Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS) Gonorenin (Neisseria gonorrhoeae enfeksiyonu) Mikrobiyolojik Tanısı Hazırlayan Birim Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Bakteriyoloji Bölüm Mikrobiyolojik Tanımlama Standart No B-MT-17 Sürüm No 1.1 Onay tarihi 01.01.2015 Geçerlilik tarihi 01.01.2018 Sürüm no Değişiklik Tarih Gonore İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3 GENEL BĠLGĠ ................................................................... 4 Hastalığın önemi ve klinik özellikleri .................................... 4 Mikroorganizmanın özellikleri .............................................. 4 Mikrobiyolojik tanı ............................................................ 4 TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 5 1 2 3 4 5 Hedef mikroorganizma .................................................. 5 Tanı için asgari laboratuvar koĢulları ................................ 5 Gonore tanısında kullanılan teknikler ............................. 11 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim ................. 20 Olası sorunlar/kısıtlılıklar .............................................. 21 ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ .......................................... 21 KAYNAKLAR ................................................................... 22 Sayfa 2 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore Kapsam ve Amaç Gonore, erkekte genellikle üretrit, prostatit, epididimit, üretral darlık gibi genitoüriner enfeksiyonlara yol açan, kadında çoğunlukla asemptomatik olsa da endoservisit, salpenjit, endometrit, tubo-ovaryan apse, dıĢ gebelik, PIH gibi ciddi sorunlara yol açan, cinsel temasla bulaĢan bir hastalıktır. Etkeni sadece insanlarda patojen olan Neisseria gonorrhoeae‟dir. Ayrıca cinsel davranıĢlara bağlı olarak farenjit, proktit ile de karĢımıza çıkabilir. Gebelikte spontan düĢük, erken membran rüptürü, prematüre doğum gibi komplikasyonlara; enfekte anneden doğan bebeklerde gonokokkal konjonktivite neden olabilir. Çocuklarda izole edilmesi cinsel istismar göstergesidir (1,2,3,4,5,6). Gonorenin kesin tanısı mikrobiyolojik inceleme ile konur. Laboratuvarda Gram boyama, kültür, hızlı antijen testleri, NAH testleri ve NAAT gibi yöntemlerden yararlanılabilirse de yöntemlerin hepsi tanıda aynı değere sahip değildir (1,3,5,6). Bu UMS belgesi, gonorenin kesin tanısı için geçerli yöntemlere dair prosedürleri kapsamaktadır. Belgenin amacı ise; hasta yönetiminde ve bildirime esas doğru ve güvenilir sonuçların elde edilebilmesi için, yöntemlerin seçiminde, tanıdaki yerlerinin değerlendirilmesinde ve doğru uygulanmalarında kullanılacak süreçleri vermektir. Kısaltmalar ve Tanımlar CLSI Clinical and Laboratory Standarts Institute CTA Sistin Triptikaz Soy Agar FITC Fluorescein isothiocyanate MALDI-TOF MS Matrix-assisted laser desorption ionization-time -of-flight mass spectrometry MLST Multilocus sequence typing MTM Modifiye Thayer Martin NAAT Nükleik asit amplifikasyon testleri NAH Nükleik asit hibridizasyon NG-MAST Neisseria gonorrhoeae multiantigen sequence typing PFGE Pulsed field gel electrophoresis PIH Pelvik inflamatuvar hastalık RFLP Restriction fragment length polymorphism SDA Strand-displacement amplification Substrat Enzimin etki ettiği madde T-I Trans-isolate (besiyeri); hem taĢıma besiyeri olarak, hem de kültür besiyeri olarak kullanılır. TIMA Transcription mediated amplification TM Transport medium (taĢıma besiyeri) TSA Triptik soya agar Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 3 / 23 Gonore Genel Bilgi Hastalığın önemi ve klinik özellikleri N.gonorrhoeae’nin neden olduğu gonore cinsel yolla bulaĢan ve genellikle alt genital sistem olmak üzere çeĢitli mukoz membranları tutan bir hastalıktır. Cinsel temasla bulaĢan bakteriyel enfeksiyonlar arasında ikinci sıklıkla görülmektedir. Özellikle ergenlik ve genç eriĢkinlik döneminde görülür (1,2,3,5,6). Erkekte sıklıkla belirti verir ve en sık üretral akıntı ve dizüri Ģikayetine neden olur. Kadında vajinal akıntı, cinsel iliĢki sonrası kanama görülse de %80 belirtisizdir. Erkekte genellikle üretrit, prostatit, epididimit gibi genitoüriner enfeksiyonlara ve üretral darlık, kısırlık gibi sonuçlara yol açar. Kadında endoservisit, salpenjit, endometrit, tubo-ovaryan apse, dıĢ gebelik, kısırlık, PIH gibi ciddi sorunlara yol açabilir. Ayrıca erkeklerle cinsel iliĢkide bulunan erkeklerde ve kadınlarda cinsel davranıĢlara bağlı olarak farenjit, proktit ile de karĢımıza çıkabilir (1,2,3,5,6). Gonore, gebelikte spontan düĢük, erken membran rüptürü, prematüre doğum gibi komplikasyonlara da neden olur. EriĢkinde otoinokülasyon ile veya enfekte anneden doğan bebeklerde gonokokkal konjonktivit (oftalmia neonatorum) oluĢabilir. Tarihte körlüklere neden olmuĢtur. Doğumda göze %0.5‟lik eritromisin içeren merhem sürülmesi doğumsal konjonktiviti önlemek için kullanılır (1,2,4,6). Mukozal enfeksiyonların %1‟inden azında immün kompleks oluĢumuna bağlı yaygın gonokokkal enfeksiyon görülebilir. Septik artrit ve vaskülitik deri lezyonlarıyla ortaya çıkar. Çocuklarda gonore tespit edilmesi cinsel istismar göstergesidir, tanıda çok dikkatli olmak gerekir (1,5,6). Mikroorganizmanın özellikleri N. gonorrhoeae gram negatif diplokoktur. Hareketsizdirler. Oksidaz ve katalaz pozitiftir. Karbonhidratlardan fermentasyonla değil oksidasyonla asit oluĢtururlar. Sadece glikoza etki eder. Güç üreyen bir bakteridir. Çikolata agar gibi zengin besiyerinde, nemli ve %3-7 CO2‟li ortamda 35-37°C‟de 48-72 saatte ürer (1,5,6). DıĢ ortam Ģartlarına son derece dayanıksız bir bakteri olan N. gonorrhoeae sadece insanda patojendir. Belirti vermese de bireyde N. gonorrhoeae saptanırsa, kesinlikle patojen kabul edilir (1,5,6). Mikrobiyolojik tanı Gonorenin kesin tanısı mikrobiyolojik inceleme ile konur. Laboratuvarda Gram boyama, kültür, hızlı antijen testleri, NAH testleri ve NAAT gibi yöntemlerden yararlanılabilirse de yöntemlerin hepsi tanıda aynı değere sahip değildir. Ayrıca hasta baĢı hızlı testler de kullanıma girmiĢtir (6,7,8). Üretra erkeklerde primer enfeksiyon bölgesidir ve tanıda en sık kullanılan örnek üretral akıntıdır; ancak N. gonorrhoeae rektum, orofarinks, konjonktiva, epididim gibi bölgelerde de enfeksiyona neden olabildiği için klinisyen farklı örnekleri laboratuvara gönderebilir. Ġlk-akım idrar da değerli bir tanı örneğidir (4). Sayfa 4 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore Kadınlarda gonokok enfeksiyonun primer bölgesi ise endoservikstir; ancak organizma ayrıca üretra, rektum, orofarinks, konjonktiva ve Bartholin bezlerinin kanallarından elde edilebilir. Vajinal sürüntü kadınlardaki enfeksiyonun tanısı için geçerli bir örnek olarak kabul edilmemektedir ancak ergenlik öncesi kızların gonore tanısı için değerli bir örnek olabilir. Kadınlarda ilerleyen genital enfeksiyon pelvik inflamatuvar hastalığa (PIH) ve nadiren de perihepatite yol açabilir (4). Tanıda klinik örneklerden olabildiğince hem mikroskopik incelemeler hem de kültür yapılmalıdır. Üretral akıntıdan yapılan Gram boyamada bol PNL ve hücre içi gram negatif diplokokların görülmesi önemli bir bulgudur ve erkek olgularda kesin tanı koydurur. Kadınlarda endoservikal bölge florasının benzer bakterileri nedeniyle pozitif yaymalar olası tanı bulgusudur ve kültür ile doğrulanmalıdır (5,6). Kültürler çikolata agar ve seçici MTM gibi besiyerlerine ekilir, CO2‟li etüv veya mumlu jarda, 35°C‟de, 48-72 saat inkübe edilir. Besiyerlerinde üreyen gram negatif diplokoklar incelenir. Oksidaz pozitif ve süperokzol test pozitif olanlar kültür doğrulama testlerine (karbonhidratlara etki testleri ve Mueller Hinton agar gibi temel besiyerlerine ekim) alınır. N. gonorrhoeae temel besiyerlerinde üreyemez. Glikoza etki ederken, maltoz, sukroz, früktoz ve laktoza etkimez. Ayrıca gerekirse kromojenik enzim substrat testleri, DFA, NAH, NAAT, MALDI – TOF MS, DNA sekanslama gibi yöntemlerden biriyle daha doğrulama yapılır (1,5,6,8,9,10). N. gonorrhoeae‟nin laboratuvar incelemeleri kapsamında, rutinde, antibiyotik duyarlılık testi yapılmaz. Tedavide önceleri penisilin, tetrasiklin, spektinomisin ve kinolonlar kullanılırken, direnç geliĢimi nedeniyle bugün sadece tek doz seftriakson ve sefiksim reçete edilmektedir. Hastaların cinsel partnerleri de tedavi edilmelidir (2). Tedaviye dirençli izolatlar için antibiyotik duyarlılık testleri genellikle yeterli imkanlara sahip üniversite veya eğitim araĢtırma hastaneleri tarafından yapılabilir (1,5,6,8). Teknik Bilgiler 1 Hedef mikroorganizma Neisseria gonorrhoeae 2 Tanı için asgari laboratuvar koĢulları 2.1. Laboratuvar güvenliği N. gonorrhoeae Risk Grubu 2 mikroorganizmadır ve bu organizmalarla ilgili iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün kültürler ve klinik örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli, daima standart önlemler uygulanmalı ve önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. Aerosol oluĢturması muhtemel tüm laboratuvar çalıĢmaları bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi”). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 5 / 23 Gonore 2.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) yöntem(ler)i uygulamadan önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıĢ olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aĢina olmalı, ve; (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. Testlerin prosedürlere uygun gerçekleĢtirilmesinden ve tanının doğruluğu ve güvenilirliğinden Mikrobiyoloji Uzmanı sorumludur. 2.3. Gonokok tanısında inceleme örnekleri Ġnceleme örneklerinin seçimi, özellikleri, alınması ve gönderilmesi ile ilgili bilgi için “BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi”ne baĢvurulmalıdır. AĢağıda bazı önemli noktalara tekrar dikkat çekilmektedir. Üretral akıntı Üretral akıntı yakınması olan hastadan mikroskopi ve kültür incelemeleri için ilk tercih edilecek örnektir.  Hasta, örnek vermeden önceki son 2 saat içinde idrar yapmamıĢ olmalıdır.  Örnek, hekim tarafından muayenehane Ģartlarında alınır. ĠĢlem ağrılı ve rahatsızlık vericidir. Gereken dikkat gösterilmelidir. Eküvyon amaç için uygun, tel saplı, ince sentetik (rayon veya dakron) uçlu olmalıdır.  Örnek alımı esnasında hastanenin mikrobiyoloji laboratuvarı uzmanının da bulunması ve örneğin hasta baĢında hemen uygun bir gonokok besiyerine ekilmesi ve mikroskopi için yayma hazırlanması ideal olur.  Ancak laboratuvar uzmanının katılması mümkün değilse hekim Ģu yolu izleyebilir. Çift eküvyon varsa; örnek aldığı ilk eküvyonu Amies TM‟ye koyarak laboratuvara gönderir; ikinci eküvyon ile aldığı örneği bir lam üzerine 12 cm alana sürer* ve yayma havada kurutulur; üzerine saf metanol eklenip sabitlenir ve lam kutusuna konarak laboratuvara gönderilir. Tek eküvyon varsa; eküvyon önce lama sürülerek yayma yapılır ve hemen ardından Amies TM içine konur; yayma sabitlenir ve Amies TM tüpü ile birlikte laboratuvara gönderilir (4). *ÖNEMLĠ: Eküvyon lam üzerine tek yöne doğru nazikçe döndürülerek sürülmelidir; yoksa nötrofiller parçalanabilir ve organizmaların karakteristik görüntüsü bozulabilir. İdrar (ilk akım; erkek hastadan) Üretral akıntı yakınması olan erkek hastadan tanı Ģansını yükseltmek için, akıntı örneği alındıktan hemen sonra idrar örneği alınması önerilir. Üretral akıntı örneğinin alınamadığı durumlarda da idrar alınıp incelenebilir. Hastalardan hem ilk-akım, hem de orta-akım idrar örnekleri alınmalıdır. Kültür ve moleküler testlerde ilk-akım örneğinin duyarlılığı yüksektir. Orta-akım idrar daha ziyade mikroskopik incelemede ön tanı amacıyla kullanılır. Kadınlarda idrar örneğinin gerek kültürler gerekse moleküler tanı için duyarlılığı düĢüktür. Sabah ilk idrar olması veya hastanın son 2 saat içinde idrar yapmamıĢ olması gerekir. Ġlk-akım idrar 20 mL‟den fazla olmamalıdır (4). Sayfa 6 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore Anorektal sürüntü Hekim tarafından muayenehane Ģartlarında alınır. Örnek alırken, dıĢkıya bulaĢtırılmamalıdır. Eküvyon Amies TB içine konur ve gönderilir (4). Endoservikal sürüntü Jinekolojik Ģartlarda hekim tarafından alınır. Eküvyona bol kolumnar epitel hücresinin bulaĢmasını sağlamak için örnek alırken epitel yüzeye hafif kuvvet uygulanmalı veya hücre fırçası (cytobrush) kullanılmalıdır. Eküvyon veya fırça Amies TM içine konur ve gönderilir (4). Endoservikal sürüntüden mikrokopik inceleme kesin tanı koydurucu değilse de yayma hazırlanmalıdır ve kültürlerdeki üreme ile birlikte değerlendirilmelidir. Orofarinks sürüntüsü Eküvyon ile tonsil pililerinden, farinks arkasından, ülsere veya pürülan akıntılı bölgelerden örnek alınır. Önce dil basacağı kullanılarak dil nazikçe aĢağı itilmiĢ olmalı, eküvyon dil veya yanağa değdirilmemelidir (4,6). Konjonktival sürüntü Her iki gözden ayrı bir eküvyonla olacak Ģekilde -konjonktivalara sürülerek- örnek alınır (4,6). Örnek topikal tedavi öncesinde alınmalıdır. Diğer klinik örnekler Gonore tanısı için ayrıca endometrium veya fallop tüpleri materyali, „cul de sac‟ aspiratı, Bartolin bezleri aspiratı, eklem sıvısı vb. alınıp gönderilir. Bu tür örnekler aseptik olarak, muayenehane veya operasyon Ģartlarında alınabilir. Aspirat örnekleri mümkünse >1 mL olmalıdır.  Hücre fırçası ya da eküvyon kullanılmıĢ ise hemen Amies TM içine daldırılır ve gönderilir.  Sıvı örnekler hemen T-I besiyerine inoküle edilmelidir. T-I mevcut değilse örnek steril vida kapaklı bir tüpe aktarılarak gönderilmelidir. ÖNEMLĠ: Aspirat materyali enjektör içinde laboratuvara gönderilmez. Eğer, enjektör ile gönderilmesi kaçınılmaz ise iğnesi atılır ve ağzına bir „Luer-Lok‟ takılır (Resim 1). Enjektör asla üzerinde iğne ile laboratuvara gönderilmez! Kan kültürü için kan örneği Gonokokların kan kültürlerinden izole edilme olasılığı için kan örneği de alınıp gönderilebilir. Kan kültürü alma prosedürü için bkz. “BulaĢıcı Hastalıkların Laboratuvar Tanısı için Saha Rehberi” Resim 1. Luer-Lok (sızdırmaz enjektör tıpası). Örneğin laboratuvara enjektör ile gönderilmesi kaçınılmaz ise, kesinlikle iğnesi çıkarılmıĢ (kesicidelici atık kutusuna atılmıĢ) ve ucu sızdırmaz bir Ģekilde tıpa ile kapatılmıĢ olmalıdır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 7 / 23 Gonore İnceleme örnekleri için önemli notlar Gonokoklar dıĢ ortam Ģartlarına çok duyarlı bakterilerdir. Kültürlerden izolasyonunda baĢarı örneğin alınması, gönderilmesi ve saklanması koĢulları ile doğrudan iliĢkilidir. Bu nedenle aĢağıdaki hususların daima göz önünde tutulması gerekir:  Gonokok bakterisi gün ıĢığı, sıcak ve soğuktan hızla etkilenir. Bu nedenle; örnekler en kısa sürede laboratuvara ulaĢtırılmalıdır. Soğuk zincir kullanılmaz! Kısa bir süre için bile olsa örnekler buzdolabına konmamalıdır! Birkaç saatlik gecikme kaçınılmaz ise örnek oda ısısı veya 35°C‟de bekletilebilir ve taĢınabilir. TaĢıma sırasında örneklerin aĢırı sıcaklık değerlerine (<18°C veya >37°C) maruz kalmasına izin verilmemelidir. TaĢıma için örnekleri 25-35°C‟de tutacak portatif inkübatör kullanmak ideal olur.  Örneklerin besiyerine ekilip yollanmasının avantajları vardır. Bu amaçla üretilmiĢ hazır ticari sistemler mevcuttur (JEMBEC, BD Diagnostic Systems; Gono-Pak, BD Diagnostic Systems; InTray Biomed Diagnostic Systems, vb). Bu sistemlerde uygun besiyerlerine ekim yapılır, hava geçirmeyen bir plastik pakete konur. Paket içindeki bikarbonat-sitrik asit pellet uygun Ģekilde ıslatıldığında gerekli nem ve CO2 seviyesi sağlanmıĢ olur (1,5,6).  “T-I besiyeri” yatık agar ve sıvı olmak üzere iki fazlı bir besiyeridir. T-I besiyerine konan örnekler bir gece 35°C‟de inkübe edildikten sonra ve/veya 24 saat içinde oda ısısında (>21°C) laboratuvara ulaĢtırılabilir. Bu besiyeri laboratuvarda hazırlanan bir besiyeridir ve ticari olarak piyasadan temin edilemez. Referans Laboratuvar tarafından üretilir ve Ġl Halk Sağlığı Müdürlüğünden temin edilebilir.  Örnek almadan önce bütün T-I besiyeri veya kan kültür ĢiĢelerinin lastik tıpaları %70‟lik izopropil alkol veya fenol bileĢikleri ile mutlaka dezenfekte edilmiĢ ve 1 dk beklenmiĢ olmalıdır (4).  Gonokok tanısı amacıyla örnek almak için kullanılacak eküvyonlar sentetik (dakron veya rayon) uçlu olmalıdır; üretradan örnek almak için ise ince uçlu ve esnek tel saplı olanlar kullanılır. Ticari ambalajında genellikle Amies TM ile birlikte satılırlar. Pamuk uçlu veya kalsiyum aljinatlı veya tahta saplı eküvyonlar ile alınmıĢ örnekler ret edilir.  Örnek olarak bir buyyona daldırılmıĢ bir eküvyon gönderilmemelidir; laboratuvara kabul edilmez. Biyolojik materyal taĢıma Ģartlarına uygun gönderilmemiĢ örnekler laboratuvara kabul edilmez (11). 2.4. Reaktif, Kit, Donanım Besiyeri / Reaktif  Gram boya ve Loeffler‟in metilen mavisi - N.gonorrhoeae‟nin klinik örneklerden mikroskopik incelemesinde kullanılan bu boyalar hazır olarak piyasadan temin edilebilecekleri gibi laboratuvarda da hazırlanabilirler (bkz. UMS-B-TP-03 ve UMS-B-TP-14)  Temel besiyerleri - TSA, Mueller Hinton agar, nutrient agar  Seçici olmayan besiyeri - Çikolata Agar Sayfa 8 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore  Seçici besiyerleri – N.gonorrhoeae izolasyonunda kullanılabilecek seçici besiyerleri aĢağıda listelenmiĢtir. Piyasadan hazır temin edilebilecekleri gibi toz maddelerinden laboratuvarda da hazırlanabilirler. (a) Modifiye Thayer Martin - vankomisin, kolistin, nistatin ve trimetoprim içerir (b) Martin-Lewis; vankomisin, kolistin ve anisomisin içerir (c) Thayer Martin-improved (Remel Inc.); vankomisin, kolistin, trimetoprim ve anisomisin içerir (d) Vankomisin içermeyen Thayer Martin (Remel Inc.) (e) Linkomisinli Martin-Lewis besiyeri (Hardy Diagnostics) (f) GC-Lect (BD Diagnostic Systems) - vankomisin, kolistin, trimetoprim, linkomisin ve amphoterisin B içerir. (g) New York City (BD Diagnostic Systems) - vankomisin, kolistin, trimetoprim, linkomisin ve amphoterisin B kapsar.  Oksidaz ayıracı  %30‟luk hidrojen peroksit Neisseria tanımlama sistemleri  Karbonhidratlara etki testleri (1,4,6) (a) %1 karbonhidrat içeren CTA (glikoz, maltoz, laktoz, ve sükroz); laboratuvarda hazırlanabilir. (b) %20 karbonhidrat içeren karbonhidrat degradasyon besiyeri (Remel, Inc.)  Koagülasyon (1,4,6) (a) Gonogen (New Horizons Diagnostics; BBL Microbiology, BD Diagnostic Systems) (b) Phadebact GC monoklonal antikor testi (Boule Diagnostics AB, Huddinge, Ġsveç)  Monoklonal antikor testleri (1,4,6) - GonoGen II (New Horizons Diagnostics; BBL Microbiology, BD Diagnostic Systems)  Kromojenik enzim substrat kullanım testleri (4,6) (a) RapID NH, BactiCard Neisseria, NET (Remel, Inc) (b) Gonocheck II (EY Laboratories, Inc., San Mateo, Calif) (c) Neisseriae Screen (Key Scientic Products, Round Rock, Tex.) (d) BBL Crystal N/H ID system (BD Diagnostic Systems) (e) Neisseriae/Haemophilus ID kit, API NH (bioMérieux)  Floresan antikor testi (1,4) - Syva MicroTrak N.gonorrhoeae kültür doğrulama testi (Trinity Biotech plc., Co. Wiclow, Ġrlanda)  Prob hibridizasyon (1,4) - AccuProbe N. gonorrhoeae kültür doğrulama testi (Gen-Probe, Inc.)  Moleküler testler (4,9,10,12,13) Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 9 / 23 Gonore (a) PACE 2 GC ve PACE 2 CT/GC (Genprobe Inc., San Diego, CA), (b) COBAS AMPLICOR (CT/NG) N. gonorrhoeae PCR (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ), (c) SDA (BD ProbeTecET, BD Biosciences), (d) TIMA (APTIMA COMBO 2, Genprobe, San Diego), (e) Digene Hybrid Capture Test (Digene Silver Spring,MD), (f) Real-Time CT/NG (Abbott), Xpert CT/NG (Cepheid) Diğer gereç, donanım Mikroskopi ve kültür için;  IĢık mikroskobu, binoküler - 10, 40 ve 100 immersiyon objektifleri ve 10 oküleri olan  Floresan mikroskop - 20, 40 ve 100 immersiyon objektifleri, 10 oküleri olan ve FITC konjugat için uygun filtreleri ile iyi çalıĢır durumda  Ġnkübatör (36°C) ve CO2‟li inkübatör (36°C) veya mumlu jar  Ġmmersiyon yağı  Kesici-delici atık kabı, toksik boya atıklarını toplamak için kap PCR ve diğer moleküler testler için;  En az üç ayrı oda - Nükleik asit ekstraksiyonu, PCR karıĢımının hazırlanması, amplifikasyonun ve sonuç gözetiminin yapılabileceği ayrı odalar. Ġdeal olarak PCR karıĢımı hazırlama odası (temiz oda) pozitif basınçlı, agaroz jel elektroforezi yapılan oda (kirli oda) negatif basınçlı havalandırmaya sahip olmalıdır.  Donanım – biyogüvenlik kabini, soğutmalı mikrosantrifüj, hassas terazi, vorteks, su banyosu, yatay çalkalayıcı, PCR ısı döngü cihazı, mikrodalga fırın, jel görüntüleme sistemi, elektroforez ünitesi vb. 2.5. Kalite kontrol4  Kullanmadan önce besiyerlerinin son kullanma tarihi içinde olduğundan emin olunmalıdır. Son kullanma tarihi dolmamıĢ olsa da eğer besiyerinde kuruma, çatlak vb. gözlenirse, kullanılmamalıdır. Güncel CLSI dokümanındaki kalite kontrol önerilerine uyulmalıdır.  Uzun süre depolanan besiyerlerinde nem kaybı sonucu içeriğindeki maddelerin yoğunluğu artabilir ve besiyeri üremeyi baskılayıcı özellik kazanabilir.  Antimikrobiyaller zaman içinde yıkılabilir. Bu nedenle, antibiyotik içeren besiyerlerinin etkinliği de zamanla azalabilir.  Tüm kit ve ayıraçların her lotu firma önerilerine göre test edilmelidir.  Kitlere dayalı testlerde her zaman kitin pozitif ve negatif kontrolleri kitte verilen prosedüre göre teste dahil edilmelidir.  Laboratuvar aynı zamanda kendi kalite kontrol örneklerine sahip olmalı ve testlere dahil etmelidir. Sayfa 10 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore  Bütün kalite kontrol sonuçları, kitin lot numarası, tarih ve diğer bilgilerle birlikte kalite kontrol kayıt defterine veya kartlarına kaydedilmelidir.  Genellikle Ģeker testleri veya kitler için Ģu kontrol suĢları kullanılır. N. gonorrhoeae ATCC 43069 Neisseria meningitidis ATCC 13077 Neisseria lactamica ATCC 23970 Moraxella catarrhalis ATCC 25240  Çikolata agar ve seçici besiyerlerinin her lotu için kalite kontrol yapılmalıdır. Besiyerlerinin kalite kontrolü için önerilen organizmalar aĢağıdaki tabloda verilmiĢtir.  Kalite kontrol için inoküle edilen besiyerleri %3-7 CO2‟li ortamda ve 35°C‟de, 24-48 saat inkübe edilmelidir. Besiyeri / Test organizması / ATCC no Sonuç Çikolata agar Neisseria gonorrhoeae 43069 veya 43070 Üreme Haemophilus influenzae 10211 Üreme Patojen Neisseria spp için seçici besiyerleri Neisseria gonorrhoeae 43069 veya 43070 Proteus mirabilis 43071 (Sadece trimetoprim içeren besiyerleri için) Staphylococcus epidermidis 12228 Üreme Üremede kısmi engellenme Üremede kısmi engellenme 3 Gonore tanısında kullanılan teknikler 3.1. Direkt testler Gram boya  Üretral ve endoservikal yaymalar mutlaka Gram boya ile boyanmalıdır.  Ayrıca eklem sıvısı ve deri lezyonları gibi normalde steril veya minimal kontamine alanlardan da Gram boyama yapılmalıdır (4,7).  Gram boya prosedürü için ilgili UMS belgesine bakınız (UMS-B-TP-03).  Semptomatik erkekte üretral akıntı örneğinin Gram boyasında bol PNL ve gram negatif kahve çekirdeği Ģeklinde, hücre içi diplokokların görülmesi kesin tanı bulgusudur. Duyarlılığı >%95, özgüllüğü >%99 olarak bulunmuĢtur (2,3).  Kadında ise normal flora gram negatif kokobasiller içerebildiği için Gram yaymasında pozitiflik olası tanı bulgusudur, kültürle doğrulanmalıdır. Enfekte kadınların sadece %50‟inde Gram boya bulgusu görülür (3).  Faringeal ve rektal örneklerden Gram boyama yapılmaz (4,6). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 11 / 23 Gonore Prob testleri  Genellikle endoservikal veya üretral örneklerden çalıĢılırlar. AĢağıda “Moleküler Testler” baĢlığı altında anlatılacaktır. 3.2. Kültür  Her örneğe uygulanabilmesi ve gerektiğinde antibiyotik duyarlılık testi yapılabilmesi avantajlarıdır. Duyarlılığı örneğe göre %72-95 arasında değiĢir. Geç sonuç vermesi ve özellikle asemptomatik enfeksiyonlarda duyarlılığın %62-85‟e düĢmesi önemli dezavantajlarıdır (3).  Örnek gelir gelmez çikolata agar ve seçici besiyerlerinden birine (MTM gibi) ekim yapılır.  Plaklar 35-37°C‟de , %3-7 CO2 içeren CO2 etüv veya mumlu jarda, nemli ortamda 72 saat (kan kültürü için 10 gün) inkübe edilir (4,6). NOT 1: Mumlu jar için kullanılan mum beyaz ve kokusuz olmalıdır, diğer tipler üremeyi engelleyebilir. NOT 2: Nemli ortam etüv tabanına geniĢ bir cam tepsi ile distile su konarak elde edilir. Tepsinin kuru kalmasına izin verilmemeli, düzenli aralarla kontrol edilerek su eklenmelidir. Eğer mumlu jar kullanılıyorsa jarın tabanına distile su ile ıslatılmıĢ filtre kağıdı serilmelidir. NOT 3: Örnekler doğrulama gereksinimi için mutlaka saklanmalıdır.  Tüm plaklar 24 saat sonra incelenir; üreme yoksa 72 saat inkübe edilir. Eğer üreme var ise akıĢ Ģemasına göre tanımlama basamaklarına geçilir (bkz. ġekil 1).  Tipik küçük, gri-beyaz, dıĢbükey, yarı- saydam, dıĢbükey kolonilerdir ama S tipi olabildiği gibi düzensiz kenarları plili tipler de görülebilir.  ġüpheli kolonilerden Gram boyama ve oksidaz testi yapılır. Oksidaz pozitif, gram negatif komĢu kenarları düz diplokoklar izolatın Neisseriae sp olabileceğini düĢündürür. Oksidaz testi yapılıĢ prosedürü için ilgili UMS belgesine bakınız (UMS-B-TP-16).  Tanımlama testleri yapılır. Eğer örnek genital sistem dıĢındaki bir bölgeden veya bir çocuktan alınmıĢ ise iki kültür doğrulama testi yapılmalıdır; karbonhidratlara etki testleri, immünolojik testler (monoklonal antikor floresan testleri, koagülasyon testleri), enzimatik prosedürler (spesifik enzim aktivitelerinin kromojenik saptanması gibi) veya DNA prob kültür doğrulama testi (1,2,4). (a) Süperokzol test için, %30‟luk H2O2 koloni üzerine dökülür; N.gonorrhoeae anında patlar tarzda köpürür. N.meningitidis ve M.catarrhalis’in bazı suĢları zayıf pozitif olsa da pozitif sonuç N.gonorrhoeae için olası tanı bulgusudur. (b) TSA, MHA veya nutrient agar gibi temel besiyerlerinden birine ve çikolata agara paralel pasaj yapılır. Bir gecelik inkübasyondan sonra çikolata agarda üreme olup, temel besiyerinde üreme olmaması N. gonorrhoeae için olası tanı bulgusudur (ġekil 1) (4). Sayfa 12 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore Ġlk ekim plaklarını incele SB‟de 24 saatte üreme yok SB‟de üreme var Çikolata agarı incele Plakları 72 saat inkübe et, oksidaz + koloni ara Oksidaz - / GN diplokok yok Oksidaz- / GN diplokok yok Oksidaz+, GN diplokok Superokzol test + (%30‟luk H2O2 ile 4+) Katalaz - Temel besiyerinde üreme yok N.gonorrhoeae için doğrulama testi yap Temel besiyerinde üreme var N.gonorrhoeae olarak tanımlanamaz veya örnek çocuktan ise farklı bir kitle çalıĢ N.gonorrhoeae olarak tanımlanırsa rapor et N.gonorrhoeae olarak tanımlanamaz ise referans laboratuvara gönder Rapor et N.gonorrhoeae üredi Rapor et: N.gonorrhoeae üremedi Şekil 1. Kültür ile N.gonorrhoeae tanısı. Kültür plaklarının ilk değerlendirmesi yapıldıktan sonra Ģüpheli izolatların kesin tanımlaması için akıĢ Ģemasında verilen yol izlenir. (SB, seçici besiyeri; GN, gram negatif) 3.3. Kültür doğrulama testleri  AĢağıdaki metotlardan birini laboratuvarınızda kullanacağınız temel test olarak seçmeniz önerilir. Doğrulama testlerinin uygulanmasında akılda tutulması gereken en önemli hususlar Ģu Ģekilde sıralanabilir: (a) Doğrulama testlerinden herhangi biri ile elde edilen tek negatif sonuç N.gonorrhoeae tanısını dıĢlamaz. (b) Temel besiyerlerinde üremeyen, seçici besiyerinde üreyen, oksidaz pozitif, gram negatif diplokok ısrarla doğrulama testlerinden birinde negatif sonuç veriyorsa ileri araĢtırma için yeterli bir laboratuvara gönderilmelidir (bkz. ġekil 1) (4,6).  N. gonorrhoeae‟nin ayırıcı tanısında kullanılacak biyokimyasal reaksiyonlar Tablo 1‟de gösterilmiĢtir (4).  Özellikle N. gonorrhoeae‟nin kültürlerden doğrulanması için tasarlanmamıĢ ancak veri tabanında N. gonorrhoeae‟nin de yer aldığı biyokimyasal ve/veya enzimatik bakteri tanımlama sistemleri mevcuttur (ör., API NH- Biomérieux, IDS RapID NH panel- Remel, Inc., BBL Crystal N/H ID kit- BD Diagnostic Systems, Vitek NHI cardBiomérieux, Microscan HNID- Dade Behring) ve bunlarla doğru sonuçlar elde edildiği bildirilmiĢtir (1,4,6). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 13 / 23 Gonore Karbonhidratlara etki testleri  %1 Ģeker eklenmiĢ CTA - Fenol kırmızısı ve glikoz, maltoz, sukroz, laktoz içeren besiyeri tüplerine ve Ģeker içermeyen kontrol tüpüne, Ģüpheli kolonilerin çikolata agardaki 18-24 saatlik saf kültüründen yoğun ekim yapılır. Bir gecelik inkübasyon sonrasında N.gonorrhoeae sadece glikoz içeren tüpte asit reaksiyonla sarı renk oluĢturur (4).  %20 Ģeker eklenmiĢ CTA - Aynı Ģekilde tüplere yoğun ekimler yapılır, 1-4 saat inkübasyon sonucunda değerlendirilir (4).  RIM-NEISSERIAE Testi (Remel Laboratories) - Bu kit sistemi küçük miktarlarda Ģeker içeren mikrotüpler içerir. ġüpheli kolonilerden yapılan ekimler sonrasında 1 saat inkübe edilir. Negatif Ģeker reaksiyonları pembe-kırmızı, pozitifler sarı renk verir (4).  Diğer Ģeker fermantasyon testleri - Neisseria-Kwick test kiti (MicroBiologics, St.Cloud MN), Gonobio Test (I.A.F. Production, Inc., Laval, Kanada); ticari hızlı Ģeker testleridir. Ekim sonrası 3-4 saatte değerlendirilirler (6). N. gonorrhoeae 4+ R +/N. menengitidis 2-4+ D R + +/N. lactamica 2+ + R + + + N. cinerea 2+ + D D N. flavescens 2+ + S N. elongata 2+ + S Diğer Neisseria spp 2+ + D + + M. catarrhalis 2-4+ + D Kingella + R + D PRO, propil-iminopeptidaz; GLUT, d-glutamil-aminopeptidaz; D, değiĢken +/-, genellikle pozitif ama nadiren negatif sonuç; R, dirençli; S, duyarlı PRO GLUT + D + + + + D D D D D D reaksiyonlar; Butirat Kolistin disk Sükroz Temel besiyerinde üreme Laktoz Süper okzol Maltoz Organizma Glikoz Tablo 1. Neisseria ve benzeri mikroorganizmaların biyokimyasal reaksiyonları + - Monoklonal antikor bazlı koagülasyon testleri  N.gonorrhoeae‟nin kültürden doğrulanması amacıyla monoklonal antikor bazlı koagülasyon testleri de kullanılabilir. AĢağıda bu testlerin kullanım prosedürü özetlenmektedir (4,6).  BBL GonoGen – Test, organizmanın majör dıĢ membran proteininin (protein I‟in) tanınması esasına dayanır. (a) ġüpheli kolonilerden McFarland no 3 bulanıklığında süspansiyon hazırlanır. Süspansiyon 100°C‟de 10 dk ısıtılır, oda ısısına soğutulduktan sonra vortekslenir. (b) Bir lam üstüne “Reagen G” pozitif, negatif kontrol ve süspansiyon için ayrı ayrı damlatılır. Süspansiyonun bir damlası, pozitif ve negatif kontroller “Reagen G” üzerine eklenip karıĢtırılır. (c) 2 dk içinde görünür aglütinasyon pozitif olarak değerlendirilir. Sayfa 14 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore  Phadebact GC monoklonal test - Cansız stafilokok Protein A„sına bağlı gonokok spesifik membran proteini (protein I) saptanır (4,6). (a) 0.5 McFarland ayarında bir bakteri süspansiyonu hazırlanır. (b) Süspansiyon 5 dk kaynatılır, oda ısısına soğutulur. (c) Bir lam üzerinde bir damla gonokokkal monoklonal ayıracından ile bir damla süspansiyon karıĢtırılır. (d) 1 dk içinde görünür aglütinasyon pozitif olarak değerlendirilir.  GonoGen II - Monoklonal antikor bazlı kolorimetrik koagülasyon testidir. Test protein I‟in tanınması esasına dayanır (1,4,6). (a) Pozitif, negatif kontroller ve test edilecek izolat için üç ayrı tüpe 500 µL GonoGen II eritici tamponundan konur. (b) Bu tüplerde McFarland no.1 ayarında süspansiyon hazırlanır. (c) Her tüpe birer damla GonoGen II murine monoklonal antikor solüsyonundan konur, iyice karıĢtırılıp, oda ısısında 5 dk bekletilir. (d) Reaksiyon kuyucuklarına her test tüpünden 2 damla aktarılır ve kuyucuk matriksi tarafından emilmesi beklenir. (e) Test kuyucuğunda pembe-kırmızı renk oluĢumu pozitif olarak değerlendirilir. Kromojenik substrat testleri  Patojen Neisseriae türlerinin oluĢturduğu enzimlerin saptanması ve böylece türlerin ayırıcı tanısı için kromojenik substratların kullanıldığı hazır kitlerden de yararlanılır.  Ġncelenen izolatın seçici besiyerinde üreyen ama temel besiyerinde üremeyen suĢ olmasına dikkat edilmelidir.  BactiCard Neisseria - 4 kromojenik substrat test reaksiyon kartına emdirilmiĢtir. N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica ve M.catarrhalis ayrımını sağlar (6). (a) Her bir substrat dairesi 1 damla Bacticard rehidrasyon sıvısıyla ıslatılır. (b) Tahta aplikatör kullanılarak Ģüpheli koloniler her bir substrat dairesi üzerine sürülür. (c) Oda ısısında 2 dk inkübe edilir. (d) Her bir dairede mavi-yeĢil renk var ise veya renk oluĢturucu damlatıldıktan sonra pembe-kırmızı renk meydana gelmiĢ ise pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. (e) N. gonorrhoeae prolil-iminopeptidaz için pozitif, -galaktozidaz, butirat esteraz ve -glutamil-amino-peptidaz negatiftir. (f) Kingella, N.cinerae ve N.subflava, N.gonorrhoeae benzeri sonuç verebilir.  Gonocheck II, NET ve Neisseriae Screen - 3 kromojenik substrat bir test tüpünde hazırlanmıĢtır. N. gonorrhoeae, N. menengitidis ve N.lactamica ayrımını sağlar (6). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 15 / 23 Gonore (a) Reajen tüpüne 4 damla reajen tamponundan konur. (b) ġüpheli izolattan 5-10 koloni alınarak tüp içinde homojenize edilir. (c) 30 dk 37°C‟de inkübe edilir. (d) Sarı renk (-glutamil-amino-peptidaz pozitif) oluĢması N.meningitidis olarak değerlendirilir. (e) Mavi renk (indolil--D-galaktozidaz pozitif) oluĢması N. lactamica olarak değerlendirilir. (f) Eğer renk değiĢimi görülmez ise beyaz tüp kapağı çıkarılıp kırmızı kapak takılır (Gonocheck II). (g) Solüsyonla karıĢması için tüp ters çevrilir (alternatif olarak NET veya Neisseriae Screen için tüpe reaktif eklenebilir). Tekrar düz çevrilince oluĢan kırmızı renk (prolil-iminopeptidaz pozitif) N.gonorrhoeae olarak değerlendirilir. (h) Kingella, N. cinerae ve N. subflava N. gonorrhoeae benzeri sonuç verebilir. Direkt floresan antikor (DFA)  N. gonorrhoeae‟nin kültürlerden doğrulanmasında DFA‟da kullanılabilir.  MikroTrak N. gonorrhoeae kültür doğrulama reaktifi – FITC ile iĢaretli monoklonal antikor kullanan DFA testidir. Testin 18-24 saatlik taze pasajlardan yapılması gerekir. Kültür 24 saatten yaĢlı ise yeniden pasajlanmalıdır. (a) Lam kuyucuğuna 5 µl distile veya deiyonize su konur; öze ile Ģüpheli koloniden alınarak damlada homojenize edilir ve kuyucuğa yayılır. Pozitif ve negatif kontrol suĢlarından da aynı Ģekilde pozitif ve negatif kontrol kuyucukları hazırlanır. (b) Lam havada kurutulur ve ısı ile fikse edilir. (c) Her kuyucuğa 30 µl “MicroTrak N.gonorrhoeae kültür doğrulama reaktifi” konur ve lam 15 dk 37°C‟de nemli ortamda inkübe edilir. (d) Reaktif fazlası yumuĢak bir Ģekilde 5-10 sn su ile yıkanır; lam havada kurutulur. (e) Üzerine bir damla „mounting‟ sıvısı konup lamel kapatılır; 100 objektifle floresan mikroskopta inceleme yapılır. (f) Elma yeĢili floresan veren diplokokların görülmesi pozitiflik olarak değerlendirilir. DNA prob testi  N.gonorrhoeae‟nin kültürlerden doğrulanmasında DNA probları da kullanılmaktadır.  Accuprobe - N. gonorrhoeae‟nin rRNA sekansını tanıyan kemiluminesanla iĢaretli ss-DNA probu kullanan bir sistemdir. Hedef RNA serbestleĢtirildikten sonra, DNA probe stabil bir DNA:RNA oluĢturur. Hibridize olmayan prob reaktifle uzaklaĢtırılır ve iĢaretlenmiĢ DNA:RNA hibriti luminatörle saptanır. Bu testin duyarlılığı %100‟dür (4,6). Sayfa 16 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore (a) AraĢtırılacak izolat sayısı kadar ve bir pozitif (N. gonorrhoeae) ve bir negatif (N. meningitidis) kontrol için prob reaktif tüpleri etiketlenir. (b) Her tüpe 50 µL lizis reaktif (eritici) konur. (c) Her tüpe bir küçük öze dolusu koloni (<48 saatlik kültürlerden) konup iyice homojenize edilir. (d) Her tüpe 50 µL hibridizasyon tamponu konur, vortekslenir. (e) Tüpler 5 dk 60°C su banyosu veya kuru-ısı bloğunda inkübe edilir. (f) Tüpler oda ısısına getirildikten sonra her tüpe 300 µL „selection‟ reaktifi eklenir ve vortekslenir. (g) Tüpler tekrar 5 dk 60°C su banyosu veya kuru-ısı bloğunda inkübe edilir. (h) Tüpler oda ısısına getirilir ve 30 dk içinde luminometrede sonuçlar okutulur. Pozitif ve negatif sinyaller için eĢik değerler, kullanılan luminometrenin tipine göre üretici firma tarafından verilmiĢtir. 3.4. Moleküler testler  Primer örnekten çalıĢılan ve doğrudan N. gonorrhoeae genomunun saptandığı hibridizasyon (NAH) ve amplifikasyon (NAAT) yöntemleri de kullanılmaktadır.  NAH testleri kadın endoservikal ve erkek üretral akıntı örneklerinden, NAAT ise endoservikal, vajinal, üretral sürüntü ve idrar örneklerinden çalıĢılabilir. Yine de NAAT testlerinin kullanma talimatları incelenmeli, hangi örnekler için onay aldığına bakılmalıdır. CDC komplike olmayan ürogenital enfeksiyonlar için NAAT önermektedir (2,3).  Moleküler metotların en önemli avantajı; idrar gibi kolay elde edilen örneklerle çalıĢılabilmesi, kısa sürede sonuç alınması ve kültüre göre oldukça yüksek duyarlılıkta olmalarıdır (1,2,4). Ancak pahalı metotlardır, özel çalıĢma alanları ve eğitimli personel ihtiyacı vardır (1,4,12). Yeni ortaya çıkan antibiyotik dirençli gonokok izolatlarını tespit edemeyebilirler.  Genital bölge dıĢı gonore enfeksiyonunda ve çocuklardaki genital, rektal veya faringeal enfeksiyonlarda mutlaka kültür yapılmalıdır (2,3,4). Tanıda kullanılan moleküler testler aĢağıda listelenmiĢtir. (a) PACE 2 GC ve PACE 2 CT/GC (Genprobe Inc., San Diego, CA) Gonokokkal rRNA hibritleyen nonizotopik kemilumisan DNA prob sistemidir. Kültürden daha duyarlıdır. Duyarlılığı endoservikal örnekler için %85.5-100, erkek üretral örnekleri için %100‟dür. Özgüllüğü ise endoservikal örnekler için %93.5-99.7, erkek üretral örnekleri için %82.2-99.9‟dur. Faringeal ve rektal örnekler için de kullanılabilir ama FDA (Food and Drug Administration, U.S.) onayı henüz yoktur (6). (b) GC-ID HC2DNA Test ve CT/GC-ID HC2DNA Test (Qiagen) - Hibrit capture yöntemini kullanır (9,10). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 17 / 23 Gonore (c) SDA (BD ProbeTecET C. trohomatis ve N. gonorrhoeae Amplified DNA Assay, BD Biosciences) - ÇeĢitli çalıĢmalarda çalıĢılan örnek tipine göre %84.9-100 duyarlılık ve % 94.4-100 özgüllük bildirilmiĢtir (6,12). (d) AMPLICOR N.gonorrhoeae PCR, COBAS AMPLICOR N.gonorrhoeae PCR (Roche Diagnostic Systems, Branchburg, NJ) - ÇeĢitli çalıĢmalarda çalıĢılan örnek tipine göre %94.4-100 duyarlılık ve %95.9-100 özgüllük bildirilmiĢtir (6,9,10,12). (e) TIMA (APTIMA COMBO 2, Genprobe, San Diego) - ÇeĢitli çalıĢmalarda çalıĢılan örnek tipine göre %99.2-98.7 duyarlılık ve %91.3-99.3 özgüllük bildirilmiĢtir (6,12). (f) Digene Hybrid Capture Test (Digene Silver Spring, MD) - ÇeĢitli çalıĢmalarda çalıĢılan örnek tipine göre %92.2-92.6 duyarlılık ve %98.5-99. özgüllük bildirilmiĢtir (6,12). (g) „Real-Time‟ PCR (Real-Time CT/NG, Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL) - Kit içeriğine göre duyarlılık %98, özgüllük %99.7‟dır (12). (h) „Real-Time‟ PCR (Xpert CT/NG, Cepheid) - 90 dakikada sonuç veren hızlı tam otomatik gerçek-zamanlı bir PCR sistemidir. Örneğe bağlı olarak duyarlılığı %95.6-99.9 ve özgüllüğü %98-100 olarak saptanmıĢtır (13). 3.5. MALDI-TOF MS  3.6. MALDI-TOF MS patojen Neisseriae tanımlanmasında yeni kullanıma giren bir tekniktir. Dakikalar içinde sonuç alınabilir (1). EIA  Endoservikal ve idrar örnekleri için EIA geliĢtirilmiĢtir ama pozitif tahmini değer düĢük olduğu için kullanımı yaygınlaĢmamıĢtır (3). 3.7. Tiplendirme  Oksotiplendirme; çeĢitli besin maddelerinin (aminoasitler, pürinler, primidinler ve vitaminler) bakteri üremesi üzerine etkilerine bakılarak yapılabilir. Yeterince iyi bir test olmadığı gibi zahmetli ve zaman alan bir teknik olduğu için yerini genotiplendirmeye bırakmıĢtır (12,14).  Serotiplendirme; dıĢ membran por proteininin çeĢitli antijenik tiplerine karĢı geliĢmiĢ antikorlar aranarak yapılabilir. Oksotiplendirmeden daha ayırt edici, uygulaması daha kolay, nispeten daha ucuz yöntemlerdir. Artık yerini genotiplendirmelere bırakmıĢtır (12,14).  DNA-bazlı tiplendirme metodları; DNA bantlarını jel elektroforezle analiz eden plazmid analizi, RFLP, PFGE, ribotipleme, Opa tipleme, PCR-bazlı tiplendirmeler gibi jel-bazlı ve porB sekans analizi, NG-MAST ve MLST gibi DNA sekanslama yapan DNA-sekans bazlı iki çeĢit yöntem kullanan metotlar vardır. Mikro ve makroepidemiyolojik amaçlarla kullanılırlar (14). Sayfa 18 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore 3.8. Hasta baĢı hızlı testler  Lökosit esteraz testleri - ÇeĢitli çalıĢmalarda bu testlerin duyarlığı %71 ve özgüllükleri %70 bulunmuĢtur. Genellikle üç aĢamalı ve iki dakikada sonuç veren testlerdir (15,16).  Ġmmünokromatografik stripler - ÇeĢitli çalıĢmalarda bu testlerin duyarlığı %70 ve özgüllükleri %96 bulunmuĢtur. Genellikle beĢ ila yedi aĢamalı ve 15-30 dakikada sonuç veren testlerdir (15,16). 3.9. Antibiyotik duyarlılık testi  Rutin olarak antibiyotik duyarlılık testi yapılmaz. Tedaviye direnç varsa veya yeni ve direnci bilinmeyen bir antibiyotik söz konusu ise ADT yapılır.  ADT referans laboratuvarlarına bırakılmıĢtır.  CLSI N. gonorrhoeae disk difüzyon testi için %1 üreme zenginleĢtirici eklenmiĢ GC agar kullanılmasını önermektedir. 0.5 McFarland ayarlı bakteri süspansiyonu kullanılır.  CLSI, minimum inhibitör konsantrasyon (MIK) ölçümü için agar dilüsyon önermektedir ama kullanımı kolay gradient difüzyon (E-test vb.) sistemleri de kullanılabilir (1,2,4,6,17).  Gonore tedavisinde antibiyotiklere karĢı artan direnç geliĢimi olduğu için tedavide genellikle seftriakson, sefiksim kullanılmaktadır.  Hastaların cinsel partnerleri de tedavi edilmelidir. N. gonorrhoeae genellikle C. trahomatis ile ko-enfekte olduğu için her iki mikroorganizmaya etkili tedavi rejimi seçilmesi önerilir. Bunun için tedaviye azitromisin veya doksisiklin eklenir (2,17,18). 3.10. Saklama, Referans merkeze gönderme  Ġzolatlar laboratuvarda saklanmalı ve gerektiğinde ulusal antibiyotik direnç profillerinin araĢtırılması ya da epidemiyolojik analizler için referans laboratuvara gönderilmelidir.  Örneklerin veya izolatların gönderilmesinde paketleme ve taşıma biyolojik materyal taĢıma kurallarına uygun olmalıdır (11) (ayrıca bkz. UMS GEN-OY-01 Enfeksiyöz Maddelerin TaĢınması Rehberi).  Bir izolat mümkünse birden fazla alikot halinde saklanmalıdır.  N. gonorrhoeae izolatları %16‟lık gliserol buyyon içinde veya 3 MM Whatman filtre kağıtlarına emdirilerek -70°C‟de veya sıvı azot (-120°C) içinde yıllarca saklanabilir. Bu imkanları olmayan laboratuvarlar izolatlarını -20°C‟de yaklaĢık bir yıl saklayabilir (bkz. UMS-B-TP-01).  Ayrıca yatık çikolata agara yapılmıĢ pasajların üzerine steril sıvı parafin eklenerek izolatlar üç ay kadar saklanabilir.  Eğer liyofilizasyon yapılabilirse, izolatlar +4°C‟de veya oda ısısında uzun yıllar saklanabilir (19). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 19 / 23 Gonore 4 Test sonuçlarının yorumu, raporlama, bildirim ÖNEMLĠ: Gonore tanısı alan tüm hastalar cinsel temasla bulaĢan klamidya, sifiliz ve HIV gibi diğer hastalıklar açısından da taranmalıdır (2,3). Gram boyama  Gram boyama sonucu en kısa zamanda, tercihen bir saat içinde raporlanmalıdır.  “Gram-negatif hücre içi diplokok görüldü” veya “görülmedi” Ģeklinde raporlanır.  Pozitif sonuç, erkek üretral akıntısında tanı koydurucudur ama vajinal, servikal ve diğer örnekler için tanı koydurucu değildir.  Eğer pozitiflik varsa klinisyene bildirilmelidir. Gram boyama sonucunun negatif olması enfeksiyonu dıĢlamaz (4,6). Kültür  Negatif kültür “Neisseria gonorrhoeae üremedi” Ģeklinde rapor edilir.  Gerekirse aĢağıdaki örnekler gibi notlar eklenebilir (4); (a) “Örnekte bol normal flora bakterileri üremiĢtir. Yeni bir örnekle kültür tekrarı önerilir.” (b) “Örnek Neisseria gonorrhoeae için inhibitör olan mayalarla kontaminedir. Yeni bir örnekle kültür tekrarı önerilir.” (c) “Örneğin alındıktan sonra laboratuvara teslim süresi ..... saattir. Bu tür örneklerde Neisseria gonorrhoeae üreme oranı düĢmektedir.”  Pozitif kültürler olası cins ve tür belirtilerek rapor edilmelidir; “Neisseria gonorrhoeae üredi.”  Klinisyene bilgi verilmelidir.  Eğer hasta çocuk ise veya yasal bir durum söz konusu ise izolatlar gerekli incelemeler için dondurulmalıdır.  Kültürün pozitifliği enfeksiyon göstergesidir; “kesin tanı” bulgusudur. Negatif kültür sonucu enfeksiyonu dıĢlamaz (1,4,6). Moleküler raporlama  Kullanılan testin hangi mikroorganizmayı saptadığı mutlaka belirtilmelidir. Bazı testler her iki etkeni birden saptar ama ayırt etmez. “C. trachomatis ve/veya N. gonorrhoeae rRNA saptandı/saptanmadı” Ģeklinde rapor edilmelidir (9,10). Bildirim  Gonore ülkemizde rutin izlenen, bildirimi zorunlu bir hastalıktır (20).  Olguların kayıt ve bildirimi için Sağlık Bakanlığının yayınlamıĢ olduğu “BulaĢıcı hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi” izlenmelidir (21). Sayfa 20 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore 5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar  Mikroorganizmanın yanlıĢ tanımlanması sonucu yalancı pozitif sonuç raporlanabilir.  Örneğin uygun olmayan koĢullarda veya gecikmiĢ taĢınması yalancı negatif sonuçlara neden olabilir.  Doğrulama testlerinden tek bir negatif sonuç olması N. gonorrhoeae tanısını dıĢlamaz. Ek doğrulama testi yapılmalıdır.  ġeker fermantasyon testlerinde nadiren glikoz negatif N. gonorrhoeae veya maltoz negatif N. meningitidis olabilir. Farklı bir metot ile doğrulama mutlaka yapılmalıdır.  Çocuk istismarı şüphesinde mutlaka kültür ve birden fazla kültür doğrulama testi yapılmalıdır.  Farinkste genellikle saprofit olarak bulunan N. cinerea‟nın etken olduğu konjonktivit, bakteriyemi ve peritonit olguları bildirilmiĢtir. N. cinerea bazı hızlı tanı sistemlerinde N. gonorrhoeae ile karıĢabilir ama kolistine duyarlıdır ve çoğu suĢu temel besiyerlerinde ürer.  CO2 üreten sistemler tercih edilmelidir. Eğer mumlu jar kullanılacak ise beyaz, kokusuz mum kullanılmalıdır.  Monoklonal antikorlar N. gonorrhoeae‟in tüm suĢlarıyla reaksiyon vermeyebilir. Ayrıca N. meningitidis ile yalancı pozitif sonuçlar da raporlanmıĢtır.  NAH testleri idrar, faringeal ve rektal örneklerden yapılamaz. Endoservikal ve erkek üretral örnekleri için kullanılır ama duyarlılıkları NAAT‟e göre daha düĢüktür (2,3). İlgili diğer UMS belgeleri Bu prosedür belgesi (Gonorenin Mikrobiyolojik Tanısı) aĢağıda verilen UMS belgeleriyle de ilgilidir ve ilave bilgi için bu belgelere de bakılması önerilir: UMS, UMS, UMS, UMS, UMS, B-TP-01 B-TP-03 B-TP-14 B-TP-10 B-TP-16 UMS, B-MT-03 SuĢ saklama prosedürü Gram boyama Loeffler'in metilen mavisi Katalaz testi Oksidaz testi Neisseria meningitidis enfeksiyonunun mikrobiyolojik tanısı (Ģeker utilizasyon testleri ve diğer tanımlama basamakları için) UMS, AMD-TP-01 AMD testleri için besiyerlerinin hazırlanması UMS, AMD-TP-04 MIK saptama yöntemleri UMS, GEN-ÖY-01 Enfeksiyöz maddelerin taĢınması rehberi Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 21 / 23 Gonore Kaynaklar 1 Elias J, Frosch M, Vogel U. Neisseria. In: Versalovic J (ed in chief). Manual of Clinical Microbiology. 10th ed., ASM Press, Washington D.C. 2011. p.559-573 2 Workowski KA, Berman S. (CDC). Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2010. MMWR Recomm Rep 2010 Dec 17;59(RR-12):1-110 3 Swaygard H, Sena AC, Cohen MS, et al. Diagnosis of gonococcal infections. UpToDate, Nov 2012. http://www.uptodate.com/contents/diagnosis-of-gonococcalinfections?source=search_result&search=neisseria+diagnosis&selectedTitle=71%7E150 (son eriĢim tarihi: 20.12.2013) 4 Dunne WM. Neisseria gonorrhoeae cultures. In: Garcia LS (ed in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed. ASM Press, Washington D.C. 2010, p. 3.9.3.1- 3.9.3.13 5 Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Neisseria and Moraxella catarrhalis. In: Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 12th ed., Mosby Elsevier Press, St. Louis, MO. 2007, p. 447-453 6 Winn Jr W, Allen S, Janda W, Konemann E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G. Neisseria species and Moraxaella catarrhalis. In: Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 6th ed., Lippincott Williams and Wilkins; Philadelphia, PA: c2006, p.566-622 7 Mayor MT, Roett MA, Uduhiri KA. Diagnosis and management of gonococcal infections. Am Fam Physician 2012;86(10):931-8 8 Health Protection Agency. Identification of Neisseria species. National Standart Method NSM BSOP ID6 Issuex. 2007. http://www.hpa-standartmethods.org.uk/pdf (son eriĢim tarihi: 18.12.2013) 9 Leber AL. Amplification-based methods. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed., ASM Press, Washington D.C. 2010, p. 12.2.3.1- 12.2.3.11 10 Novak-Weekley S. Nucleic acid probe-based methods. In: Garcia LS (editor in chief). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3rd ed., ASM Press, Washington D.C. 2010, p. 12.2.2.112.2.2.6 11 Enfeksiyöz madde ile enfeksiyöz tanı ve klinik örneği taĢıma yönetmeliği. Sağlık Bakanlığı, Ankara. Resmi Gazete 25.09.2010 – 27710. 12 Health Protection Agency. Detection of Neisseria gonorrhoeae using Molecular Methods. UK Standarts for Microbiology Investigations. P 6 Issue 2. 2012. http://www.hpa-org.uk//SMI/pdf (son eriĢim tarihi: 18.12.2013) 13 Gaydos CA, Van Der Pol B, Jett-Goheen M, et al. Performance of Cepheid CT/NG Xpert rapid PCR test for the detection of Chlamydiae trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. J Clin Microbiol 2013;51(6):1666-72 14 Unemo M, Dillon JR. Review and international recommendation of methods for typing Neisseria gonorrhoeae isolates and their implications for improved knowledge of gonococcal epidemiology, treatment and biology. Clin Microbiol Rev 2011;24(3):447-458 15 Peeling RW, Mabey D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infect 2010;16(8):1062-1069 16 Watchirs Smith LA, Hillman R, Ward J, et al. Point-of care tests for the diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infection: a systematic review of operational and performance characteristics. Sex Transm Infect 2013;89(4):320-6 17 CLSI. Performance standarts for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twenty fourth informational supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 2013 18 Chanal J, Lassau F, Morand P, et al. What‟s new in the diagnosis of treatment of Neisseria gonorrhoeae. Presse Med 2013;42(4 Pt 1):458-8 19 Laboratory Manual. Identification and antimicrobial susceptibility testing of Neisseria gonorrhoeae. 2011. http://www.gasp-lac.net/wp-content/uploads2/EnglishFull_FINALVERSION-1_Mar-27-2012.pdf (son eriĢim tarihi: 18.12.2013) Sayfa 22 / 23 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-MT-17 / Mikrobiyolojik Tanımlama / Bakteriyoloji Gonore 20 BulaĢıcı Hastalıklar Sürveyans ve Kontrol Esasları Yönetmeliğinde DeğiĢiklik Yapılmasına Dair Yönetmelik. Resmi Gazete; 02.04.2011 – 27893. http://www.resmigazete.gov.tr/eskiler/2011/04/20110402-3.htm (son eriĢim tarihi: 06.01.2014) 21 BulaĢıcı Hastalıkların Ġhbarı ve Bildirim Sistemi, Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi, Sağlık Bakanlığı Ankara. 2004. http://www.shsm.gov.tr/public/documents/legislation/bhkp/asi/bhibs/BulHastBilSistStanSurveL abReh.pdf (son eriĢim tarihi: 18.12.2013) Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Bakteriyoloji / Mikrobiyolojik Tanımlama / B-MT-17 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015 Sayfa 23 / 23