grubu mantarların mikroskopik grünümü (www.atsu.edu)
126
Cryptococcus neoformans
Genellikle immün yetmezliği olan kişilerde görülen fırsatçı mikoz etkenlerinin
başlıcalarındandır. Meningeal enfeksiyon sıktır ve en kolay tanınan şeklidir. Enfeksiyonları
Kriptokokkoz olarak adlandırılır. Tıbbi önem taşıyan mayalar arasında kapsüllü olması ile
ayrıcalıklı bir mantardır. C.neoformans, hem 37°C, hem de 26°C’de tomurcuklanarak
üreyebilen 5-12 µm çapında, kapsüllü, maya fazında bir mantardır.
Cryptococcus neoformans’ın Laboratuvar Tanısı
a.
Direkt mikroskopik inceleme
Klinik örnekler (çoğunlukla BOS) C. neoformans açısından çini mürekkepi ile incelenir.
Örnekler mutlaka santrifüj edilmelidir. Temiz bir lam üzerinde örnek ve çini mürekkebi
birebir oranında karıştırılır. Üzeri lamel ile kapatılarak 400X büyütmede incelenir. Gri-siyah
zeminde kapsüllü, bazen tomurcuklanmış veya ikili şekillerde görülür. Mantarın çevresinde
çini mürekkebi preperatında görülen kapsül asidik mukopolisakkarit yapısında olup kapsül
genişliğinin patojenite ile ilişkisi vardır.
Şekil 13-20. C. neoformans’ın mikroskopik görünümü (www.1.bp.blogspot.com)
b.
Kültür
Örnekler SDA’ya ekimleri yapıldıktan sonra 35-37°C’lik etüvde 48-72 saat arası inkübe
edilirler. Süre sonunda krem renkli, yassı, parlak, ıslak görünümlü çoğunlukla sümüğümsü ve
çevresi düzgün koloniler oluştururlar. Kapsülün kalınlığı arttıkça oluşan koloniler daha
mukoid olur.
c.
Cryptococcus Türlerinin Tanımlanması
Kolonilerin mukoid olması ve mikroskopik incelemede kapsüllü maya hücrelerinin görülmesi
C. neoformans’ı düşündürmelidir. Kesin tanımlama için üreaz testi ve difenol oksidaz enzim
aktivitesi bakılır. Her iki enzimde C. neoformans’ta pozitiftir. Ayrıca karbohidrat
fermentasyon ve asimilasyon testlerine dayanan hazır maya tanımlama kitleri ile kesin
tanımlama yapılır (bkz. Candida).
127
Laboratuvarda Yapılacak işlemler
1. Hazır olarak size gösterilen preparatları inceleyiniz ve şekillerini çiziniz.
2. Maya fazında üremiş olan mantar kolonilerinden boyama yaparak inceleyiniz.
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Kern ME, Blevins KS (1997). Medical Mycology. A Self-Instructional Text. Second Edition. F.A. Davis
Cmpany, Philadelphia
2. Arıkan S (2003). Mantar Enfeksiyonlarında Tanı Yöntemleri. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim
Kitabı (Günalp A, Yılmaz Akyön Y, Pınar A), Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 140-164.
128
Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-14
Parazitoloji
Dersin Amacı
Parazitlerin ve tanılarının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Parazit çeşitlerini öğrenir
Parazit incelenmesi ve tanısını öğrenir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Lam
Lamel
Tahta çubuk
Lugol
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Gaita örneği
Giriş
Parazitik yaşamı benimsemiş o tip yaşama uyum sağlamış canlıya parazit denir. Parazitik
yaşam ise bir canlının yaşamını üzerinde veya içinde yaşadığı bir diğer canlının zararına
sürdürmesidir.
Parazitler
1- Protozoonlar: Tek hücreli canlılardır. Bunlarda doku ve organlardan bahsedilmez.Katı ve
sıvı besinlerle beslenirler. Besinleri absorsiyon, fagositoz ve pinositoz ile alırlar. Hareket organeli
olarak kamçı, yalancı ayak veya kirpik bulunur. Protozoonlar eşeysiz üreme, basit ikiye bölünme,
tomurcuklanma şekillerinden biriyle ürerler. Eşeyli üreme ise gametogoni ya da konjugasyonla
gerçekleşir. Bu grupta 4 şube bulunmaktadır.
a. Sarcomastigophora: Bunlar da kamçılılar ve yalancı ayaklar olmak üzere ikiye ayrılırlar.
Örneğin Leishmania, Trypanasoma, Giardia, E.histolytica gibi.
b. Apicomplexa: Hücre içi parazitidirler. Plasmodium. Toksoplazma , Pneumocystis,
Cryptosporidium gibi.
129
c. Microspora: Pirimitif ökoryatik organizmalar olarak kabul edilirler.
d. Ciliophora
2- Metazoonlar : Bilateral simetrili omurgasız hayvansal parazitlerdir. Solucanlar ve eklem
bacaklılar olmak üzere 2 ye ayrılır:
A- Solucanlar (Helmintler)
Vücutları yassı yaprak şeklinde tek parçadan yapılmış biri hariç
hermafroditdirler. Örnek: Fasciola , Dicrocoelium, Schistosoma gibi
1) Trematodlar:
Vücutları yassı halkalardan oluşmuş hermafrodit parazitlerdir. Taenia, H.nana,
E.granulosus gibi
2) Sestodlar:
3)
Nematodlar: Vücutları silindir şeklinde tek parçadan yapılmış yuvarlak solucanlardır.
Örnek: Ascaris lumbricoides, E.vermicularis, N.americanus
B- Eklem bacaklılar: Vücutları kitinden yapılmış hakiki bir vücut boşlukları olan erkek ve
dişileri ayrılmış çoğunlukla ektoparazit olarak yaşarlar. Akarlar ( keneler) gibi ve böcekler ( sivri
sinek, bit , pire ) bu gruptandır.
Laboratuar Tanısı
Parazitozların kesin tanısı ancak laboratuvar incelemeyle konur.
1-Direkt etiyolojik tanı: Bu tip tanıda laboratuvarda dışkı idrar kan balgam vücut sıvıları
kazıntı ve otopsi materyalleri fonksiyon ve biyopsi örnekleri incelenir ve bu örneklerden parazit ve
parazit örneğin varlığı araştırılır.
Dışkı İncelenmesi: Dışkı steril çok temiz yıkanmış kaplar içinde toplanır ve mümkün
olduğunca incelemeler için taze olması gerekir. Ayrıca dışkıdaki nem oranının azalması
protozoonlarının trofozoitlerinin kist şekillerine dönüşürler. Bu yüzden erken incelenmelidir. Bunun
için:
a) Direkt preparat hazırlanması: Bir lam üzerine aynı anda biri boyasız biride boyalı ( iyot) iki
preparat hazırlanır. Bunu için lamın 1/3 ne yakın yerine %85 lik tuzlu su diğer bir 1/3
kısmına ise 1/5 oranında sulandırılmış iyot eriyiği konur. Bir kürdan ile alınan dışkı ayrı
ayrı iki damla içerisinde ezilerek süspansiyon haline getirilir her birinin üzerine birer lamel
bırakılır lamellerin etrafı parafin ile çevrilerek kurumaları önlenir daha sonra mikroskobun
kondansatörü hafif aşağı olacak biçim de diyafram kısılarak önce 10x daha sonra 40x
büyütme ile incelenir. Varsa protozon trofozoit ve kistleri ile helmint yumurtaları görülür.
130
b. Yoğunlaştırma yöntemleri: Az sayıda bulunabilecek helmint yumurtaları için 2 türlü
yoğunlaştırma uygulanabilir.
Çöktürme yöntemi: Bir tüp içerisine yaklaşık 1,5 cm. çapında bir dışkı parçası ve üzerine
10 ml tuzlu su konur ve süspansiyon olacak şekilde karıştırılır. Bu süspansiyondan 10 ml kadar
alınarak bir tülbentten başka bir tüpe süzülerek alınır. Daha sonra 2 dak santrifij edilir. Üstteki sıvı
dökülür ve dipte kalan sedimente ( ki yaklaşık 1 ml dir) 9 ml formalin eriyiği ilave edilir 5 dakika
beklenir üzerine 4 ml etil asetat konur bir dakika santrifüjlenir. Tüpün üst kısmı dökülerek dipte
kalan materyalden lam lamel arası preparat yapılarak incelenir. Etil asetat yerine eterde çöktürme
yapılabilir.
1)
2) Yüzdürme yöntemi: Doymuş sodyum klorür eriyiği hazırlanır kahve fincanı büyüklüğündeki
bir kap içerisine sodyum klorür eriyiği konur üzerine bir parça dışkı ilave edilir. İyice karıştırılarak
süspansiyon yapılır. Bir lamel bu sıvının yüzeyine yavaşca bırakılır daha sonra buradan alınarak
mikroskopla incelenir.
3) Dışkı preperatlarının boyanması :
Trikrom boyanma
Seloteyp (selofan bant) yöntemi: E.vermicularis ve Taenia yumurtalarını daha çok perianal
bölgeye bıraktıklarından bu amaç için geliştirilmiş pratik bir yöntemdir. Şeffaf olması gereken 5-6
cm uzunluğunda bir parça selofan banttan kesilir ve bu parça bir dil basacağının üzerine öyle
katlanarak konur ki yapışkan yüzü, dışta yapışkan olmayan yüzü dil basacağına gelecek şekilde olur.
Bu şekilde duran selofan bantın yapışkan yüzleri anüs çevresine çepeçevre dokundurulur. Seloteyp
uçlarından tutarak temiz bir lama gergin olarak yapıştırılır daha sonra mikroskopta incelenir.
4)
5) Boyalı preperat yapma: Giemsa
2- İndirekt Etiyolojik Tanı
a)
Serolojik deneyler: Aglütinasyon, presipitasyon, elisa vb.
b)
Cilt testler
NEMATOD ŞEKİLLERİ
Şekil 14-1. A.lumbricoides larvaları
131
Şekil 14-2. Enterobius vermicularis
Şekil 14-3. Strongyloides stercoralis
Şekil 14-4. Trichuris trichiura
132
Şekil 14-5. Trichinella spiralis larvası kasta
SESTOD ŞEKİLLERİ
Şekil 14-6. Hymenolepis nana
Şekil 14-7. Diphyllobothrium latum
133
TREMATOD ŞEKİLLERİ
Şekil 14-8. Schistosoma mansoi ve yumurtası
Şekil 14-9. Fasciola hepatica
Şekil 14-10. Paragonimus westermani
134
Şekil 14-11. Dicrocoelium dendriticum
PROTOZOON ŞEKİLLERİ
Şekil 14-12. Entamoeba histolytica
Şekil 14-13. Entamoeba coli
135
Şekil 14-14. Plasmodium falciparum (sağda)
Şekil 14-15. Toxoplasma gondii
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Parazitleri mikroskopik olarak inceleyiniz ve çiziniz.
2. Gaita örneğinden preparat hazırlayınız.
3. Selofan bant preparatını inceleyiniz.
Parazitlerin İncelenmesi
Enterobius vermicularis
Giardia intestinalis
136
Entemoeba coli
Fasciola hepatica
Ascaris lumricoides
Taenia saginata
Hymenolopis nana
Plazmodium falciparum (ince yayma)
137
Plazmodium falciparum (kalın damla)
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
138

incele - Tusem

ııı. sınıf tıbbi mikrobiyoloji laboratuvar föyleri - E

ı. sınıf tıbbi mikrobiyoloji laboratuvar föyleri - E

Shigella enfeksiyonları - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Görev ve Çalışma Yönetmeliği - Altınordu Belediye Başkanlığı

Katkıda Bulunanlar

Campylobacter enfeksiyonları - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Hacettepe Üniversitesi Merkez Laboratuvarı Test Rehberi

Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

129-134 Nurhan Albayrak.indd

PDF formatında görüntülemek için lütfen tıklayınız.

(tig) bağıl değer listesi