III. SINIF
TIBBİ MİKROBİYOLOJİ
LABORATUVAR FÖYLERİ
2014-2015
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-1
Mikrobiyolojik Tanı Yöntemleri
A-Mikrobiyolojide Kullanılan Besiyerleri ve Ekim Yöntemleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan besiyerlerinin öğrenilmesi
Besiyerlerine ekim yöntemlerinin öğrenilmesi
Bakterilerin besiyerlerinde oluşturdukları koloni tiplerinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Besiyerlerinin adlarını sayar.
Besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılan temel maddeleri sayar.
Besiyerlerinin özelliklerini açıklar.
Besiyerlerini kullanım amaçlarına göre gruplandırır.
Besiyerlerini fiziksel özelliklerine göre sınıflandırır.
Ekim yöntemlerini sıralar.
Koloni tiplerini özellikleri ile birlikte sıralar.
Besiyerlerini tanıyıp ayırır.
Ekim yöntemlerini uygular.
Koloni tiplerini değerlendirir.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Temel ya da basit besiyeri
Zenginleştirilmiş besiyeri (Kanlı agar, Çikolatamsı agar)
Özgül besiyeri (Lowenstein-Jensen besiyeri)
Seçici besiyeri (Selenit F besiyeri)
Ayırıcı besiyeri (EMB agar, Kanlı agar)
Ayıraçlı besiyeri (Şekerli besiyerleri, Fenol kırmızılı besiyerleri)
Öze
Eküvyonlu çubuk
Pipet
Tüpte sıvı besiyeri
Tüpte yatık katı besiyeri
Tüpte dik hazırlanmış katı besiyeri
Anaerobik kavanoz
S tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
R tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
M tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü
1
Giriş
Mikroorganizmaların laboratuvar şartlarında üretilmeleri, saf olarak elde edilmeleri,
çeşitli özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi için besiyeri
adı verilen çeşitli besleyici ortamlar kullanılır. Besiyerlerinde hidrojen alıcı ve verici maddeler,
karbon kaynağı, azot kaynağı ve mineraller üretilecek mikroorganizmanın ihtiyacı olduğu
kadar mevcut olmalıdır.
Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan
Temel Maddeler
-Su: Besiyeri hazırlanırken distile (saf) su ya da deiyonize su kullanılmalıdır.
-Peptonlar: Çeşitli proteinlerin pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri
sonucunda suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagüle olmayan polipeptid,
dipeptid ve aminoasit gibi maddelerden oluşur. Besiyerine eklenen bu maddelerin karışımı
bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır.
-Kimyasal maddeler ve tuzlar: Besiyerine eklenecek olan maddeler kimyasal olarak saf
olmalıdır. Bu maddeler uygun çözücülerde çözülerek besiyerine eklenir.
-Kan: Besiyerlerinin zenginleştirilmesi amacıyla tavşan, koyun veya at kanı kullanılabilir.
Besiyerine eklenecek olan kanlar steril ve pıhtılaşmamış olmalıdır.
-Serum: Koyun, tavşan, at gibi hayvanlardan steril olarak alınan kan 750 xg’de 5 dakika
santrifüj edilerek serum kısmı ayrılır ve buzdolabında saklanarak kullanılır.
-Haben sıvısı: Sirozlu hastaların periton boşluğunda toplanan sıvıdır. Steril şartlarda toplanır
ve buzdolabında saklanır.
-Maya özütü: Çeşitli vitaminler ve aminoasitler içerdiğinden zenginleştirici olarak kullanılır.
Mikroorganizmaların Laboratuvarda üretilebilecekleri besleyici ortamlar iki çeşittir.
A-Canlı ortamlar
1. Embriyonlu yumurta
2. Hücre kültürleri
3. Deney hayvanları
B-Cansız ortamlar
Besiyerlerinin Sınıflandırılması
Besiyerleri biçimlerine göre katı, sıvı, yarı katı ve yarı sıvı besiyerleri olarak ayrılırlar.
Besiyerlerinin katılaştırılmasında en çok kullanılan madde agar-agar'dır. Bir çeşit deniz
yosunundan elde edilen bu maddeyi mikroorganizmaların çoğu parçalayamaz. Bu madde
yaklaşık 42°C'de donar ve mikroorganizmaların üretilme derecelerinde erimez. Agarın %1.5 3 oranlarında sıvı ortamlara katılması ile katı besiyerleri, %0.3 - 0.5 oranlarında kullanılması
ile yarı katı besiyerleri elde edilebilir.
2
Kullanılış amaçlarına ve kimyasal yapılarına göre başlıca besiyeri grupları şunlardır:
1-Kimyasal Yapıları Bilinen Sentetik Besiyerleri
Saf kimyasal maddelerden hazırlanırlar. Eritici olarak saf su ya da iyonsuzlaştırılmış su
kullanılır. Özellikle mikroorganizmaların metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini
saf olarak elde etmek amacıyla kullanılırlar.
Sadece inorganik maddeler içerenlere basit sentetik besiyeri, buna ek olarak aminoasitler
gibi organik maddeler içerenlere de kompleks sentetik besiyerleri adı verilir.
2-Genel üretim besiyerleri
Güncel Laboratuvar çalışmalarında kullanılan, normal vücut florasında bulunan veya patojen
özellikler gösteren mikroorganizmaların çoğunun üretilebildiği besiyerleridir. Sıvı yada katı
biçimde hazırlanan bu besiyerleri üreticilik özelliklerine göre ikiye ayrılırlar.
a-Temel yada basit besiyerleri
Bunlarda başlıca pepton+tuz (peptonlu su) ya da et suyu+pepton+tuz (buyyon) gibi
maddeler ve su bulunur. Buyyona agar eklemek suretiyle elde edilen katı besiyerine jeloz adı
verilir. Bu ortamlar birçok mikroorganizmanın üremesi için elverişlidir.
b-Zenginleştirilmiş besiyerleri
Temel besiyerine kan, serum, haben sıvısı, glukoz, yumurta gibi daha besleyici maddelerin
eklenmesi ile elde edilen besiyerleridir (kanlı agar, çikolatamsı agar gibi). Basit
besiyerlerinde üremeyen bazı mikroorganizmalar bu besiyerlerinde üretilebilirler.
Şekil 1-1. Kanlı agar
Şekil 1-2. Çikolatamsı agar
3-Özel besiyerleri
Üremede güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmesi için özel olarak hazırlanan
besiyerleridir. Bu besiyerlerine belirli maddeler ve ayıraçlar konularak bazı
mikroorganizmaların üremeleri sağlanırken diğerlerinin üremeleri engellenmiştir.
a-Özgül besiyerleri
Yalnız bir çeşit ya da sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi için hazırlanan besiyerleridir.
(Mycobacterium tuberculosis`in üretilmesinde kullanılan Löwenstein-Jensen besiyeri gibi).
Şekil 1-3. Lowenstein Jensen besiyeri
3
b-Seçici besiyerleri
Bazı mikroorganizmaların üremelerini önleyici maddeler içeren, bu suretle karışık
bulundukları ortamlardan belirli mikroorganizmaların seçilerek üretilmelerini sağlayan
besiyerleridir (dışkıdaki Salmonella`ların çoğaltılmasını sağlayan Selenit F besiyeri gibi). Bu
besiyerleri temel ya da zenginleştirilmiş katı ya da sıvı besiyerlerine bir kısım bakterilerin
üremesini önleyen antibiyotikler, kimyasal maddeler, boyalar konularak hazırlanırlar.
c-Ayırıcı besiyerleri
İçerdikleri ayıraçlar aracılığı ile benzer bakterilerin ayrı görünümde koloniler oluşturmalarını
sağlayarak karışık bakterileri birbirinden ayırmaya yarayan besiyerleridir (Laktoza etkili
bakterileri etkisizlerden ayırmaya yarayan Eozin Methylene Blue (EMB) agar, hemoliz yapan
ve yapmayanları ayırmada kullanılan kanlı agar gibi).
Şekil 1-4. EMB besiyeri
d-Ayıraçlı besiyerleri
Mikroorganizmaların metabolizmalarına bağlı biyokimyasal özelliklerini incelemek amacıyla
besiyerlerine çesitli maddeler ve mikroorganizmaların bu maddeleri değişikliğe uğrattıklarını
gösteren ayıraçlar eklenerek hazırlanan besiyerleridir (şekerli besiyerleri, fenol kırmızılı
besiyerleri gibi).
Ekim Yöntemleri
İçerisinde mikroorganizma bulunduğu bilinen ya da mikroorganizma bulunup
bulunmadığı araştırılacak olan ortamlardan ekim aletleri ile alınan örneklerin belirli kurallar
çerçevesinde besiyerlerine aktarılması işlemine ekim denir. Ekimleri yapılacak örnekler ya
doğrudan doğruya hastalardan alınan hastalık örnekleridir ya da daha önce üretilmiş olan
bakteri kültürleridir.
Ekim yapılacak materyal sıvı ise öze, pipet, eküvyonlu çubuk; katı ise öze kullanılarak
ekim yapılır. Ekim yapılmadan önce ve sonra çalışılacak bankonun üzeri antiseptik eriyiklerle
silinmeli ve daima güvenlik kabinetinde çalışılmalıdır.
1-Tüpte sıvı besiyerine ekim: Tüp içerisindeki besiyerine ekim yapılırken tüp eğik olarak
tutulur. Ekim materyali öze ile alınmış ise öze tüpe yavaşça sokulur ve özedeki materyal
bırakılır. Materyal katı ise önce öze tüp duvarına dairesel hareketlerle sürülerek daha sonra
yavaşça sıvı besiyeri ile karıştırılarak ezilir. Pipetle alınan sıvı materyal besiyerine damlatılarak
ekim yapılır. Eküvyonlu çubuklar besiyerine daldırılır ve tüp kenarına bastırılarak içeriğinin
tüpteki besiyerine geçmesi sağlanır.
4
Şekil 1-5. Tüpteki sıvı besiyerine ekim
2-Tüpte yatık katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal hiç bir yere değdirilmeksizin
tüpteki besiyerinin alt noktasına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılır ve aynı
doğrultuda geri çekildikten sonra besiyerinin yüzeyinde zikzaklar çizilerek yayılır.
Şekil 1-6. Tüpte yatık besiyerine ekim
3-Tüpte dik hazırlanmış katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal tüpteki besiyerinin
dip kısmına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılıp aynı doğrultuda çıkarılarak
ekim yapılır.
4-Plak besiyerine ekim:
a-Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim: Bu ekim yönteminde amaç bakterilerin katı
besiyerine seyreltilerek ekilmeleri, bu şekilde besiyerine tek tek düşmelerinin sağlanması ve
böylece birbirinden ayrı koloniler elde edilmesidir. Bu amaçla petri kutusundaki katı besiyeri
dört bölge olarak düşünülür. Öze ile alınan materyal ilk bölgede bir noktadan başlayıp sık
zikzaklar çizilerek ekilir ve ikinci ekim sahasına geçilir. Birinci bölgeden ikinciye doğru daha az
sıklıkta zikzaklar çizilir. Üçüncü bölgede zikzaklar daha da seyrek olmalıdır. En son dördüncü
bölgede bir-iki zikzak yapılarak ekim tamamlanır. Bu ekim yönteminde, her ekim sahasına
geçmeden önce besiyeri 90 derece açıyla döndürülerek yeni ekim sahasına geçilir. Her ekim
sahasına geçildiğinde öze sterilize edildikten sonra veya farklı öze kullanılarak ekim yapılır.
Eküvyonlu çubuk ile materyal alınmış ise önce bu pamuklu çubuk ilk ekim sahasına
sürülür. Daha sonra öze ile yukarıdaki işlemlere devam edilir.
5
Şekil 1-7. Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim
b-Plak besiyerine yaygın ekim: Antibiyotik duyarlılık testleri, faj tiplendirme deneyleri gibi
amaçlar için bakterilerin plak besiyerinin yüzeyine homojen olarak dağıtılması suretiyle
yaygın ekim yapmak gerekir.
Ekim yapılacak plak yüzeyine örnekten pastör pipeti ya da otomatik pipet ile birkaç
damla damlatılır. Örnek eküvyonlu çubuk ya da öze yardımı ile besiyerinin ortasında bir çizgi
şeklinde yayılır. Steril bir cam çubuk ya da eküvyonlu çubuk ile besiyerinin ortasına kadar sık
zikzaklar çizilir. Daha sonra aynı işlem besiyerinin diğer yarısında da uygulanır. Besiyeri 90
derece çevrilerek yapılan işlemler tekrarlanır. Böylece besiyerinin her tarafına homojen
olarak ekim yapılmış olur.
Şekil 1-8. Plak besiyerine yaygın ekim
Ekim yapılan besiyerleri üretilecek mikroorganizma için gerekli optimum sıcaklık
derecelerine ayarlanmış etüvlerde ve uygun atmosferik şartlarda inkübasyona bırakılır.
Aerop ve fakültatif anaerop mikroorganizmaların üretilmesinde normal atmosferik koşullar
yeterlidir. Anaeroplar ve mikroaerofilik mikroorganizmaların üretilmesi için kapakları sıkıca
kapatılabilen cam ya da çelik silindir seklinde kaplar (anaerobik jar) kullanılır. Ekim yapılmış
plaklar bu kaplara yerleştirilir ve yanlarına özel gaz karışımı sağlayan ticari kitler koynularak
ağızları kapatılır ve uygun sıcaklıktaki etüvlere yerleştirilir.
6
Koloni Tipleri
S (smooth=düz) tipi koloni: En sık görülen şekildir. Yuvarlak, düz kenarlı, kabarık, düz yüzeyli,
nemli ve homojen kolonilerdir.
R (rough=pürtüklü) tipi koloni: S tipi koloni yapan bakterilerin eski kültürlerinde ve uygunsuz
koşullarda üretimi ile meydana gelen koloniler bu tipte olabildiği gibi bazı tür bakteriler doğal
olarak R tipi koloni yaparlar. Yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları girintili ve çıkıntılı,
basık görünümdedirler. S tipi koloni, R tipi koloni şekline dönerse virülansı azalır.
M (mucoid) tipi koloni: Bir kısım bakterilerde hücre çeperlerinin dış tabakasında polisakkarit
ve bazen polipeptid yapısında, az veya çok miktarda kapsül maddesi bulunur. Bu kapsüllü
bakterilerin uygun ortamlarda (serumlu, habenli, kanlı, vs) sümüksü görünüşlü, yapışkan ve
akıcı koloniler oluşturdukları görülür. Uygunsuz koşullarda bu bakteriler S tipi koloni
oluştururlar.
L tipi koloni: Besiyerinin dip kısmına doğru uzanan kolonilerdir. Hücre duvarını kaybeden
bakteriler (L formu) bu tip koloniler oluştururlar.
Şekil 1-9. S tipi koloni
Şekil 1-10. R tipi koloni
Şekil 1-11. M tipi koloni
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1-Besiyeri gruplarına örnek olarak getirilen besiyerlerini incelenip adlarını, besiyeri grubunu
ve ne amaçla kullanıldığını yazınız.
2- Katı ve sıvı besiyerlerine verilen numunelerden uygun bir şekilde ekim yaparak yaptığınız
ekimi şematize ederek çiziniz.
a) Tek koloni
b) Homojen ekim
7
c) Sıvı besiyerine ekim
d) Yatık besiyerine ekim
4- Laboratuvara hazır olarak getirilen kültürlerde koloni görünümlerini değerlendirerek,
hangi tip koloni olduğunu çiziniz.
a)
b)
c)
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA: Klinik Mikrobiyoloji
Manual of Clinical Mikrobiology (Çev Edit. AC Başustaoğlu). Dokuzuncu baskı.
Atlas Kitapçılık, Ankara, 2009, cilt 1, s.187-190.
2. Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, Đzmir,
2009, s.97-123.
3. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A: Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim
Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 2003, s.44-54.
4. Winn Jr. W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G,
Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostik Microbiology, Sixth edition,
Lippincott Williams and Wilkins, s.29-38.
8
B-Mikrobiyolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerinin öğrenilmesi
Basit boyama ve Gram boyama yöntemlerinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bilgi
Bu dersi alan öğrenciler;
Bakteri boyalarını sıralar.
Basit boyama yönteminin basamaklarını sıralar.
Gram boyama yönteminin basamaklarını sıralar.
Basit boyama yöntemini basit boyama kılavuzuna uygun şekilde
uygular.
Gram boyama yöntemini Gram boyama kılavuzuna uygun şekilde
uygular.
Basit boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak
değerlendirir.
Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik
olarak değerlendirir.
Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Gram boyama seti
Mikroskop
Lam
Öze
Bek
Gram pozitif kok (Örn; Stafilokok ya da Streptokok) üremiş kültür
plakları
Gram negatif basil (Örn; E. coli) üremiş kültür plakları
Giriş
Mikrobiyolojik tanıda morfolojik incelemeler büyük değer taşır. İyi bir incelemenin en
azından tanıya doğru yönlendirici değeri vardır. Morfolojik incelemelerden olan boyama
işlemi, bakterilerin identifikasyonu ve sınıflandırılmalarında önemli bir işlemdir. Bunlar içinde
en sık kullanılanlar şunlardır;
123456-
Basit boyama
Gram boyama
Asido rezistan boyama (Ehrlich - Ziehl-Neelsen boyama)
Metilen mavisi boyama
Giemsa boyama
Çini mürekkebi boyama
9
7- Laktofenol pamuk mavisi boyama
8- Spor boyama
9- Kapsül boyama
10- Neisser boyama
Bütün boyama işlemlerinden önce preparatın hazırlanıp, uygun yöntemle tespit edilmesi
gerekir.
Preparatın Hazırlanması: Preparatlar doğrudan hastalık örneklerinden, kültürlerden ya da
deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanır. Bunun için temiz lamlar kullanılır.
Sıvı materyalden preparat hazırlanıyor ise öze ya da otomatik pipet yardımı ile bir damla
örnek alınarak lamın orta kısmına bırakılır. Öze yardımı ile dairesel hareketler ile küçük bir
bozuk para büyüklüğünde yayılır. Bakteri kolonisi ya da katı bir klinik materyalden preparat
hazırlarken önce bir damla steril serum fizyolojik lamın ortasına damlatılır. Örnek öze ile
alınarak damlanın kenarında ezilir. Dairesel hareketlerle sıvı ile karışması sağlanır. Preparat
oda ısısında kurumaya bırakılır.
Tespit Yöntemleri: Preparatın tespit edilmesinde amaçlanan, üzerindeki materyalin lama
yapışmasını sağlamaktır. Üç yöntemle tespit işlemi yapılabilir:
1- Havada kurutularak tespit: En az güvenilir olanıdır. Hazırlanan preparat 2-18 saat
bekletilmelidir.
2- Alevde tespit: En çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan sonra
materyalli yüzü yukarı gelecek şekilde bir ucundan tutulur. Lamın alt yüzü yanmakta olan
alevin mavi kısmına, yukarıdan aşağıya doğru yavaş yavaş hareket ettirilerek yalatılır.
3- Kimyasal maddeler ile tespit: Alevde tespit edildiğinde morfolojisini kaybedebilecek
materyali (protozoa, lökosit, eritrosit, epitel hücresi vs.) tespitte kulanılır. Etil alkol (8-10
dakika), metil alkol (3 dakika) ve aseton (5 dakika) tespit işleminde en çok kullanılan
kimyasallardır. Bu maddeler hazırlanan preperatın üstüne, materyal bulunan kısmını
kaplayacak şekilde dökülerek kullanılır.
Basit Boyama
Bu yöntemde, boyama için genellikle tek bir boya kullanılır ve mikroorganizmaların
morfolojileri gözlenir.
12345-
Preparat hazırlanıp tespit edilir.
Metilen mavisi, safranin veya kristal viyole gibi boyalardan birisi ile 1 dakika boyanır.
Su ile yıkanır.
Havada kurutulur.
İmmersiyon objektifi ile incelenir.
Bu boyama sonucu bakteriler, metilen mavisi ile mavi, safraninle pembe/kırmızı, kristal
viyole ile mor/lacivert boyanır.
10
Gram Boyama
Bakterilerin hücre duvar yapılarındaki farklılıklara dayalı bir boyama yöntemi olup,
bakterileri gram pozitif ve gram negatif olarak sınıflayan bir boyama yöntemidir.
Gram Boyama Becerisi Öğrenim Rehberi
ARAÇLAR: Gram boyama seti, lam, su, penset, incelenecek hasta örneği ya da bakteri
kültürü
BASAMAK
NO
1
BASAMAKLAR
Preparatı hazırlayınız. (Bakınız; preparatın hazırlanması)
Preparatı uygun yöntem ile tespit ediniz. (Bakınız; Tespit yöntemleri)
3
Preparat yatay konumda iken üzerine kristal viyole dökerek1 dakika
bekletiniz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile boya tamamen akıncaya kadar yıkayınız.
4
Preparat yatay konumda iken üzerine lügol dökerek 1 dakika bekletiniz.
5
Preparatın üzerindeki lügol solüsyonunu dökünüz.
6
Preparatın üzerine damla damla aseton – alkol dökerek dekolorizasyon
(renksizleştirme) yapınız. Bu işlemi kristal viyole tamamen akana kadar
sürdürünüz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız.
2
7
9
Preparat yatay konumda iken üzerine safranin (zıt boya) dökerek 30 saniye
bekletiniz.
Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız.
10
Preparatı oda ısısında kurutunuz.
11
Preparatı immersiyon objektifi ile inceleyiniz.
8
Bu boyamayla gram pozitif bakteriler mor, gram negatif bakteriler pembe boyanır.
Boyaların hazırlanışı:
Metilen mavisi
Kristal viyole
Lugol
Aseton – alkol
Safranin
:1,5 gr metilen mavisi, 100 ml %95’lik etil alkol
:1 gr kristal viyole, 10 ml %96’lık etil alkol, 100 ml saf su
: 1 gr kristal iyot, 2 gr potasyum iyodür, 300 ml su
:1:1 oranında %95’lik etil alkol ile %100’lük aseton karışımı
:%1’lik sudaki eriyiği
11
Asido Rezistan Boyama
Özellikle Mycobacterium'lar olmak üzere Nocardia'lar gibi hücre duvarlarında bol
miktarda lipid içeren mikroorganizmaların boyanmasında kullanılan bir yöntemdir. Bu
boyama yönteminde asit-alkole dirençli boyanan bakteriler kırmızı (karbolfuksin ile), diğer
bakteriler ve zemin mavi (metilen mavisi ile) boyanır.
Metilen Mavisi Boyama
Özellikle dışkı örneklerinde polimorfonükleer lökositlerin ve mikroorganizmaların
gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Polimorfonükleer lökositler, bakteriler ve diğer hücreler
mavi gözlenir.
Giemsa Boyama
Protozoa (Plasmodium vs.) türlerinin ve kan hücrelerinin gözlenmesi amacıyla
uygulanır. Parazitler mavi-mor renkte ve kırmızı çekirdekli olarak gözlenir. Beyaz kan
hücrelerinin çekirdekleri mor, sitoplazmaları mavi renkte görülür. Eritrositler ise açık
kahverengi olarak gözlenir.
Çini Mürekkebi Boyama
Çini mürekkebi ile boyama, en sık Cryptococcus neoformans’ ın kapsülünün
gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Çini mürekkebi kapsülü boyamadığından, siyah zemin
üzerinde mayayı çevreleyen açık renkli kapsül gözlenir.
Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama
Küf mantarlarının tanınması amacıyla uygulanır. Mavi boyanmış hifa ve spor
morfolojileri incelenir.
Spor Boyama
Spor yapan bakterilerin, sporlarının varlığını ve yerleşimini gözlemek için kullanılan bir
boyama yöntemidir. Bu yöntemle bakteri kırmızı (safranin ile), içindeki spor yeşil (malaşit
yeşili ile) boyanır.
Neisser Boyama
Corynebacterium diphteriae'larda bulunan metakromatik cisimcikleri boyamada
kullanılan bir boyama yöntemidir. Bakteriler sarı, metakromatik cisimcikler kahverengi
boyanır.
12
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1. Masalarda bulunan besiyerlerde üremiş bakteri kolonileri, basit ve gram boyama
yöntemiyle boyanıp mikroskopta incelendikten sonra şekil (kok, basil) ve renkleri (mor,
pembe) belirterek çizilecek.
Boyama: Basit boyama
Bakteri:…………………
Şekil:………………
Renk:………………
Boyama: Gram boyama Boyama: Gram boyama
Bakteri: S. aureus
Bakteri: E.coli
Şekil: ………………………
Şekil:…………………..
Renk:…………………… … Renk:………………….
Tarih
Laboratuvar görevlisinin imzası
NOT: Diğer boyama yöntemleri daha sonra yapılacak olan ilgili laboratuvar saatlerinde
uygulamalı olarak gösterilecektir.
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü baskı. Barış yayınları, İzmir, 73-76.
2. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 5561.
3. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH,Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical
Microbiology. Klinik Mikrobiyoloji. Cilt 1. 9th ed.,Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, 183184.
13
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-2
Antibiyotik Duyarlılık Testleri
Dersin Amaçları
Mikrobiyolojide kullanılan antibiyotik testlerinin neden yapıldığının
ve çeşitlerinin ve yapılışlarının öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Antibiyotik testlerinin çeşitlerini sayar
Niçin antibiyotik testi yapıldığını söyler
Testlerin yapılışını öğrenir
Beceri
Antibiyotik testlerinin değerlendirmesini yapar
Hangi testi nasıl kullanacağını bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Üreme olmuş örnek
Öze
Transport besiyeri
Müller Hinton Broth
Müller Hinton Agar
Antibiyotik diskleri
Alkol
Pens
0,5 McFarland Tüpü
Eküvyonlu çubuk
Giriş
Antibiyotiklerin mikroorganizmalarla ilişkileri çeşitli yönlerden incelenmektedir.
Bunlardan başlıcaları şunlardır:
1- Antimikrobiklerin mikroorganizmalar üzerindeki etkinliklerinin ölçülmesi
2- Vücut sıvılarındaki antimikrobik etkinliğinin ölçülmesi
3- Sağaltım sırasında vücut sıvılarındaki antimikrobik maddenin hastalık etkeni
üzerindeki etkinliğinin saptanarak dozunun ayarlanması
4- Mikroorganizmaların antimikrobiklere karşı oluşmuş dirençliliğinin saptanması
14
5- Antimikrobiklerin mikroplar üzerindeki birlikte etkilerinin saptanması
Dilüsyon (sulandırım) yöntemlerinde kural; sıvı ya da katı besiyerleri içinde
antimikrobiklerin belirli sulandırımları yapılarak mikroorganizmalarla karşılaştırılmasıdır.
Antimikrobik maddenin hangı sulandırıma kadar mikroorganizma üzerinde etkili olduğu MIC
(Minimal inhibitör konsantrasyon), MCC (Minimal sidal konsantrasyon) ya da MBC
(Minimal bakterisidal konsantrasyon) yöntemleri ile saptanabilmektedir.
Sıvı besiyerlerinde mikroorganizmalarla antimikrobikler doğrudan doğruya ilişkide
bulunduklarından sonuçlar daha duyarlı olarak bulunmaktadır. Gerek antimikrobiklerin
etkinliklerinin araştırılmasında gerekse mikroorganizmaların dirençlerinin araştırılmasındaki
çalışmalarda kalite kontrolü yapmak için antimikrobiklere karşı dirençlilik durumları bilinen
standart mikroorganizmalardan yararlanmak gerekmektedir.
Antimikrobiklerin Antibakteriyel Etkinliklerinin Ölçülmesi (MIC ve
MCC’ nin Saptanması)
Bir antimikrobik preparatın etkinliğinin ölçülmesi amacı ile kullanılmaktadır. Daha çok
sıvı ortamlarda sulandırma yöntemleri uygulanır.
Testin yapılışı:
1- Bir dizi serolojik tüp alınır.
2- İlk tüp dışındaki tüm tüplere 0,5 ml besiyeri konulur. Birinci ve ikinci tüplere
incelenmekte olan antimikrobiğin ana sulandırımından 0,5 ml konur.
3- İkinci tüpten başlayarak her seferinde 3-5 kez emip bırakmak sureti ile karıştırarak
tüpten tüpe 0,5 ml aktarmalar yapılarak çift kat sulandırmalar yapılır.
4- Sondan bir önceki tüpten 0,5 ml dışarı atılır. Son tüp besiyeri kontrol tüpü olup
buna kemoterapötik konmaz.
5- Mikroorganizmanın ana sulandırımından tüm tüplere 0,5 ml eklenir, karıştırılır,
35 C’de bir gece üremeye bırakılır.
o
6- Üremenin olup olmadığı tüplerdeki bulanıklığa bakarak anlaşılır. İlk tüplerde
antimikrobik madde yoğun olduğundan üreme görülmez.
7- Üremenin önlenmiş olduğu son tüp o antimikrobiğin mikroorganizma üzerindeki
minimal inhibitör konsantrasyon (MIC)’dur.
15
Minimal sidal etkinliğin (MCC) saptanması isteniyorsa;
a- Her iki sırada üreme göstermeyen tüplerden ayrı ayrı birer öze alınıp katı
besiyerine çizgi ekimleri yapılır
b- Bir gece üremeye bırakıldıktan sonra incelenir. Sıvı besiyerinde bulanıklık
görülmediği halde bu tüplerden yapılan pasajlarda üreme görülmesi o tüplerde
bakteriyostatik etkinliğin bulunmasına rağmen bakterisidal etkinliğin bulunmadığı anlamına
gelmektedir.
c- Antimikrobik maddenin katı besiyerlerindeki ekimlerde de üreme göstermeyen
son tüp antimikrobiğin bakterisidal (sidal=minumum sidal ) konsantrasyonudur.
d- Bir antimikrobiğin saptanan MIC miktarı o antimikrobiğin sağıltım dozları ile
sağlanabilen optimal serum konsantrasyon dozundan düşük bulunursa denenmekte olan
bakteri o antimikrobiğe duyarlı aksine MIC serum optimal konsantrasyonlarından yüksek
bulundu ise bakteri o antimikrobiğe dirençlidir.
E TEST
E test, agar difüzyon yöntemi ile mikroorganizmaların antimikrobiklere karşı olan
duyarlılıklarını kantitatif olarak ölçen ve MIC değerlerini belirten bir yöntemdir. Agarlı
besiyerine yüzeyel ekim yapılmış mikroorganizma ekiminin üzerine özel hazırlanmış belirli bir
ucundan diğer ucuna doğru giderek azalan yoğunlukta antimikrobik içeren 5x50 mm
boyutlarında ve üzeri MIC değerleri işaretlenerek oluşturulan bölüntüler bulunan inert
plastik şeritler konularak uygulanması sonuçların elips şeklinde oluşan inhibisyon zonlarının
bu bölüntülerle kesiştikleri noktadaki sayılara göre okunması temeline dayanmaktadır.
Yapılışı:
1- Bakteri süspansiyonu Mueller Hinton Agar plağına dökülür.
2- E test şeritleri plak yüzeyine yeterli aralıklarla ve radyal biçimde sıralanır.
3- Ekimler 18-20 saat 35o C de inkübe edilir.
4- İnhibisyon zonlarının şeritlerin üzerindeki bölüntülerle kesiştikleri noktalardan
doğrudan doğruya MIC değerleri okunur. Bakterinin o antimikrobiğe duyarlı ya da dirençli
olduğu belirlenir.
ALAMAR TESTİ
Bakterilerin belirli antimikrobiklere karşı MIC değerlerinin ölçülmesi için geliştirilmiş
bir deneydir. Her çukurunda bir öncekinden bir kat daha fazla antimikrobik madde içeren
disklerin bulunduğu çukurlu tablalara ayıraçlı besiyerinde süspanse edilmiş bakteri
süspansiyonlarının ekilmesi ve enkübasyondan sonra oluşan renk değişikliğine göre
sonuçların okunması temeline dayanır.
16
MİKROORGANİZMALARIN ANTİMİKROBİKLERE OLAN DİRENÇ VE DUYARLILIKLARININ
SAPTANMASI
Mikroorganizmaların antimikrobiklere karşı direnci etki spektrumları içinde
bulundukları antimikrobiğin teropatik konsantrasyonlarına karşı kazandıkları dayanıklılıktır.
Mikrobiyostatik etki: Bu etki sonucunda mikroorganizmaların üremesi durur. Çok
uzun olmayan bir süre sonra mikroorganizma antimikrobiğin etkisinden kurtarılıp yeni ve
uygun bir ortama aktarılırsa yeniden üremesini sürdürür.
Mikrobisit etki: Antimikrobik maddenin mikroorganizmanın ölümüne yol açmasıdır.
Bu mikroorganizma uygun ortama aktarılsa bile ya hiç üremez ya da bir iki pasajdan sonra
üremesi durur ve ölür.
Tüm antimikrobikler mikroorganizmalara belli yoğunluklarda ve belirli bir zaman
süreci içerisinde önce mikrobiyostatik etki gösterir. Daha yüksek yoğunluklarda ve daha uzun
süre içerisinde ise mikrobisit etki göstermektedir.
BAŞLICA DUYARLILIK DENEYLERİ
A- Sulandırım yöntemleri
1- Sıvı besiyerlerinde sulandırım yöntemleri
2- Agarlı (katı) besiyerinde sulandırım yöntemleri
B- Yayılım yöntemleri
C- Otomatik ve hızlı direnç saptama yöntemleri
A- Sulandırım yöntemleri
Rutin laboratuvar uygulamalarında sınırlı kullanılırlar. Bölünme zamanları uzun ve
üremeleri yavaş olan bakterilerde uygulanabilir. Ayrıca yayılım yöntemleri ile dirençlilik
durumları sınırda olarak saptanan bakterilerin kesin durumları sulandırım yöntemleri ile
saptanırlar.
1- Sıvı besiyerinde sulandırım yöntemleri: Genellikle Mueller Hinton buyyonu besiyeri
olarak kullanılır. Duyarlılığın saptanma yöntemleri en duyarlı yöntemlerdir. Ticari
mikrodilüsyon yöntemleri mevcuttur.
2- Agarlı (katı) besiyerinde sulandırım yöntemleri: Antimikrobiklerin sulandırımları
erimiş agarlı besiyerlerinde yapılır; tüp ya da plakalar halinde hazırlanırlar. Bir plakta çok
sayıda bakteri denenebilmesi gibi avantajı olduğu gibi MIC saptanabilmesi fakat MCC’ nin
saptanamaması gibi olumsuzlukları da vardır.
17
B- Yayılım yöntemleri
Bu yöntemin temeli incelenecek olan bakterilerin standardize edilmiş plak
besiyerlerinin yüzeylerine veya içlerine belirli yoğunluktaki süspansiyonlarda ekilmeleri;
sonra besiyerinin belirli noktalarına çeşitli yöntemlerle bırakılan standart miktardaki
antimikrobiklerin buradan yayılarak bakterilerin üzerine etkili olması ve sonuçların oluşan
üremenin önlendiği zon çapının ölçülmesi ile değerlendirilmesi şeklinde özetlenebilir. Bugün
kullanım kolaylığı bakımından en çok kullanılan kuru disk yöntemleridir.
- Duyarlılık yöntemleri yalnızca saf kültürlerden yapılmalıdır.
- Zor direnç kazanan mikroorganizmalar için duyarlılık deneyleri ile zaman
kaybedilmemelidir. Örneğin S.pyogenes için penisilin kullanımı gibi.
- Yavaş üreyen mikroorganizmalar için güvenilir olmayabilir. Bu tür bakterilerde katı
besiyerine sulandırma yöntemi ile MIC bakılmalıdır.
- Yapılan ekimin yoğunluğu zon çaplarını etkileyeceğinden uygun yoğunlukta bakteri
süspansiyonu kullanılmalıdır.
- Plaklara yapılan ekimlerde disklerin yerleştirilmesine kadar geçecek zaman çok uzun
olmamalıdır (15 dk olmalı).
- Enkübasyon sıcaklığı olarak 35 oC uygun bulunmuştur.
- Enkübasyon süresi genellikle 16-18 saat yeterlidir.
- Kullanılan besiyerlerinin nitelikleri uygulanmakta olan yöntemin gerektirdiği türde
seçilmelidir.
- Plakların biçimi, besiyerinin kalınlığı gibi faktörler antibiyogramda zonların
büyüklüğünü etkileyebilmektedir.
- Kullanılacak diskler güvenilir olmalıdır.
1- Bauer-Kirby Disk Yöntemi
En çok kullanılan yöntemdir.
Yapılışı:
1- Genellikle Mueller Hinton Agar kullanılır. Agar kalınlığı 4 mm olmalıdır.
2- Antimikrobiklere karşı duyarlılığı ölçülecek olan mikroorganizma besiyerine
standart miktarda ekilmelidir.
3- Sıralanacak antimikrobik disklerin hastalık materyaline ve soyutlanan
mikroorganizmaya göre seçilerek kullanılması gerekmektedir.
18
4- Diskler, ince uçlu bir penset yardımı ile; her seferinde pensetin ucu aleve kısaca
yalatılarak yerleştirilmelidir.
5- Diskler kenardan 15 mm ve birbirinden yaklaşık 25-30 mm uzaklıkta olacak şekilde
konulmalıdır.
6- Diskler dizildikten sonra yaklaşık 30 dakika içinde plaklar 35oC’lik etüve
konulmalıdır.
7- Bir gecelik enkübasyondan sonra disklerin etrafında oluşan zonların çapları
ölçülmelidir.
8- Dirençli, duyarlı ve orta derece duyarlı olarak sonuçlar değerlendirilir.
-DİRENÇLİ: Mikroorganizmanın söz konusu antimikrobik maddenin sağaltımda
kullanılan dozlarla elde edilen kan ve doku konsantrasyonlarına karşı dirençli olduğu
anlamına gelmektedir.
-ORTA DERECE DUYARLI: Kullanılan antimikrobik maddenin daha yüksek dozlarda
verilmesi halinde sonuç alınabileceği anlamına gelmektedir
-DUYARLI: Mikroorganizmanın aynı konsantrasyonlarına karşı duyarlı olduğunu
göstermektedir.
2- Hemoglobin redüksiyonuna dayalı çabuk yöntem:
Bauer-Kirby yönteminden farklı olarak plak besiyeri için Mueller Hinton besiyerinin
yerine kanlı jeloz kullanılır. Diğer uygulamalar aynıdır. Üreyen bakteriler hemoglobini redükte
edeceğinden inhibisyon zonlarında bakteri üremez ve buralarda kanlı jelozun rengi değişmez.
3- Direnç saptanmasında primer ekimlerle çabuk sonuç almak (Direkt yöntem)
Hastalık materyalinde yalnızca bir tür bakteri olduğu tespit edilirse hastalık
materyalinden doğrudan doğruya antibiyogram için ekim yapılabilir. Direk materyal Mueller
Hinton besiyerine yayılır ya da zenginleştirilmiş bir buyyon (beyin-kalp buyyon, triptikazlı
soya buyyon) içinde 4-6 saat zenginleştirilir ve yayılıp üzerine diskler yerleştirilir. Bu yöntem
çabuk sonuç verir fakat standardize edilemez.
4- E.J.Stokes yöntemi
Aynı plakta hastalık etkenini duyarlılığı ile aynı anda saptanan standart kökenin
duyarlılıklarının karşılaştırmalı olarak değerlendirilmesine dayanan bir yöntemdir. Standart
ile aynı anda çalışıldığından inhibisyon zonlarını etkileyecek çeşitli faktörlerin etkinliği en aza
indirilmiş olur. Daha güvenilir fakat zor bir yöntemdir.
19
5- Hemophilus Genusu ve diğer güç üreyen bakterilerde disk yöntemi ile direnç
saptama
Bauer Kirby yöntemi gibidir fakat besi yerine %1 hemoglobin ve %1 isovitaleks
eklenir. Karbondioksitli ortamda enkübe edilir.
C- Otomatik ve hızlı direnç saptama yöntemleri:
Ticarette
mikroorganizmaların
hızlı
identifikasyonunun
yanında
bu
mikroorganizmaların antimikrobiklere dirençlerini ölçen otomatik mikroyöntemler ve bunları
uygulayan aygıtlar geliştirilmiştir. Bunu için etken saf kültür halinde üretilmiş olmalıdır ve
uygun konsantrasyonda alınmalıdır. Aygıt tarafından sonuçlar otomatik olarak okunur ve MIC
değerleri ile birlikte değerlendirilerek sonuç verilir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- Kirby - Bauer Disk Difüzyon Yöntemi ile antibiyogram hazırlayınız.
2- Önceden hazırlanmış antibiyotik duyarlılık testini inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Çotuk A. (2003) Genel Mikrobiyoloji Laboratuar Yöntemleri. Nobel Tıp Kitabevleri,
İstanbul.
3. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları,
İzmir.
4. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 5561.
20
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-3
Deri, Mukoza ve Yumuşak Doku Örneklerinin Mikrobiyolojik
İncelenmesi
Dersin Amaçları
Deri, mukoza ve yumuşak doku örneklerin mikrobiyolojik
incelemesinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Deri, mukoza ve yumuşak doku mikrobiyolojik örneklerini
söyleyebilir
Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir
Beceri
Mikrobiyolojik örnek isimlerini bilir
Deri, mukoza ve yumuşak doku örneklerinde hangi testi
kullanacağını bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Lam
Gram boyama seti
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Yara/abse örneği
Tiyoglikolatlı besiyeri
Hazır preparatlar
Serum fizyolojik
Besiyeri bulunan ve bulunmayan eküvyon çubuğu
Giriş
İNCELENEN ÖRNEKLER
-
İNCELEME YÖNTEMLERİ
Yara
Abse
Doku parçası
- Mikroskopi
- Kültür
21
Abse, Yara Kültürü ve Doku Örneklerinin İncelenmesi
1- Örnek alınması
2- Transport
3- Mikroskopik inceleme
-
Gram/ARB boyama
4- Kültür
1- Örnek Alınması
- Yara yüzeyleri sıklıkla mikrobiyota bakterileriyle kontaminedir.
- Bu yüzden pamuk silgeçle alınan örnekler sıklıkla gerçek enfeksiyon etkenini göstermez.
- Doku biyopsisi, yara drenajından yapılan küretaj veya yaradan ponksiyonla alınan sıvı
veya püy, inceleme için uygun örneklerdir.
-
Örnek alınacak bölge % 70’lik etil veya izopropil alkolle dekontamine edilir.
Alınan materyal steril bir kaba konarak laboratuvara gönderilir.
Eğer enjektör ile materyal alınamazsa yara yüzeyinden kültür yapılması gerekebilir.
Bu işlem için genellikle eküvyon çubukları kullanılır.
Yüzey temizliği dikkatlice yapıldıktan sonra ya yara ağızları steril eldivenli başparmakla
işaret parmağı yardımıyla birbirinden ayrılmalı ya da steril bir bistüriyle küçük bir
insizyon yapıldıktan sonra diğer elle de steril eküvyon yaranın içine daldırılarak örnek
alınmalı ve en kısa zamanda laboratuara ulaştırılmalıdır.
- Yara kenarlarının yakınındaki sağlam deriye eküvyonu değdirmemeye dikkat
edilmelidir.
- Açık Yaralarda:
- Gerekli temizlik yapıldıktan sonra eküvyonla yara üzerindeki irinli kısım silinip
atıldıktan sonra ikinci bir eküvyonla yara tabanına da sürterek irinli örnek alınıp
laboratuara gönderilir.
2- Transport
-
Eğer materyallerin laboratuara ulaşması yarım saatten uzun sürecekse taşıyıcı besiyeri
içinde gönderilir.
Eğer çok az miktarda materyal alınırsa enjektör, kapalı ve zarar vermeyecek bir şekilde
gönderilip laboratuar da bu konuda bilgilendirilir.
Laboratuarda kültür için gönderilen enjektör ve içindeki materyal sıvı besiyeri ile
yıkanarak kültüre alınır.
Fiksatif içinde gönderilen materyaller kesinlikle reddedilir.
22
-
-
Kronik yaralardan eküvyonla alınan örneklerde etkenin saptanması daha zor
olacağından yara çevresi temizliği yapıldıktan sonra yara kenarındaki sağlam deriden
bir enjektör batırılarak yara tabanına doğru ilerletilir.
Enjektör ucunun bulunduğu yerin kenarlarından hafifçe baskı yapılarak o bölgeye
piyojenik materyalin toplanması sağlanır.
Enjektöre mümkün olduğunca fazla miktarda sıvı çekilerek laboratuara gönderilir.
3- Mikroskopik inceleme
-
Gelen tüm örneklere Gram boyama yapılır.
-
Tüberküloz şüphesi varsa ARB boyama da yapılır.
-
Örnekten yapılan boyamada epitel hücreleri, lökositler, bakteri morfolojisi,… gibi
şeyler not edilir.
4- Kültür
- Gelen numunelerden aerop ve anaerop ekimler yapılır.
- Hem nonspesifik, hem de spesifik besiyerine ekim yapılır.
- Eküvyonla alınan örnekler anaerop ekim için uygun olmadığından bunlardan sadece
aerop ekimler yapılır.
-
Enjektörle ağzı kapalı olarak gönderilmiş örnekler anaerop ortama da ekilir.
-
Bunlar aynı zamanda tiyoglikolatlı besiyerine de ekilerek gerektiğinde pasaj yapılır.
- Doku parçaları steril bistüri ile parçalanıp veya steril havanla ezilip üzerine besiyeri
aktarılarak, ya da steril homojenizatörle parçalanıp besiyeri eklenerek ekilebilir.
Şekil 3-1. Steril bistüri tekniği
23
Şekil 3-2. Havan tekniği
Şekil 3-3. Homojenizatör tekniği
Etken olarak üreyebilecek mikroorganizmalar:
Aerop ve fakültatif anaeroplar
Providencia
KNS’ler
stuartii
S. aureus
Beta hemolytic
Proteus spp.
streptokoklar
Acinetobacter
baumannii
Enterococcus spp.
Pseudomonas
S.viridans
aeruginosa
S. anginosus
Stenotrophomona
Corynebacterium
S. maltophilia
spp.
Sphingobacterium
B. cereus
multivorum
Escherichia coli
Anaeroplar
Serratia spp.
Peptostreptococcus
Klebsiella spp.
spp.
Enterobacter spp.
Clostridium spp.
Citrobacter spp.
P. acnes
Morganella
B. fragilis
morganii
Prevotella spp.
Fusobacterium
necrophorum
Veillonella spp
Nadir rastlanan
aerobik
veya
zoonotik etkenler
Actinobacillus
actinomycetemco
mitans
Aeromonas spp.
Bacillus anthracis
Capnocytophaga
spp.
Chromobacterium
violaceum
24
Eikenella
corrodens
Erysipelothrix
rhusiopathiae
Francisella
tularensis
Haemophilus spp.
Kingella kingae
Pasteurella
multocida
Streptobacillus
moniliformis
Vibrio vulnificus
Mayalar
C. albicans
C. krusei
C. parapsilosis
-
-
Direkt boyamada lökosit ve bakteri görülmüş, kültür sonucunda da bununla uyumlu
üreme olmuşsa üreyen bakteri etken olarak kabul edilip identifikasyon ve duyarlılık testi
yapılır.
Direkt boyamada bakteri görülmüş ve aerop kültürde üreme olmamışsa anaerop
etkenden şüphelenilir.
Eğer bol miktarda epitelyum hücresi ve birden fazla bakteri ürerse mikrobiyota
elemanlarıyla kontaminasyon düşünülür.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- Önceden hazırlanmış preparat örneklerini inceleyiniz.
2- Laboratuarda bulunan dersle ilgili ekim yapılmış besiyerlerini inceleyiniz.
Kaynak
1. Bowler, P. G., B. I. Duerden, and D. G. Armstrong. 2001. Wound microbiology and associated
approaches to wound management. Clin. Microbiol. Rev. 14:244–269.
25
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-4
Kan, Kemik İliği ve Doku Örneklerinin Mikrobiyolojik İncelenmesi
Dersin Amaçları
Kan, kemik iliği ve doku örneklerinin mikrobiyolojik incelemesinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Kan, kemik iliği ve doku örneklerinin mikrobiyolojik örneklerini
söyleyebilir
Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir
Beceri
Kan, kemik iliği ve doku örneklerin Mikrobiyolojik örnek isimlerini bilir.
Mikroorganizma örneklerinde hangi testi kullanacağını bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Lam
Giemsa boyası
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Serum örneği
Tüp
Pipet ve pipet ucu
Brucella antijenleri
Rose Bengal Testi
Hazır preparatlar
Serum fizyolojik
Giriş
Bakterilerin kanda bulunması durumu çeşitli şekillerde görülür.
SEPTİSEMİ: Ateş ,üşüme ,titreme ve taşikardi ile seyreden bakterilerin kanda fagositler
tarafından temizlenemiyecek sayıda bulunmaları durumudur.
BAKTERİYEMİ: Bakterilerin kanda bulunması halidir.
-Geçici bakteriyemi de bazı zorlamalar sonucunda (diş fırçalamak,ıkınma ) flora
bakterilerinin kanda bulunması söz konusudur.
-İntermittent bakteriyemi vücudun belli bir yerinde lokalize enfeksiyonlardan
(abse,ampiyem..) zaman zaman kana geçmeleridir.
26
-Sürekli bakteriyemi ise bakterilerin kan ile doğrudan ilişkili olabilecekleri tipteki
enfeksiyonlarda (bakteriyel endokardit,intraarteriyel enfekte katater..) oluşur.Sağlıklı
kimselerde kana geçen bakteriler 30-45 dk içinde dalak ve karaciğerin fagositleri tarafından
ortadan kaldırılır.
Örneklerin İncelenmesi
Kandaki bakterilerin ortaya çıkartılabilmesi için kullanılan temel yöntem kan kültürü
(hemokültür)’ dür. Kan içerisinde bulunabileceği düşünülen bakterilere göre seçilen
besiyerlerine yapılan ekimlerin izlenmesi suretiyle bakteriler üretilebilir.
Kandan soyutlanabilecek başlıca bakteriler: E.coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus,
Pseudomonas, S.aureus, S.epidermidis,
Daha az sıklıkla soytlananlar : Corynebacterium, Citrobacter, Serratia, Aeromonas,
Acinetobacter, Brucella
Nadir olarak soyutlanabilenler: Shigella, P.multicida, F.tularensis
Kan kültürü yapılırken dikkat edilecek noktalar:
1- Kan olabildiğince kemoterapiye başlamadan önce alınmalıdır.
2- Bakterilerin kanda en çok bulundukları zaman ateş yükselmeden hemen önceki zamandır. O
zaman alınmalıdır.
3- Bakteriler kanda hastalığın erken dönemlerinde, ilk haftalarında çok sayıda bulunur.Bu
dönemlerde alınmaya dikkat edilmelidir.
4- Ekilecek olan kan ne kadar fazla miktarda ve gün içinde ne kadar çok kez alınırsa
mikroorganizmaların üretilme olasılığı o kadar artar. Gün içinde belirli aralıklarla farklı
venalardan 3 kez 10 ml kan alınması başarı şansını artırır. Bir kez kan alınıp bakteri ürememesi
hemokültür sonucunun olumsuz kabul edilmesi için yeterli değildir.
5- Hemokültür sonucunun başarı şansı ekilen kan miktarının ekildiği besiyerine oranına da
bağlıdır. Bir kısım kanın 9 kısım ya da en azından 5 kısım besiyerine ekilmesi koşuldur.
Kullanılan besiyerlerinin niteliği: İlke olarak bir aerop bir de anaerop için iki besiyeri
kullanılmalıdır. Aerop ekimler için triptik ya da triptikas soya buyyonu, Columbia buyyonu,
beyin kalp enfüzyon buyyonu, Brucella buyyonu gibi besiyerlerine ekilir. Anaerop ekimler için
içerisinde %0.05 cysteine bulunan Columbia buyyonu, redüklenmiş beyin kalp infüzyon
buyyonu, thioglycollate’lı buyyon kullanılır. Kanın ekileceği besiyerine antikoagülan koyulmalı
ve ekim hasta başında yapılmalıdır.
27
Kan Kültürü Yöntemleri
Hemokültür için iki yöntem kullanılır:
1- Kanı bir antikoagülan içine alıp laboratuvara iletmek ve ekimleri orada yapmak tekniği:
Bu yöntem maniplasyon sayısını artırdığından kontaminasyon riskinide artıracağında
çok zorunlu durumlar dışında tercih edilmemektedir.
2- Hasta başında ekim yöntemi: Hastanın yanına besiyeri ile gidilir ve orada ekim yapılır.
Tercih edilen yöntem budur.
Yöntem; En iyisi ön kol venalarından kan almaktır.
1- Hastanın kolu sabit bir yere dayatılır.
2- Üst kola lastik bağlandıktan sonra venalar incelenir.%70 lik alkol ile iyice silinerek
temizlenir. Sonra yeni bir tampon ile %2 lik iyot tentürü ya da povidonlu iyot eriği sürülerek
kuruması beklenir. Sonra %70 lik alkol ile iyot silinir.
3- Kan alacak kimse de ellerini aynı şekilde dezenfekte etmelidir.Steril eldiven de kullanılabilir.
4- Besiyerinin lastik tıkaçlarıda iğne sokulacağı yerler dezenfekte edilmelidirler.
5- Hastadan 10-15 ml kan alınır, alındıktan sonra deri %70 lik alkol ile silinir ve bir kuru tampon
bastırılır.
6- Alınan kan önce anaerop sonra aerop besiyerine ekilir. Köpürtmemeye dikkat edilmelidir.
Ekilen kan oranının besiyeri miktarına oranı 1/10 ve en az 1/5 olmalıdır.
7- Bebeklerden kan vena jugularisten alınmalıdır.
Kan kültürlerinin uygun atmosfer koşullarında üretilmesi: İdeal olarak tüm kültürlerin
%5-10 CO2’li ortamda birinin aerop diğerinin anaerop olarak üretilmesi uygundur. Ticarette
hazır olarak satılan besiyerleri hafif vakumlu ortamda CO2 içerir.
Şekil 4-1. Kan kültürü yöntemi
28
Kan kültürlerinin izlenmesi ve incelenmesi:
1- Genellikle kan kültürleri 35-360 C lik etüvlerde inkübe edilir
2- Kan kültürlerinde üreyen bakterilerin üreme zamanları farklı olduğu için ilk hafta her gün
ikinci haftadan itibaren iki günde bir incelenir.
3- Makroskopik incelemenin önemi büyüktür.
Mikroskopik inceleme ve aktarma ekimleri: Amaç kontamisyona yol açmayacak şekilde
çok dikkatli çalışmaktır. Ticaretten sağlanan ağzı lastik tıkaçlı hemokültür şişelerinin bu
tıkaçları %70 lik alkol ile iyice dezenfekte edilip steril enjektörler batırılarak 0.5 ml örnek
alınmalıdır. Preparat hazırlanarak gram boyama yapılır.
Şekil 4-2. Kan kültürlerinin ekimleri
Yapılan boyamada hiçbir bakteri görülmez ise;
a- Bir yandan hemokültür ekiminin inkübasyonuna devam edilir.
b- Bir kanlı plak besiyerine tek koloni ekim yapılır. Plaklar 37 0C de bekletilmekte iken her
gün incelenirler. 48 saate üreme görülmez ise atılır. Esas hemokültür ekimleri 14 gün bekletilir
ve her gün makroskopik olarak üreme olup olmadığına bakılır. Üreme olmazsa 14.gün aynı
işlemler yapılıp çıkarılır. Haemophilus, Eikenella, Cardiobacterium, Brucella düşünülen
kültürler bir ay tutulur.
Yapılan incelemelerde Gram preparatında bakteriler saptanırsa bunların morfolojilerine
göre hareket edilir. Difteroid bakteriler, Bacillus, Coagulase olumsuz stafilokoklar ve birden
fazla bakteri türünün üremesi genellikle kontaminasyon kabul edilir. Aynı etkenlerin tekrar
üremesi halinde hastalık etkeni olarak kabul edilebilir.
Gram olumsuz bakteriler görülmüş ise;
-
Bir kanlı plak yüzeyine tek koloni ekim yapılır.
-
Bir McConkey agara tek koloni ekimi yapılır.
-
Brucella kuşkusu var ise Brucella agara ekim yapılır.
29
-
Haemophilus kuşkusunda Çikolata agara tek koloni ekimi yapılır.
Kültürler 35-360C de enkübe edilirler. Brucella ve Haemophylus için CO2 li atmosfer
uygulanmalıdır. Üreyen bakterilere göre identifikasyon yapılır.
Şekil 4-3. Brucella spp. makroskopik ve mikroskopik görüntüsü
Gram olumlu koklar görüldü ise;
-
Streptokok, Stafilokok, Enterokoklar olabilir. Hemokültür şişelerinin makroskobik
incelemelerinde jelifikasyon görülmesi Staphylococcus aureus lehine anlamlıdır.
-
Kanlı jeloz plak yüzeyine tek koloni ekim yapılır. Bu ekimin yoğun yerine bir basitrasin
diski birde optokin diski koyulur.
24 saatte incelenen ekimlerden oluşan kolonilerin hemolitik özellikleri ve yerleştirilmiş
olan disklerin durumu incelenir.
Şekil 4-4. Gram olumlu kokların mikroskopik görüntüsü
Gram olumsuz koklar görülmüşse;
Neisserialar söz konusu olabilir. Bu durumda:
-
Bir kanlı plak yüzeyine ekim
-
Bir çikolatamsı jeloza veya Thayer Martin agara yüzeyel ekim yapılır.
Her ikiside 35-36 0C de %5-10 CO2 li ortamda enkübe edilir. Üremeden sonra koloniler
incelenir. Oksidaz deneyi yapılır. Neisserialar oksidaz olumludur.
30
Şekil 4-5. Neisseria spp. mikroskopik görüntüsü
Gram olumlu çomaklar saptanmışsa;
- Sporsuz silindirik veya bir iki ucu şişkinlik gösteren çomaklar ya da koklara yakın boylarda
çoğu ikili bakteriler görülmüş ise Listeria düşünülmeli ve buna yönelik identifikasyona
gidilmeli.
- Aerop sporlu basillerin çoğu kontaminanttır. Klinikte uygun ise nadiren Bacillus anthracis
soyutlanabilir.
- Difteroid görünümündeki bakterilerinde çoğu floradan bulaşmış Corynebacteriumlar
olabilirse de fırsatçı enfeksiyon koşulları varsa bunların göz ardı edilmemesi gerekir.
Şekil 4-6. Gram olumlu çomakların mikroskopik görüntüsü
Anaerop hemokültür ekimlerinin incelenmesi
-
Anaerop bakteriler söz konusu ise genelde 24-48 saat içinde üreme gösterirler.
Makroskopik görünümde bulanıklık saptanır.
-
İlk üremelerinde bulanıklık saptanmamış, yapılan preparatlarda bakteri görülmemiş ve
ikinci olarak yapılan bu aktarma ekimlerinde de 24-48 saat içinde üreme göstermemiş
olan hemokültürler olumsuz olarak bildirilir.
-
İlk 48 saat içinde üreme olduysa ve aerop kültürde üreme olmadıysa üreyen bakteriler
anaerop olduğu anlaşılır.
31
-
Hem aerop hemde anaerop kültürlerde üredi ise bakterilerin morfolojileri de aynı ise
fakültatif anaerop bakteriler olabilecekleri düşünülür.
Kandan soyutlanabilecek anaerop bakteriler: Bacteroides fragilis, Fusobacteriumlar,
Peptococcuslar, Clostridiumlar gibi bakteriler vardır.
CASTANEDA NIN SIVI-KATI (DİFAZİK) BESİYERLERİNDE HEMOKÜLTÜR YÖNTEMİ
Sıvı besiyerlerine yapılan ekimlerden katı besiyerlerine yapılan aktarmalarda
kontaminasyon riski olduğundan Castenada denilen aynı şişede sıvı ve katı besiyerinin birlikte
kullanma yöntemi yapılmıştır. 5 ml kan sıvı kısma ekilip karıştırılır. Her gün sıvı besiyeri katı
kısmın üzerine yaydırılıp doğrultularak katı besiyerine ekim yapılır. Her gün kolonilerin oluşup
oluşmadığı şişe açılmadan takip edilir.
Şekil 4-7. Castaneda difazik besiyeri
HÜCRE ERİTME VE YOĞUNLAŞTIRILMALI KAN KÜLTÜRÜ YÖNTEMLERİ
Özellikle az sayıda bakteri bulunması ve bu bakterilerin hücre içine yerleşmeleri halinde
hastadan alınan kan örneğindeki hücrelerin eritilmesi ve sonra santrifüjlenerek ya da filtreden
süzülerek yoğunlaştırılması temeline dayanan eritmeli çöktürme veya eritmeli süzme
yöntemleri kullanılır.
Basit olarak steril bir tüpe alınan 10 ml kan üzerine iki kat steril saf su eklenerek
karıştırılmak ve bekletilmek sureti ile hücreler eritilebilir.
Kemik İliğinin Bakteriyolojik İncelenmesi
Kan kültürü ile olumsuz sonuç alınan hastalarda kemik iliği olumlu sonuç verebilir.
Kemik iliği incelenmek amacı ile ya sternumdan ya da ilik kemikten alınabilir.
Sternumdan alınması:
Yatmakta olan hastada manubrium sterni altındaki sternum seksiyonu üzerindeki deri önce
tentürdiyot sonra alkol ile silinir,orta çizgiden sternuma batırılır.İğneni deriden sonra kemiğin
32
ön laminasını delerek bir boşluğa girdiği hissedilir.Kemik iliği aspire edilir. 0-5 ile 1.5 ml ilik
almak mümkündür.
Örnek alındıktan sonra,
-
Yapılan preparatların Gram ve Gıemsa ile boyanıp incelemeleri ile etken bakterilerin
görülmesi olasılığı vardır.
-
Bir kanlı agar ve birde çikolatamsı agar plak besiyerlerine ikişer damla kemik iliği
damlatılıp yaydırılır. 35-37 0C %5-10 CO2 li ortamda inkübe edilir.
-
Bir tiyoglikolatlı buyyonada ekim yapılır.
-
Brucella kuşkusu varsa Brucella besiyerine de ekim yapılır.
-
Mantar kuşkusuna aynı şekilde Saboruaud besiyerine ekim yapılır
-
Tüberküloz kuşkusunda ekim için Middlebrook 7H-9 buyyona ekim yapılır.
Şekil 4-8. Kemik iliğinin alınması
Otomatik Kan Kültürü Sistemi ve Yöntemleri
Bu sistemler sayesinde hemokültür sonuçlarının daha çabuk daha sağlıklı alınmasında
ve özellikle kontaminasyonların önlenmesinde ilerleme kaydedilmiştir. Üretilen bakterininde
çeşitli otomasyon sistemleri ile identifiye edilip antibiyogramınn yapılması septisemi gibi
olaylarda klinik başarıyı artırmıştır. Bu amaçla kullanılan bazı ticari sistemler:
1- BACT/ALERT kan kültürü sistemi: Bunlarda geniş üretme özelliği bulunan besiyeri var
olup 10 ml kan alabilecek kapasitededir. Üreyen mikroorganizmalar CO2 oluştururlar;
her şişenin tabanında CO2 e duyarlı bir ayıraç bulunmakta olup bu kan ve besiyerinin
bulunduğu bölümden tek yöne geçişe izin verir. CO2 oluştuğunda ayracın rengi yeşilden
sariya döner. Şişelerin yerleştirildiği aygıt otomatik olarak karıştırıcı enkübatördür ve her
10 dk bir her şişe için özel diyotlardan salınan bir ışın şişenin endikatörüne yöneltir.eğer
yetrli CO2 oluşup endikatörün rengi değişmiş ise aygıta bağlantılı olan bilgisayarda o
şişenin kodunu belirten bir sinyal alınır.
33
2- BACTEC 9440/9120 kan kültür sistemi: İnkübasyon, çalkalama ve yerleştirilme şekli
aynıdır. Bactec sisteminde şişelerde yeterli CO2 oluşması halinde şişede bulunan
ayraçtan bir florasansın çıkması bunun ışığa duyarlı bir diyot ile şişenin barkodu ile
birlikte her 10 dk bir okunması ve bilgisayar sistemine aktarılmasıdır.
3- Difco- Extra Sensing Power (ESP) Kan Kültürü Sistemi: Bu sistemin diğerlerinden
farklılığı CO2 oluşumu manometrik olarak ölçülmektedir. Şişe içerisindeki gazların hem
kullanımı hem de oluşumu ölçülebilmekte ve gerek H2 gerekse O2’ nin varlıklarındaki
değişiklikle, CO2’ deki değişikliklerle birlikte izlenebilmektedir.
4- Vital Kan Kültürü Sistemi: Temel olarak üretme ve çalkalama işlevi BACTEC sistemine
benzer. Mikroorganizmalarca oluşturulan CO2, besiyeri içerisindeki bir floresan molekülü
etkileyerek ortaya çıkan floresans ışınlandırma sistemi ile bilgisayara aktarılarak
değerlendirilir (biomerieux- Vitek)
5- Oxoid Signal Sistemi: Yine CO2 oluşturulmasının saptanması temeline dayanır. Özel
besiyeri şişelerine 10 ml kan ekimleri yapıldıktan sonra ucunda iğnesi bulunan ve sinyal
odacığı adı verilen ikinci bir parça iğnesi, besiyeri sıvısının düzeyini aşacak kadar itilerek,
besiyeri şişelerindeki CO2 basıncını ölçer.
6- SEPTİ-CHECK Kan Kültürü Sistemi: Difazik besiyeri sistemine dayalı bir sistemdir. Birinci
şişede geniş üretme kapasiteli bir sıvı besiyeri vardır. İkinci şişenin içerisinde 3 yüzeyli
plastik bir parça bulunmakta olup, bu yüzeylerden birisinde çikolatamsı agar, ikincisinde
McConkey Agar ve üçüncüsünde de malt agar besiyerleri bulunmaktadır. Sıvı
besiyerinde üreme olduğunda katı besiyerlerinde de oluşan oluşan koloniler incelenerek
identifiye edilirler (Roche-Diagnostic).
Tanı Yöntemleri
Brusella enfeksiyonunun serolojik tanısında kullanılan aglutinasyon testleri;
Rose Bengal testi:
Lam aglutinasyon testidir. Hızlı tarama amacı ile kullanılır. Antijen: rose bengal boyası ile
özel teknik ile boyanan Brucella abortus bakterilerinin tamponlu tuzlu sudaki standart
süspansiyonlarıdır.
Yapılışı: Rose bengal latex test kartlarına bir kuyucuğa bir damla hasta serumu damlatılır. Rose
bengal antijeni iyice karıştırılarak serumun üzerine damlatılır ve bir kürdan ile iyice karıştırılır.
Elde çevirmeli haraketler yapılarak 4 dakika çevrilir. Sonuçta iri tanecikli çökelti oluşursa
olumlu, ince tanecikli çökelti oluşursa kuşkulu, homojen görüntü olumsuz olarak
değerlendirilir.
34
Şekil 4-9. Rose Bengal testi
Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi):
Antijen olarak B. abortus S99 ya da B. melitensis antijenleri kullanılır. Hem B. abortus
hem de B. melitensis antikorları tespit edilebilir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır.
1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Rose Bengal testi
kuvvetli pozitif olduğu halde, Wright testi negatif veya zayıf reaksiyon gösteriyorsa “Blokan
antikorlardan” şüphelenilir. Blokan antikorların varlığı Coombs testi veya enzim immunoassay
ile tespit edilir.
Yapılışı:
1- Tüp taşıyıcısına 10 adet tüp sıralanır. Bunlardan birincisine 0.9 diğerlerine 0.5 er ml
fizyolojik tuzlu su dağıtılır.
2- Birinci tüpe hasta serumundan 0.1 ml konur. Yeni bir pipet ile birkaç kez karıştırıldıktan
sonra bu tüpten 0.5 ml ikinci tüpe aktarılır. Aynı pipet kullanılarak bu kez aynı şekilde
ikinci tüpten üçüncüye ve bu şekilde sondan bir önceki tüpe kadar tüpten tüpe 0.5 er
ml aktarılır. Bu tüpten 0.5 ml dışarı atılır. Son tüpe serum konmaz (Antijen kontrol
tüpü).
3- Antijen süspansiyonu iyice karıştırıldıktan sonra tüm tüplere (kontrol tüpü dahil) 0.5 er
ml antijen dağıtılır. Bu işlemle tüpteki serum serum sulandırımları birer kat artmıştır.
4- Tüpler çalkalanarak karıştırılır. 37oC de 48 saat bekletildikten sonra değerlendirilir.
5- Önce kontrol tüpünde aglütinasyon olup olmadığına bakılır. Sonra ilk tüpten
başlanarak tüpte aglutinasyon olup olmadığı kontrol edilir. İlk Tüp sulandırıma göre
1/80, 1/160, 1/320… şeklinde pozitiflik belirlenir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler
anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar
edilmelidir.
Brucella tanısında kullanılabilecek diğer serolojik testler; Spot test, ELISA ile IgG ve IgM
türü antikorların tespit edilmesi, kompleman birleşme deneyi ya da radioimmunoassay olarak
sıralanabilir.
35
Şekil 4-10. Wright testi
Giemsa ile boyama:
a- Yayma kan preparatlarının Giemsa ile boyanması: (Kan hücreleri ve Plasmodium için)
1- Temiz bir lam üzerine bırakılan bir damla kan, bir lamel ya da düzgün bir lam aracılığı ile
yayılıp havada kurutulur.
2- Metanol ile 2-3 dakika ya da saf etil alkol ile 5 dakika tutularak tespit edilir. Preparat saf
su ile yıkanır.
3- Ticari boya 1/10 oranında sulandırılır. Tespit edilmiş ve saf su ile yıkanmış preparatın
üzerini kaplayacak şekilde bu boyadan konur. 30 dakika bekletilir.
4- Bu süre sonunda saf su ile yıkanan preparatlar havada kurutulur. İmmersiyon objektifi
ile incelenir.
b- Kalın damla preparatlarının Giemsa ile boyanması: (Plasmodium araştırılması amacı ile)
1- Temiz bir lam üzerine büyükçe bir damla kan konup 1-2 cm çapında yayılır. Havada
kurutulur. Kurutma süresi ne kadar uzun olursa okadar iyidir.
2- Bu preparatlarda eritrositlerin parçalanıp hemoglobinin uzaklaştırılması istenildiğinden
preparatlar tespit edilmez. Bunun için üzerine damla damla saf su damlatılır.
Hemoglobinin suya geçip akıp gittiği izlenir. Bu işlem preparatın rengi açık pembe
oluncaya kadar sürdürülür.
3- Preparatın üzeri boya ile kaplanır. Bir saat bekletilir. Süre sonunda damla damla saf su
dökülerek preparat yıkanır. Eğik durumda süzülerek havada kurutulur ve immersiyonla
incelenir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1234-
Önceden hazırlanmış preparat örneklerini inceleyiniz.
Laboratuarda bulunan dersle ilgili ekim yapılmış besiyerlerini inceleyiniz.
Rose Bengal ve Wright testlerini inceleyiniz.
Preparat hazırlayarak Giemsa boyaması yapınız.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
36
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-5
Solunum Yolu Örneklerinin Mikrobiyolojik İncelenmesi
Dersin Amaçları
Solunum yolu örneklerinin mikrobiyolojik incelemesinin öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Solunum yoluna ait mikrobiyolojik örnekleri söyleyebilir
Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir
Beceri
Solunum yolu örneklerinin işlemlerini yapabilir ve incelemelerini
yaparak raporunu yazabilir.
Etken mikroorganizmaların örneklerde nasıl inceleneceğini bilir.
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Lam
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Hazır preparatlar
ÖRNEKLERİN İNCELENMESİ
1- Boğaz Kültürlerinin İncelenmesi
Farenksin bakteriyel enfeksiyonlarının çoğu Grup A Streptococcus (S. pyogenes)
tarafından gelişir. Farenjit yapabilen diğer etkenler arasında Arcanobakterium hemolyticum,
Corynebacterium diphteriae, B. pertussis, Neisseria gonorrhoeae, Clamydia pneumoniae ve
Mycoplasma penumoniae bulunmaktadır. Boğaz kültürü başlıca S. pyogenes’ i saptamak
amacıyla yapılır. S. pyogenes kanlı agarda geniş beta hemolitik zon yapmış küçük koloniler
oluşturur. S. pyogenes’ in gram boyanmasında ise uzun zincirler yapmış gram pozitif koklar
görülür.
Bacitrasin duyarlılık testi yapılışı ve değerlendirilmesi: Kültür plağı üzerindeki şüpheli
beta hemolitik kolonilerden biri öze ile alınır. Materyal kanlı agara yayılarak ekilir ve plağın
ortasına 0.04 ünite basitrasin içeren disk yerleştirilir. Bir gece inkübasyondan sonra disk
etrafında inkübasyon zonu görülürse Streptokokların A grubu (S. pyogenes) oldukları anlaşılır.
37
2- Balgam Örneğinin İncelenmesi
a- İyi balgam örneğinin özellikleri:
- 100 büyütme ile her alanda 10’ dan az sayıda skuamöz hücre ve 25’ den fazla lökosit
görülmesi,
- Silli bronş epitelinin görülmesi,
- Mukus iplikçiklerinin görülmesi veya epitel/lökosit=1/5 olması.
b- Kötü balgam örneğinin özellikleri:
Ekspektore balgam, üst solunum yolu florasıyla kontamine olabileceğinden
örnekler oral kontaminasyonun yoğunluğunu saptamak amacıyla mikroskobik olarak
değerlendirilmelidir. 100 büyütme ile her alanda 10’ dan fazla sayıda skuamöz hücre
görülen balgamlar orofaringeal flora ile kontamine balgam olup incelenmeye değer
görülmez.
3- Asido-Resistan Boyalı Preparatların İncelenmesi
Mikobakteriler Erlich-Ziehl-Nielsen yönteminde mavi zemin üzerinde uzun ve yer yer
şişlikler gösteren düzensiz pembe basiller olarak görülürler.
4- Streptococcus pneumoniae Özellikleri
Pnömokoklar toplum kaynaklı pnömonilerin en sık etkenidir. Kanlı agarda α-hemolitik
koloniler oluştururlar. Gram boyamada oval veya lanset şeklinde diplokoklar veya kısa zincirler
oluşturan gram pozitif koklar görülür. Safrada erime deneyi ve optokin duyarlılık deneyi
pozitiftir.
5- Haemophilus influenza Özellikleri
H. influenza menenjit, konjunktivit, pnömoni, bronşit, otitis media, sellulit, epiglottit
gibi enfeksiyonlar oluşturabilirler. Üremesi için X ve V faktöre ihtiyaç duyar. Çikolata agarda
üretilir. Gram boyamada gram negatif çomaklar görülür. Koloniler kanlı agarda S. aureus
kolonilerinin etrafında üremiş küçük koloniler olarak tespit edilebilir (Satellite-uydu fenomeni).
6- Moraxella catarrhalis Özellikleri
Moraxella catarrhalis bronşit, bronkopnömoni, otitis media, sinüzite neden olur. Zorunlu
aerop, oksidaz pozitif, gram negatif diplokoktur. Kanlı agarda gri beyaz S tipinde koloniler
oluştururlar. DNAse testi pozitiftir.
38
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- Önceden hazırlanmış preparat örneklerini inceleyiniz.
1- İyi balgam mikroskopisi
2- Kötü balgam mikroskopisi
3- Balgamda gram (+) diplokok
4- ARB mikroskopisi
5- Balgamda gram (-) çomak
6- Balgamda gram (-) kok
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
39
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-6
GİS Örneklerinin Mikrobiyolojik İncelenmesi
Dersin Amaçları
Gastrointestinal sistem örneklerin mikrobiyolojik incelemesinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
GİS mikrobiyolojik örneklerini söyleyebilir
Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir
Beceri
Mikrobiyolojik örnek isimlerini bilir
GİS örneklerinde hangi testi kullanacağını bilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Lam
Lamel
Tahta çubuk
Lugol
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Gaita örneği
Hazır preparatlar
Serum fizyolojik
Giriş
İNCELENEN ÖRNEKLER
-
Dışkı
Safra
Mide özsuyu ve kusmuk
-
Ağız
İNCELEME YÖNTEMLERİ
1- Makroskopik
2- Direkt Tanı Yöntemleri
- Mikroskopi
- Kültür
3- İndirekt Tanı Yöntemleri
- Serolojik
40
Dışkının İncelenmesi
PARAZİTOLOJİK İNCELEME
1- Örnek alınması
2- Dışkının incelenmesi
Makroskopik incelenmesi
Mikroskopik incelenmesi
Direkt (nativ) yöntem
Zenginleştirme yöntemi
Selofan bant yöntemi
3- Parazitlerin tespit ve boyanması
4- Kültür
1- Örnek Alınması
- Temiz bir kaba alınmalıdır (2-5 gr).
- Şekilli bir dışkı ise oda ısısında bir gece bekletilebilir.
- Diyareik ve dizanterik dışkılar hemen (30 dakika içinde) incelenmeli veya tespit edilmelidir.
- 3-4 saat içinde incelenmeyen dışkılar buzdolabında saklanmalı veya formalin, PVA (Polivinil
Alkol), M.İ.F (Mertiolat-iyot-formaldehit) veya Schaudinin fiksatifi ile tespit edilmelidir.
2- Dışkının İncelenmesi
Makroskobik inceleme: Şekil, renk, içerdiği elemanlar ve parazitlerin segmentleri veya erişkinleri
açısından değerlendirilir.
Şekil: Şekilli, yumuşak, diyareik
Renk: Siyah, koyu kahverengi, kahverengi, açık kahverengi, sarı, yeşil, killi çamur gibi
Elemanlar: Müküslü, kanlı Taenia segmentleri ve Enterobius vermicularis erişkinleri görülebilir.
Şekil 6-1. T. saginata
41
Mikroskobik inceleme: Protozoonların trofozoit ve kist formları, helmintlerin yumurtaları
araştırılır.
a- Direkt Yöntemler
b- Zenginleştirme (Yoğunlaştırma) Yöntemleri
c- Selofan Bant Yöntemi
Şekil 6-2. Dışkı (Lökosit)
a- Direkt Yöntemler
1- Tuzlu su (SF) preparasyonu
2- Lugol ile inceleme
- Dışkı örneğinin değişik yerlerinden (varsa müküslü ve kanlı kısımlarından) alınan dışkı materyali
lam-lamel arası incelenir.
- E.histolytica şüphesinde örnek 37°C’lik etüve konulur veya el üstünü yakmayacak şekilde ısıtılan
lam üzerinde SF ile incelenir.
- SF yerine lugol ile inceleme yapılabilir.
Şekil 6-3. E. histolytica trofozoiti (İodin) ve kisti
42
b) Zenginleştirme (Yoğunlaştırma) Yöntemleri
Zenginleştirme yöntemleri, direkt incelemede görülemeyecek kadar az sayıdaki organizmanın
saptanmasını sağlar.
1- Çöktürme(Sedimentasyon)
2- Yüzdürme (Flotasyon)
1- Çöktürme yöntemleri:
a- Basit çöktürme yöntemi
- Dışkı SF ile ezilir, üstüne SF ilave edilerek doldurulur
- 15–30 dk beklenir. Üst kısım atılır.
- Bu şekilde yıkama birkaç kez tekrarlanır.
- Dipte çöken kısım 1500 devirde 5 dk çevrilir. Üst kısım atılır.
- Çökeltiden lama alınıp, lamel kapatılarak incelenir.
b-Formalin- eter Sedimantasyonu
-
10 ml dışkı %5–10 formalin içeren bir tüpe konur. Yeterli fiksasyon için 30 dk beklenir.
İki kat gazlı bezden süzülür.
Üzerine SF veya %5–10 formalin, tüpe konur ve 500xg’de 10 dk santrifüj edilir.
Üst kısım dökülür, SF eklenir, 500xg’de 10 dk santrifüj edilir.
Sedimente 3 ml eter eklenip 30 sn çalkalayarak 10dk santrifüj edilir.
c-Formalin-etil asetat Sedimentasyonu
Dışkı, 15 ml’lik konik santrifüj tüpüne 2 kat gazlı bezden süzülür. 650×g’de 2 dk çevrilir.
1ml’lik çökelti üzerine 10 ml SF eklenir, yeniden santrifüj edilir
- Sedimente %10 formalin eklenir, en az 5 dk beklenir.
- Üzerine 4ml etil asetat eklenerek çalkalanır.500 ×g’de 1 dk santrifüjlenir.
Formalin→ kistleri fikse eder, morfolojilerini korur.
-
Etil asetat→parazitlerin dışkıdaki artefaktlardan ayrılmasını sağlar.
2- Yüzdürme(Flotasyon) Yöntemleri
-
Çinko sülfat
-Tuzlu su
-Parazitolojik Tanı Setleri
43
a-Basit yüzdürme yöntemi:
-
1 cm³ dışkı bir tüpte, %33’lük Zn-sülfatta eritilir
Sonra tüp, ağzına kadar aynı dilüsyondaki çinko sülfat ile doldurulur.
15–20 dk bekletilir.
Tüpün üzerine kapatılan lamel incelenir. Lamelin altında hava boşluğu kalmamalıdır.
b- Doymuş tuzlu su ile yüzdürme yöntemi:
-
Doymuş tuzlu su; 1 lt suda 375 gr yemek tuzu (NaCI3) kaynatılarak eritilir.
Bir dışkı kabında 3–5 cm³ dışkı, doymuş tuzlu su ilavesi ile ezilir. Homojen hale gelinceye
kadar karıştırılır.
Kap dolana kadar doymuş tuzlu su ilave edilir.
Sıvı yüzeyine lamel bırakılarak sıvı üstünde yüzmesi sağlanır.
30 dk beklenir.
Lamel, lam üzerine bırakılarak mikroskopta incelenir
c- Çinko sülfat ile yüzdürme yöntemi:
-
Doymuş tuzlu su yerine %33lük çinko sülfat(ZnSo4) dan da yararlanılabilir.
SELOFAN BANT YÖNTEMİ
-
Özellikle Enterobiasis tanısında kullanılır.
Parazitin biyolojisi gereği yumurtaları perianal bölgede aramak gerekir.
Bir lam üzerine selofan bant parçası takılır.
Bant ucu anüsün yakın çevresine temas ettirilir.
Sonra bant lama tekrar yapıştırılarak mikroskopta E.vermicularis yumurtası aranır.
Şekil 6-4. Selofan band E. vermicularis yumurtası
44
3- Parazitolojik Boyalar
- Lugol’ün iyot eriyiği
- İyot-Eosin eriyiği
- Mertiolat-İodine-Formaldehyde (MIF) boyama
- Trichrom boyama
- Demir Hematoksilen boyama
- Modifiye Kinyon’s Asit Fast boyama
- Giemsa Boyama
- Bunların dışında Phenol-alcohol-formaldehyde, Alcohol-formalin-acetic asid, Dobell ve
O’Connor’un iodine ve Polyvinil alcohol (PVA) solüsyonları ile tespit, muhafaza ve boyama
yöntemleri de kullanılır.
4- Kültür Boyama
- Protozoon hastalıklarında tanı, fizyolojilerini incelemek, antijen hazırlamak, ilaçların etkisini invitro incelemek için yapılır.
- Serbest yaşayan protozoonlar kültürde genellikle daha kolay ürer. Fakat insanda hastalık yapan
protozoonların birçoğu da uygun besiyerlerinde uygun tekniklerle üretilebilir.
- Barsak protozoonlarının kültürü için katı ise nohut tanesi kadar, sulu dışkıdan 0.2-0.5cm³ kadar
dışkı ekilir.
- Protozoonları bakterilerden arınmış şekilde üretmek için yumurta sarısı, KC özeti, pirinç
nişastası, çeşitli fizyolojik ve tampon çözeltiler, serum, albümin içeren besiyerlerine ekim yapılır.
BAKTERİYOLOJİK İNCELEME
-Salmonella -Shigella
- C.jejuni
-S.aureus
-E.coli türleri -Y.enterocolitica
-V.cholera -V.parahemolyticus
-C.difficile
Salmonella, Shigella, E.coli (EPEC ve ETEC)
-
Direkt Mikroskopi: Gram negatif basil
Kültür:
Çoğaltıcı besiyeri (selenit F, GN, Tetratiyonat buyyon) ekim, 6-18 saat sonra ayırtıcı
besiyerine aktarma ekimi yapılır.
Doğrudan ayırtıcı besiyerine (MacConkey, EMB, ENDO, Deoxycholate agar)
ekim yapılır.
Salmonella, Shigella için seçici besiyerine (SS agar, Xylose Deoxcholate agar,
Hektoen Enteric agar, Deoxycholate citrate agar) yoğun ekim yapılabilir. Laktoza
etki temeline dayalıdır.
45
MacConkey agar
EMB besiyeri
Salmonella
Shigella
Besiyerinin
değiştirmez,
saydam
E.coli
Tuğla kırmızısı ve opak
SS agar
Salmonella
Shigella
rengini Renksiz,
renksiz saydam
Mavi-siyah,
yeşilimsi
madeni
parlaklık
ENDO
besiyeri
Deoxycholate
agar
citrate
Renksiz
Renksiz (proteus→geniş
koloni, renksiz)
Parlak
kırmızı
Kırmızı
(Enterobacterler→ortası
pembe,kendisi soluk)
Xylose lysine Deoxycholate Hektoen enterik agar
agar
Renksiz,
saydam Ortası siyah kırmızı
veya yarı saydam
(S.parathyphi,
S.choleraesuis→H2S(-)
Ortası siyah, mavi-yeşil ve
değişik büyüklükte
Renksiz,
saydam Kırmızı
veya yarı saydam
Daha büyük, daha yeşil
(S.parathyphi,
S.choleraesuis→ H2S(-)
Şekil 6-5. Salmonella ve Mac Conkey Agar görüntüsü
46
Şekil 6-6. Salmonella (SS Agar) ve Salmonella (Hektoen Enterik Agar)
Şekil 6-7. Shigella ve Mac Conkey Agar (orta), SS Agar (sağda) görüntüsü
Oksidaz Deneyi:
Oksidaz (-) Enterobacteriaceae üyelerinin, oksidaz (+) olan Pseudomonas, Aeromonas,
Plesiomonas, Vibrio genus üyelerinden ayrımını sağlar.
---------Ön tanıma besiyeri: TSİ, Christensen üre agar besiyerine ekim yapılarak saf kültür elde
edilir.
Şekil 6-8. Oksidaz Deneyi (+)
47
Biyokimyasal Testler
TSI besiyeri:
- Salmonella→yatık alkali, dip asit, gaz (+), H2S (+) (S.typhi→gaz (-) bazen H2S (-) S.paratyphi A→
H2S (-)
-Shigella→yatık alkali, dip asit, gaz (-) (S.flexneri→gaz (+), H2S (-)
-P.vulgaris, P.mirabilis→yatık asit ya da alkali, dip asit, gaz (+), H2S (+)
-E.coli→yatık asit,dip asit, gaz(+) (bazen-), H2S(-)
Şekil 6-9. TSI ve H2S (+) Agar görüntüleri
ÜRE JELOZU ekimleri:
-Üreyi parçalayan bakteriler alkali yan ürün oluşturarak besiyerinin rengini pembe-kırmızıya
değiştirirler.
Proteus, Morganella, Klebsiella, bazen Enterobacter→üreaz(+)
Salmonella, Shigella, E.coli→üreaz(-)
Şekil 6-10. Üre agar
48
İNDOL BESİYERİ ekimleri:
-Kovacs veya Ehrlich ayıraçları damlatıldığında kırmızı renk oluşur
Salmonella (+), Shigella(değişken), E.coli (+)
Şekil 6-11. İndol deneyi
SİMONS SİTRAT BESİYERİ ekimleri:
- Sitratı tek karbon kaynağı olarak ütilize eden bakteriler, besiyerindeki bromtimol mavisi
ayıracına etki ile mavi renk oluşturur. Salmonella (+), Shigella (-), E.col i(-)
Şekil 6-12. Simons Sitrat Agar
Methyl Red (MR) ve VogesProskauer (VP) deneyleri için Clark Lubs besiyerine ekim:
- MR: Bakterilerin besiyerindeki glikozu fermente edip, kuvvetli asit oluşumu incenir.
Olumlu ise kırmızı renk oluşur.
Salmonella (+), Shigella (+), E.coli (+)
-
VP: Bakterilerin glikozdan asetoin oluşumu incelenir. Olumlu ise pembe renk oluşur.
Salmonella (-), Shigella (-), E.coli (-)
49
Şekil 6-13. Metil red deneyi ve Voges-Proskauer Deneyi
MİKROTEST SİSTEMLER: APİ, Micro ID
Şekil 6-14. APİ Testi
ANTİKOR KAPLI LATEKS AYIRAÇLARI: Yöntemin temeli dışkıdan izole edilen Salmonella, Shigella
bakterilerinin anti Salmonella ve Shigella antikorları ile kaplanmış lateks parçacıkları ile
karşılaştırılması ve aglütinasyon araştırılmasıdır.
V. cholerae- V. parahaemolyticus
Direkt Mikroskopi:
-
Karanlık alanda hareket muayenesi (V.cholera→Gr (-), virgül şekilli, sinek uçuşması/balık
sürüsü gibi hareket. V.parahemolyticus→morfoloji benzer)
Gram: Gram negatif, virgül seklinde basil
Kültür:
- Alkali Peptonlu suya ekim yapılıp, 6–8 saat sonra incelenir.
- TCBS besiyerine ekim yapılıp, 35°C’ de inkübe edilip, 24–48 saat sonra incelenir.
V.cholerae→opak, sarı ,V.parahaemolyticus→mavi
Her ikisi oblik ışıkta→refle veren koloni----Monsur, Alkış gibi özel besiyerlerine ekim yapılabilir.
Her ikisi→Oksidaz (+)
50
Biyokimyasal Testler:
TSİ: V.cholera dip ve yatık kısımda asit, H2S (-), gaz (-)
V.parahaemolyticus dip asit, yatık alkali, H2S (-), gaz (-)
İndol V.cholera (+)
VP Biyotip Klasik (-),biyotip Eltor (+)
Serolojik tanı: Antiserumla tiplendirme
Şekil 6-15. V.cholera
Şekil 6-16. V.parahemolyticus (TCBS)
Yersinia enterocolitica
Direkt Mikroskopi: Gram negatif, bipolar boyanan kokobasiller
Kültür:
- MacConkey, SS agara ekim. Birisi 25°C de enkübasyon (daha iyi ürer)
MacConkey agarda→1-2mm hafif pembe koloni
-
SS agarda→renksiz koloni (kökenlerinin bazıları üremez)
51
-
Soğukta zenginleştirme yöntemi: Materyal 5 ml fosfat tamponlu suda +4 °C bekletilir.7,
14, 21.günlerde tekrar ekimler yapılarak incelenir.
-
CIN (Culfsulodin-ırgasan-novobiocin) agarda (ayırtıcı besiyeri) parlak pembe veya kırmızı
koloni
Şekil 6-17. Y. enterocolitica ve CIN agar görüntüsü
Biyokimyasal Testler:
-
TSI: dip asit, yatık asit(bazen alkali), H2S(-), Gaz(-)
Üreaz:3–24 saatte (+)
Hareket: 25°C de (+),35°Cde az hareketli
Serolojik tanı: Antiserumla tiplendirme
Campylobacter jejuni
Direkt Mikroskopi:
Gram: Gram(-) kıvrık, martı kanadı şeklinde çomak
Karanlık alan muayenesi: Tipik hareket (ok gibi düz yönde fırlayarak)
Kültür:
- Ayırtıcı besiyeri(Campy agar) tek koloni ekimi
- 42°C’de mikroaerofil ortamda üremeye bırakılır(en iyi %3–6 ve %3–10 CO2 içeren ortam).
- 24–48 saat sonra non hemolitik, basık, griden yeşilimsi pembeye kadar değişen hafif mukoid
koloniler kuşkulu
- Oksidaz(+)
52
Şekil 6-18. C. jejuni
VİROLOJİK İNCELEME
Etken: Rotavirus, Norwalk virus ve Adenovirus
Elektron mikroskopik inceme
Seroloji: Virus antijeni arama
İmmunflouresans
KBD
Latex Aglütinasyon Yöntemi
ELİSA Yöntemi
RİA Yöntemi
Şekil 6-19. Rotavirus ve Adenovirus (orta) ve Norwalk virus
SAFRANIN İNCELENMESİ
Örnek alınması: Enzimatik aktivite nedeniyle bekletilmeden incelenir.
Direkt Mikroskopi:
-
Lam- lamel arası: Mukus arasında kalmış ve safra boyası ile boyanmış epitel ve çok sayıda
lökositlerin görülmesi
Giardia lamblia,Necator americanus,Strongloides stercoralis,Faciola hepatica gibi
parazitler ve yumurtaları görülmesi
53
-
Gram: Lökositler ve etken bakteriler görülmesi
Kültür: Kanlı agar( aerop ve anaerop), EMB veya MacConkey, Tiyoglikolatlı buyyon
MİDE ÖZSUYU ve KUSMUK ÖRNEKLERİNİN İNCELENMESİ
-
M.tuberculosis aranması
-
Besin zehirlenmesi etkeni araştırılması
-
H.pylori ---- mukoza biyopsi örnekleri
Şekil 6-20. H. pylori
Örnek alınması: Mide özsuyu sabah aç karnına alınır.
Direkt Mikroskopi:
- EZN boyama (mavi zeminde pembe basiller)
- Histopatolojik inceleme
- Gram boyama
Kültür: Tbc: Löwenstein-Jensen, Middlebrook besiyeri
Şekil 6-21. M. tuberculosis
54
Besin zehirlenmesi: !!!!
-Kanlı agar (Aerop ve anaerop inkübasyon).
-MacConkey, EMB besiyeri,
-Tiyoglikolatlı buyyona ekim
-Botulismus şüphesi → Hayvan deneyi
AĞIZ ÖRNEKLERİNİN İNCELENMESİ
-
Ağız enfeksiyonları; Ağız mukozası, diş etleri, odontojenik enfeksiyonlar ve genel
enfeksiyonların oluşturduğu lezyonlar
Örnek alınması:
- Kök kanal enfeksiyonları: Diş yüzeyi %3 iyot ile silinir ve örnek kanal iğneleri ile alınır.
- Fasial periodontal abseler, Perimandibular abseler: Açılarak silgiç ile ağız florasına
bulaştırmadan püy alınır.
- Gingivit, Ağız ülserleri, Pamukçuk, Sifiliz ülserasyonları(şankr): Pamuklu silgiç ile örnek
alınır.
- Herpes simpleks ülserasyonları: Ülser tabanı kazıntısından örnek alınır.
Direkt Mikroskopi:
-
Lökositler arasında çok sayıda spiroket (Treponema vincenti) ve füziform basiller
(Fusobacterium nucleatum)
Tomurcuklanan Gr(+) maya hücreleri ve psödohifler
Şekil 6-22. Treponema vincenti ve Fusobacterium nucleatum
55
Şekil 6-23. Oral candiasis
Viral etkenler:
-
Giemsa: Çok çekirdekli dev hücreler
Flouresanlı antikor boyaması: Hücre içi inklüzyon cisimciklerinin görülmesi
H.simplex (multinükleer dev hücreler)
Şekil 6-24. Oral Herpes ve H. simplex (multinükleer dev hücreler)
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- Önceden hazırlanmış preparat örneklerini inceleyiniz.
2- Laboratuarda bulunan dersle ilgili ekim yapılmış besiyerlerini inceleyiniz.
3- H. pylori ELİSA plağını inceleyiniz.
Kaynaklar
1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
2. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
3. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, 55-61.
56
57
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-7
Ürogenital Sistem Örneklerinin Mikrobiyolojik İncelenmesi
Dersin Amaçları
İdrar yolları enfeksiyonlarının önemini ve oluşma sebeplerinin
öğrenilmesi
İdrar örneklerinin alınma, saklanma ve laboratuvara gönderme
koşullarının öğrenilmesi
İdrar örneklerinin mikrobiyolojik inceleme yöntemlerinin
öğrenilmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
İdrar yolları enfeksiyonları ve oluş mekanizmalarını açıklar.
İdrar örneğinin alınma, saklanma ve laboratuvara gönderme
koşullarını açıklar.
İdrar örneğini makroskobik olarak değerlendirir.
Nativ preparat hazırlar ve değerlendirir.
İdrar örneğini uygun boyalarla boyar ve mikroskobik olarak
değerlendirir.
İdrar örneğinin kültürü için uygun besiyerlerine ekim işlemini yapar.
Kültürlerde üreyen mikroorganizmaları tanır.
Antibiyotik duyarlılık testlerini değerlendirir.
Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır.
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Beceri
Tutum
Gerekli Malzemeler
Mikroskop
Lam
Lamel
Öze
Gram boyama seti
Temiz tüpler
Bakteriyolojik kültür besiyerleri
İdrar örneği
Giriş
İdrar yolu enfeksiyonları en sık karşılaşılan bakteriyel enfeksiyonlar arasındadır. Etken
olarak başta barsak bakterileri olmak üzere birçok bakteri gerek erkek gerekse kadınlarda
idrar yollarına yerleşip hastalık etkeni olabilirler. Bütün vakaların kesin teşhisi ancak
mikrobiyolojik yöntemlerle konulabilmektedir.
57
Normal insanda böbrek ve mesane sterildir. Buna karşılık üretranın son kısmında
üretra flora bakterileri bulunabilir ve buradan, deriden ve sindirim yolundan üreme organları
bakterilerle karşılaşabilir. İdrara üretradan, vajinadan ve dışarıdan karışan mikroorganizmalar
sınırlıdır. Bunların içinde en sık görülen bakteriler; koagülaz negatif stafilokoklar, difteroid
basiller, koliform bakteriler, enterokoklar, streptokoklar, laktobasiller vs. sayılabilir.
Mayalardan Candida sp. görülebilir. Bu bakterilerin büyük kısmı vajinal florada
bulunmaktadır. Kadınlarda bu bakteriler yanında Gardnerella vaginalis, Bacteriodes ssp. gibi
anaerob basiller, Mobilincus sp. gibi üremeleri daha nazlı bakteriler de vardır. Fakat bu
bakteriler aerob ortamda yapılan idrar kültürlerinde kontaminasyon gibi istenmeyen
durumlara yol açmazlar.
İdrar yolu enfeksiyonlarında; Escherichia coli, Proteus sp., Klebsiella ssp., Yersinia sp
ve diğer Enterobacteriaceae familyası üyeleri, enterokoklardan Streptococcus faecalis ve S.
faecium, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve S. epidermidis, β-hemolitik
streptokoklar, Candida türleri, tüberküloz basilleri, anaerob bakteriler, bazı gonokok ve
leptospiralar patolojik etken olarak bulunabilirler.
İdrar Örneğinin Alınması
İdrar örneği alınacak kişi eğer antibiyotik kullanıyorsa idrar örneği vermeden 2 gün
önce antibiyotik kullanımını kesmelidir. İdeal idrar örneği sabah alınan ilk idrar örneği veya 35 saat mesanede beklemiş idrar örneğidir. Örnek alındıktan sonra en geç bir saat içinde
incelenmelidir, incelenemeyecek ise 3-4 saat buzdolabı sıcaklığında muhafaza edilmelidir.
Bakteriyolojik incelemeye alınacak idrar çeşitli şekillerde elde edilebilir:
1- Orta akım idrar örneği alma yöntemi: Orta akım idrar örneği alma yöntemleri
kadınlar ve erkeklerde farklılık gösterir. Kadın üreme organı kendine özgü zengin bir
flora içerdiği için idrar örneği almadan önce temizliğe çok önem verilmelidir.
Kadınlarda idrar örneği alımından önce yapılması gereken temizlik genellikle %0.1’lik
potasyum permanganat veya sulandırılmış diğer antiseptik maddelerle ya da sabunla
yapılmalıdır. İdrar yaparken ilk gelen kısmın atılması deri ve üretra flora
mikroorganizmalarının dışarı atılmasını sağlar. Bu idrar bakteriyolojik incelenmeye
alınamaz. Daha sonraki idrar ise bakteriyolojik incelenmeye alınabilecek niteliktedir.
Çünkü mesanedeki idrarı temsil eder. Orta akım idrarı steril kaplara alınır,
araştırılacak bakteri cinsine göre 10-50 ml kadar alınır.
2- Sonda ile idrar örneği alma yöntemi: Genellikle orta akım idrarı veremeyecek
durumdaki hastalardan alınmalıdır. İdrarın toplandığı torbadan değil, alkolle silinmiş
sonda kanalından steril bir enjektörle hastanın idrar yaptığı bir anda alınmalıdır.
Sonda yerleştirilmesi sırasında dışarıdan bakterilerin içeriye sokulma olasılığına karşı
idrar örneği almadan önce sterilizasyon kurallarına tam olarak uyulmalıdır.
3- Mesane ponksiyonu ile idrar örneği alma yöntemi: İnvaziv bir yöntem olduğu için
travma olasılığı vardır ve yukarıda sayılan yöntemlerle istenildiği şekilde idrar örneği
alınamayan hastalara ve anaerop enfeksiyon düşünülen durumlarda
uygulanmaktadır.
58
İdrarın Mikrobiyolojik Olarak İncelenmesi
1- Makroskobik inceleme: İdrar normalde açık sarı renkli, berrak, viskoz olmayan ve
kendine has kokusu olan bir sıvıdır.
2- Mikroskobik inceleme:
a- Direkt inceleme: Usulüne uygun olarak alınan idrar örneği iyice karıştırıldıktan sonra
santrifüj edilmeden bir damla lam üzerine damlatılır ve lamelle kapatılır. Dörtyüz
büyütme altında eritrosit, lökosit, epitel hücresi, kristal ve bakteri varlığı açısından
incelenir. Hücre (eritrosit, lökosit veya epitel hücre) bakımından zengin idrar renk ve
berraklık bakımından değişiklik gösterir. Eritrosit bol bulunan idrar daha çok kırmızı
renkli olup bu duruma hematüri denir. Lökosit bol bulunan idrar beyaz olup, bu
duruma da piyüri denir. Kristal görüldüğünde bu olaya kristallüri, bakteri
görüldüğünde ise bakteriüri denir. Her mikroskop sahasında görülen bir hücre
(eritrosit, lökosit veya bakteri) 105 hücre/ml idrar olarak düşünülür.
b- Boyama: İdrardan hazırlanan preparatlar Gram boyama yöntemiyle boyanarak
immersiyon objektifi ile incelenir. Gram pozitif veya negatif kok veya basiller aranır.
Direkt incelemede bakteri görülüp Gram boyamada bakteri görülmüyor ise idrar
homojenize ve dekontamine edilerek ARB yöntemiyle boyanır ve tüberküloz basili
açısından incelenir.
3- Kültür: İdrar yolu enfeksiyonlarında daha çok karşılaşılan etken bakteriler
Enterobacteriaceae familyası üyeleri olduğu için idrar Eosine Methylen Blue (EMB), Endo
veya McCokey agara ekilir. Stafilokok veya enterokoklar gibi Gram pozitif bakteriler için
bir de kanlı agara ekimi yapılır. Tüberküloz basili için ise homojenizasyon ve
dekontaminasyon işlemlerinden sonra Lowenstein-Jensen besiyerine ekilir. Mayalar için
Saboraud dekstroz agara ekilmelidir.
İdrar genellikle ölçekli özeler veya mikropipet yardımıyla besiyerlerine alınarak steril
cam baget yardımıyla bütün besiyeri yüzeyine yayılarak ekilir. Kültürün
değerlendirilmesinde bakteri sayımı olduğu için 0.01 ml idrar ekilir. İdrar ekimi için
gereken hacmi (0.01 ml) alabilen özeler 4 mm. halka çapına sahiptir. Üreyen bakteri sayısı
1000 ile çarpılarak idrarın mililitresindeki bakteri sayısı hesaplanır.
Antibiyogram
Bütün bakteriyel enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde olduğu gibi üriner sistem
hastalıklarında da tedaviden önce etken izole edilip belirlendikten sonra antibiyogram testi
yapılmalıdır. Bakterinin hassas ve dirençli olduğu ilaç profili belirlenmelidir.
Erken üreme fazına kadar üretilen bakteriler 0.5 McFarland bulanıklığına ayarlanarak
standard olarak 4 mm kalınlığa sahip antibiyogram agar yüzeyinin tümüne steril pamuklu
eküvyon yardımıyla ekilir. Pamuğun ucu bakteri süspansiyonuna bir kere daldırılır ve iyice
ıslanması sağlanır. Agarda bir uçtan diğer uca eküvyon ucuyla bir artı çizilir ve artının 4
59
hattından agar sonuna doğru boşluk kalmayacak şekilde 4 kere bakteri yüzeye yayılır. Yüzeyi
kurutulmuş agara belirli konsantrasyonda antibiyotik emdirilmiş kağıt diskler en az 2-3 cm
aralıklarla yerleştirilir. Aerob ortamda 18 saat 37ºC’de inkübe edilir. Disk etrafındaki
bakterinin üremediği alanın çapı (inhibisyon zonu) milimetre cinsinden ölçülür ve
antibiyogram çizelgesindeki zon kriterlerine göre hassas, orta hassas ve dirençli olarak rapor
edilir.
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- İdrar örneğinden preparat hazırlayarak Gram boyama yöntemiyle boyayınız.
2- İdrar kültürlerini değerlendirerek mililitredeki bakteri sayısını hesaplayınız.
3- Antibiyogram plaklarını inceleyerek antibiyogram çizelgesine göre değerlendiriniz.
Tarih:
Laboratuvar görevlisinin imzası
Kaynaklar
1. Bilgehan H (2009). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Beşinci Baskı. Barış Yayınları Fakülteler
Kitabevi, İzmir, 375-383.
2. Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim
Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 243-278.
60
Dönem 3. Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik Uygulama-8
Santral Sinir Sistemi Örneklerinin Mikrobiyolojik İncelemesi
Dersin Amaçları
Santral sinir sistemi örneklerinin incelenmesi
Dersin Hedefleri
Bu dersi alan öğrenciler;
Bilgi
Santral sinir sistemi enfeksiyon etkenlerinin isimlerini söyleyebilir
Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir
Beceri
Santral sinir sistemi örneklerinin alınışını bilir.
BOS örneğinde hücre sayabilir
Tutum
Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir.
Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek
bırakır.
Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar.
Gerekli Malzemeler
Lam
Mikroskop
İmmersiyon yağı
Tüp
Pipet ve pipet ucu
Hazır preparatlar
Giriş
Santral sinir sistemi ve beyin dıştan içe doğru
- Duramater
(Arak+Pia = Leptomeninks)
- Araknoid
- Piamater
ile örtülüdür.
Araknoid villuslar BOS’ un absorplanarak kana aktarıldığı yerlerdir.
İnfeksiyon Kaynakları
Kan yolu: Koroid plexüs veya diğer beyin damarlarıyla infeksiyon etkenlerinin subaraknoid
aralığa ulaşmasıyla ( en sık )
1- İnfeksiyon bölgesinden direk yayılım ile : Orta kulak iltihabı, sinüzit, mastoidit.
2- Sinirler boyunca yayılarak : Kuduz, Herpes simplex virus infeksiyonları
61
İnfeksiyonlar
Menenjitler: Subaraknoid aralığın yani leptomeninkslerin iltihabıdır.
Etken mikroorganizmaya karşı konağın verdiği cevaba göre iki türlüdür:
1-Pürülan menenjit
2- Aseptik menenjit
Pürülan menenjitte etken bakterilerdir. İnflamasyon artmıştır. Ventriküllerde
tutulursa ventrikülit adını alır.
SAVUNMA MEKANİZMALARI
1- Kan-beyin bariyeri
2- Koroid plexüs
3-Araknoid membran
4-Serebral mikrovasküler endotel
Vasküler endotelin eşsiz yapısal özellikleri nedeniyle infeksiyon ajanlarının BOS’a
geçişi minimaldir. Yaş ve altta yatan hastalıklar diğer predispozan faktörlerdir.
Yenidoğanda menenjit prevelansı en yüksektir. Bunun nedenleri:
-
Bağışıklık sisteminin tam olgunlaşmaması
-
Anne vajeninde bakterilerin kolonize olması
-
Yenidoğanda kan-beyin bariyerinin geçirgenliği daha fazladır.
-
H. influenzae tip b ‘ ye karşı antikor olmaması nedeniyle bu infeksiyona açıktırlar.
Aynı sebeple kalabalık yaşanan ortamlarda örneğin kışlalarda N. menengitidis’ e karşı
bağışık olmayan kişiler nedeniyle epidemiler gelişir. Menenjit etkenlerinin çoğunun
organizmaya giriş yeri solunum yolları olduğundan yetişkindeki menenjiti hazırlayan faktörler
çocukluk çağındakilere benzer. Alkolizm, splenektomi, diyabet, şant ve bağışıklığın
baskılanması infeksiyon riskini arttıran faktörlerdir.
S. pneumoniae ve N. meningitidis IgA proteazı salgılarlar böylece bakterinin epitele
yapışması kolaylaşır. Bazı ajanların antifagositik kapsülleri vardır. Organizmalar kan-beyin
bariyerindeki bozulma nedeniyle BOS’ a geçebilirler.
Menenjitler hastalığın ortaya çıkışı ve ilerleyişine göre akut veya kronik olabilirler.
62
Akut Menenjit: Ateş, ense, sertliği, baş ağrısı, bulantı, kusma, nörolojik belirtiler ve mental
durumda değişiklikler görülür.
Akut bakteriyel menenjitte BOS bulguları:
Lökosit: 1000/mm3 ve üstü lökosit özellikle PNL
Glukoz seviyesi azalmış: BOS glikozu/ serum glikozu = 0.60 veya altı
Protein artmış: Yetişkinde 15-50 mg/dl yeni doğanda ortalama 90 mg/dl
Akut bakteriyel menenjitte sekeller:
- Serebral ödem
- Hidrosefali
- Serebral herni
- Fokal nörolojik değişiklikler
- Sağırlık % 10
Özellikle bağışık sistemi baskılanmış kişilerde menenjit semptomlarının bir ay veya
daha fazla sürdüğü tablo kronik menenjit olarak adlandırılır.
Kronik menenjit: Vakaların çoğu 5 yaşın altındadır.
Yenidoğanda : GBS, E. coli , diğer Gram negatif çomaklar, L. monocytogenes
Çocuklarda : Meningokoklar
Yetişkinlerde : Meningokoklar, pnömokoklar, L. monocytogenes daha az sıklıkta S. aures ve
gram negatif çomaklar etkendir.
Kronik Menenjit Etkenleri :
- M. tuberculosis
- Candida sp.
- C. neoformans
- Nocardia
- C. immitis
- H. capsulatum
- Actinomyces - T. pallidum - Brucella
- B. dermatitidis
- Salmonella
- T gondii, T spiralis, P westerrmani, Cysticercus
Aseptik Menenjit: BOS’ da lenfositler artmıştır (pleositoz). Hastada ateş, ense sertliği, bulantı
ve kusma vardır. Bakteriyel ve fungal kültürler negatiftir. Çoğunlukla etken viruslardır.
İnfeksiyonlar kendiliklerinden sınırlanırlar. Daha seyrek olarak spiroketler etken olabilir.
Malinitelerde de benzer bulgular olabilir.
63
BOS BULGULARI
Etken
Lökosit
Yaygın
Protein
Şeker
hücre
mg/dl
mg/dl
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Normal
0-5
mononükleer
15-50
45-100
Viral infeksiyon
2-2000 (80)
Pürülan infek.
5-20.000(800)
Mantar, Tbc
mononükleer
5-2000(100)
PMN
mononükleer
50-100
normal
100’ün üzeri
45’in altı
50’den fazla
normal*
ENSEFALİT VE MENİNGOENSEFALİT
Ensefalit beyin parenkiminin inflamasyonudur ve etken çoğunlukla viral
infeksiyonlardır. Yaz aylarında sık görülür ve etken çoğunlukla enteroviruslardır.
Coxsackievirus A, B, echovirus, mumps, herpes simplex, arboviruses, togavirus, bunyavivirus,
equine encephalitis, st. Louis encephalitisi ve diğer ensefalit virusları.
HIV ile infekte kişilerde sinir sisteminin tutulumu sıktır. HIV nörotropik bir virusdur
SSS’e makrofajlarla taşınır ve çeşitli nörolojik sendromlara yol açar. İmmunsupreselerde daha
ilerleyici davranır ve SSS fırsatçı patojenler için hedef haline gelir. ( CMV )
Parazitler; Serbest yaşayan amipler Naegleria ve Acanthamoeba direk nazal
mukozadan özellikle HIV pozitiflerde Toxoplasma gondii kan yoluyla beyne ulaşır hücre içi
yerleşim gösterir ve parenkim hasarı yapar. Entomoeba histolytica ve Strongyloides
stercoralis beyin dokusunda görülür. Taenia soliumun larval formu kan yoluyla beyne
ulaşabilir (sistiserkus) ve menenjit benzeri tabloya yol açar.
BEYİN ABSESİ
Menenjit benzeri klinik tablo gelişir. BOS’da değişiklikler olabilir. Abse subaraknoid
boşluğa açılabilir. Yüksek mortalite ile seyreden menenjite neden olur. Anaerobik
mikroorganizmalar ve Viridan streptokolar BOS’dan izole edilebilir ancak çoğunlukla kültür
negatiftir. Bağışık sistemi baskılanmış veya diyabetli hastalarda hızlı ilerleyen mantar
infeksiyonları (fikomikozis) görülür.
BOS Örneğinin Alınması
Özellikle menenjitlerde, bel ponksiyonu infeksiyonun tanısında en önemli basamaktır.
64
BOS’ un elde edilmesi:
1- Bel ponksiyonu
2- Oksipital ponksiyon
Ponksiyon için gerekli malzemeler: 1-Ponksiyon iğnesi 2-Steril deney tüpleri 3- % 70’lik alkol
4- % 2’lik tentürdiyot
5-Steril gazlı bez
İşlemler:
1- Hastanın pozisyonu: - Oturarak
-Yatarak
---Oturarak yapılan ponksiyonlarda serebellum pons üzerine hernileşebilir!
2- Derinin temizliği: - Önce % 70’lik alkol
- Sonra % 2’lik tentürdiyot ile
3- Doktorun el temizliği: - Sabun ile antisepsi
-3 dk. % 70’lik alkol ile tutulur
- Parmak uçları iyot ile silinir
- Steril eldiven giyilir
4- Ponksiyon işlemi:
- Deriye dik olarak ponksiyon iğnesi ile girilir
- İğne hastanın başına doğru yönlendirilerek itilir
- Duramater delindiğinde hissedilir ve mandren çekilir
- Tüplere BOS alındıktan sonra mandren geri çekilir
5- BOS basıncı ve görünümü: Menenjitlerde BOS basıncı yükselir. Normalde saniyede 3-4
damla akan BOS menenjitlerde daha hızlı akar hatta bazen fışkırır. BOS normalde şeffaf
görünümlüdür menenjitlerde bulanıktır.
BOS kanlı ise;
- İğnenin travmatizasyonu ?
- İntrakranial kanama ?
BOS görünümü berrak ancak ksantokromik ise;
- Eski bir intrakranial kanama ?
- BOS sirkülasyonunu engelleyen bir durum ?
6- Örnek miktarı: BOS basıncına göre;
- Yetişkinlerde 5-15 ml.
- Çocuklarda
4-5 ml
65
Örnek 3 ayrı tüpe alınmalıdır. Hücre sayımı son tüpten yapılır. Tbc veya kriptokok
menenjitinde etkenin izolasyonu için en az 10 ml. BOS alınmalıdır. BOS laboratuvara hemen
ulaştırılmalıdır. S. pneumoniae gibi etkenlerin izole edilebilmesi için örnek 1 saat içinde
incelenmelidir. Viral incelemeler dışında kesinlikle buzdolabına koyulmamalıdır. Oda ısısında
veya 35°C de tutulabilir. Viral incelemeler için 1 güne kadar buzdolabında veya –70°C de
daha uzun süre bekletilebilir.
BOS Örneğinin İncelenmesi
1- Makroskopik görünüm: BOS berrak kaya suyu görünümündedir.
- Pürülan menenjitte bulanık
- Pürülan olmayan menenjitte berrak veya hafif buzlu
-Tbc’de alındığında berrak olan BOS bekletildiğinde tüpün dibinde örümcek ağı
görünümünde fibrin ağı oluşur.
2-Hücre sayısı ve tipi: Normalde BOS’un milimetre küpünde erişkinde 0-10, çocuklarda 0-20
hücre bulunur ve hepsi mononükleerdir.
Aseptik menenjitte
500
Lenfositik koriomenenjitte
1000 bazen 2000/mm
Pürülan menenjitte
Tbc menenjitte
en fazla 1000 / mm.
1000/mm den fazla
25-1000/mm
Sayım: BOS ‘da hücre saymak için Thoma lamı kullanılır.
Thoma lamı: Thoma lamı üzerinde iki sayım alanı bulunan özel bir lamdır. Sayım alanlarında
bulunan çizgiler mikroskop altında birbirinden ayırt edilebilirler. Bu çizgiler üzerinde oluşan
karelerde sayım gerçekleştirilir. Sayım alanları üzerine yerleştirilen lamel ile sayım alanı
arasındaki mesafe 0,1 mm; sayım alanının çizgilerinin kesiştiği mesafe de 1 mm’dir. Buradan
sayım alanının hacmi = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3 olarak hesaplanır.
Şekil 8-1. Thoma Lamının genel görünüşü
66
Şekil 8-2. Thoma Lamı üzerindeki sayma kamaralarının büyütülmüş görüntüsü
Hücre sayarken BOS ‘daki eritrositleri parçalamak için 10 kısım BOS’a 1 kısım metil
viyole ile renklendirilmiş % 5’lik asetik asit eriyiği ile karıştırılabilir. Bu durumda sayım sonucu
1.1 ile çarpılmalıdır.
Lökosit sayma pipetinin 1 bölmesine kadar lökosit sayma eriyiği 11 bölmesine kadar
BOS çekilir. Sonuç 11 ile çarpılır.
Hücre tipi: Normalde BOS’da bulunan hücreler mononükleer hücrelerdir. Akut pürülan
menenjitte çoğu parçalı. Aseptik menenjit ve lenfositik koriomenenjitte lenfosit ve Tbc ‘ de
başlangıçta parçalı daha sonra lenfosit hakimiyeti vardır.
3- Bakteriyolojik İnceleme:
- Mikroskobik inceleme (M.tuberculosis ve Cryotococus hariç)
- 10 ml. Boş steril tüpte 3000 rpm’de 10 dk. santrifüjlenir.
- Üst sıvı steril bir tüpe aktarılır. Yaklaşık 0,5ml BOS bırakılır ve sediment vortekslenir. 3 adet
preparat hazırlanır.
- Giemsa
- Gram
- Akridin-oranj: Floresans mikroskopta 400’lük büyütme ile incelenir.M. tuberculosis için
10ml. BOS 2000 g’de 30 dk. santrifüjlenir.
- Tüpün dibindeki çökeltiden preparatlar hazırlanır ve
1- Rhodamin –Auramin
67
2- EZN ile boyanır. Önce A-R ile boyanan preparatın immersiyon yağı ksilol ile silinirse
EZN ile tekrar boyanabilir. Bekletilen BOS’da örümcek ağı oluştuysa buradan yapılan
preparatlar boyanarak M. tuberculosis aranabilir.
Cryptococus için;
Çini mürekkebi ile boyama:
- Çökeltiden bir damla temiz bir lama koyulur
- Üzerine bir damla da çini mürekkebi koyulur ve karıştırılır
- Lamel kapatılarak 400 büyütmede incelenir
Geniş kapsül içinde oval – yuvarlak maya hücresinin görülmesi C. neoformansı
düşündürür. Blastospor yapmış maya hücresi tanı değeri taşır. Mürekkebin kontamine
olmasını önlemek için 0,05 ml mertiolat damlatılır.
KÜLTÜRLER:
Santrifüjlenmiş BOS’ un çökeltisinden ;
-Koyun kanlı agar
-Çukulatamsı agar (%5-10 CO2’de ink.)
-Mc Conkey veya Endo agar
-Tripticase’ li soya buyyon
-Tiyoglikolatlı buyyon’ a ekim yapılır.
Maya mantarı kuşkusu varsa;
-1 adet BHI agar
-2 adet SDA ekimi yapılır.
M. tuberculosis kuşkusunda; BOS’ da başa bakteri yoksa direk ekim, varsa
dekontamirasyon işleminden sonra:
-Löwenstein Jensen
-MCIT
-BACTEK ekimi yapılır.
68
SONUÇLAR: Laboratuvarda yapılan her türlü incelemenin sonucu en çabuk yoldan klinisyene
iletilmelidir.Direk inceleme, hücre sayımı ve biyokimyasal incelemelerin sonuçlarını kültür ve
antibiyogram sonuçlarını beklemeden iletilmelidir.
ERKEN TANI YÖNTEMLERİ
-İlk kez Rake tarafından kapiller tüp presipitasyon yöntemi ile antijen aranmıştır.
-Karşıt ımmun elektrofonez.(CIE) ile belirli antikorları içeren bağışık serumlar kullanılarak
BOS’ da H. influenzae, S. pneumoniae,N. meningitidis ve L. monocytogenes aranabilir.
-Latex aglutinasyonu veya koaglutinasyon ile de BOS’ da antijen aranabilir(C.neoformans).
-Kapsül şişme reaksiyonu
Kapsüllü bakterilerden etken olarak BOS’ dan izole edilebilecek olanlar N.
meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, K. pneumoniae gibi bakterilerdir.
Temiz bir lama;
-
1 damla sulandırılmış antiserum,
-
1 damla da kontrol için SF damlatılır.
Her iki damlanın üzerine;
-
1’ er damla BOS çözeltisi ve
-
1’ er damla %1 metilen mavisi üzerine lamel kapatılır
Antiserum bulunan tarafta S.F bulunan tarafa göre daha geniş kapsül görülmesi testin
pozitif olduğunu gösterir.
BOS’ da amip aramak için santrifüjlenmiş örnekten direk lam-lamel arası preparatının
incelenmesi yeterlidir.
Moleküler yöntemler : PCR
Diğer testler : Limulus lizat testi, gas-likid kromotografisi
Laboratuvarda Yapılacak İşlemler
1- Laboratuarda önceden hazırlanmış örnekleri inceleyiniz.
2- BOS da hücre sayımı yapınız.
Kaynaklar
1.
2.
Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir.
Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir.
69

İndir - TC Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı

ıı.sınıf tıbbi mikrobiyoloji laboratuvar föyleri - E

Ekinokokkoz - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

ı. sınıf tıbbi mikrobiyoloji laboratuvar föyleri - E

Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

5. Kurul Ders Programı - İstanbul Yeni Yüzyıl Üniversitesi

Campylobacter enfeksiyonları - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

öğrenme faalġyetġ–3

Tek kan kültürü

Hacettepe Üniversitesi Merkez Laboratuvarı Test Rehberi

Acinetobacter baumannii

Anaerop Bakterilerde Antimikrobiklere Direnci Saptayalım Mı, Nasıl

EUCAST Disk Difüzyon Testi El Kitabı

Untitled

Neisseria meningitidis enfeksiyonları

olgu sunumu

123-128 Gulseren Aktas.indd

PDF - Ege Journal of Medicine

OLGULARLA MİKOBAKTERİYOLOJİ OLGU SUNUMU

Dönem II-II_kurul 2014

PDF formatında görüntülemek için lütfen tıklayınız.

performans programı