T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK
MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
Tez Yöneticisi
Prof. Dr. Metin OTKUN
HASTANE KÖKENLİ ESCHERİCHİA COLİ
İZOLATLARINDA GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU
BETA-LAKTAMAZLAR
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Şermin MERİÇ YAPAR
EDİRNE-2007
TEŞEKKÜR
Uzmanlık
eğitimimde
ve
tez
çalışmamda yardımlarını hiçbir zaman
esirgemeyen
Mikrobiyoloji
ve
Klinik
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı başkanı sayın
hocam Prof. Dr. Metin Otkun’a, sayın
hocalarım Prof. Dr. Murat Tuğrul’a, Doç.
Dr. Müşerref Otkun’a, Doç. Dr. Nermin
Şakru’ya, Doç. Dr. Şaban Gürcan’a, Doç.
Dr.
Neşe
Kuloğlu’na,
Akış’a,
Doç.
Doç.
Dr.
Dr.
Figen
Muzaffer
Eskiocak’a, laborant Metin Alkan ve diğer
laboratuvar
personeli
arkadaşlarımın
tümüne, Dr. Çiğdem Karagöl ve diğer
asistan arkadaşlarıma teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
GİRİŞ VE AMAÇ .............................................................................................
1
GENEL BİLGİLER ...........................................................................................
3
GRAM NEGATİF BAKTERİLERDE BETA-LAKTAM DİRENCİ............................
3
BETA-LAKTAMAZLAR………………………………………………………………..
3
GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR
8
DNA DİZİ ANALİZİ……………………………………………………………………..
17
GEREÇ VE YÖNTEMLER .............................................................................
20
BULGULAR .......................................................................................................
32
TARTIŞMA .......................................................................................................
45
SONUÇLAR .......................................................................................................
55
ÖZET ..................................................................................................................
57
SUMMARY .......................................................................................................
59
KAYNAKLAR ...................................................................................................
61
EKLER
3
SİMGE VE KISALTMALAR
bp
: Base pair
CLSI
: Clinical and Laboratory Standarts Institute
ÇDST
: Çift disk sinerji testi
DNA
: Deoksiribonükleik asit
dNTP
: Deoksinükleotid trifosfat
EDTA
: Etilen diamin tetra asetik asit
GSBL
: Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz
Hİ
: Hastane infeksiyonları
IRT
: Inhibitor resistant TEM
IEF
: Isoelectric focusing
MHA
: Müller-Hinton agar
MHB
: Müller-Hinton broth
MİK
: Minimum inhibitör konsantrasyonu
PZR
: Polimeraz zincir reaksiyonu
pI
: İzoelektrik nokta
TBE
: Trizma baz-borik asit-Etilen diamin tetra asetik asit
TE
: Trizma baz-Etilen diamin tetra asetik asit
4
GİRİŞ VE AMAÇ
Hastane infeksiyonları (Hİ)’nın, yol açtığı mortalite ve morbidite ile hasta, toplum ve
sağlık ekonomisi açısından önemli bir sorun olduğu bilinmektedir (1). Hastaların hastaneye
başvurduğu dönemde inkübasyon döneminde olmayan, hastaneye başvurularından 48-72 saat
sonra gelişen veya taburcu olduktan sonraki 10 gün içinde ortaya çıkabilen infeksiyonlar Hİ
olarak adlandırılırlar. Değişik çalışmalarda Hİ görülme sıklığının %3,1-14,1 arasında değiştiği
tespit edilmiştir (2). Ülkemizde de total sürveyans yapılan az sayıda hastanede %5 civarında
oranlar saptanmıştır (3). Hİ etkenleri ve direnç profilleri ülkeler, hastaneler ve hatta aynı
hastanenin değişik birimleri arasında bile farklılıklar gösterebilmektedir (4). Escherichia coli
Hİ’de önemli bir etkendir. Üriner sistem infeksiyonlarının en sık ve nozokomiyal sepsislerin
%15’inin etkenidir. E.coli’nin neden olduğu diğer infeksiyonlar arasında cerrahi alan
infeksiyonları, intraabdominal abseler, peritonit ve pnömoni sayılabilir (5).
Hastane kökenli E.coli izolatlarında direnç problemi giderek büyümektedir. Betalaktam antibiyotiklere karşı direnç gelişmesinde beta-laktamaz enziminin yapımı, penisilin
bağlayan proteinlerin yapısında değişiklik ile antibiyotiklerin bağlanmasının engellenmesi ve
bakteri içine antibiyotik girişinin azalması önemli rol oynamaktadır (5). Klinikte gram negatif
bakteriler arasında beta-laktam antibiyotiklere karşı direncin en yaygın nedeni beta-laktamaz
yapımıdır. Bu enzimler kromozomal, plazmid ve transpozonlar aracılı olabilir (6).
Günümüzde
350’yi
aşan
değişik
beta-laktamazlar
mevcuttur.
Yeni
beta-laktam
antibiyotiklerin geliştirilerek klinik kullanıma sunulması ve yaygın kullanımını takiben yeni
beta-laktamaz varyantları ortaya çıkmıştır (7).
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL)’lar sefuroksim, sefotaksim, seftriakson,
seftizoksim, seftazidim, sefpirom ve sefepim gibi oksiimino-sefalosporinleri hidrolize
1
edebilen ve genellikle klavulanik asit, sulbaktam veya tazobaktam gibi beta-laktamaz
inhibitörleri ile inhibe olan beta-laktamazlardır. Bu tür enzimlerin tamamına karbapenemler,
TEM-52 ve TEM-88 dışındaki enzimlere de sefoksitin ve sefotetan gibi sefamisinler
dayanıklıdırlar. Çoğu kez GSBL üreten mikroorganizmalar aminoglikozidler, kloramfenikol,
sulfonamid ve florokinolonlar gibi diğer gruplardaki antibiyotiklere de dirençlidirler (8).
İlk olarak 1983’te Almanya’da saptandıktan sonra GSBL’ler dünya çapında
tanımlanmaya devam etmiştir (9). Klebsiella spp. ve E.coli izolatlarında daha sık bulunmakla
birlikte Salmonella spp. ve Shigella flexneri de dahil olmak üzere birçok enterik bakteride
bildirilmiştir. Ülkemizde 1992’den beri GSBL’ler araştırılmakta ve bildirilmektedir (8).
Taşlı ve Bahar (10) tarafından yapılan bir çalışmada ampisiline dirençli
Enterobacteriaceae izolatlarında GSBL yapımı araştırılmış, izolatların %38’inde GSBL
saptanmış,
izoelektrik
nokta
saptanması,
polimeraz
zincir
reaksiyonu
(PZR)
ve
deoksiribonükleik asit (DNA) dizi analizi sonucunda izolatların beşinde SHV-2, yedisinde
SHV-5 ve beşinde SHV-12 tespit edilmiştir.
Jeong ve ark.’ın (11) Kore’de yaptıkları bir çalışmada E.coli ve Klebsiella pneumoniae
izolatlarında TEM ve SHV tipi enzimler araştırılmış, beş farklı TEM tipi ve iki farklı SHV
tipi beta-laktamaz tespit etmişlerdir.
Ülkemizde GSBL’ler ile ilgili moleküler çalışmalar sınırlı sayıdadır. Hastanemizde ilk
kez yapılacak olan bu çalışmanın amacı, GSBL üreten hastane kökenli E.coli izolatlarında
GSBL türlerini ve bunların antibiyotiklerle direnç ilişkisini araştırmaktır.
2
GENEL BİLGİLER
GRAM NEGATİF BAKTERİLERDE BETA-LAKTAM DİRENCİ
Beta-laktam antibiyotikler günümüzde en sık kullanılan antibiyotik türevlerinin
başında gelir ve penisilin bağlayan proteinler adı verilen enzimlere bağlandıktan sonra
bakterilerin hücre duvar sentezini inhibe ederek etki gösterirler. Çok yaygın kullanılmalarının
sonucu olarak da beta-laktam antibiyotiklere karşı direnç giderek artmaktadır. Bakterilerde
beta-laktamlara direnç gelişmesine neden olan mekanizmalar ilacın beta-laktamazlarca
parçalanması, penisilin bağlayan proteinlerde oluşan değişiklikler ile ilacın hedefine etkin
konsantrasyonda ulaşmasını engelleyen porin değişikliklerine bağlı geçirgenlik azalması
ve/veya aktif pompa (efluks) sistemleridir (12).
BETA-LAKTAMAZLAR
Beta-laktamazların Sınıflandırılması ve İsimlendirilmesi
Enterobacteriaceae ailesi arasında beta-laktam antibiyotiklere karşı direncin en yaygın
nedeni beta-laktamaz üretimidir. Beta-laktamazlar, beta-laktam halkasını hidrolize ederek
beta-laktam antibiyotiklerin etkisine karşı mikroorganizmaları korurlar (13). Bu enzimler
gram negatif bakterilerde periplazmik boşluk içinde yer alırlar; beta-laktam halkasındaki
siklik amid bağını parçalayan enzimlerdir (12).
Beta-laktamazların sayısının artması sonucu farklı zamanlarda birçok sınıflandırma
şeması önerilmiştir. Yaygın kabul gören ilk şema 1960’larda Richmond ve Sykes tarafından
önerilmiştir (14). Bu şema 1976 yılında Sykes ve Matthew tarafından izoelektrik odaklamayla
beta-laktamazların ayrımı vurgulanarak genişletilmiştir. Zamanla hatalar ve eksiklikler
3
görülünce şema 1989’da Karen Bush tarafından değiştirilmiş ve 1995’te güncelleştirilmiştir.
Hem plazmid hem de kromozomal özellikli enzimlerin olduğu bu sınıflandırmada önceki
sınıflandırmalarda kullanılan substrat profili, inhibitör profili, moleküler ağırlığı, hidroliz hızı,
bağlanma afinitesi ve izoelektrik nokta gibi özelliklere oksasilin, sefoksitin ve nitrosefinin
substrat profiline ve tazobaktamın inhibisyon profiline katılmasıyla enzimler dört grupta
toplanmıştır (Grup 1-4). Grup 1 sefalosporinazlar klavulanik asit ile iyi inhibe olmazlar. Grup
2 genellikle klavulanat tarafından inhibe edilen en geniş grubu oluşturur (15). Bu enzimler
penisilinleri, sefalosporinleri, kloksasilini, karbenisilini, karbapenemleri ve monobaktamları
hidrolize etmelerine göre altı alt gruba ayrılır (12). Grup 3 metallo-beta-laktamazlar etilen
diamin tetra asetik asit (EDTA) ve p-kloromerkuribenzoat ile inhibe olurlar, klasik betalaktamaz inhibitörleriyle inhibe olmazlar. Grup 4 beta-laktamazlar penisilinazlardır ve yine
klavulanik asit ile inhibe olmazlar. Moleküler düzeydeki mekanizmalara dayanan
sınıflamanın ilk temellerini ise 1980 yılında Ambler atmıştır (15). Bu sınıflandırmada betalaktamazlar A, B, C ve D olmak üzere dört grupta toplanmaktadır. A, C ve D grupları ‘serin’
enzimlerini içerirken B grubunda ‘çinko’ enzimleri bulunmaktadır (12,16,17). Sınıf A serin
penisilinazları, sınıf B metalloenzimleri, sınıf C serin sefalosporinazları ve sınıf D oksasilini
hidrolize eden serin beta-laktamazları içerir (18).
Beta-laktamazların sınıflandırılmasında olduğu gibi isimlendirilmesinde de önemli bir
karışıklık vardır. Bazı enzimler tercih ettikleri substratlara (CARB, OXA, IMP, FUR), bazıları
biyokimyasal özelliklerine (SHV), bazıları izole edildikleri bakterilere (PSE), bazıları
genlerine (AmpC, CepA), bazıları dirençli bakterinin izole edildiği hastanın ismine göre
(TEM, ROB), bazıları eyaletlere (OHIO), bazıları enzimi bulan kişilerin isimlerine (HMS)
göre isimlendirilmiştir (19). Bugün için ulaşılan bilgilerle bu isimlendirmeler geçersiz
durumdadır. Örneğin ismini biyokimyasal özelliği olan ‘sülfidril variable’ nedeniyle alan
SHV enziminin aktif bölgesinin serin hidroksil olduğu anlaşılmıştır. Sefotaksime karşı
dirence yol açtığı için CTX-1 olarak isimlendirilen enzimin nükleotid dizi analizi sonucu
TEM beta-laktamazları kodlayan genlerde nokta mutasyonlarının birikiminden köken aldığı
anlaşılmıştır. Sonuç olarak CTX-1 TEM-3 olarak isimlendirilmiştir. Benzer şekilde SHV-1 de
1972’de ilk olarak Pitton tarafından PIT-2 olarak isimlendirilmişti. Bu nedenle artık aynı
enzimden köken alanların numaralandırılması (TEM 1-36, SHV 1-12 gibi) yöntemi
kullanılmaktadır (15,20,21).
4
Beta-laktamazların Belirlenmesi
1) Beta-laktamazları tespit eden testler: Direkt beta-laktamaz testleridir. Zor üreyen
gram negatif türleri, Staphylococcus spp. ve gram negatif basiller için uygulanır. Sadece
enzimin var olup olmadığını gösterir. Tedavi seçeneğini etkilediği için en çok Haemophilus
influenzae, Moraxella catarrhalis ve Neisseria spp.’de kullanılır. Bu gruptaki testlerin hepsi
beta-laktam hidrolizine bağlı son ürünlerin saptanması temeline dayanır ve renk değiştirme
reaksiyonudur. Kromojenik sefalosporin testleri (Nitrosefin testi, 7 (tienil-2-asetamido)-3-[2(4-N,N-dimetilaminofenilazo) piridinium metil]-3-sefem-4-karboksilik asid testi), iyodometrik testler ve asidometrik testler en çok kullanılan testlerdir (6).
Nitrosefin testi: Nitrosefin kromojenik bir sefalosporindir, ticari olarak çözücüleriyle
birlikte pudra şeklinde veya nitrosefin emdirilmiş kağıt disk şeklinde temin edilebilir.
Nitrosefin hidrolize olduğunda sarıdan kırmızıya renk değişimi olur. Beta-laktamazların çoğu
için en duyarlı test nitrosefin testidir. Ancak bu test Staphyloccus spp.’nin penisilinazlarını ve
Haemophilus spp.’nin ender görülen ROB-1 enzimini saptamada yetersizdir (6).
7 (tienil-2-asetamido)-3-[2-(4-N ,N-dimetilaminofenilazo) piridinium metil]-3-sefem4-karboksilik asid testi: Teste adını veren kimyasal madde yine kromojenik sefalosporindir,
ancak temini güçtür (22).
İyodometrik testler: Beta-laktamların yıkım ürünleri iyodu iyodüre indirger ve bakteri
beta-laktamaz üretiyorsa iyodin-nişasta kompleksinin oluşumu engellenir, renksizleşme
görülür (6). Hazırlanan penisilin süspansiyonuyla tüpte test edilebileceği gibi filtre kağıdına
önceden penisilin ve nişasta emdirilerek hazırlanan disklerle de test edilebilir. Diskin üzerine
iyot solüsyonu damlatılıp bakteri kolonileri sürülür, 5 dk içerisinde rengin giderilmesi betalaktamaz varlığını gösterir (22).
Asidometrik testler: Beta-laktam halkasının hidrolizi bir karboksil grubunu oluşturur
ve tamponsuz ortamda pH düşer. Bu da pH indikatörlerinde renklenmeyle ölçülür. Fenol
kırmızısı solüsyonu üzerine penisilin ilave edilir, pH: 8,5’e ayarlanır. Alınan bakteri lam
üzerinde veya tüpte solüsyona ilave edildiğinde 5-10 dk içerisinde sarı renk oluşumu betalaktamaz aktivitesini gösterir (22). Bu yöntem nitrosefin testinden daha ucuzdur. Duyarlılığı
yüksek olmakla birlikte yanlış pozitiflik oranı da yüksektir (6).
Biyolojik metodlar: İndikatör bir mikroorganizmanın (beta-laktamaz negatif)
kullanıldığı ‘Masuda Çift Disk Yöntemi’ bunlardan biridir. İndikatör organizma MüllerHinton agar (MHA) besiyerine ekilir. Test edilecek antibiyotik besiyerinin ortasına
yerleştirilir. Beta-laktamaz yapımı araştırılacak bakteri veya hücre ekstraktı filtre kağıdına
emdirilip antibiyotik diskinin 1,5 cm uzağına yerleştirilir. Bir gece 37 Cº’de inkübasyondan
5
sonra antibiyotik diskinin bakteri ekstraktı tarafında çentik oluşması beta-laktamaz varlığını
gösterir. Kalitatif olmasına rağmen oldukça duyarlıdır (23).
2) Beta-laktamazları tiplendiren testler: Kromozomal beta-laktamazlar (AmpC
beta-laktamazlar) için indüksiyon testleri ve GSBL için olan testler (Sayfa 13’te ayrıntılı
olarak bahsedilecektir)’dir (22).
AmpC beta-laktamaz için indüksiyon testi: Direnç Enterobacteriaceae ailesi
üyelerinde basit olarak sefoksitin direnciyle tespit edilir. Disk difüzyon testinde sefotaksim
gibi zayıf bir indükleyici yanına sefoksitin gibi güçlü bir indükleyici içeren disk
yerleştirilmelidir. Sefoksitine komşu sefotaksim zonunda kesilme indüksiyonu göstermektedir
(24). Dikkat edilmesi gereken sınırda bir sefoksitin direnci değil hiç inhibisyon zonu
olmaması ve minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) ≥128 mg/L olacak şekilde ileri
derecede direncin kesin kriter olarak alınmasıdır. Sefoksitin etrafında inhibisyon zonu olan
ancak zon çapı dirençli olarak değerlendirilen sınırlar içinde olan kökenler Enterobacter spp.,
Serratia spp. ya da Citrobacter spp. olarak tanımlanırsa AmpC direnç riski yönünden
klinisyene bildirilmelidir (17).
Beta-laktamazlar direnç geninin kromozom ya da plazmid üzerinde bulunmasına göre
iki gruba ayrılırlar: Kromozomal beta-laktamazlar ve plazmid aracılı beta-laktamazlar.
Kromozomal Beta-laktamazlar
Bu gruptaki enzimlerin bazı türleri sınıf A enzimlere sahip iken esasen çok sayıdaki
tür sınıf C sefalosporinazlardır ve klavulanik asit ile iyi inhibe olmazlar. Salmonella spp.
dışında hemen tüm gram negatif bakterilerde bulunur. Ancak miktar, sentez yolu ve dirençteki
rolleri açısından farklılık gösterir. İndüklenebilir, yüksek düzeyde yapısal (stabil derepresyon)
ve düşük düzeyde yapısal enzimler olarak bulunabilirler. E.coli ve Shigella spp.’de düşük
düzeyde sentezlenen yapısal enzimler vardır ve miktarları ampisilin ve dar spektrumlu
sefalosporinlere karşı direnç oluşturmayacak kadar düşük düzeydedir. Buna karşın E.coli
izolatlarının %2’sinde AmpC enzimlerinin aşırı sentezi sonucu yüksek düzeyde direnç
oluşabilmektedir. Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Serratia
spp., Morganella morganii, Providencia stuartii ve Providencia rettgeri’de sentezlenen
kromozomal beta-laktamazlar indüklenebilen türdedir (6).
Ampisilin ve dar spektrumlu sefalosporinler enzim hidrolizine dayanıksız olup genel
olarak MİK değerlerinin altında güçlü indükleyicilerdir. Sonuç olarak hem indüklenebilir hem
de stabil dereprese organizmalar bu antibiyotiklere dirençlidir. Geniş spektrumlu
6
sefalosporinler, üreidopenisilinler ve karboksipenisilinler bu enzimler tarafından hidrolize
dayanıksız, ancak MİK değerlerinin altında zayıf indükleyici olduklarından indüklenebilir
beta-laktamazı olan organizmalar duyarlı, stabil dereprese olanlar ise dirençlidir.
Karbapenemler güçlü indükleyiciler olup enzim hidrolizine de dayanıklıdırlar ve hem
indüklenebilir hem de stabil dereprese organizmalara karşı etkilidirler. Temosilin ise zayıf bir
indükleyici olup bu enzimler tarafından hidrolize dayanıklıdır (24).
Plazmid Aracılı Beta-laktamazlar
Moleküler sınıf A ve D içinde yer alan en geniş kategoriye sahip enzimlerdir (12).
Dereprese mutantların ortaya çıkışından sorumlu genler kromozom kaynaklı olduğundan
bakteriler arasında yayılmasında problem olmaz diye düşünülürken son on beş yıldır tipik
olarak Enterobacter ve Citrobacter türlerinde görülen yüksek düzeyde sefalosporinaz üretimi
Klebsiella spp. ve E.coli’de de dikkat çekmeye başlamıştır. Burada problemin dereprese
mutantlardan kaynaklanmadığı, söz konusu bakterilerin plazmid kaynaklı AmpC geni
taşıdıkları belirlenmiştir. Plazmid kaynaklı sefalosporinazlar (MOX-1, FOX-1, CMY-1,
CMY-2, LAT-1, BIL-1, MIR-1) kromozomal AmpC sefalosporinazlarla ilişkilidir. İlk olarak
K.pneumoniae kökenlerinde saptanan (MIR-1) bu beta-laktamazlar sefoksitin, oksiiminosefalosporinler ve aztreonama dirence neden olurlar. GSBL’lerin aksine beta-laktamaz
inhibitörlerine de dirençlidirler (MOX-1 hariç) (25).
Plazmid bağımlı beta-laktamazlar beş başlık altında toplanabilir (6): TEM-1, TEM-2
ve SHV-1 enzimleri, klasik OXA ve PSE enzimleri ve daha nadir dar spektrumlu enzimler,
TEM ve SHV türevi GSBL’ler, TEM ve SHV’den kaynaklanmayan GSBL’ler ve inhibitör
dirençli TEM mutantları. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar ayrı başlık altında
anlatılacaktır.
TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 enzimleri: Enterobakterilerde plazmid kaynaklı
enzimlerin en yaygını TEM-1 olup, E.coli izolatlarının yaklaşık %50’sinde görülen ampisilin
direncinin %90’ından sorumludur. Ayrıca bu enzim Haemophilus, Vibrio ve Neisseria
cinslerinde giderek artan miktarda görülen ampisilin ve penisilin direncinden de sorumludur.
TEM-1 enzimi penisilin ve sefalotin ile sefaloridin gibi ilk kuşak sefalosprorinleri hidrolize
edebilmektedir. TEM-1’den ilk türeyen enzim olan TEM-2, orijinal beta-laktamazdan tek bir
aminoasit yerleşimindeki farklılık ile ayrılır, fakat substrat profilinde bir değişiklik söz
konusu değildir. SHV-1 en çok K.pneumoniae kökenlerinde bulunmakla birlikte Citrobacter
7
diversus, E.coli ve P.aeruginosa’da da bu enzimlere rastlanmıştır. TEM tipi betalaktamazların aksine SHV-1’in nispeten daha az sayıda türevi vardır (26).
Klasik OXA ve PSE enzimleri: Enterobakterilerde klasik OXA enzimlerinin en
yaygın tipi OXA-1 olup genel olarak penisilinlere karşı düşük düzeyde direnç sağlar. OXA-1
üreten bakterilerin çoğu piperasilin-tazobaktama duyarlı olmalarına karşın klavulanatla olan
kombinasyonlara dirençlidir. Geniş spektrumlu sefalosporinler bu enzimlere dayanıklıdır.
PSE-1 ve PSE-4 beta-laktamazları klasik TEM tiplerine benzer direnç paterni göstermekte
olup gram negatif bakterilere etkili tüm penisilinler, sefoperazon ve sefsulodin bu enzimlere
duyarlıdır. Bu enzimlere sahip P.aeruginosa izolatları sıklıkla inhibitör kombinasyonlarına
dirençlidir (6).
İnhibitöre dirençli TEM mutantları: TEM tipi beta-laktamazlardaki mutasyonlar
sonucu GSBL’lerde olduğu gibi yeni beta-laktamaz inhibitörlerine dirençli varyantların
oluştuğu belirlenmiştir. Bu enzimler GSBL olmamakla birlikte sıklıkla GSBL’ler ile birlikte
anılmaktadırlar, çünkü bu enzimler de klasik TEM ve SHV tipi enzimlerden türemişlerdir. Bu
enzimler önceleri ‘Inhibitor Resistant TEM’ (IRT) olarak isimlendirilmiş, ancak daha sonra
köken aldıkları TEM ya da SHV’de sıralamaya girmiştir. Örneğin IRT-1 TEM-31, IRT-2
TEM-44 olarak yeniden numaralanmıştır (6). Günümüzde en az 19 farklı IRT mevcuttur (8).
IRT’ler esas olarak E.coli izolatlarında bulunmuştur, fakat aynı zamanda K.pneumoniae,
Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis ve C.freundii’nin bazı kökenlerinde de gösterilmiştir.
IRT’ler klavulanik asit ve sulbaktam ile inhibisyona dirençli olmakla birlikte tazobaktam ve
sonradan kullanılan piperasilin/tazobaktam kombinasyonuna duyarlı kalmaya devam
etmektedirler (26). TEM-50 ve TEM-68 gibi nadir örnekler dışında IRT’ler üçüncü kuşak
sefalosporinleri hidroliz etmemektedir (27).
GENİŞLEMİŞ SPEKTRUMLU BETA-LAKTAMAZLAR
Oksiimino-sefalosporinlerin gram negatif bakteriler nedeniyle gelişen infeksiyonların
tedavisinde 1980’li yıllarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmasından sonra yeni betalaktamazlar ortaya çıkmıştır. Bunlardan ilki Almanya’da bir Klebsiella ozaenae kökeninde
bulunan SHV-2 enzimidir. Etki spektrumlarının artmasından dolayı bu enzimler genişlemiş
spektrumlu beta-laktamazlar olarak isimlendirilmişlerdir (28).
8
Genel Özellikleri
Oksiimino-sefalosporinleri (örn. sefotaksim ve seftazidim) ve monobaktamları (örn.
aztreonam) hidrolize ederek etkisiz hale getirirler. Genellikle sefamisinlere (örn. sefoksitin)
ve karbapenemlere duyarlıdırlar (27). Buna karşın klavulanik asit gibi beta-laktamaz
inhibitörleriyle olan kombinasyonlar her zaman etkili olmayabilir. Enzim çok miktarda
sentezleniyorsa, birden fazla enzim varsa veya permeabilitede porin kaybına bağlı bir azalma
söz konusu ise bazı GSBL içeren bakteriler bu kombinasyonlara dirençli olabilirler (15).
Ayrıca infekte eden bakteri miktarı, ilacın dozu ve var olan GSBL’nin tipine göre de betalaktam/beta-laktamaz inhibitörü kombinasyonunun etkisi farklılık gösterebilir (26).
Çoğu GSBL enterik gram negatif bakterilerin klasik plazmid kökenli beta-laktamazları
olan TEM-1, TEM-2 ve SHV-1’den köken alır. Köken alınan ana enzimin moleküler
yapısındaki aminoasitlerden bir ila dördünün yerine farklı aminoasitlerin gelmesi sonucu
oluşurlar (14). Bugün 100’ü aşan TEM tipi ve 50’yi aşan SHV tipi GSBL mevcuttur (29).
Mevcut
GSBL
tipleri
ve
sayılarına
ilişkin
en
güncel
bilgilere
ulaşmak
için
‘http://www.lahey.org/studies/webt.html’ web adresinden yararlanılabilir.
Sınıflandırılması
Büyük çoğunluğu aktif bölgesinde serin molekülü içerir ve Ambler’in moleküler
sınıflamasına göre sınıf A’da (Bush sınıflamasına göre Grup 2be), oksasilini hidrolize eden
beta-laktamazlar ise sınıf D’de (Bush sınıflamasına göre Grup 2d) yer alırlar. Yapısal ve
evrimsel özellikler açısından GSBL’ler dokuz farklı grup içinde sınıflandırılmaktadır. Bu
gruplar TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES/IBC, TLA, BES ve OXA’dır (30).
TEM: Geçmişe bakıldığında 1987’de izole edilen TEM-3 ilk TEM tipi GSBL
olmayabilir. 1982’de Liverpool’da ilk olarak plazmid taşıyan bir genin kodladığı seftazidim
direncine sahip K.oxytoca izole edildi. Sorumlu beta-laktamaz bugün TEM-12 olarak
adlandırılan enzimdi. O yıllardan bu yana 100’ün üzerinde TEM tipi beta-laktamaz
tanımlanmıştır ve bunların çoğunluğu GSBL’dir. İzoelektrik nokta aralıkları 5,2-6,5
arasındadır. Beta-laktamaz inhibitörleriyle çoğunun etkisinin azaldığı bulunmuştur (31).
TEM enzimlerinde görülen aminoasit yer değişiklikleri sınırlı sayıda pozisyonda
görülür. Bu değişiklikler 104. pozisyonda glutamat yerine lizin, 164. pozisyonda arjinin
yerine serin ya da histidin, 238. pozisyonda glisin yerine serin ve 240. pozisyonda glutamat
yerine lizin şeklindedir. TEM-AQ denilen TEM benzeri enzimler diğer TEM enzimlerinde
görülmeyen birkaç aminoasit yer değişikliği ya da aminoasit çıkartılmasını içerir. En sık
9
E.coli ve K.pneumoniae’de görülmekle birlikte enterik ve non-enterik pek çok bakteride de
bulunabilecekleri bildirilmiştir (28).
SHV: Aminoasit değişikliği olan pozisyonlar TEM grubu GSBL’lere kıyasla daha
azdır. SHV türlerinin çoğunda karakteristik değişiklik 238. pozisyonda glisin yerine serinin
gelmesidir (8). SHV-5 ilişkili pek çok tür 240. pozisyonda glutamat yerine lizinin gelmesiyle
oluşur. Her iki pozisyondaki aminoasit yer değişikliğinin TEM tipi beta-laktamazlarda da
görülmesi ilginçtir. Seftazidimin etkin hidrolizi için 238. pozisyondaki serin rezidüleri,
sefotaksimin etkili hidrolizi için ise lizin rezidüleri önemlidir. Sadece SHV-10 inhibitör
dirençli özelliktedir. SHV tipi GSBL’ler K.pneumoniae dışında C.diversus, E.coli ve
P.aeruginosa’da da tanımlanmıştır (28).
CTX-M: Almanya, Fransa ve Arjantin’de 1990’ların
başında sefotaksime
seftazidimden daha yüksek düzeyde direnç gösteren GSBL üreten gram negatif bakteriler
tanımlandı. Ambler sınıf A beta-laktamazlardan olan bu enzimler sefotaksimi yüksek düzeyde
etkilediğinden CTX-M olarak adlandırıldı (32.). Esas olarak Salmonella enterica serovar
typhimurium ve E.coli’de bulunmakla birlikte diğer Enterobacteriaceae türlerinde de
tanımlanmışlardır (26). Aminoasit dizilerine göre beş farklı grupta toplanırlar: CTX-M-1
grubu (CTX-M-1, -3, -10, -11, -12, -15, -22, -23, -29, -30, -32, -33, -28, -36, -54 ve UOE-1),
CTX-M-2 grubu (CTX-M-2, -4, -6, -7, -20, -31, -44 (önceden TOHO-1’di) ve FEC-1), CTXM-8 grubu (CTX-M-8 ve CTX-M-40), CTX-M-9 grubu (CTX-M-9, -13, -14, -16, -17, -18, 19, -24, -27, -45 (önceden TOHO-2 idi), -46, -47, -48, -49 ve CTX-M-50) ve CTX-M-25
grubu (CTX-M-25, -26, -39 ve CTX-M-41) (33).
CTX-M enzimleri en yaygın plazmid aracılı TEM ve SHV beta-laktamazlarla %40 ya
da daha az homoloji gösterir. Bilinen aminoasit dizileriyle %70-75 arasında olan en iyi
benzerlik skoru K.oxytoca, Proteus vulgaris ve C.diversus’un sefalosporinleri hidrolize eden
kromozomal enzimleriyle gözlenir. CTX-M tipi beta-laktamazların genişlemiş spektrumlu
aktivitesinde anahtar role CTX-M enzimlerinde değişmeden var olan 237. pozisyondaki serin
rezidüleri katkıda bulunmuştur (34). Tazobaktam bu enzimlere karşı klavulanata göre yaklaşık
10 kat daha fazla inhibitör etkiye sahiptir. TOHO-1 ve TOHO-2 yapısal olarak CTX-M tipi
beta-laktamazlarla ilişkilidir. Bunların hidrolitik aktiviteleri seftazidime göre sefotaksime
karşı daha güçlüdür (31).
10
OXA: Bu enzimler diğer GSBL’lerin aksine moleküler sınıf D’de ve fonksiyonel grup
2d’de yer alırlar (30). OXA-15 ve OXA-32 OXA-2’den türemiştir (27,35). OXA-11, OXA13, OXA-14, OXA-16, OXA-17, OXA-19, OXA-28 ve OXA-35 ise OXA-10’dan türemiştir
(27,36-39). OXA-11, -14, -15 ve OXA-16 seftazidim direncine yol açarken, OXA-17
sefotaksime direnç oluşturmaktadır (28). Oksasilin ve kloksasiline karşı gösterdikleri yüksek
hidrolitik aktivite en önemli özellikleridir. Beta-laktamaz inhibitörleri tarafından inhibe
edilmez ya da zayıf bir biçimde inhibe edilirler (40). Ancak OXA-18’in klavulanik asit ile
tamamen inhibe edildiği bildirilmiştir. En sık P.aeruginosa’da bulunmakla birlikte diğer gram
negatif bakterilerin çoğunda tespit edilmiştir (29).
Bunlara ek olarak pek çok GSBL olmayan OXA derivesi de tanımlanmıştır. Bunlar
OXA-20, OXA-22, OXA-24, OXA-25, OXA-26 ve OXA-30’dur (28).
Oksasilinazların çoğunluğu kromozomal enzimlerdir, bununla birlikte Pseudomonas
spp., Acinetobacter spp. ve Enterobacteriaceae ailesi gibi gram negatif patojenlerde
plazmidlerde yerleşen genlerle kazanılır ve transpozon ya da integronlar tarafından kontrol
edilirler (40).
PER: Tanımlanmış GSBL tipleriyle yakın ilişki içinde olmayan bazı GSBL tipleri
daha vardır. İlk kez Türkiye’den bir hastanın P.aeruginosa kökeninden izole edilen PER-1
bunlardan biri olup kromozomal bir enzimdir (41). Daha sonra aynı enzim Salmonella
enterica serovar typhimurium ve Acinetobacter baumannii izolatlarında da gösterilmiştir. Bu
enzim seftazidime dirençli A.baumannii kökenlerinin %60 kadarında bulunmaktadır (26).
PER-1 enzimi içeren P.aeruginosa’nın en belirgin özellikleri, izolatların seftazidime çok
dirençli olmalarına karşın (MİK ≥256 µg/ml) piperasilin için daha düşük bir direnç
göstermeleridir (MİK: 8-16 µg/ml). Bu enzimler klavulanik asit ve tazobaktama duyarlıdır
(8).
Epidemiyoloji
Geniş spektrumlu beta-laktamlar ilk kez Batı Avrupa’da kullanılmaya başladığından
GSBL’ler ilk olarak burada görülmeye başlamış, ancak kısa sürede ABD ve Asya’ya da
yayılmıştır. ABD’de GSBL yapım oranı kurumlara bağlı olarak % 0-25, ortalama %3
civarındadır (28).
Klinik izolatlar arasında GSBL’lerin prevalansı şehirden şehire ve hatta hastaneden
hastaneye farklılık gösterir. Fransa’da 1990’larda nozokomiyal K.pneumoniae izolatlarının
%25-35’inde GSBL üretimi varken son yıllarda infeksiyon kontrol önlemlerinin
11
uygulanmasıyla bu oran düşmeye başlamıştır (31). On Avrupa ülkesindeki 31 merkezde
yapılan son büyük incelemede 1610 E.coli ve 785 K.pneumoniae izolatı arasında GSBL
prevalansı Kuzey Avrupa ülkelerinde (örn. Almanya) %1-5 kadar düşük, Doğu Avrupa
ülkelerinde (örn. Rusya, Polonya ve Türkiye) ise %39-47 kadar yüksek bulunmuştur (27).
Son yıllarda yapılan ve Japonya’dan 196 farklı kurumun verilerini içeren bir çalışmaya
göre E.coli’lerin %0,12’sinden ve K.pneumoniae’lerin %0,03’ünden azında GSBL üretimi
saptanmıştır (26). Kore’de bu oran %4,8, Tayvan’da %8,5 ve Honkong’da %12’ye yakındır
(28).
Trakya Üniversitesi Hastanesi’nde 1995-1999 yılları arasında yapılan bir çalışmada
toplam 194 nozokomiyal Enterobacteriaceae kökeninin %11,8’inde GSBL üretimi
gösterilmiştir (42).
Spesifik GSBL’lerin sadece belirli ülke ya da bölgelerde görülmesi ilginçtir. Örneğin
TEM-10 uzun yıllardır ABD’de, salgınlarla ilişkisi olmayan bazı GSBL üreten
mikroorganizmalarda bulunmaktadır. Bununla birlikte son yıllarda TEM-10 Avrupa’da da
benzer sıklıkta görülmektedir (31). Fransa’da SHV-3, SHV-4 ve TEM-3, Almanya’da ise
SHV-2 ve SHV-5 daha sıktır (43). Farklı olarak SHV-5 beta-laktamaz dünya çapında en
yaygın rastlanılan GSBL’dir ve Hırvatistan, Fransa, Yunanistan, Polonya, Macaristan, Güney
Afrika, İngiltere ve ABD’den bildirilmiştir (28). Kore’de en sık bulunan GSBL’lerin SHV-12
ve CTX-M tipi beta-laktamazlar olduğu saptanmıştır (44).
CTX-M tipi GSBL’ler başlıca Salmonella enterica serovar typhimurium ve E.coli’de
bulunmuştur, fakat diğer Enterobacteriaceae türlerinde de tanımlanmıştır (28). Önceleri TEM
ve SHV tipi enzimler baskın olan GSBL’ler iken, son on yılda CTX-M enzimleri hem hastane
kökenli hem de toplum kökenli izolatlarda en sık görülen GSBL’ler halini almıştır (33).
Genellikle Güney Amerika, Uzak Doğu ve Doğu Avrupa ülkelerinde daha baskın olarak
bulunur. Arjantin’de en sık görülen GSBL CTX-M-2’dir. Polonya’da CTX-M-3 yaygın olarak
bulunur. Son yıllarda CTX-M tipi enzimler ABD’de ve Batı Avrupa ülkelerinde de
bildirilmiştir (32).
Genişlemiş spektrumlu OXA enzimlerinin ilki olan OXA-11 ve daha sonra OXA-14, 15, -16 ve OXA-17 ilk kez Türkiye’de izole edilen farklı P.aeruginosa kökenlerinde
tanımlanmıştır (8). Bunların Türkiye ve Fransa’da sık bulunmalarının nedeninin bu enzimleri
içeren kökenlerin bulunmasından mı yoksa bu enzimler üzerinde çalışan araştırmacıların bu
ülkelerde bulunmasından mı kaynaklandığı bilinmemektedir (28). Ülkemizde bildirilen diğer
GSBL türleri PER-1, SHV-12, SHV-5, SHV-2, CTX-M-15, CTX-M-3 ve CTX-M-2’dir
(9,45-50).
12
Neden Olduğu Sorunlar
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sentezleyen bakterilerin klinikte neden olduğu
sorunların başında direnç problemi gelmektedir. Bu enzimlerden birini sentezlediği saptanan
gram negatif bakteri penisilinlere, tüm sefalosporinlere ve monobaktamlara dirençli kabul
edilmelidir. Öte yandan bu enzimleri kodlayan plazmidler aynı zamanda pek çok beta-laktam
dışı antibiyotiğe karşı da genetik materyal taşımaktadırlar. Bu yüzden GSBL sentezleyen
bakteriler aynı zamanda başta aminoglikozidler olmak üzere kinolonlar, tetrasiklin,
kloramfenikol ve sülfonamidlere karşı da direnç gösterebilirler (51,52).
Bir bakteri sentezlediği GSBL enziminin farklı sefalosporinlere afinitesinin farklı
olması ve inokulum etkisi gibi nedenlerle 3. kuşak sefalosporinlere duyarlı gibi gözükebilir.
Ancak bu bakterinin neden olduğu hastalık üriner sistem dışında bir infeksiyonsa 3. kuşak
sefalosporin tedavisi başarısızlıkla sonuçlanır. Örneğin TEM-26 taşıyan bir K.pneumoniae
kökeni in-vitro seftazidime dirençli (MİK >256 µg/ml), sefotaksime ise duyarlı (MİK ≤0,5
µg/ml) gözükebilir. Böyle bir durumda sefotaksim tedavisi başarısızlıkla sonuçlanır. Bunun
nedeni TEM-26’nın düşük yoğunluklarda bile seftazidime yüksek afinite göstermesi,
sefotaksimi ise ancak infeksiyon ortamındaki gibi yüksek bakteri yoğunluğu durumunda
hidrolize edebilmesidir (52). Bu yüzden rutin duyarlılık testlerinde seftazidime yüksek afinite
gösteren GSBL’lerin sık rastlanıldığı bir yerde laboratuvarın sefotaksim ve seftriaksonu rutin
duyarlılık testlerinde kullanılan 3.kuşak sefalosporin olarak tercih etmesi GSBL saptanmasını
güçleştirecektir (7). Buna karşın CTX-M tipi GSBL’ler ise genellikle seftazidimi hidrolize
etmezler, dolayısıyla seftazidim GSBL varlığını göstermede tek başına uygun bir belirleyici
değildir (53).
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sentezleyen organizmalarla olan infeksiyonların
tedavisi konusunda randomize, kontrollü çalışmalar yoktur (27). Ancak çeşitli retrospektif
çalışmalarda GSBL varlığının mortalite ve morbiditeyi olumsuz yönde etkilediği
gösterilmiştir (52). Yakın zamanda yapılan çok merkezli prospektif bir çalışmada GSBL
üreten K.pneumoniae ile gelişen bakteremilerde uygun antibiyotik kullanılmadığında
mortalitenin arttığı, baktereminin başlangıcından itibaren ilk beş gün içinde uygulanan
karbapenemin in vitro olarak etkin görülen diğer antibiyotiklere kıyasla mortaliteyi önemli
ölçüde azalttığı bulunmuştur (54).
Saptama Yöntemleri
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz üreten bakteriyel kökenlerin artan prevalansı
birçok salgına neden olmuştur. Bu durum GSBL tarama ve doğrulama testleri için hızlı ve
13
güvenilir laboratuvar testlerinin yerleşmesini gerekli kılmıştır (55). ‘Clinical and Laboratory
Standarts Institute’ (CLSI) bu testlerin K.oxytoca, E.coli ve P.mirabilis izolatları için rutin
olarak yapılmasını önerir (56).
Klinik
ve
Laboratuvar
Standartları
Enstitüsü’nün
önerdiği
genişlemiş
spektrumlu beta-laktamaz tarama ve doğrulama testleri: Disk diffüzyon yöntemi ve
dilüsyon yöntemleriyle yapılır.
1) Disk diffüzyon yöntemi: Bu yöntemi uygularken CLSI sefpodoksim (10 µg),
seftazidim (30 µg), aztreonam (30 µg), sefotaksim (30 µg) ve seftriakson (30 µg) içeren
antibiyotik disklerinden bir ya da testin duyarlılığını arttırmak için birden fazlasının
kullanılmasını önerir. Müller-Hinton agar besiyerinde yapılan disk diffüzyon testi sonucunda
sefpodoksim ≤17 mm, seftazidim ≤22 mm, sefotaksim ≤27 mm, aztreonam ≤27 mm,
seftriakson ≤25 mm inhibisyon zonu oluşturmuşsa bakterinin GSBL ürettiğinden şüphelenilir.
Bu durumda sefotaksim ve seftazidim tek başına ve klavulanik asit (10 µg) ile birlikte test
edilerek fenotipik doğrulama testi yapılmalıdır. Klavulanik asit varlığında inhibisyon zon
çapında ≥5 mm artış olması GSBL varlığını doğrular (56).
2) Dilüsyon yöntemleri: ‘Mikroplate’ ya da tüpte katyon katkılı Müller-Hinton broth
(MHB) ile yapılan dilüsyon testleri ile elde edilen MİK değerlerinin seftazidim, sertriakson,
aztreonam ve sefotaksim için ≥2 µg/ml, sefpodoksim için ise ≥8 µg/ml (Proteus için ≥2
µg/ml) olarak saptanması GSBL üretiminin olduğunu düşündürür. Tarama testinin pozitif
çıkması durumunda sefotaksim ve seftazidim tek başlarına ve klavulanik asit (4 µg/ml)
ilavesiyle birlikte test edilmelidir. Klavulanik asit ilavesiyle oluşan MİK değerleri ≥8 kat
azalma gösterdiğinde GSBL üretimi fenotipik olarak doğrulanmış olur (56).
Çift disk sinerji testi (ÇDST): Fransız araştırmacılar tarafından 1980’lerin sonlarında
tanımlanmıştır. Test edilecek mikroorganizma inoküle edilen MHA besiyerinin merkezine
amoksisilin/klavulanat (20 µg/10 µg) diski yerleştirilir ve çevresine merkezden merkeze 30
mm uzaklık olacak şekilde 30 µg’lık seftriakson, sefotaksim (tercihen), seftazidim, aztreonam
ya da 10 µg’lık sefpodoksim disklerinden bir ya da birkaçı yerleştirilerek klavulanat ile bu
antibiyotikler arasındaki sinerji araştırılır. 37 °C’de bir gecelik inkübasyondan sonra
klavulanat içeren disk ile sefalosporinler arasında ürememe zonu ya da sefalosporinlerin
inhibisyon zonunda klavulanat içeren diske doğru belirgin genişleme GSBL’nin varlığını
gösterir (22,27). GSBL ürettikleri genotipik olarak doğrulanan kökenlere karşı bu yöntemde
14
sefpodoksimin tercih edimesiyle duyarlılık %79-97, özgüllük %94-100 arasındadır (57,58).
Yanlış negatif sonuçlar SHV-2, SHV-3 ve TEM-12 içeren izolatlarda görülmüştür (57,59).
Klavulanat eklenen agar yöntemi: Klavulanat (4 µg/ml) eklenen MHA ile
klavulanatsız MHA besiyerine ekim yapıldıktan sonra geniş spektrumlu sefalosporin içeren
diskler yerleştirilir. İki besiyeri arasında antibiyotiklerin inhibisyon zonunda ≥10 mm artış
olması GSBL yapımını gösterir. Seftazidimle duyarlılığı %93-96 ve özgüllüğü %100’dür
(60).
Üç boyutlu test: Bu test Thomson ve Sanders (57) tarafından tanımlanmıştır. Disk
difüzyon yöntemini esas alan bu yöntemin ondan teknik olarak farkı, MHA plağının
merkezine yakın tarafta ve antibiyotik disklerinin 3 mm uzağında ucu 11 no.lu bisturinin
kalınlığına eşit olacak şekilde dairesel bir bıçak taşıyan alet ile yapılan kesi ile besiyerinde
yarık açılmasıdır. Direkt ve indirekt olarak uygulanabilir. Direkt yöntemde 0,5 McFarland
bulanıklığına eşit olacak şekilde hazırlanan test edilecek bakteri süspansiyonu MHA plağının
yüzeyine inoküle edilir. İndirekt yöntemde ise besiyeri yüzeyine kullanılan antibiyotiklere
duyarlı olduğu bilinen bir köken ekilir. Kesilen yarığın içerisine ise test edilecek bakterinin
yaklaşık olarak 109-1010 bakteri yoğunluğuna eşit olacak şekilde hazırlanan süspansiyonu
steril mikropipet kullanılarak inoküle edilir, 35 °C’de 18-20 saatlik inkübasyondan sonra
yapılan değerlendirmede antibiyotiklere ait inhibisyon zonunda yarık hizasında bozulma ya da
kesilme görülmesi yarığa ekilen kökenin GSBL ürettiğini gösterir. Oldukça duyarlı bir test
olmasına karşın hem teknik hem de iş yükü olarak zordur.
E-test yöntemi: E-test şeritleri (AB Biodisk Solna, İsveç) ilaç emdirilmiş plastik
şeritlerdir. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz E-test şeritleri ise bir tarafında değişen
konsantrasyonlarda seftazidim, diğer tarafında ise sabit konsantrasyonda klavulanat (2 µg/ml,
sonraları 4 µg/ml olarak değişmiştir) ilave edilmiş seftazidim (MİK: 0,12-32 µg/ml) içerir
(61). CTX-M tipi enzimler gibi sefotaksim hidrolizini tercih eden GSBL’leri tespit etmek için
de sefotaksim içeren şeritler mevcuttur (53). Klavulanat varlığında sefalosporinlerin MİK
değerinde sekiz kat veya daha fazla bir azalma olması GSBL varlığını gösterir. Hem tarama
hem de fenotipik doğrulama için yararlıdır (31). Fenotipik doğrulamada duyarlılığı %87-100,
özgüllüğü %95-100 arasındadır (59-62). Bazen klavulanatın sadece seftazidim olan tarafa
doğru diffüzyonu nedeniyle seftazidimin MİK değerlerini okumak zor olabilir. Bu durumlarda
15
sadece seftazidim ya da sefotaksim içeren şeritlerle ayrıca MİK değerlerini ölçmek tercih
edilir (31).
Otomatize antimikrobiyal duyarlılık test sistemi: VİTEK, MicroScan ve BD
Phoenix otomatize antimikrobiyal test sistemleriyle de GSBL varlığı saptanabilir.
VİTEK (BioMérieux, Fransa) GSBL test kartları sefotaksim (0,5 µg/ml) ve seftazidimi
(0,5 µg/ml) tek başına ve klavulanat (4 µg/ml) ile kombine olarak kullanır. Klavulanat içeren
kuyucuklar sefalosporinlerin tek başına olduğu kuyucuklarla karşılaştırıldığında önceden
tahmin edilen üremedeki azalma miktarı GSBL varlığını gösterir. Duyarlılık ve özgüllüğü
%90’ın
üzerindedir
(63).
Genişlemiş
spektrumlu
beta-laktamaz
ve
AmpC
beta-
laktamazlarının her ikisini de üreten K.pneumoniae izolatlarında yanlış pozitif sonuçlar
gözlenmiştir (64). K.peumoniae, K.oxytoca ve E.coli dışındaki türlerde bu testin GSBL tespit
etmedeki güvenilirliği bilinmemektedir (31).
Phoenix (BD, ABD) GSBL testinde ise seftazidimle sefotaksime ek olarak
sefpodoksim ve seftriakson da hem tek başına hem de klavulanat ile kombine olarak
kullanılır. Bu test için algoritma tanımlanmıştır. Sadece E.coli ve Klebsiella türleri için değil
Proteus, Enterobacter ve Citrobacter türlerinde de GSBL test sonucu güvenilirdir (65).
Beta-laktamaz inhibitörleriyle kombine edilen seftazidim ya da sefotaksim içeren
MicroScan (Dade Behring, ABD) panellerinin de GSBL saptamada güvenilirliğinin yüksek
olduğu gösterilmiştir (66).
Dizileme dışındaki moleküler yöntemler: Buraya kadar bahsedilen testler sadece
GSBL varlığını ortaya koymaktadır. Klinik izolatta hangi GSBL tipinin olduğunun
aydınlatılması ise çok daha karışıktır. GSBL çalışmalarının ilk dönemlerinde izoelektrik
noktanın tayini genellikle GSBL varlığının gösterilmesi için yeterliydi. Bununla beraber
sayıları gittikçe artan TEM tipi beta-laktamazların benzer izoelektrik noktalara sahip olmaları
nedeniyle GSBL’nin izoelektrik noktayla tayini artık mümkün değildir. Aynı durum
GSBL’lerin SHV, CTX-M ve OXA aileleri için de geçerlidir (28).
İlk GSBL çalışmaları TEM ailesine ait olan DNA probları kullanılarak yapıldı (67).
Ancak bu yöntem yoğun emek gerektirir, GSBL ve GSBL olmayan beta-laktamazlar arasında
ve TEM ile SHV varyantları arasında ayrım yapamaz (28). TEM-1 ve TEM-2 arasındaki
ayrımı saptamada kullanılan oligotipleme metodu da ilk moleküler yöntemlerdendir. Bu
yöntem nokta mutasyonları tespit etmek için tasarlanan oligonükleotid probları kullanır (53).
16
Bir enzim ailesine ait beta-laktamazların varlığını tayin etmek için kullanılan en kolay
ve en yaygın yöntem beta-laktamaz genine özgü nükleotid primerlerinin kullanıldığı PZR’dir.
Oligonükleotid
primerleri
Genbankası
gibi
kullanıma
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html).
Bu
açık
primerler
yerlerden
seçilebilir
genellikle
nokta
mutasyonların olmadığı bilinen bölgelerden seçilmiştir. Bununla birlikte TEM ve SHV’nin
farklı varyantlarını ayırt edemez. Ayrıca GSBL ve GSBL olmayan enzimleri birbirinden
ayıramaz (28).
TEM tipi beta-laktamazların alt tiplerinin saptanmasında kullanılan bir yaklaşım;
PZR’ye ‘restriction fragment length polymorphism’ (RFLP) analizinin eklenmesidir. Bu
yöntemde amplifiye edilmiş PZR ürünleri restriksiyon endonükleaz enzimleriyle sindirime
tabi tutulur ve oluşan parçalar elektroforez ile ayrılır. Her bir restriksiyon enzimiyle
oluşturulan parçanın boyutu TEM yapısal geni içindeki nokta mutasyonları gösterir (28).
SHV gen mutasyonlarını tespit etmek için son zamanlarda ‘restriction site insertion
PZR’ tekniği geliştirilmiştir. PZR-RFLP ve ‘restriction site insertion PZR’ yöntemlerinin
kombinasyonlarının SHV için epidemiyolojik çalışmalarda kolayca uygulanabildiği
gösterilmiştir. Belirli SHV varyantlarını tespit etmeye yarayan bir diğer yöntem ‘PZR-single
strand conformational polymorphism’ ve PZR-RFLP’nin birlikte kullanımıdır (31). Yine bu iş
için son zamanlarda geliştirilen yöntemlerden biri de ligaz zincir reaksiyonudur. Bu yöntemde
termostabil ligaz ve biyotinle işaretli primerler kullanılır ve tek baz çifti değişikliği tespit
edilebilir (68).
Kromozomal DNA ile yapılan ‘pulsed-field gel electrophoresis’ yöntemini GSBL
üreten mikroorganizmaların genotiplemesi için çoğu araştırmacı kullanır. GSBL’lerin çok
büyük bir çoğunluğu plazmid aracılı olduğundan epidemiyolojik çalışmalarda plazmid profili
analizi de kullanılır. Bu yöntemde izole edilen plazmidlerin sayı ve boyutları agaroz jel
elektroforezi ile gösterilir. Ayrıca ribotipleme, RFLP ve ‘arbitrary primed PZR’ olarak da
bilinen ‘randomly amplified polymorphic DNA’ epidemiyolojik çalışmalar için kullanılan
diğer yöntemlerdir (31).
DNA DİZİ ANALİZİ
Bu yöntemde; nükleik asit izolasyonu, DNA sentezi ve nükleik asit hedefinin
işaretlenmesi, işaretlenmiş hedeflerin elektroforetik olarak ayrılması ve elektroforezden elde
edilen bilginin anlamlı DNA dizi bilgisine dönüştürülmesi şeklinde dört basamak vardır (69).
17
Nükleik Asit İzolasyonu
Tanımlanmış hedefler sıklıkla dizi analizinden önce PZR ile çoğaltılırlar. Duyarlılığı
en üst düzeye getirmek ve hedef dizilerin okunabilirliğini arttırmak için yeterli miktarda hedef
DNA’nın bulunması gereklidir. Elektroforez öncesinde kullanılan DNA konsantrasyonu dizi
analizi reaksiyonunda sinyal yoğunluğu ve çözünürlüğü etkiler. Fazla miktarda bulunan DNA,
floresan sinyalini doyurarak çözünürlüğü azaltan düşük sinyallerin alınmasına neden olur.
Yeterli dizi verisi ortaya çıkartmak için gereken uygun DNA konsantrasyonu hedefin
büyüklüğü ve cinsine, kullanılan dizi analizi kimyasına ve dizi analizi platformuna bağlıdır.
Genel olarak kapiller elektroforezde kalıp jel elektroforezine kıyasla daha az miktarda DNA
kullanılması gerekir (69).
İşaretleme Stratejileri ve DNA Dizi Analizi
Çalışmaların çoğunda zincir uzamasının sonlandırılması yöntemi kullanılmaktadır. Bu
yöntem DNA polimerazların deoksinükleotid trifosfat (dNTP)’ların yanında deoksiribozun 3´
pozisyonunda OH grubu taşımayan dideoksinükleotid trifosfat (ddNTP)’ları substrat olarak
kullanmaları esasına dayanır. Sentezlenen DNA iplikçiğine dNTP eklendiğinde uzama devam
ederken, ddNTP eklenmesi halinde zincir uzaması durmaktadır. Kalıp DNA’lar, primer,
dNTP karışımı ve enzimin konulduğu dört reaksiyon tüpünün her birine bir ddNTP
eklenmesinden sonra bağlanma ve uzama işlemleri uygulanmaktadır. Böylece reaksiyon
tüplerinde farklı uzunluklarda DNA parçalarının oluşması gerçekleşmektedir. Daha sonra bu
DNA parçaları akrilamid jelde elektroforeze tabi tutulmaktadır (70). Dizi analiz sonucunu
görünür hale getirmek için farklı boyalarla ortaya çıkartılan floresan sinyalin belirlenmesi,
radyoizotopik
sinyal
belirleme
stratejilerinin
yerini
almıştır.
Florofor
belirteçler
oligonükleotid primerlere (boya primerler) veya dideoksi sonlandırıcı nükleotidlere (boya
nükleotid) eklenebilir. Otomatize sistemlerin çoğunda reaksiyonun başlangıcında floresan
veren madde ile işaretli primer veya nükleotidler kullanılarak baz dizilimi gözlenebilir hale
getirilmektedir (69).
Florofor işaretleme stratejileri çok sayıda floresan boya ve eşleştirme yöntemlerini
kullanma avantajına sahiptir. ‘Applied Biosystems’ (Foster city, California) çok sayıda
floresan boya geliştirmiştir. Bunlar arasındaki ‘Big Dye’ teknolojisi dört renkli işaretleme ve
belirleme ile tek tüpte dizi analizi reaksiyonları gerçekleştirebilir, duyarlılık ve çözünürlüğün
arttırılmasını sağlar (69).
18
DNA Fragmanlarının Ayrılması ve Sinyal Belirlenmesi
Bugün en sık kullanılan yaklaşım olan Sanger’in DNA analizi (70) ile oluşturulan
fragmanların büyüklüğü birbirinden sadece bir baz ile farklılık gösterir. Bu nedenle güvenli
veri elde edebilmek için yüksek çözünürlükte ayırma işlemlerinin kullanılması gerekir. Kalıp
jel veya kapillerler kullanılarak DNA dizisinin belirlenmesinden sonra elektroforez ile
fragmanlar birbirinden ayrılabilir. Fragmanın büyüklüğü ile belirlenen 3’ ucunun kimliğine
göre elektroforetif izler anlamlı DNA dizi bilgisine dönüştürülür. Bir hedefe ait olan ve tek bir
dizi analizi reaksiyonu sonucu belirlenebilen nükleotid bazlarının sayısı okuma uzunluğu
olarak tanımlanır. Farklı otomatize dizi analiz sistemleri ve farklı dizi analizi kimyalarıyla
elde edilebilen okuma uzunlukları ve örnek işleme verimleri birbirinden farklıdır. Bu
sistemler arasında otomatik kalıp jel dizi analiz cihazlarından ‘LI-COR Global IR’ 1000 ‘base
pair’ (bp), ABI Prism 377 cihazı ise 900 bp okuma uzunluğuna sahip olup, tek kapillere sahip
ABI Prism 310 cihazının okuma uzunluğu 650 bp, 96 kapillere sahip ABI Prism 3700
cihazının ise 550 bp’dir (69).
Dizi Verilerinin Değerlendirilmesi
Elektroforetik görüntünün anlamlı DNA dizi verisine dönüştürülmesi, bilgisayar
destekli algoritmalar, elle işleme ve dizi derlemesine gerek duyar. Dizi verisinin kalitesi ve
değerlendirilmesini etkileyen çeşitli değişkenler elde edilen piklerin yüksekliği, genişliği ve
pikler arası uzaklıktır. Piklerin yüksekliği belirlenebilen sinyal yoğunluğu ile, pik genişliği
her bir sinyalin birbirine göre dağılımı ile, pikler arası uzaklık ise farklı fragmanların
çözünürlüğü ile ilişki göstermektedir. Sıranın ortasında sinyal yoğunluğu en fazladır, uçlara
doğru gidildikçe sinyaller azalır. Özellikle elektroforetik ayırma işleminin başında ortaya
çıkan ve bağlanmamış floresan işaretlere bağlı artefaktlar sinyal oranlarını azaltıp veriyi
bozabilir. Elektroforezin sonunda piklerin genişlemesi ve sinyal yoğunluğunun azalması
nedeniyle baz yakalama doğruluğu azalır. Sinyal yoğunlukları belirgin şekilde artmışsa ya da
sıralar birbirinin üzerine çıkmışsa elle optimizasyon gerekebilir. Son dizi verisinin
düzeltilmesi otomatik olarak yapılabilir ancak elde edilen dizi verisinin kalitesinin de
değerlendirilebilmesi için elle değerlendirilmesi tavsiye edilir (69).
Nükleotid dizileme izolatlardaki spesifik beta-laktamaz geninin saptanması için altın
standart olmayı sürdürmektedir. Bu yöntemle GSBL’lerin tüm varyantları tespit edilebilir.
Ancak, yoğun emek gerektirir ve kullanılan yönteme bağlı olarak değişik sonuçlar da verebilir
(28).
19
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Bu çalışma; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu onayı alınarak
Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
laboratuvarı ve İstanbul İontek laboratuvarında gerçekleştirildi (Ek 1). Trakya Üniversitesi
Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu (TÜBAP) tarafından 734 numaralı proje ile destek
sağlandı.
Çalışmada Trakya Üniversitesi Eğitim-Uygulama ve Araştırma Hastanesi’nde yatan ve
hastaların çeşitli materyallerinden hastane infeksiyonu etkeni olarak 15 Kasım 2004 - 30
Haziran 2005 tarihleri arasında Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
laboratuvarında izole edilen 269 Escherichia coli izolatı arasından GSBL üreten 45 izolat
kullanılmıştır. Bir hastadan tekrar izole edilen aynı izolatlar çalışmaya alınmamıştır.
ÇALIŞMADA KULLANILAN KİMYASALLARIN HAZIRLANMASI
Agar Dilüsyon Testi İçin Gerekli Kimyasallar
1) 0,5 McFarland bulanıklık tüpü: Önce %1 H2SO4 (Riédel de haën, Almanya)’den
9,9 ml ve %1BaCl2 (Merck, Almanya)’den 0,1 ml alınıp karıştırılarak 1 McFarland bulanıklık
tüpü elde edildi. Bu solüsyon 1:1 oranında distile su ile sulandırılarak 0,5 McFarland
bulanıklığı oluşturuldu.
2) Müller-Hinton agar besiyeri: Toz MHA (Oxoid, İngiltere)’dan 38 gr alınarak
hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda (Schott Gerate, GMBH,
Almanya) karıştırılarak kaynatıldıktan sonra otoklavda (OT 4060 Nüve) 121 °C’de 15 dk
20
tutularak sterilizasyon sağlandı. Su banyosunda (ST 402 Nüve) 50 °C’ye soğutularak
kullanıma hazır hale getirildi.
3) Müller-Hinton broth besiyeri: Toz MHB (Oxoid, İngiltere)’den 21 gr alınarak
hacim distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra deney
tüplerine 2’şer ml dağıtıldı. Otoklavda 121 °C’de 15 dk tutularak sterilizasyon sağlandı.
Beta-laktamazların İzoelektrik Noktalarının Tespiti İçin Solüsyonlar
1) 0,1 M Fosfat tamponu: Na2HPO4 (Merck, Almanya)’ten 35,81 gr, KH2PO4
(Merck, Almanya)’ten 13,60 gr alınıp Merck (Almanya) firması tarafından sağlanan özel saf
su ile hacim 1000 ml’ye tamamlandı. Hazırlanan solüsyonun pH’si pH metre (Inolab,
Almanya) yardımıyla 0,1 M HCl ya da 0,1 M NaOH kullanılarak 7,0’a ayarlandı.
2) Akrilamid-bisakrilamid %25’lik stok solüsyonu: Akrilamid (Sigma, ABD)’den
24,25 gr, Bisakrilamid (N, N’-metilenbisakrilamid) (Sigma, ABD)’den 0,75 gr alınıp hacim
saf su ile 100 ml’ye tamamlanarak elde edildi. Filtre edilerek 4 °C’de saklandı.
3) %0,1’lik Riboflavin (w/v) stok solüsyonu: Riboflavin 5’ P (Sigma, ABD)’den 50
mg alınıp hacim saf su (Merck, Almanya) ile 50 ml’ye tamamlanarak elde edildi. Filtre edilip
4 °C’de saklandı.
4) %25’lik Gliserol (w/v) solüsyonu: Gliserol (Merck, Almanya)’den 25 ml alınıp 50
ml saf su ile süspansiyon hazırlandıktan sonra hacim saf su ile 100 ml’ye tamamlanerak elde
edildi.
5) %10’luk Amonyum persülfat solüsyonu: Amonyum persülfat (Sigma, ABD)’tan
100 mg alınarak saf su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Solüsyon günlük taze olarak hazırlandı.
DNA İzolasyonu İçin Solüsyonlar
1) 10xTE tamponu (100mM Tris-10 mM EDTA) stok solüsyonu: Trizma-baz
(Sigma, ABD)’dan 12,11 gr, EDTA (Sigma, ABD)’dan 3,72 gr alınarak hacim distile su ile
1000 ml’ye tamamlandı, pH: 8,0’a ayarlandı.
21
2) 1xTE tamponu: Stok solüsyonu olan 10xTE distile su ile 1:10 oranında
sulandırılarak elde edildi.
3) Proteinaz K solüsyonu (1mg/ml): Proteinaz K (>30 U/mg) (Sigma, ABD) distile
su ile 1:1 oranında sulandırılarak elde edildi.
4) Fenol Solüsyonu: Kristalize fenol (Fluka, ABD) 60 °C’deki su banyosunda eritildi,
üzerine eşit hacimde 10xTE eklendi. Daha sonra manyetik karıştırıcıda karıştırıldı, bir süre
sonra beherde iki tabaka oluştuğu gözlendi ve üst tabaka pipetle dikkatlice çekilip atıldı.
İkinci kez aynı miktarda 10xTE eklenip aynı işlem tekrar uygulandı. Kullanılan fenole eşit
miktarda 1xTE eklendi ve aynı işlem tekrar uygulandı. İkinci kez eşit hacimde 1xTE eklendi
ve aynı işlem tekrarlandıktan sonra fenolün üzerinde küçük bir tabaka koruyucu olarak
bırakıldı, pH: 8,0’a ayarlandı. pH yüksekse TE eklenen basamaklar tekrarlandı. Hazırlanan
solüsyon ışıktan korunarak -20 °C’de saklandı.
5) 5 M NaCl solüsyonu: Balon jojeye 292,2 gr NaCl (Merck, Almanya) alınıp hacim
distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak elde edildi.
PZR ve Agaroz Jel Elektroforez İçin Hazırlanan Solüsyonlar
1) 10 mM dNTP karışımı: Her biri 100 mM olan dNTP tüpleri (Fermantas, ABD) tek
bir ependorf tüpüne boşaltılarak 25 mM stok karışım elde edildi. Kullanılacak miktar 1,5 kat
distile su ile sulandırılarak 10 mM dNTP elde edildi. Hazırlanan karışım -20 °C’de saklandı.
2) 5xTBE stok tampon solüsyonu: Trizma-baz’dan 54 gr, borik asit (Merck,
Almanya)’ten 27,5 gr, 0,5 M EDTA’dan 20 ml alınarak hacim distile su ile 1000 ml’ye
tamamlandı. Manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra pH: 8,0’a ayarlandı.
3) 0,5 M EDTA: Cam şişeye EDTA’dan 46,53 gr alınıp hacim distile su ile 250 ml’ye
tamamlanarak elde edildi.
4) 1xTBE tampon solüsyonu: Stok olarak hazırlanan 5xTBE solüsyonu distile su ile
1:5 oranında sulandırılarak elde edildi.
22
5) %1,5 Agaroz jel: Agaroz (Sigma, ABD)’dan 2,25 gr, 1xTBE tamponundan 150 ml
alınıp karıştırılarak mikrodalga fırında (Arçelik) eritildi.
Plazmid İzolasyonu ve Elektroforezde Kullanılan Kimyasallar
1) Luria Bertanii sıvı besiyeri: Tripton (Oxoid, İngiltere)’dan 1 gr, ‘yeast extract’
(Oxoid, İngiltere)’tan 0,5 gr, NaCl’den 1 gr alınarak hacim distile su ile 100 ml’ye
tamamlandı. Karıştırıcıda eritildikten sonra 5 N NaOH (Merck, Almanya) ile pH: 7,0’a
ayarlandı. Deney tüplerine 2’şer ml konularak otoklavda steril edildi.
2) Lizis tampon solüsyonu: Trizma-baz (tamponsuz)’ın 250 mM’lik solüsyonundan 4
ml, %15’lik sodyum dodesil sülfat (Sigma, ABD)’tan 3 ml alınarak hacim distile su ile 4,25
ml’ye tamamlandı. Kullanılmadan hemen önce bu karışıma 150 µl 5 N NaOH eklendi.
3) 5xTAE stok tampon solüsyonu: Trizma-baz’dan 24,2 gr, glasial asetik asit (Merk,
Almanya)’ten 5,7 ml, 0,5 M EDTA (pH: 8)’dan 10 ml alınarak hacim distile su ile 1000 ml’ye
tamamlandı.
4) 1xTAE tampon solüsyonu: 5xTAE 1:5 oranında distile su ile sulandırılarak elde
edildi.
5) Yükleme tamponu: Bromfenol mavisi (Sigma, ABD)’nden 2,5 mg, ‘ficoll’
(Pharmacia Fine Chemicals, İsveç)’den 1,5 gr alınarak hacim distile su ile 9,5 ml’ye
tamamlandı.
ÇALIŞMA AKIŞI
1) Bakteri kültürü ve VİTEK 2 ile bakteri tanımlanması
2) VİTEK 2 ve agar dilüsyon ile antibiyotik duyarlılık testi
3) VİTEK 2, agar dilüsyon ve ÇDST ile GSBL’lerin saptanması, disk difüzyon ile
inhibisyon zon çaplarına göre GSBL tarama testi
4) ‘Isoelectric focusing’ (IEF) yöntemiyle beta-laktamazların izoelektrik noktalarının
tespiti
5) Beta-laktamaz tiplerinin PZR ile belirlenmesi
6) Plazmid izolasyonu ve plazmid DNA’sıyla PZR yapılması
7) Beta-laktamazların DNA dizi analizi ile isimlendirilmesi
23
Bakteri Kültürü ve Tanımlanması
Daha önceden izole edilip −70 °C’de stoklanan izolatlar eosin-metilen blue agar
(EMB) (Salubris) besiyerine ekilip 37 °C’ye ayarlanmış etüvde (EN 500, Nüve) bir gecelik
inkübasyon ile canlandırıldı. Üreyen kolonilerden bakteri tanımlanması VİTEK 2
(BioMérieux, Fransa) otomatize sistem ile GN 21-341 identifikasyon kartları kullanılarak
gerçekleştirildi.
Antibiyotik Duyarlılık Testleri
İzolatların antibiyotik duyarlılıkları GSBL varlığını da saptayabilen AST-GN13 test
kartları (BioMérieux, Fransa) kullanılarak VİTEK 2 yöntemiyle ve bu kartlar ile bakılamayan
ancak CLSI tarafından E.coli için test edilmesi önerilen diğer antibiyotiklerin duyarlılıkları ise
agar dilüsyon yöntemiyle belirlendi.
VİTEK 2 otomatize sistem ile antibiyotik duyarlılık testi: Üretici firmanın
önerilerine göre 0,5 McFarland bulanıklığında bakteri süspansiyonu kullanılarak AST-GN13
duyarlılık kartları ile yapıldı. Kalite kontrol kökeni olarak Mikrobiyoloji ve Klinik
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı tarafından temin edilen E.coli ATCC 25922 ve E.coli ATCC
35218 kökenleri kullanıldı (56). Bu kartlarla MİK ölçümü yapılan antibiyotikler ampisilin,
ampisilin/sulbaktam, aztreonam, sefazolin, sefepim, sefotetan, seftriakson, seftazidim,
ertapenem, imipenem, siprofloksasin, levofloksasin, gentamisin, tobramisin, amikasin,
amoksisilin/klavulanat, piperasilin/tazobaktam ve trimetoprim/sulfametoksazol idi.
Agar dilüsyon yöntemi ile antibiyotik duyarlılık testi: ‘National Committee for
Laboratory Standards’ tarafından yapılan önerilere göre önce sıvı dilüsyon testi ile
kullanılacak antibiyotiklerin potensleri hesaplandıktan sonra agar dilüsyon yöntemi uygulandı
(71). Bu yöntemle MİK değeri saptanan antimikrobiyaller piperasilin (Eczacıbaşı), sefuroksim
(Glaxo-Smith Kline), sefotaksim (Sigma) ve amoksisilin/klavulanat (Mustafa Nevzat/FakoActavis) idi. Bu test için önce antibiyotik sulandırımları, antibiyotikli agar plakları ve
inokulum hazırlandı (72).
Ağırlık (mg): (Volüm (ml) X Konsantrasyon (µg/ml))/ Potens (µg/mg)
Yukarıdaki formül kullanılarak gerekli antibiyotiklerin miktarları, konsantrasyonlar
klavulanat için 2560 µg/ml, diğerleri için 5120 µg/ml ve volüm 2 ml olarak alınıp
24
hesaplandıktan sonra hassas terazide (Libor AEX-1206, Shimadzu, Japan) tartıldı. Hazırlanan
stok solüsyonu eşit hacimde MHB besiyeriyle sulandırılıp konsantrasyon her seferinde yarıya
inecek şekilde 12 tüpte sulandırım yapıldı. Böylece ilk tüpteki konsantrasyonlar klavulanat
için 1280 µg/ml, diğer antibiyotikler için 2560 µg/ml olurken, son tüpteki konsantrasyonlar
ise klavulanat için 0,625 µg/ml, diğer antibiyotikler için 1,25 µg/ml’ye indi.
Üretici firma önerilerine göre hazırlanan MHA besiyeri 50 °C’ye soğutulduktan sonra
2 ml’lik her dilüsyon 90 mm çapındaki petrilere döküldü ve üzerine 18 ml MHA besiyeri
eklenerek karıştırıldı. Ayrıca bir de antibiyotiksiz kontrol besiyeri hazırlandı. Agar konulan
petrilerin oda ısısında donması sağlandı. Petri kapakları aralık bırakılarak etüvde kurutuldu.
Kuruyan plaklar hemen kullanıldı.
Katı besiyerinde üreyen kolonilerden MHB’ye alınarak ile 0,5 McFarland
bulanıklığına (108 CFU/ml) eşit bir süspansiyon hazırlandı. Bu süspansiyon 1:10 oranında
steril serum fizyolojik ile sulandırılarak konsantrasyon 107 CFU/ml’ye ayarlandı. Hazırlanan
her süspansiyondan 100 µl inokulum çukurlarına dağıtıldı. İnokülatör ile buradan alınan
süspansiyonlar önce antibiyotik içermeyen kontrol besiyerine, daha sonra da en düşük
antibiyotik konsantrasyonu içeren besiyerinden başlayarak tüm antibiyotikli agarların
yüzeyine ekildi. İnokülatör ile 1-2 µl ekilebildiğinden agar yüzeyindeki bakteri sayısı yaklaşık
104 CFU/ml olmaktadır. Bakterilerin ekildiği noktalar tamamen kuruyana kadar plaklar oda
ısısında bırakıldı. Daha sonra petriler ters çevrilerek 35 °C’de 16-20 saat inkübe edildi.
Üremenin engellendiği en düşük antibiyotik konsantrasyonu MİK değeri olarak kabul edildi.
Tek bir koloni ya da inokülatörün oluşturduğu hafif inokulum izi dikkate alınmadı.
Genişlemiş Spektrumlu Beta-laktamazların Saptanması
Daha önceden VİTEK 1 ile GSBL pozitif olarak saklanmış izolatlar GSBL varlığı
açısından tekrar araştırıldı. Bu amaçla VİTEK 2 yöntemi, agar dilüsyon testi, ÇDST ve CLSI
tarafından tarama testi olarak önerilen inhibisyon zon çaplarına göre disk diffüzyon testi
kullanıldı.
VİTEK 2 testi: Antibiyotik duyarlılık testi için kullanılan AST-GN13 kartları ile aynı
zamanda GSBL varlığı da değerlendirildi. Sistem bu kart ile kendi içinde sefotaksim ve
seftazidimi hem tek başına hem de klavulanat ile kombinasyon halinde test ettikten sonra
MİK değerlerini karşılaştırarak GSBL’nin var olup olmadığını tespit edebilmektedir. Çalışılan
izolatlarda böylece GSBL test sonucu yoruma gerek kalmadan doğrudan ‘pozitif’ ya da
‘negatif’ olarak gösterildi.
25
Agar dilüsyon testi: Bu test için CLSI’nın önerilerine göre sefotaksim ve seftazidim
hem tek başına hem de klavulanat (4 µg/ml) eklenerek test edildi. Sefotaksim ya da seftazidim
MİK değeri ≥2 µg/ml olduğunda GSBL varlığı düşünülen izolatların, sefalosporinlere
klavulanat eklendiğinde MİK değerlerinde en az sekiz kat azalma saptandığında GSBL
ürettikleri gösterildi. Negatif kontrol olarak E.coli ATCC 25922 kökeni kullanıldı.
Disk diffüzyon yöntemiyle genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz tarama testi ve
çift disk sinerji testi: Katı besiyerinden MHB’ye alınan koloniler ile 0,5 McFarland
bulanıklığına eş değer bakteri süspansiyonu hazırlandı. Eküvyon ile alınan süspansiyon, 90
mm’lik petrilerde 4 mm kalınlığında hazırlanmış MHA besiyerinin yüzeyine 60 derecelik
açıyla döndürülerek üç yönlü olarak ekildi. Plak yüzeyindeki nem kaybolunca petrinin
merkezine antibiyotik disklerinden (Oxoid, İngiltere) biri olan amoksisilin/klavulanat (20
µg/10 µg) yerleştirildi. Daha sonra bunun çevresine merkezden merkeze 30 mm uzaklık
olacak şekilde seftazidim (30 µg), sefotaksim (30 µg), seftriakson (30 µg), sefepim (30 µg) ve
aztreonam (30 µg) diskleri yerleştirildi. Plaklar 35 °C’de bir gecelik inkübasyondan sonra
değerlendirildi. Seftazidim ≤22 mm, sefotaksim ve aztreonam ≤27 mm, seftriakson ≤25 mm
şeklinde inhibisyon zon çapı oluşturduğunda izolatın GSBL tarama testi pozitif olarak kabul
edildi. Amoksisilin/klavulanat diski ile diğer antibiyotik disklerinden herhangi biri arasında
üremenin inhibe olduğu bir alan görülmesi veya disklerden birinin inhibisyon zonunun
amoksisilin/klavulanat diskine doğru belirgin olarak genişleme göstermesi ÇDST için pozitif
sonuç olarak değerlendirildi (22).
‘Isoelectrıc Focusıng’ Yöntemi ile İzoelektrik Noktaların Saptanması
‘Isoelectric focusing’ yöntemi ‘Model mini IEF cell’ sistemi (Bio-Rad, USA)
kullanılarak poliakriamid jel elektroforeziyle uygulandı (73).Önce beta-laktamaz enzimleri
izole edilip nitrosefin ile beta-laktamaz varlığı gösterildi. Daha sonra izoelektrik nokta jeli
hazırlanarak poliakrilamid jel elektroforez ile beta-laktamazların izoelektrik noktaları tespit
edildi.
Enzim izolasyonu: Her bir ependorf tüpüne 250 µl 0,1 M fosfat tamponu (pH:7,0)
dağıtıldı. Katı besiyerinde üreyen kolonilerden bol miktarda alınıp fosfat tamponu içinde
süspansiyon hazırlandı. Süspansiyonlar −70 °C’lik derin dondurucuda (Heraus, Almanya) 30
dk, ardından 37 °C’lik su banyosunda 10 dk bekletildi. Bu döngü 10 kez tekrarlandı. Tüpler
26
12.000 g’de 15 dk santrifüj (Biofuge 22 R, Heraus, Almanya) edildi, üstteki kısım yeni bir
ependorfa alındı. İzole edilen enzimler −20 °C’de saklandı (72).
Beta-laktamaz varlığının gösterilmesi: Nitrosefin (liyofilize, Oxoid, İngiltere)
sulandırıcısı ile 500 µg/ml konsantrasyonunda olacak şekilde sulandırıldı. Mikrotitrasyon
çukurlarının her birine 5 µl nitrosefin çözeltisi dağıtıldı. Üzerine 5 µl enzim süspansiyonu
karıştırıldı. Bakterinin beta-laktamaz sentezlediği çözelti renginin 10 dk içinde koyu kırmızı
renge dönüşmesi ile gösterildi (23).
İzoelektrik nokta jelinin hazırlanması: Çalışmada ‘Model 111 mini IEF cell’ (BioRad, ABD) jel plağı, lamı, yükleme şeriti ve elektroforez tankı kullanıldı. Jel dökülecek
lamlar hafifçe ısıtıldı. Steril bir tüp içine akrilamid/bisakrilamid’in %25’lik solüsyonundan 2
ml, gliserol’ün %25’lik solüsyonundan 2 ml, riboflavin 5’ P’den 50 µl konularak üzerine 5,5
ml distile eklendi. Bu karışıma son olarak 15 µl monyum persülfat ve 3 µl TEMED (N, N, N’,
N’-tetrametiletilendiamin) eklendikten sonra jel karışımı süratle lam ile plak arasına hava
kabarcığı oluşturmadan pipetle sızdırıldı. Güneş ışığında polimerize oluncaya kadar yaklaşık
bir saat bekletildi. Polimerize olan jel camla birlikte kenardan spatula ile kaldırılarak plaktan
ayrıldı (73).
Poliakrilamid jel elektroforez ile beta-laktamazların izoelektrik noktalarının
tespiti: Hazırlanan jelin ortasına yükleme işleminde yardımcı olacak delikli şerit yerleştirildi.
TEM-1, SHV-1 ve TEM-2 kontrol kökenleri de dahil olmak üzere 5’er µl enzim yüklendi.
Beş dk bekledikten sonra süspansiyonların fazlası kurutma kağıdıyla alındı. Şerit
çıkartıldıktan sonra jelin elektrodların değeceği her iki ucuna defibrine koyun kanı ile işaret
kondu. Elektrodlar hafifçe ıslatıldıktan sonra üzerine jel yerleştirildi. Power Pac 3000 güç
kaynağı (Bio-Rad, ABD) ilk 15 dk 5 miliamper, 0,5 watt ve 100 volta, sonraki 15 dk 5
miliamper, 1 watt ve 200 volta, son olarak 60 dk 4 miliamper, 2 watt ve 400 volta ayarlanarak
jel yürütüldü. Jel ortamındaki taşıyıcı amfolitler ile oluşturulan pH gradientinde elektroforez
ile her enzimin belli bir pH değerinde toplam elektrik yük toplamının sıfıra eşit olduğu değer
olan izoelektrik nokta (pI) değerleri saptanmaya çalışıldı. Elektroforez sonunda her iki uçtaki
kanın birleştiği görüldü. Jel elektrodlardan alınarak üzerine daha önceden hazırlanan
nitrosefin çözeltisi damlatıldı ve cam baget yardımıyla yayılarak jelin üzeri tamamen
nitrosefin ile boyandı. Kısa bir süre sonra oluşmaya başlayan bantlar anoda uzaklıklarıyla
birlikte asetat kağıdına ve oradan da milimetrik kağıda aktarıldı. Standart olarak kullanılan
27
TEM-1 enziminin pI değeri 5,4, TEM-2’nin pI değeri 5,6 ve SHV-1’in pI değeri 7,6
olduğundan diğer bantlar bunlarla kıyaslanarak bakterilerin izoelektrik noktaları saptandı
(73).
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Bu test için önce DNA izolasyonu yapıldı, ardından hedef DNA çoğaltılarak agaroz jel
elektroforezde yürütüldü ve elde edilen ürünler görüntülendi.
DNA izolasyonu: Katı besiyerinde hazırlanan taze kültürlerden alınan kolonilerle
steril distile suda 1 McFarland bulanıklığında bakteri süspansiyonu hazırlandı. Ependorf
tüpüne bakteri süspansiyonundan 100 µl, 1xTE tamponundan 42 µl ve 1 mg/ml olarak
hazırlanan stok proteinaz K’dan 17 µl karıştırılıp vortex cihazında (Bioblock scientitic, IKA,
ABD) vortekslendi. Kuru ısı bloğunda (Techne dry block, DBZA, İngiltere) 60 °C’de 1 saat
inkübe edildi. Karışımın üzerine 1:1 oranında hazırlanan fenol (Fluka, ABD) – kloroform
(Sigma) karışımından 300 µl ilave edilip 10 kez alt üst edildikten sonra 15.000 g’de 10 dk
santrifüj edildi. Üstteki berrak kısım ayrı bir ependorf tüpüne alınıp üzerine bu hacmin 1/20’si
kadar 5 M NaCl ve son oluşan volüme eşit miktarda −20 °C’de tutulan izopropanolol (Merk,
Almanya) ilave edildi. Bir saat −70 °C’de bekletildikten sonra 4 °C’de 15.000 g’de 20 dk
santrifüj uygulandı. Üstteki sıvı döküldü ve pellet üzerine −20 °C’de tutulan %70’lik
etanolden 1 ml ilave edilip 15.000 g’de 10 dk tekrar santrifüj uygulandı. Üst sıvı dikkatlice
döküldü ve pellet 37 °C’deki kuru ısı bloğunda 30 dk tutularak kurutuldu. Üzerine 50 µl TE
tamponu ilave edilerek resüspanse edildi (74). DNA örnekleri PZR yapılana kadar −20 °C’de
saklandı.
Hedef DNA’nın çoğaltılması: Örnek DNA’lardan TEM, SHV, CTX-M ve OXA tipi
enzimlerin varlığı PZR ile araştırıldı. İontek (İstanbul) şirketine sentezletilen primerlerin
oligonükleotid dizileri ve parantez içinde belirtilen PZR sonucu beklenen bp büyüklükleri
aşağıda belirtildiği şekildeydi (44).
TEM-S:
5´-ATA AAA TTC TTG AAG ACG AAA -3´
TEM-AS:
5´-GAC AGT TAC CAA TGC TTA ATC-3´
SHV-S:
5´-TGG TTA TGC GTT ATA TTC GCC-3´
SHV-AS:
5´-GGT TAG CGT TGC CAG TGC T-3´
28
(1080 bp)
(865 bp)
CTX-M-9-S:
5´-TAT TGG GAG TTT GAG ATG GT-3´
(932 bp)
CTX-M-9-AS: 5´-TCC TTC AAC TCA GCA AAA GT-3´
OXA-1-S:
5´-AGC CGT TAA AAT TAA GCC C-3´
OXA-1-AS:
5´-CTT GAT TGA AGG GTT GGG CG-3´
(908 bp)
Çalışılacak her örnek için PZR karışımı 5 µl Taq polimeraz tamponu, 1,5 mM MgCl2,
1 µl dNTP karışımı (10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dTTP ve 10 mM dGTP),
araştırılacak enzim hangisiyse ona ait primerin her birinden 50 pM ve 1,25 Ü Taq polimeraz
enzimi ile ependorf tüpünde hazırlandı. Üzerine her örneği 45 µl’ye tamamlamak için distile
su ilave edildi. Karışımda kullanılan kimyasallar Fermantas (ABD)’tan sağlandı. Her örnek
için ‘thin wall’ tüpüne 45 µl PZR karışımı dağıtıldı ve üzerine 5 µl DNA örneği ilave edildi.
Tüm işlemler buz içerisinde yapıldı. Örnekler ‘thermocycler’ (Icycler, Bio-Rad, ABD)
cihazına yerleştirildi (73).
Çoğaltma için ‘thermocycler’ cihazı; 30 döngü olacak şekilde 95 °C’de 1 dk
denatürasyon, TEM ve CTX-M enzimleri için 50 °C’de 1 dk, SHV ve OXA için 55 °C’de 1
dk bağlanma ve 72 °C’de 1 dk polimerizasyon reaksiyonu için programlandı. Son reaksiyon
72 °C’de 10 dk uzama olarak ayarlandı. Ürünlerin döngülerin bitiminde korunması için
programa 4 °C’de saklama ilave edildi. Bu şekilde DNA çoğaltma aşaması tamamlanan
örnekler agaroz jel elektroforez yapılana kadar 4 °C’de tutuldu (44).
Agaroz jel elektroforez ve PZR ürünlerinin görüntülenmesi: Kullanılan
kimyasallar Sigma’dan (ABD), cihazlar ise Bio-Rad (ABD) firmasından sağlandı. Önce
1xTBE tamponu ile %1,5’lik agaroz jel hazırlanıp, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin her
bir kuyucuğuna 10 µl örnek ile 2 µl yükleme tamponu (Fermantas, ABD) karıştırılarak
yüklendi. Ortadaki ve her iki uçtaki kuyucuğa ise 2 µl 1000 bp’lik DNA ‘size marker’, 2 µl
yükleme tamponu ve 4 µl distile su ile karıştırılarak yüklendi. Pozitif kontrol kökenleri olarak
kullanılan TEM-1, SHV-1 ve OXA-1 enzimleri üreten bakteriler Doç.Dr. Müşerref
Otkun’dan, CTX-M-15 enzimi üreten bakteri Prof.Dr. Çiğdem Bal’dan temin edildi. Negatif
kontrol olarak E.coli ATCC 25922 kökeni kullanıldı. Yaklaşık 45 dk 1xTBE tamponu içinde
90 voltta elektroforez uygulandı. Etidyum bromür (1 µg/ml) (Sigma) ile boyanan ürünler UV
transilluminatörde gözlendi (74). Oluşan bantlar ‘Gel-doc’ sistemi (Bio-Rad) yardımıyla
bilgisayarda görüntülendi. Çalışılan enzimler için beklenilen ağırlıklara uyan bantlar pozitif
sonuç kabul edildi.
29
Plazmid İzolasyonu
Kado ve Liu’nun (75) protokolü kısmen modifiye edilerek uygulandı.
Taze olarak pasajlanan kültürde üreyen bakteriler 2 ml Luria-Betanii sıvı besiyeri
içeren tüplere aktarıldı. Süspansiyon çalkalayıcılı su banyosunda (ST 402, Nüve) 37°C’de
yaklaşık 16 saat inkübe edildi. Sıvı besiyerinden 1,5 ml bakteri süspansiyonu ependorfa
aktarılıp 10 dk buzda tutuldu. Oda ısısında 12.000 rpm’de 10 dk santrifüj uygulandı. Üstteki
kısım atılıp her birine 20 µl 1xTE tamponu eklenerek vortekslendi. Hazırlanan lizis
tamponundan 100’er µl eklendi ve tüpler birkaç kez alt üst edildi. Su banyosunda 58 °C’de 45
dk inkübasyon uygulandı. Her tüpe 100 µl 1:1 fenol - kloroform solüsyonu eklendi ve tüpler
alt üst edildi. Onbeş dk 13.500 rpm’de santrifüj edildi. Üstteki kısımdan 90 µl alınarak başka
bir ependorfa aktarıldı.
İzole edilen plazmidlerin elektroforezi için 1xTAE ile %0,8’lik agaroz jel hazırlandı.
Her örnekten 15 µl alınıp 5 µl yükleme tamponuyla karıştırıldı ve karışım jele yüklendi. İki
saat 80 voltta elektroforez uygulandı. Oluşan bantlar etidyum bromür ile boyandıktan sonra
UV trasilluminatörde incelendi. ‘Gel-doc’ sistemiyle görüntüler bilgisayara aktarıldı. Plazmid
DNA’sına da PZR uygulandı.
DNA Dizi Analizi
Beta-laktamaz enzimlerinin dizi analizi İontek laboratuvarında (İstanbul) yapıldı.
Önce PZR ürünleri, üreticinin önerileriyle saflaştırma kiti (Roche, Almanya) kullanılarak
saflaştırıldı. Elde edilen ürünler %1’lik agaroz jelde yürütülüp görüntülenerek bant yoğunluğu
kontrol edildi. Saflaştırılmış PZR ürünü, araştırılacak enzime özgü primer, floresan işaretli
ddNTP karışımı, Taq polimeraz, MgCl, tampon ve dNTP içeren dizileme reaksiyonu karışımı
distile su ile 10 µl’ye tamamlandı. Dizileme reaksiyonu dideoksi-zincir sonlandırma yöntemi
esasıyla yapıldı (70). Mastercycler cihazında (Eppendorf, Almanya) 95 °C’de 20 sn, 50 °C’de
25 sn ve 60 °C’de 2 dk şeklinde 35 döngü yaklaşık iki buçuk saatte tamamlanarak dizileme
işlemi yapıldı. Diziler saflaştırıldıktan sonra ‘ABI Prism 310 genetic analyzer’ (Perkin Elmer,
ABD) cihazına yüklendi. Cihaz tek kapillere sahip olup kapiller elektroforez yöntemiyle
analiz yapmaktadır. Primerin uzamasını takip eden ilk 30-50 bazda anlamlı veri sağlanamaz.
Okuma uzunluğu yaklaşık 650 bp kadardır. Kapillere gelen lazer ışınlarıyla örneklerdeki
floresansın tespiti sonucu oluşan kromatogram, sistem bilgisayarında görüntülendikten sonra
ChromasPro programı yardımıyla ‘Basic Local Aligment and Search Tool’ (BLAST)’a
aktarılarak nükleotid dizilerinin veri tabanındaki dizilerle benzerliği araştırıldı (76). İyi
okunamayan diziler cihazda tekrar analiz ettirildi. Kullanılan PZR ürünlerinin uzunlukları 865
30
bp, 908 bp, 932 bp ve 1080 bp olduğundan bu sistemle gen uzunluklarının tamamı
okutulamadı. İontek şirketi tarafından temin edilen primer-3 programı kullanılarak gen
uzunluklarının ortalarından başlayacak şekilde yeni dizileme primerleri tasarlanıp
sentezletildi, bu primerlerle yeniden dizi analizi yapıldı. Böylece oluşacak ortalama ürün
boyları yaklaşık 400 bp’ye ayarlanarak genlerin baş veya sonlarındaki nükleotidlerin
okunabilmesi amaçlandı.
İSTATİSTİKSEL ANALİZ
Verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi için Epi İnfo Version 3.3.2 paket
programı kullanıldı. Çalışmaya alınan tüm izolatlarda ve TEM içeren izolatlarda betalaktam/beta-laktamaz
inhibitörü
kombinasyonları
arasındaki
direnç
sıklıklarının
karşılaştırılmasında ki-kare testi, beta-laktamaz tiplerine göre antibiyotiklerin direnç
sıklıklarının karşılaştırılmasında ise Fisher’in kesin ki-kare testi kullanıldı ve p<0,05 değerleri
istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
31
BULGULAR
Hastane infeksiyonu etkeni olarak 15 Kasım 2004 - 30 Haziran 2005 tarihleri arasında
Trakya Üniversitesi Eğitim-Uygulama ve Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik
Mikrobiyoloji Anabilim Dalı laboratuvarında izole edilen 269 Escherichia coli izolatı
arasından GSBL pozitif olarak stoklanan 45 izolat ile çalışma planlandı. Ancak altı izolatın
agar dilüsyon yöntemiyle GSBL doğrulama testi sonucunun negatif bulunması üzerine bu
izolatlar çalışmadan çıkartıldı. Örneklerin çoğunluğu idrardan izole edildi. Çalışılan
bakterilerin izolasyon yerlerine göre dağılımı Tablo 1’de görülmektedir.
Tablo 1. Bakterilerin izolasyon yerlerine göre dağılımı
İzolasyon yeri
İdrar
Sayı
19
Kan
4
TTA
3
Yara
13
Toplam
39
TTA: Transtrakeal aspirat.
Bakteriler en fazla genel cerrahi kliniğinden olmak üzere 15 farklı klinikten izole edildi.
İzolatların kliniklere göre dağılımı Tablo 2’de görülmektedir.
32
Dahili klinikler
(n: 16)
Cerrahi
klinikler
(n: 23)
Tablo 2. İzolatların kliniklere göre dağılımı (N: 39)
Klinik
Genel cerrahi
Üroloji
Ortopedi
Reanimasyon
Beyin cerrahisi
Nefroloji
İnfeksiyon hastalıkları
Nöroloji
Hematoloji
Kardiyoloji
KYBÜ
Onkoloji
Pediatri
Gastroenteroloji
Göğüs hastalıkları
Sayı
9
7
3
2
2
3
2
1
1
2
1
1
3
1
1
KBYÜ: Koroner yoğun bakım ünitesi.
Agar dilüsyon yöntemiyle bakılan GSBL doğrulama testiyle karşılaştırıldığında,
izolatların tümü VİTEK 2 yöntemi ve disk diffüzyonla zon çapına göre GSBL tarama testiyle
GSBL pozitif olarak sonuç verirken, ÇDST ile izolatların ancak 19’u (%49) GSBL pozitif
bulundu. Bu yöntemin negatif olarak sonuçlandığı 20 izolatın inhibisyon zon çapı ya hiç yok
ya da çok dardı.
VİTEK 2 sistemiyle ve bu sistemde kullanılan AST GN13 kartında bulunmayan
piperasilin, sefuroksim, sefotaksim ve amoksisilin/klavulanat için agar dilüsyon yöntemiyle
yapılan duyarlılık testi sonucunda ortaya çıkan antibiyotiklerin duyarlılık dağılımları Tablo
3’te görülmektedir.
Duyarlılık sonuçları değerlendirilirken orta duyarlı kökenler dirençli kabul edildi.
Buna göre çalışmaya alınan 39 izolatın tamamı ampisilin, piperasilin ve sefuroksime dirençli,
karbapenemlere ve sefotetana duyarlıydı. Oksiimino-sefalosporinlerden seftazidime 15 (%38),
sefotaksim ve seftriaksona beş (%13) izolat fenotipik olarak duyarlı bulundu. Dördüncü kuşak
sefalosporin olan sefepime ise 23 (%59) izolat duyarlıydı. Beta-laktam/beta-laktamaz
inhibitörü kombinasyonlarından piperasilin/tazobaktam 34 izolatta (%87) duyarlı bulunurken,
amoksisilin/klavulanat 24 izolatta (%62), ampisilin/sulbaktam ise sadece bir izolatta (%3)
duyarlıydı. Piperasilin/tazobaktam duyarlılığı amoksisilin/klavulanata göre daha yüksek
bulundu (ki-kare: 5,45, p<0,05). Kinolon grubu antibiyotiklerin her ikisine de %15 duyarlılık
gözlenirken, aminoglikozidlerden amikasine %95, gentamisine %41 ve tobramisine %18
oranında duyarlılık saptandı.
33
Tablo 3. Tüm izolatların antibiyotik duyarlılıklarına göre dağılımları (N: 39)
Antibiyotikler
AMP
PIP
SAM
ATM
KZ
CXM
FEP
CTT
CRO
CTX
CAZ
AMC
TZP
IPM
ETP
CIP
LEV
GN
TOB
AK
SXT
S
1
5
1
23
39
5
5
15
24
34
39
39
6
6
16
7
37
23
R
39
39
38
34
38
39
16
34
34
24
15
5
33
33
23
32
2
16
AMP: Ampisilin, PIP: Piperasilin, SAM: Ampisilin/sulbaktam, ATM: Aztreonam, KZ: Sefazolin, CXM:
Sefuroksim, FEP: Sefepim, CTT: Sefotetan, CRO: Seftriakson, CTX: Sefotaksim, CAZ: Seftazidim, AMC:
Amoksisilin/klavulanat, TZP: Piperasilin/tazobaktam, IPM: İmipenem, ETP: Ertapenem, CIP: Siprofloksasin,
LEV: Levofloksasin, GN: Gentamisin, TOB: Tobramisin, AK: Amikasin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol,
S: Duyarlı, R: Dirençli.
Beta-laktamaz izolasyonu sonrasında tüm izolatlarda nitrosefin testi pozitif bulundu.
İzolatlarda poliakrilamid jel elektroforez ile IEF uygulanması sonucunda 10 farklı bant tespit
edildi. İzolatların beş tanesinde IEF ile hiçbir bant tespit edilemedi. Ayrıca tüm izolatlarda pI
değeri 8,1’in üzerinde olan, gözle ayırt edilebilen bant oluşturmayan, yayılma tarzında geniş
bantlar gözlendi. Belirlenen bantların pI değerlerine göre dağılımı Tablo 4’te görülmektedir.
34
Tablo 4. ‘Isoelectric focusing’ ile bantları belirlenen izolatların pI değerlerine göre
dağılımı
Bant belirlenen
izolatların sayısı
14
11
10
5
6
1
1
1
1
1
pI Değeri
7,3
5,6
5,4
5,7
7,5
5,8
6,9
7,6
7,9
8,1
En fazla pI: 7,3, 5,6 ve 5,4 olan bantlar gözlendi. İzolatların 15’inde (%38) iki farklı
bant görülürken, bir izolatta üç farklı bant izlendi. Bazı örneklere ait IEF ile belirlenen pI
değerlerini gösteren bantlar Şekil 1’de görülmektedir.
7,6
7,3
6,9
5,6
5,4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Şekil 1. Poliakrilamid jel elektroforez sonucu oluşan beta-laktamaz bantlarının pI
değerleri. 1: TEM-1 (pI:5,4) ve 2: SHV-1 (pI:7,6) kontrol bantları. 3: 4, 4: 10, 5:
12, 6: 21, 7: 22, 8: 23, 9: 36, 10: 3 no.lu kökenlere ait bantlar.
TEM, OXA, SHV ve CTX-M enzim tipleri PZR ile araştırıldı. Agaroz jel elektroforez
ile 39 izolatın 34’ünde toplam 51 ürün bandı görüntülendi. Kullanılan DNA standardı 1000 bp
büyüklüğündeydi. Bu nedenle TEM için beklenen uzunluk olan 1080 bp tam olarak
ölçülemedi, oluşan bant uzunlukları 1000 bp’in hemen üzerinde bulundu. Diğer enzimlere ait
bantlar standartla karşılaştırıldığında beklenen büyüklüklere uygun bulundu. En fazla TEM
tipi (n: 27), en az CTX-M tipi (n: 1) beta-laktamaz saptandı. İzolatların beşinde araştırılan
35
enzimlerden hiçbirine rastlanmadı. Enzimlerin tiplere göre dağılımı Tablo 5’te görülmektedir.
Elektroforez sonucu oluşan beta-laktamaz tiplerine ait bantlar Şekil 2 ve 3’te görülmektedir.
Tablo 5. Beta-laktamaz enzimlerinin tiplerine göre dağılımı
Enzim tipi
TEM
OXA
SHV
CTX-M
Toplam
Sayı (%)
27 (53)
20 (39)
3 (6)
1 (2)
51 (100)
Tek tip enzimi olan 18 izolat saptandı. Bunların 11’i TEM tipi enzim içeriyordu. Diğer
yedi izolatın altısında OXA, birinde SHV tipi enzim mevcuttu.
M 1 2 3 4 5
M
a
b
c
6
d
7
e
M
f
8 9 10 11 12 13 14
g
h
ı
j
k
l
M
m M
Şekil 2. CTX-M (üstte) ve OXA (altta) PZR ürünlerinin agaroz jelde görüntülenmesi. M:
Size marker 100-1000 bp, 1: 24, 2: 25, 3: 26, 4: 28, 5: 29, 6: 31, 7: 32, 8: 33, 9: 34,
10: 35, 11: 36, 12: 37 no.lu kökenler, 13: negatif kontrol, 14: pozitif kontrol. a: 16,
b: 17, c: 19, d: 20, e: 21, f: 24, g: 22, h: 27, ı: 23, j: 25, l: 27 no.lu kökenler, k: pozitif
kontrol, m: negatif kontrol.
36
M
1
2
3
4
M
M
a
b
c
d
e
f
Şekil 3. TEM (solda) ve SHV (sağda) PZR ürünlerinin agaroz jelde görüntülenmesi.
M: Size marker 100-1000 bp, 1: 27, 2: 30, 3: 33 no.lu kökenler, 4: negatif kontrol. a:
16, b: 17, c: 19, d: 20, e: 21 no.lu kökenler, f: negatif kontrol.
TEM tipi beta-laktamazı bulunan izolatların (n: 27) yarısında aynı zamanda OXA tipi
beta-laktamaz da vardı (n: 14). Bu 14 izolatın birinde SHV tipi beta-laktamaz da vardı. CTXM’i olan tek izolatta TEM tipi enzim de mevcuttu. TEM tipi enzimlerin tek başına ve diğer
enzimlerle birlikte olan dağılımı Tablo 6’da görülmektedir.
Rastgele seçilen altı izolat için plazmid izolasyonu yapıldı. Agaroz jel elektroforez
sonucu oluşan plazmid bandları Şekil 4’te görülmektedir. Ancak bu plazmid örnekleriyle
yapılan PZR ile, test tekrarlanmasına rağmen hiçbir enzim bandı bulunamadı.
Tablo 6. TEM tipi enzimlerin dağılımı
Enzim tipi
Yalnız TEM
Yalnız TEM+OXA
TEM+CTX-M
TEM+SHV
TEM+OXA+SHV
Toplam
İzolat sayısı
11
13
1
1
1
27
37
1
2
3
4
5
6
Şekil 4. Seçilen altı izolattan elde edilen plazmidlerin agaroz jel elektroforez görünümü.
1: 1, 2: 2, 3: 4, 4: 14, 5: 32, 6: 37 no.lu kökenlere ait bantlar.
Ampisilin/sulbaktama duyarlı bulunan tek izolat, IEF ve PZR ile beta-laktamaz
saptanamayan beş izolattan biriydi. Bu beş izolatın hepsi piperasilin/tazobaktam,
amoksisilin/klavulanat ve amikasine duyarlı bulundu. Araştırılan enzimlerin hiçbiri
bulunamayan izolatların antibiyotiklere duyarlılığına göre dağılmı Tablo7’de görülmektedir.
Yalnız TEM pozitif olan 11 izolatta, TEM ve OXA’nın ikisini birden içeren 14 izolata
göre seftazidim direnci daha düşük bulundu (p<0,05). Sefotaksim direnci açısından iki grup
arasında anlamlı fark yoktu (p>0,05). TEM ve OXA birlikte pozitif olan izolatlarda seftazidim
ve sefotaksim direnç oranı aynıydı. TEM içeren 27 izolatla TEM içermeyen yedi izolat
arasında hem seftazidim hem de sefotaksim direnci açısından anlamlı fark saptanmadı
(p>0,05).
TEM içeren 27 izolatta piperasilin/tazobaktam duyarlılığı, amoksisilin/klavulanata
göre daha yüksek (ki-kare: 4,72, p<0,05) bulundu. Yalnız TEM içeren 11 izolatta
piperasilin/tazobaktam duyarlılığı ile amoksisilin/klavulanat duyarlılığı arasında anlamlı fark
saptanmazken (p>0,05), TEM ve OXA birlikte pozitif olan 14 izolat arasında
piperasilin/tazobaktam duyarlılığı, amoksisilin/klavulanata göre daha yüksek bulundu
(p<0,05). Bununla birlikte yalnız TEM pozitif izolatlarla TEM ve OXA birlikte pozitif olanlar
arasında piperasilin/tazobaktam direnci açısından anlamlı fark bulunamadı (p>0,05). Ayrıca
amoksisilin/klavulanat duyarlılığı açısından da bu iki grup arasında fark bulunamadı (p>0,05).
38
Tablo 7. Hiçbir enzim saptanamayan beş izolatın antibiyotiklere duyarlılıklarına göre
dağılımı
Antibiyotik
AMP
PIP
SAM
ATM
KZ
CXM
FEP
CRO
CTX
CAZ
AMC
TZP
CTT
IPM
ETP
CIPn
LEV
GN
TOBn
AK
SXT
S
1
1
3
1
2
5
5
5
5
5
2
2
2
3
5
2
R
5
5
4
4
5
5
2
5
4
3
3
3
3
2
3
AMP: Ampisilin, PIP: Piperasilin, SAM: Ampisilin/sulbaktam, ATM: Aztreonam, KZ: Sefazolin, CXM:
Sefuroksim, FEP: Sefepim, CTT: Sefotetan, CRO: Seftriakson, CTX: Sefotaksim, CAZ: Seftazidim, AMC:
Amoksisilin/klavulanat, TZP: Piperasilin/tazobaktam, IPM: İmipenem, ETP: Ertapenem, CIP: Siprofloksasin,
LEV: Levofloksasin, GN: Gentamisin, TOB: Tobramisin, AK: Amikasin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol,
S: Duyarlı, R: Dirençli.
Yalnız TEM içeren izolatlarla TEM ve OXA’yı birlikte içerenlerin antibiyotik
duyarlılıklarına göre dağılımları Tablo 8’de görülmektedir.
39
Tablo 8. Yalnız TEM (n: 11) ile TEM ve OXA’yı birlikte içeren (n: 14) izolatların
antibiyotik duyarlılıklarına göre dağılımları
Yalnız TEM TEM+OXA
Antibiyotik
S
R
S
R
AMP
11
14
PIP
11
14
SAM
11
14
ATM
1
10
14
KZ
11
14
CXM
11
14
FEP
6
5
8
6
CRO
11
1
13
CTX
1
10
2
12
CAZ
6
5
2
12
AMC
6
5
8
6
TZP
9
2
13
1
CTT
11
14
IPM
11
14
ETP
11
14
CIP
2
9
1
13
LEV
2
9
1
13
GN
3
8
8
6
TOB
3
8
14
AK
10
1
13
1
SXT
3
8
12
2
AMP: Ampisilin, PIP: Piperasilin, SAM: Ampisilin/sulbaktam, ATM: Aztreonam, KZ: Sefazolin, CXM:
Sefuroksim, FEP: Sefepim, CTT: Sefotetan, CRO: Seftriakson, CTX: Sefotaksim, CAZ: Seftazidim, AMC:
Amoksisilin/klavulanat, TZP: Piperasilin/tazobaktam, IPM: İmipenem, ETP: Ertapenem, CIP: Siprofloksasin,
LEV: Levofloksasin, GN: Gentamisin, TOB: Tobramisin, AK: Amikasin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol,
S: Duyarlı, R: Dirençli.
Toplam TEM içeren izolatlarla TEM dışı enzimleri içeren izolatların antibiyotik
duyarlılıklarına göre dağılımları Tablo 9’da görülmektedir.
40
Tablo 9. TEM içeren izolatlarla (n: 27) TEM içermeyen izolatların (n: 7) antbiyotik
duyarlılıklarına göre dağılımları
Antibiyotik
AMP
PIP
SAM
ATM
KZ
CXM
FEP
CRO
CTX
CAZ
AMC
TZP
CTT
IPM
ETP
CIP
LEV
GN
TOB
AK
SXT
TEM içerenler
S
2
16
2
4
9
16
24
27
27
27
3
3
11
3
25
17
TEM içermeyenler
S
R
R
27
27
27
25
27
27
11
25
23
18
11
13
24
24
16
24
2
10
2
1
4
3
2
4
3
5
7
7
7
1
1
3
1
7
4
7
7
7
5
6
7
3
4
5
3
4
2
6
6
4
6
3
AMP: Ampisilin, PIP: Piperasilin, SAM: Ampisilin/sulbaktam, ATM: Aztreonam, KZ: Sefazolin, CXM:
Sefuroksim, FEP: Sefepim, CTT: Sefotetan, CRO: Seftriakson, CTX: Sefotaksim, CAZ: Seftazidim, AMC:
Amoksisilin/klavulanat, TZP: Piperasilin/tazobaktam, IPM: İmipenem, ETP: Ertapenem, CIP: Siprofloksasin,
LEV: Levofloksasin, GN: Gentamisin, TOB: Tobramisin, AK: Amikasin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol,
S: Duyarlı, R: Dirençli.
Beta-laktamazlar için uygulanan PZR ürünlerinin DNA dizi analizi sonucunda, TEM
tipi enzimlerin 12’si TEM-1 olarak bulundu. Geriye kalan 15 TEM tipi enzimin yaklaşık son
on beş aminoasiti analiz sonucu okunamadı, kalan kısımlar TEM-1 ve TEM-104 ile
uyumluydu. OXA tipi enzimi olan 9, 22 ve 32 no.lu izolatın OXA enzimlerinin baştaki
yaklaşık on aminoasiti okunamadı. Ancak okunan alanları OXA-30 ile uyumluydu. Geriye
kalan 17 OXA tipi enzim de OXA-30 olarak adlandırıldı. Dizilerinin tamamı okunamayan
ürünler iki kez daha tekrar analiz edildi, daha sonra dizilerin ortasına denk gelecek şekilde
yeni primerler oluşturularak testler tekrarlandı. Yeniden yapılan analiz sonucu yine tam
okunamayan diziler için dizi analizi son kez tekrar edildi. SHV tipi enzimler 14 no.lu izolatta
pI: 7,6 olan SHV-1, 21 no.lu izolatta pI: 6,9 uyumlu olmayan SHV-12 ve 32 no.lu izolatta pI:
8,2 ile uyumlu olmayan SHV-2 olarak saptandı. CTX-M pozitif tek izolat olan 37 no.lu
41
izolattaki enzim pI: 8,1 ile uyumlu olan CTX-M-14 olarak isimlendirildi. SHV-1 saptanan 14
no.lu izolatta yalnız seftazidimin MİK değeri >2 µg/ml ancak yine de duyarlı bulundu (MİK:
4 µg/ml). Diğer üçüncü kuşak sefalosporinlerin MİK değerleri ≤1 µg/ml idi. Betalaktam/beta-laktamaz inhibitörleri dirençli bulunan bu izolatta başka bir enzim saptanamadı.
CTX-M-14 enzimi saptanan 37 no.lu izolat sefotaksime dirençli, seftazidime ve betalaktam/beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlı bulundu.
Yanında TEM ve OXA tipi enzim de bulunduran SHV-2’yi taşıyan 32 no.lu izolat
sefotaksime duyarlı, seftazidime ve beta-laktam/beta-laktamaz inhibitörlerine dirençliydi. Bu
izolatların TEM ve OXA tipi enzimleri tam olarak isimlendirilemedi.
Dizileme sonucu isimlendirilen enzimlerin izolatlara göre dağılımı Tablo 10’da
görülmektedir.
42
Tablo 10. Dizileme sonucu isimlendirilen enzimlerin izolatlara göre dağılımı
İzolat no.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
TEM
*
*
TEM-1
TEM-1
*
TEM-1
TEM-1
*
TEM-1
TEM-1
*
*
TEM-1
*
*
TEM-1
TEM-1
TEM-1
TEM-1
TEM-1
*
*
*
*
*
*
*
OXA
SHV
OXA-30
OXA-30
OXA-30
OXA-30
OXA-30
OXA-30
*
OXA-30
OXA-30
OXA-30
OXA-30
*
OXA-30
OXA-30
OXA-30
OXA-30
OXA-30
*
OXA-30
OXA-30
CTX-M
-
-
SHV-1
SHV-12
SHV-2
-
CTX-M-14
-
*: Tam olarak isimlendirilemeyen enzimler.
Tüm izolatların antibiyotik duyarlılık testi sonuçları, IEF ile belirlenen bantların pI değerleri,
PZR ile saptanan beta-laktamaz enzim tipleri ve enzim adları Tablo 11’de görülmektedir.
43
Tablo 11. Tüm izolatların antibiyotik duyarlılık testi sonuçları, pI değerleri, beta-laktamaz tipleri ve enzim adları
no
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
stok no
AMP
04.11.2928 ≥32
04.11.2919 ≥32
04.11.2894 ≥32
04.11.2839 ≥32
05.05.993
≥32
05.05.1104 ≥32
05.02.442
≥32
05.01.233
≥32
05.01.203
≥32
05.06.1462 ≥32
05.01.134
≥32
05.03.539
≥32
05.01.205
≥32
05.03.603
≥32
05.04.739
≥32
05.04.746
≥32
05.02.534
≥32
05.06.1289 ≥32
04.12.2955 ≥32
04.11.2896 ≥32
05.06.1271 ≥32
05.03.544
≥32
05.05.1210 ≥32
05.05.1211 ≥32
04.11.2872 ≥32
05.05.1065 ≥32
04.11.2815 ≥32
04.12.3157 ≥32
05.03.734
≥32
05.04.748
≥32
05.03.721
≥32
04.12.2969 ≥32
05.06.1238 ≥32
05.04.899
≥32
05.05.1071 ≥32
05.01.85
≥32
05.01.98
≥32
05.01.23
≥32
04.12.3097 ≥32
PIP
128
128
256
128
256
256
256
128
256
128
256
128
256
256
128
256
256
256
256
256
64
256
256
256
128
256
256
256
256
256
128
256
128
256
128
128
128
128
256
SAM ATM KZ CXM
32
≥64 ≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
16
16 ≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
16
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
8
2
≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
32
≤1 ≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
16
16 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
16
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
32
16 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
4
8
128
32
≥64 ≥64 128
16
1
≥64 128
32
16 ≥64 ≥256
16
16 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
4
≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
32
≥64 ≥64 ≥256
FEP
8
≤1
≥64
8
16
≥64
≥64
8
2
2
≥64
≤1
2
≤1
2
8
≥64
8
≥64
16
≤1
8
8
≥64
≥64
≥64
≥64
≥64
16
16
2
2
≤1
2
2
≥64
2
2
8
Antibiyotik MİK değerleri
CRO CTX AMC TZP CTT
≥64
32
4/2
8
≤4
16
64
8/4
≤4
≤4
2
256
8/4
8
≤4
≥64
64
8/4
≤4
≤4
≥64 256
8/4
8
≤4
≥64
64
16/8
8
≤4
≥64 128
8/4
8
≤4
≥64 128
8/4
≤4
≤4
≥64 256
8/4
8
≤4
≥64
64
8/4
≤4
≤4
≥64 128 16/8
8
≤4
≥64
8
4/2
≤4
≤4
≥64 128 16/8 ≤4
≤4
≤1
0.25 16/8 ≥128 ≤4
≥64
32
8/4
8
≤4
≥64 128
8/4
≤4
≤4
≥64 256 16/8
8
≤4
≥64 128 16/8
8
≤4
≥64 128
8/4
8
≤4
≥64 128 16/8
8
≤4
2
4
8/4
≤4
≤4
≥64 128
8/4
8
≤4
≥64 128
8/4
8
≤4
≥64 128
8/4
≤4
≤4
≥64 128 16/8
8
≤4
≥64 128 16/8
8
≤4
≥64
32
16/8 ≤4
≤4
≥64
64 64/32 ≥128 ≤4
≥64 256 16/8
8
≤4
≥64 128
8/4
≤4
≤4
≤4
8
1
32/16 ≥128
64
≤4
8
4
32/16
≤4
≤4
≥64
2
4/2
≤4
≥64
64 32/16 64
32
16
8/4
≤4
≤4
≥64
64
4/2
≤4
≤4
32
16
8/4
≤4
≤4
≥64
64
8/4
8
≤4
≥64 128
8/4
8
≤4
IPM
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
≤1
ETP
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
≤0.5
CIP
≥4
1
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≤0.25
≥4
≥4
≥4
≤0.25
≥4
≤0.25
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≤0.25
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≥4
≤0.25
≥4
≥4
≥4
≥4
LEV
≥8
1
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≤0.25
≥8
≥8
≥8
≤0.25
≥8
1
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≤0.25
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
≥8
4
≥8
≤0.25
≥8
≥8
≥8
≥8
GN
≤1
≥16
≥16
8
≤1
≤1
≥16
≥16
≥16
≥16
≥16
≤1
≥16
4
≥16
≥16
≥16
≤1
≥16
≤1
8
≤1
≤1
≤1
≤1
≥16
≤1
8
≤1
≥16
≤1
≥16
≥16
≤1
≤1
≥16
≥16
≥16
≥16
TOB
≥16
≥16
≥16
8
≥16
≥16
≥16
≥16
≥16
8
≥16
1
8
1
≥16
≥16
≥16
≥16
≥16
8
≥16
≥16
≥16
1
8
≥16
1
8
≥16
≥16
8
≥16
8
1
1
4
8
≥16
≥16
AK
16
8
16
4
16
8
8
8
8
≤2
16
≤2
≤2
8
4
8
8
8
32
≤2
16
16
16
≤2
≤2
16
≤2
≤2
16
≤2
4
32
≤2
≤2
≤2
≤2
4
4
8
SXT
≤20
≤20
≤20
≥320
≤20
≤20
≥320
≥320
≤20
≥320
≤20
≤20
≥320
≤20
≤20
≤20
≤20
≤20
≥320
≤20
≤20
≤20
≤20
≤20
≤20
≥320
≥320
≥320
≤20
≤20
≥320
≥320
≥320
≥320
≥320
≥320
≤20
≥320
≤20
IEF ile
pI değeri
5,7, 7,3
5,7, 7,3
7,3
5,8, 7,5
7,5
5,7, 7,5
5,6
5,6, 7,5
5,6
5,7
7,6
7,3
5,4
5,6, 7,6
5,4, 7,3
5,6
5,6, 7,3
5,6, 6,9
5,6, 7,3
5,6, 7,3
5,6, 7,3
7,3
5,4
5,4
5,4, 7,3
5,4
7,3
Beta-laktamaz
tipi ve enzim adı
TEM, OXA-30
TEM, OXA-30
OXA-30
TEM-1, OXA-30
OXA-30
TEM-1, OXA-30
TEM
TEM-1, OXA
TEM-1
TEM
SHV-1
OXA-30
TEM-1
TEM-1, OXA-30
TEM, OXA-30
TEM
TEM-1, OXA-30
TEM, SHV-12
TEM, OXA
TEM-1, OXA-30
TEM-1, OXA-30
OXA-30
TEM-1
TEM-1
TEM-1, OXA-30
TEM
OXA-30
5,4, 7,5, 7,9
TEM, OXA, SHV-12
5,7
5,4
5,4
5,6, 8,1
7,3
5,4, 7,3
TEM
TEM
TEM
TEM, CTX-M-14
OXA-30
TEM, OXA-30
AMP: Ampisilin, PIP: Piperasilin, SAM: Ampisilin/sulbaktam, ATM: Aztreonam, KZ: Sefazolin, CXM: Sefuroksim, FEP: Sefepim, CTT: Sefotetan, CRO: Seftriakson, CTX:
Sefotaksim, CAZ: Seftazidim, AMC: Amoksisilin/klavulanat, TZP: Piperasilin/tazobaktam, IPM: İmipenem, ETP: Ertapenem, CIP: Siprofloksasin, LEV: Levofloksasin, GN:
Gentamisin, TOB: Tobramisin, AK: Amikasin, SXT: Trimetoprim/sulfametoksazol, MİK: Minimum inhibitör konsantrasyon, IEF: ‘Isoelectric fofusing’, pI: İzoelektrik nokta.
44
TARTIŞMA
Enterik gram negatif bakterilerde beta-laktamaz sentezi en önemli antibiyotik direnç
mekanizmasıdır. Enterobactericeae üyelerinde en sık görülen beta-laktamaz ise TEM-1’dir
(6). Bu enzim E.coli izolatlarının yaklaşık %50’sinde görülen ampisilin direncinin neredeyse
%90’ından sorumludur. Geniş spektrumlu beta-laktam antibiyotiklerin yaygın kullanımı ile
TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 enzimlerinde bir ila dört aminoasit değişikliği sonucu GSBL’ler
ortaya çıkmıştır (28). İlk olarak Almanya’da görülmesine rağmen, önce Fransa’da salgına
neden olmuştur (31).
Hastane infeksiyonlarından izole edilen etkenlerde GSBL varlığına ilişkin veriler
yıldan yıla, ülkeden ülkeye, hastaneden hastaneye farklılık göstermektedir. Batı Avrupa
ülkelerinde yoğun bakım ünitelerinden izole edilen Klebsiella kökenlerinde GSBL üretim
sıklığının %25 civarında olduğu bildirilmektedir (77). Çift disk sinerji testi kullanılarak
sırasıyla E.coli ve K.pneumoniae için GSBL pozitifliği oranlarını Tonkic ve ark. (78) %4,7 ve
%36,8, Gangoué-Piéboji ve ark. (79) %14,3 ve %18,8, Jeong ve ark. ise (80) %9,2 ve %30
şeklinde belirlemişlerdir. Tzalepi ve ark.’ın (81) Yunanistan’daki bir çalışmasında E-test ile
E.coli’de GSBL pozitifliği %20 olarak saptanmıştır.
Ülkemizde de bu konuda yapılmış çeşitli araştırmalar mevcuttur. Akata ve ark. (42)
1995-1999 yılları arasında izole edilen hastane kökenli Enterobactericeae üyesi 194 izolatın
23 (%11,8)’ünün GSBL ürettiğini, bunların 21’inin K.pneumoniae (84 kökenin %24’ü),
birinin E.coli (54 köken) birinin ise Providencia rettgeri (iki köken)’de bulunduğunu ÇDST
ve E-test yöntemiyle belirlemişlerdir. E-test ile E.coli’de GSBL oranını Gültekin ve ark. (82)
%21 olarak saptamıştır. Tünger ve ark.’ın (83) bir çalışmasında yoğun bakım hastalarından
izole edilen E.coli’lerin %21,5’inde GSBL aktivitesi bulunmuştur. Çift disk sinerji testiyle
45
E.coli’de GSBL oranını Özbilge ve ark. (84) %21, Delialiağlu ve ark. (85) %29 olarak
saptamışlardır.
Trakya Ünivesitesi Eğitim-Uygulama ve Araştırma Hastanesi’nde 15 Kasım 2004 - 30
Haziran 2005 tarihleri arasında hastane infeksiyonu etkeni olarak izole edilen 269 E.coli
izolatından 45’i (%17) daha önceden VİTEK 1 yöntemi ile GSBL pozitif olarak stoklanmış ve
çalışma bu izolatlarla planlanmıştır. Buradaki %17’lik oran diğer çalışmalardaki oranlara
benzer şekilde bulunmuştur. Ancak çalışma sırasında agar dilüsyon ve VİTEK 2 yöntemiyle
45 izolatın altısı GSBL negatif olarak bulunmuş ve bu izolatlar çalışma dışında tutulmuştur.
Bu negatiflik izolatların stoklama süresince plazmidlerini kaybetmiş olabilmelerinden ya da
daha önce kullanılan VİTEK 1 yönteminden kaynaklanabilir.
Bir bakteride GSBL varlığını belirlemek için laboratuvarlarda sık kullanılan bir
yöntem ÇDST’dir. Ancak, bu yöntemin güvenilirliğini azaltan çeşitli faktörler bulunmaktadır.
Bazı kökenler tarafından yüksek düzeyde oluşturulan sefalosporinazların varlığı sinerjik
etkinin görülmesini önleyebilmektedir. Ayrıca diskler arası mesafenin 30 mm olduğu
deneylerde yanlış negatif sonuçlar elde edildiği, böyle durumlarda diskler arası mesafenin 20
mm olmasının daha uygun olacağı bildirilmiştir. Klavulanik asit diskinde meydana
gelebilecek potens kaybının da dikkate alınması gerektiği belirtilmektedir (57). Ayrıca TEM
ve SHV’den kaynaklanmayan bazı GSBL’lerin (MIR-1, CMY-2 ve OXA grubu enzimler
gibi) inhibitörlerden etkilenmedikleri de akılda tutulmalıdır (6).
Köroğlu ve ark. (86) GSBL yönünden şüpheli 80 kökenden 32’sinde agar dilüsyon ile
GSBL pozitifliği saptamış, agar dilüsyon ile karşılaştırıldığında diskler arası mesafeyi 25 mm
alarak yaptıkları ÇDST ve E-testin duyarlılığını %75 olarak bulmuşlardır. Ülkar ve ark. (87),
yatan hastalardaki E.coli izolatlarında ÇDST ile %3,5, antibiyotik duyarlılığı ile %11,5
oranında GSBL saptamıştır. Fincancı ve ark.’ın (88) GSBL saptamada çeşitli yöntemleri
karşılaştırarak yaptıkları bir çalışmada GSBL pozitiflik oranı en çok zon çapına göre GSBL
testiyle elde edilmiş (%50), diskler arası mesafenin 30 mm olduğu ÇDST ile %2, diskler arası
mesafenin 25 mm olduğu ÇDST ile %20 olarak bulunmuştur. Gülay ve ark. (89) yaptıkları bir
çalışmada hastane kökenli 44 K. pneumoniae izolatında ÇDST ile GSBL üretme sıklığını
diskler arası mesafe 30 mm olarak uygulandığında %56,8, 20 mm olarak uygulandığında ise
%88,6 olarak saptandığını bildirmişlerdir.
Bu çalışmada diskler arası mesafe 30 mm olarak uygulanan ÇDST, GSBL pozitif olan
39 kökenin 19’unda (%49) pozitif olarak sonuçlandı. Geriye kalan 20 kökenin tamamında
inhibisyon zon çapları ya çok dar ya da hiç yoktu. Bu sonuca göre ÇDST’nin duyarlılığı Ülkar
ve ark.’ın çalışmasıyla (87) Fincancı ve ark.’ınkinden (88) yüksek, Gülay ve ark.’ın (89)
46
çalışmasındakine
benzer,
diğer
çalışmalardakinden
ise
daha
düşük
bulunmuştur.
Çalışmamızda duyarlılığın düşük bulunması testte kullanılan sefalosporinler için inhibisyon
zon çaplarının çok dar ya da hiç olmayışıyla açıklanabilir.
Beta-laktamaz tiplerinden TEM tipi GSBL’ler en sık E.coli’de bulunur (31).
Çalışmamızda 27 izolatta PZR ile TEM tipi beta-laktamaz bulundu. ‘ABI Prism 310 genetic
analyzer’ cihazının okuma uzunluğu yaklaşık 650 bp olup araştırılan enzim tiplerinin
tamamının gen uzunluğundan daha kısa olduğundan ara primerler oluşturularak yeniden dizi
analizi yapıldı. Bunların 12’si TEM-1 olarak adlandırılırken geriye kalan 15 TEM tipi
enzimin sonundaki aminoasitler okunamadı. Bu durum örneklerin cihazın teknik
nedenlerinden dolayı tekrar analizleri ve ikinci primerlerle yapılan tekrar dizilemeleri
sonucunda defalarca çözdürülüp dondurulmasıyla DNA konsantrasyonlarında meydana
gelebilecek azalmadan kaynaklanabilir. Okunamayan son 15-20 aminoasit dışında diziler
TEM-1 ve TEM-104 ile uyumlu bulundu. TEM-104, 289 aminoasiti olan TEM-1’in 280.
pozisyondaki alaninin yerine valinin gelmesiyle sonucu oluşan enzimdir (90). Sondaki
aminoasitlerden birinde bu değişiklik söz konusu olduğundan BLAST programıyla veri
tabanındaki dizilerle yapılan karşılaştırmada örneklerimizde saptanan dizilerin TEM-1 ve
TEM-104 ile uyumlu olduğu gözlendi. Çalışmadaki tüm izolatların ampisiline dirençli olması
GSBL olmayan TEM-1 enziminin varlığıyla açıklanabilir.
TEM tipi beta-laktamazları olan izolatlarda IEF ile pI değerleri 5,4, 5,6, 5,7 ve 5,8
olan bantlar belirlendi. Bu bantlar TEM tipi enzimlere ait bantlarla uyumludur. (90). TEM-1
enziminin pI değeri 5,4’tür (28). İzolatların 10’unda bulunan pI: 5,4 olan bant TEM-1 enzimi
yanı sıra bu enzimle aynı pI değerine sahip TEM-7, TEM-19, TEM-20, TEM-29,TEM-112 ve
TEM-126 gibi başka TEM tipi enzimlerden kaynaklanabilir. On bir izolatta bulunan pI: 5,6
olan bant dar spektrumlu TEM-2’ye ait olabileceği gibi, TEM-5, TEM-10, TEM-11, TEM-13,
TEM-26, TEM-50, TEM-59 ve TEM-63 gibi enzimlere de ait olabilir. Beş izolatta bulunan
pI: 5,7 olan bant TEM-68’in varlığını düşündürür. Bir izolatta saptanan pI: 5,8 olan bant
TEM-42’nin yanı sıra GES-1 ve GES-2 (IBC-2) gibi nadir görülen enzimlerden
kaynaklanabilir (90). Bununla birlikte gün geçtikçe sayıları artan GSBL’lerin pI değerlerinin
başka pek çok enzimle aynı olabileceği açıktır. TEM-1 olarak isimlendirilen ve pI: 5,5, 5,6,
5,7 ve 5,8 bantları olan izolatlarda pI: 5,4 olan bant IEF ile saptanamadı.
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar kromozom, plazmid ve transpozonlarda
bulunabilirler (6). İzolatlardaki TEM tipi beta-laktamazların GSBL olmayan TEM-1 olarak
belirlenmesi, kullanılan DNA izolasyon yöntemiyle kromozomal ve plazmid DNA’sının
birlikte izole edilmesinden kaynaklanabilir. Bu durumda kromozomda fazla miktarda
47
kopyalanan TEM-1 izole edilerek PZR ile çoğaltılırken muhtemelen plazmid ya da
transpozonda kodlanan TEM tipi GSBL’ler saptanamadı. Seçilen altı izolattan izole edilen
plazmid ile yapılan PZR sonucunda ise hiçbir enzim bandının bulunamayışı TEM tipi
GSBL’lerin transpozonlarda bulunabileceğini düşündürür. Tüm izolatlarda plazmid
izolasyonu yapılmadığından bu durum tüm izolatlar için geçerli değildir. Bunun dışında son
yıllarda en sık rastlanılan GSBL türlerinin CTX-M tipi enzimler olduğu bilindiğinden
izolatlardaki mevcut GSBL’lerin TEM tipi olmayıp TEM-1 ile aynı plazmidde kodlanmış
ancak çalışmada araştırılandan farklı CTX-M grubu enzimler de olabileceği düşünülebilir
(33).
Çalışmada üç izolatta SHV tipi beta-laktamaz saptandı. Bunlardan biri GSBL türü
olmayan kromozomal SHV-1 beta-laktamaz idi. Bu izolatta IEF ile sadece pI’sı 7,6 olan ve
SHV-1 ile uyumlu bir bant gözlendi, gözle belirlenebilen başka bir bant izlenmedi. Bu izolatta
GSBL’nin tespit edilememesiyle ilgili olarak yukarıda bahsedilen nedenleri yine
gösterebiliriz. İzolatta sadece seftazidimin MİK değeri >2 µg/ml olup (4 µg/ml) GSBL tarama
testinin pozitifliğini sağlıyordu, diğer üçüncü kuşak sefalosporinlerin MİK değeri <2 µg/ml
idi. Bu sonuç izolatın GSBL’sini düşük düzeyde ifade ettiğini düşündürmektedir.
Tespit edilen diğer SHV tipi enzim SHV-1’in 240. pozisyonundaki glutaminin GAG
yerine GAA şeklinde kodlanıp sessiz bir mutasyona uğramasıyla oluşan SHV-2 idi. Bu
enzimin bulunduğu 32 no.lu izolatta olması gereken pI: 7,6 bandı yoktu. Ancak OXA-tipi
enzime ait pI: 7,5 bandının bu banda yakınlığı nedeniyle SHV tipi enzimin bandı fark
edilemeyebilir. Bu izolatta ayrıca IEF ile saptanıp dizilemeyle gösterilemeyen pI’sı 7,9 olan
bir enzim bandı gözlendi. Bu enzim pI değeri araştırılmayan ancak E.coli’de sık bulunabilen
ve ülkemizden de bildirilen CTX-M grubu enzimlerden CTX-M-2’ye uymaktadır (50). Bunun
CTX-M 2 grubuna özgü primerler kullanılarak araştırılması gerekir.
Saptanan son SHV tipi beta-laktamaz, 21 no.lu izolattaki SHV-12 olup, bu izolatta
olması gereken pI: 8,2 bandı yerine pI: 6,9 olan başka bir bant tespit edildi. Bu pI değeri
E.coli’de nadir de olsa bildirilen IBC-1 enzimine uygundur (91). Çalışmada bu enzim
araştırılmadığından kesin bir yorum yapmak zordur. Taşlı ve Bahar (10) yaptıkları bir
çalışmada çeşitli gram negatif bakterilerde SHV-2, SHV-5, SHV-12 ve TEM-1 tespit etmiş,
SHV-12 ve TEM-1 bulunan iki izolatta ayrıca pI: 6,9 olan bir beta-laktamaz bandı da
saptamışlardır. SHV-12’ye ve SHV-1 olan izolatın GSBL’sine ait IEF bantlarının
görülmeyişi, kullanılan jelde pI değeri 8,1’in üzerindeki bantların dağınık vaziyette
görülmesinden ya da beta-laktamaz aktivitesinin azlığından ileri gelebilir. Gülay ve ark. (92)
GSBL pozitif 34 K.pneıumoniae izolatının 27’sinde pI: 5,4 bandı, yine 27’sinde pI: 7,6 bandı,
48
19’unda pI: 8,2 bandı, 5’inde pI: 7,2 bandı ve 2’sinde pI: 7,8 bandı bulmuşlar, pI: 8,2 olan
bandın, o zamanlar SHV-12 henüz tanımlandığından bununla aynı pI değerine sahip SHV-5
olabileceğini belirtmişlerdir.
Ülkemizde SHV tipi GSBL’lerden dünyada yaygın olarak bulunan SHV-2 ve SHV5’den başka SHV-12 enzimi de bildirilmiştir (10,50,93). SHV-12, Ambler ve ark.’ın (94)
şemasına göre numaralanan aminoasit pozisyonlarından 35. pozisyonda lösinin glutaminle yer
değiştirmesiyle SHV-5’ten, buna ilaveten 238. pozisyonda glisinin serinle ve 240. pozisyonda
glutamatın lizinle yer değiştirmesiyle SHV-1’den ayrılır. SHV-2a ile ise sadece 240.
pozisyondaki glutamat yerine lizin gelmesiyle ayrılır (28,95). İlk olarak 1997’de İsviçre’de
Nüesch-Inderbinen ve ark. (95) tarafından bir E.coli ve bir K.pneumoniae izolatında tespit
edilmiştir. Yagi ve ark. (96) yaptıkları bir çalışmada GSBL üreten 15 E.coli izolatının ikisinde
ve 34 K.pneumoniae izolatının sekizinde SHV-12 saptamıştır. SHV-12’nin özellikle
seftazidim ve aztreonamın hidroliz hızlarını arttırdığı gösterilmiştir (97,98). Bu çalışmada da
SHV-12 bulunan 21 no.lu izolat sefotaksime duyarlı seftazidime dirençli bulunmuştur.
Çalışmadaki 37 no.lu izolatta pI: 5,6 ve 8,1 olan iki bant tespit edildi. Bunlardan pI’sı
5,6 olan ve PZR ile TEM pozitif bulunan enzim ikinci primer tasarımıyla yeniden analiz
ettirildiğinde de sondaki aminoasitleri okunamadığından tam olarak adlandırılamadı, ancak
okunan alanlar TEM-1 ile uyumluydu. Bu izolattaki pI’sı 8,1 olan enzim ise bu pI değeriyle
uyumlu bulunan CTX-M-14 olarak adlandırıldı. Bu enzimin dizilemesi de diğer tip betalaktamazlarda olduğu gibi enzimlerin baş ya da sonlarını okutabilmek için tasarlanan ikinci
primerlerle yeniden analiz yapılarak tamamlanabildi. Bu enzim CTX-M-9 grubundaki CTXM enzimlerinden biridir. Bu gruptan başka CTX-M-1, -2, -8 ve -25 olmak üzere dört CTX-M
grubu daha vardır. Substrat olarak seftazidim yerine sefotaksimi tercih eden CTX-M tipi
GSBL’lerin en yaygın olanları CTX-M-15, CTX-M-14, CTX-M-3 ve CTX-M-2’dir (32,33).
Türkiye’de CTX-M tipi GSBL’lerden CTX-M-2 bir K.pneumoniae izolatında, CTX-M-3 bir
Shigella sonnei ve bir salgında 15 Salmonella typhimurium izolatında, CTX-M-15 ise bir
K.pneumoniae ve bir E.coli izolatında bildirilmiştir (47-50,93). Ayrıca Gülay (99) bir
çalışmasında altı farklı merkezden toplanan çeşitli gram negatif bakterilerden 20’sine
dizileme yapmış, CTX-M-3’ün prevalansını farklı merkezlerde % 50-%100 arasında saptamış
ve Türkiye’de CTX-M tipi enzimlerin, özellikle de CTX-M-3’ün yaygınlaştığını göstermiştir.
CTX-M-2 enzimi CTX-M-2 grubundan, CTX-M-3 ve CTX-M-15 ise CTX-M-1
grubundandır. Bu çalışmada saptanan ve dünyada da yaygın olarak bulunan CTX-M-14
enzimi ülkemizde daha önce bildirilmemiştir.
49
Önceleri baskın olan GSBL’ler TEM ve SHV tipi enzimler iken, son on yılda CTX-M
enzimleri hem hastane kökenli hem de toplum kökenli izolatlarda en sık görülen GSBL’ler
halini almıştır (33). Bazı enzimler bazı ülkelerde daha sık gözlenir. CTX-M-9 ve CTX-M-14
İspanya’da (100), CTX-M-1 İtalya’da (101) daha sık saptanırken, 240. pozisyonda aspartat
yerine glisin gelmesiyle CTX-M-3’ten ayrılan CTX-M-15 dünya çapında bildirilmiştir
(48,101-105).
CTX-M-14 yine CTX-M-9 grubunda bulunan CTX-M-18 ile identiktir (33). Dizisi ilk
olarak 2000 yılında Çin’li araştımacılar tarafından bulunup Genbank’ta onaylanan CTX-M14, CTX-M-9’dan 231. pozisyondaki alaninin yerine valinin gelmesiyle ayrılır. Bu şekilde
CTX-M-9 ile %99 benzerlik gösterirken, Toho-2 (CTX-M-45) ile %87, diğer CTX-M tipi
enzimlerle daha az benzerlik gösterir. Sefotaksim hidrolizine neden olan 237. pozisyondaki
serin CTX-M-14’de de bulunmaktadır (106). Çalışmada CTX-M-14 saptanan 37 no.lu izolat
sefotaksime dirençli seftazidime ve sefepime duyarlı bulundu. Yapılan çeşitli çalışmalarda
CTX-M üreten izolatların sefepim duyarlılığının azaldığı bildirilmiştir (107-109). CTX-M-9
primeri kullanılarak CTX-M pozitif bulunan sadece bir izolat olduğundan sefepim duyarlılığı
açısından bu sonuç literatürlerle kıyaslanamaz. Ancak tüm izolatlardaki sefepim duyarlılığının
%59 ve sefotaksim duyarlılığının %13 gibi düşük düzeylerde olması diğer izolatlarda da
CTX-M tipi enzimlerin olabileceğini düşündürür.
CTX-M tipi enzimlerin pI değerleri 7,6 ila 9,0 arasındadır (90). Sık rastlanılan ve
ülkemizden de daha önce bildirilmiş olan CTX-M-2’nin pI’sı 7,9, CTX-M-3’ün pI’sı 8,4 olup
CTX-M-15’in pI’sı hem 8,6 hem de 8,9 olarak kaydedilmiştir (90). Çalışmada yapılan
poliakrilamid jel elektroforezi sonucunda 37 no.lu izolatta saptanan pI: 8,1 değeri dışında
daha yüksek pI değerleri gözle net bir şekilde ayırt edilemedi. Bununla birlikte tüm izolatlar
için pI: 8,1’in üzerindeki alanlarda dağınık ve jelin üst tarafını tamamen kaplayan geniş betalaktamaz aktivitesi izlendi. Çalışmada, daha önceden ülkemizde çalışılmayan ancak en sık
rastlanılan CTX-M tipi enzimlerden biri olan CTX-M-14’ün saptanması, bu enzim CTX-M-9
grubunda olduğundan bu gruba ait primerler kullanılarak gerçekleşti. Araştırma bütçesi göz
önüne alınarak tüm CTX-M grupları araştırılamadı. İzolatlardaki 8,1’in üzerindeki pI
değerlerinin kromozomal enzimlere ve bunlara ek olarak diğer CTX-M grubu enzimlere
özellikle de sık görülen CTX-M-1 grubundaki enzimlere ait olabileceği düşünülmektedir.
Pagani ve ark. (108) 12 GSBL üreten izolatla yaptıkları bir çalışmada üç E.coli
kökeninde CTX-M-1, bir K.pneumoniae kökeninde CTX-M-15, iki Proteus kökeninde CTXM-2 enzimi saptarken, pI: 5,4’e ek olarak pI: 8, 8,4 ve >9,0 olan altı izolatta araştırdıkları
enzimleri bulamamışlardır. Pitout ve ark.’ın (110) PZR ile sadece CTX-M tipi enzimleri
50
araştırdıkları çalışmada dört faklı CTX-M grubuna ait primerler kullanmıştır. Ryoo ve ark.’ın
(111) Kore’de yaptıkları geniş çaplı bir çalışmada CTX-M-1, 2, 8 ve 9 grubu CTX-M
enzimleri, TEM ve SHV tipi GSBL’ler yanında PER-1, VEB, IBC ve TLA gibi nadir görülen
enzimler dahi araştırılmış ve sonuçta CTX-M-3, CTX-M-14, CTX-M-15, SHV-2a, SHV-5,
SHV-12 gibi sık rastlanılan enzimler, ayrıca Kore’de sık bulunan TEM-52 ve burada ilk kez
rastlanılan GES-3 enzimi saptanmıştır. Görülüyor ki bölgesel olarak sık bulunan enzimlerin
yanı sıra çalışmanın imkanları elverdiğince araştırılan enzim gruplarının çeşitliliğine göre elde
edilebilecek sonuçlar farklı olabilmektedir.
Ambler sınıflamasına göre sınıf D’de bulunan OXA türü enzimler genellikle
sefepimden ziyade seftazidimi hidrolize ederler. Bununla birlikte seftazidim duyarlılığıyla
kombine sefepim direnci, OXA-1 tipi enzim üreten Pseudomonas aeruginosa’da
gösterilmiştir (112). Başka bir çalışmada E.coli izolatında OXA-1 derivesi olan OXA-30
nedeniyle seftazidimden çok sefepime direnç belirtilmiştir (113).
Beş grupta toplanan OXA tipi enzimlerden OXA-30 OXA-1, -4 ve -31 ile birlikte grup
III’te yer alır (114). OXA tipi beta-laktamazların en yaygını olan OXA-1 E.coli izolatlarının
%1-10’unda bulunur (6). Bu enzimle identik kabul edilen OXA-30’da OXA-1’den farklı
olarak 131. pozisyondaki arjininin yerini glisin (AGA yerine GGA) almıştır. Bu aminoasit
değişikliğinin fonksiyonel önemi minimaldir, bu nedenle iki enzim identik kabul edilirler
(115). Geniş spektrumlu beta-laktamaz olmayan bu enzimlerden OXA-30’un pI’sı 7,3, OXA1’in pI’sı 7,4’tür (28,89).
Yapılan çalışmalarda çeşitli CTX-M tipi GSBL’lerin TEM-1 ve OXA-1 ya da OXA30 ile birlikte bulunabildiği, hatta aynı plazmidde taşındığı ve birlikte transfer edildikleri
bildirilmiştir (44,116-119). Pai ve ark. (116) bu enzimlerin bir arada olmasıyla geniş
spektrumlu sefalosporinlere yüksek düzeyde direnç gözlendiğini saptamıştır. Ayrıca kinolon
ve aminoglikozidlere direnç genlerinin de OXA-1 ile birlikte görüldüğü başka bir çalışmada
belirtilmiştir (120).
Bu çalışmada, toplam 20 izolatta (%39) PZR ile OXA tipi beta-laktamaz bantları
saptanıp, bunların 17’si OXA-30 olarak isimlendirildi. Geriye kalan üç izolat dizileme cihazı
ile tekrar değerlendirildi, ancak muhtemelen diğer enzimleri araştırma sırasında da olduğu
gibi cihazın teknik nedenleri ve ara primerler oluşturulması nedeniyle yeniden yapılan
analizler
için
örneklerin
birkaç
kez
çözdürülüp
dondurulması
PZR
ürünlerinin
konsantrasyonunu azalttığından dizinin başındaki aminoasitler iyi okunamadı. Okunan
kısımlar ise yine OXA-30 ile uyumlu idi. Altı izolatta sadece bu enzim bulundu. Bu
izolatların GSBL’sinin de çalışmadığımız CTX-M grubu enzimlerden olabileceğini
51
düşünmekteyiz. OXA türü enzim içeren 20 izolatın dokuzunda (%45) sefepime direnç
gözlendi. İzolatlarda tespit edilen sefepim direncinin yüksekliği, sefepimin tedavide çok tercih
edilmiş olabilmesi, ya da OXA-30 ve muhtemel CTX-M birlikteliği nedeniyle olabilir.
OXA-30 tipi enzimi bulunan izolatların 13’ünün pI’sı 7,3 olarak saptandı. Ayrıca
dizilemede tam okunamayıp yine OXA-30 ile uyumlu bulunan bir enzimin de pI’sının 7,3
olduğu belirlendi. Geriye kalan altı izolatın ise pI’sının 7,5 olduğu gözlendi ki bu değer yine
OXA-1 türevi olan ve OXA-1 primeriyle gösterilebilen OXA-31 enzimiyle uyumludur (112).
Ancak DNA dizilemeyle hiçbir izolatta OXA-31 enzimi tespit edilmedi. Bu enzimin
transpozonda kodlanma ihtimali vardır. Çalışmada izole edilen DNA’da yeterince transpozon
elde edilememiş olması nedeniyle OXA-31 tespit edilememiş olabilir. OXA-31, OXA-30 ile
karşılaştırıldığında, üç aminoasit değişikliği gösterir. Yapılan bir çalışmada P.aeruginosa’da
OXA-31’in de OXA-30 gibi sefepim direncinde rolü olduğu açıkça gösterilmiştir (112).
Schlesinger ve ark. (121) 17 GSBL üreten izolatla yaptıkları bir çalışmasında bazı
kökenlerde TEM-1 ile birlikte SHV ya da CTX-M tipi GSBL’ler bulurken, bazılarında
araştırdıkları geniş enzim profiline rağmen hiçbir GSBL bulamamıştır. Çalışmamızda beş
izolatta araştırılan enzimlerin hiçbirine rastlanmadı. Eğer farklı enzim gruplarına yönelik
farklı primerler kullanılsaydı sonuç alma olasılığı artardı.
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz ürettiği belirlenmiş etkenlerin fenotipik olarak
duyarlı bulunsalar dahi sefamisinler dışında tüm sefalosporinlere, penisilinlere ve
monobaktamlara dirençli olarak bildirilmeleri gerekir (6,56). Her ne kadar sefoksitin ya da
sefotetan gibi sefamisinler ve sefepim GSBL’ler tarafından hidrolize edilmeye diğer
sefalosporinlere kıyasla daha dirençli olsalar da tedavide tercih edilmezler. Artan betalaktamaz yoğunluğu karşısında inokulum etkisi, sefepim kullanımındaki artışın GSBL üreten
etkenlerle salgına neden olabileceği, K.pneumoniae’de sefoksitinle tedavi sırasında porin
kaybına bağlı direnç gelişimi bunun nedenleri olarak sayılabilir (7). Karbapenemler GSBL
üreten etkenlerle olan infeksiyonların tedavisinde ilk sırada tercih edilirken, beta-laktam/betalaktamaz inhibitörlerinin ciddi infeksiyonlarda kullanımları sınırlıdır (31).
Bu çalışmada tüm izolatlar imipenem, ertapenem ve sefotetana duyarlı bulundu.
Bunun dışında en duyarlı antibiyotikler amikasin (%95) ve piperasilin/tazobaktam (%87)
olarak belirlendi. Sefepim duyarlılığı ise bakterilerin %59’unda saptandı. Yurt dışında yapılan
çalışmalardan Gupta ve ark. (122) 559 GSBL pozitif E.coli’nin %2,1’inde (n: 12) imipenem
direncine rastlarken, Mulvey ve ark. (123) GSBL üreten 74 E.coli’nin tamamınını imipenem
ve sefotetana, %94’ünü amikasine ve %92’sini piperasilin/tazobaktama duyarlı bulmuşlardır.
Şahin ve ark.’ın (124) bir çalışmasında GSBL üreten 42 gram negatif bakteride imipenem,
52
amikasin ve sefepim duyarlılığı sırasıyla %95,3, 97,6 ve 92,8 olarak saptanmıştır.
Yavuzdemir ve ark. (125) yatan hastalardan izole edilen GSBL pozitif 50 E.coli kökeninin
%98’ini imipeneme, %84’ünü amikasine, %86’sını piperasilin/tazobaktama ve %30’unu
sefepime duyarlı bulmuştur. Özbilge ve ark. (84) GSBL pozitif bulunan 34 izolatta imipenem,
amikasin, piperasilin/tazobaktam ve sefepim duyarlılığını sırasısıyla %100, %81, %85 ve
%88 olarak bildirmişlerdir. Çalışmamızda imipenem, amikasin ve piperasilin/tazobaktam
duyarlılığı diğer çalışmalardakiyle benzer oranlarda bulunurken, sefepim duyarlılığı
Yavuzdemir ve ark.’ın (125) çalışmasındakinden yüksek, diğer çalışmalardakinden daha
düşük bulundu. Sefepime duyarlılığın azalması OXA-30 ve muhtemel CTX-M varlığı
nedeniyle olabilir.
Bir bakteri, sentezlediği GSBL enziminin farklı sefalosporinlere afinitesinin farklı
olması ve inokulum etkisi gibi nedenlerle 3. kuşak sefalosporinlere duyarlı gibi gözükebilir
(52). Çalışmamızda oksiimino-sefalosporinlerden seftazidime 15 (%38), sefotaksim ve
seftriaksona beş (%13) izolat fenotipik olarak duyarlı bulundu. Ancak çalışmamızda tespit
edildiği gibi, bunlardan en az birinin MİK değerinin ≥2 µg/ml olması azalmış duyarlılık
kriteri olup GSBL üretimi için pozitif tarama testi sonucu olarak kabul edilmelidir (56).
Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazları kodlayan plazmidler aynı zamanda pek çok betalaktam dışı antibiyotiğe karşı da genetik materyal taşımaktadırlar. Bu yüzden GSBL
sentezleyen
bakteriler
aminoglikozidler
başta
olmak
üzere
kinolonlar,
tetrasiklin,
kloramfenikol ve sülfonamidlere karşı da direnç gösterebilirler (51). Amoksisilin/klavulanat,
kinolonlar, gentamisin ve tobramisine duyarlılık sırasıyla; %62, %15, %41 ve %18 olarak
bulundu.
Jain
ve
Mondal
(126)
GSBL
üreten
58
K.pneumoniae
izolatında
amoksisilin/klavulanat, seftazidim, sefotaksim, gentamisin ve siprofloksasin direncini
sırasıyla %25, %47, %52, %41 ve %39 olarak bulmuşlardır. Liao ve ark. (127) 80 GSBL
üreten E.coli izolatında gentamisin ve siprofloksasin direncinin sırasıyla %18,8 ve %30
olduğunu belirtmişlerdir. Löker ve ark. (128) GSBL pozitif 25 izolatın %20’sini seftazidime,
%32’sini sefotaksime ve %44’ünü amoksisilin/klavulanata duyarlı bulmuştur. Kirizgil ve ark.
(129) 55 GSBL pozitif bakteri arasında amoksisilin/klavulanat ve siprofloksasin duyarlılığını
sırasıyla %19 ve %64 olarak saptamıştır. Gülay ve ark. (130) GSBL pozitif 44 K.pneumoniae
izolatının %54,5’inde amoksisilin/klavulanat, %20,5’inde sefotaksim ve %56,8’sinde
seftazidim direnci saptamıştır. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz pozitif E.coli
izolatlarında gentamisin ve siprofloksasin direnci Gültekin ve ark.’ın (82) çalışmasında
sırasıyla %79 ve %14, Aydemir ve ark.’ın (131) çalışmasında %62,2 ve %83,7 olarak
53
belirlenmiştir. Çalışmamızda kinolon ve gentamisin direnci Aydemir ve ark.’nınkine (131)
benzer oranda, genel olarak diğer çalışmalardakinden daha yüksek oranda bulundu. Bu durum
OXA-30 ile aminoglikozid ve kinolon direnci genlerinin aynı plazmidde taşınabilmesinden
kaynaklanabilir. Ancak bu çalışmada aminoglikozid direnç genleri araştırılmamıştır ve bu
konuda daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Amoksisilin/klavulanat duyarlılığı Jain ve
Mondal’ınkinden (126) düşük, genel olarak diğer çalışmalardakinden daha yüksek oranda
bulundu. Ancak tüm izolatlarda piperasilin/tazobaktam duyarlılığı ile karşılaştırıldığında
amoksisilin/klavulanat daha dirençli bulundu. CTX-M grubu enzimlere karşı tazobaktamın
klavulanik aside göre yaklaşık 10 kat daha fazla inhibitör etkiye sahip olduğu bilinmektedir
(31). Sefotaksim duyarlılığı genel olarak bahsedilen literatürlerdekinden çok daha düşük
bulundu. Bu durum çalışmadaki izolatlarda araştırılmayan CTX-M grubu enzimlerin bulunma
ihtimalini
desteklemektedir.
Seftazidim
direnci
yalnız
TEM
içeren
izolatlarla
karşılaştırıldığında TEM ve OXA birlikte bulunan izolatlarda daha yüksek bulundu. Bu bulgu
OXA-30’un TEM-1 ve olası CTX-M ile birlikte bulunduğunda geniş spektrumlu sefalosporin
direncine etkili olabileceğini düşündürür.
Dünyada GSBL’ler ile ilgili moleküler çalışmalar son derece yaygın olduğu halde, ne
yazık ki ülkemizde bu konudaki çalışmalar oldukça azdır ve yapılanların çoğu yabancı
destekli çalışmalardır. Şimdiye kadar ülkemizde 39 bakteri ve dört farklı enzim tipiyle yapılan
dizileme çalışması yoktur. Her ne kadar Gülay ve ark. (132) IEF ile olası OXA-1 enziminden
bahsetmişse de E.coli’lerin %1-10’unda görülen OXA-1 ile identik kabul edilen OXA-30
enzimi daha önce Türkiye’de bildirilmemiştir. Aynı şekilde daha önce çalışılmadığı için
ülkemizdeki sıklığını da bilemediğimiz ancak dünyada yaygın bulunan CTX-M-14 enzimi de
ilk kez bu çalışmayla tespit edilmiştir. Çalışmadaki izolatların üçü dışında saptanamayan
GSBL’lerin ülkemizde de bildirilen CTX-M-15 veya CTX-M-3 olabileceği düşünülmektedir.
Bunun kesinleşmesi için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Ülkemizde bu konudaki
araştırmaların yaygınlaştırılması ve dizilemeyle ilgili teknik imkanların geliştirilmesi gerekir.
Böylelikle hastanemizde ve Türkiye’deki GSBL tipleri profili açıkça ortaya konulabilir ve
doğru antibiyotik kullanım politikaları uygulanabilir.
54
SONUÇLAR
Bu çalışmada GSBL üreten 39 hastane kökenli E.coli izolatındaki enzim tipleri ve
bunların antibiyotik duyarlılıkları araştırılmıştır. TEM, SHV, OXA ve CTX-M tipi enzimlerin
araştırıldığı çalışmada elde edilen sonuçlar aşağıda belirtilmiştir:
1-Çalışma izolatlarının elde edildiği döneme ait GSBL pozitifliği oranı %17 olup bu
oran ülkemizdeki oranlarla uyumludur.
2-Disk difüzyon yöntemiyle zon çapına göre GSBL tarama testi tüm izolatlarda pozitif
olarak sonuçlandı. Diskler arası mesafenin 30 mm olarak alındığı ÇDST’nin izolatların sadece
%49’unda pozitif sonuç vermesi inhibisyon zon çaplarının çok dar ya da hiç olmamasından
kaynaklanmıştır. Diskler arası mesafenin ÇDST duyarlılığına etkisi ise farklı çalışmalarda
gösterilebilir.
3-Beta-laktamazları tespit için yapılan IEF ile en fazla pI: 7,3, 5,6 ve 5,4 bantları
gözlendi. Beş izolatta gözle ayırt edilebilen hiçbir bant görülmedi. Tüm izolatlarda pI: 8,1’in
üzerindeki alana yayılan gözle net ayırt edilemeyen geniş beta-laktamaz aktivitesi gözlendi.
4-Enzim tipleri için yapılan PZR sonucunda toplam 27 TEM, 20 OXA, üç SHV ve bir
CTX-M enzimi tespit edildi. Beş izolatta araştırılan enzimlerin hiçbiri bulunamadı.
5-Dizileme sonucunda TEM-1, OXA-30, SHV-1, SHV-2, SHV-12 ve CTX-M-14
enzimleri tespit edildi. Çalışma dizileme yapılan izolat sayısı ve tipleri açısından ülkemizde
yapılan en geniş çalışmadır.
6-Bu çalışma ile pI: 7,3 olan ve E.coli’de en sık görülen OXA tipi enzim olan OXA-30
ülkemizde ilk kez tespit edildi.
7-Dünyada yaygın bulunan CTX-M-14 ilk kez bu çalışmayla Türkiye’de saptandı.
55
8-İzolatların tamamı ampisilin, piperasilin ve sefuroksime dirençli, karbapenemlere ve
sefotetana duyarlı bulundu. Bunun dışında en etkili antibiyotikler amikasin ve
piperasilin/tazobaktam olarak belirlendi. Seftazidime %38, sefotaksim ve seftriaksona %13
oranında fenotipik duyarlılık bulundu.
9-Sefepim’e %59, sefotaksime %13 oranında bulunan duyarlılık literatürlerdekinden
düşük bulundu.
10-İzolatların %15’i kinolonlara, %41’i gentamisine duyarlıydı. Bu sonuç GSBL
üreten bakterilerin aynı plazmidde farklı direnç genlerini taşıyabildiğini desteklemekle birlikte
bu konuda yapılacak ileri çalışmalarla bu ilişki açıkça gösterilebilir.
11-Tüm izolatlarda piperasilin/tazobaktam duyarlılığı, amoksisilin/klavulanattan daha
yüksekti.
12-TEM-1 ve OXA-30’un ikisini birden içeren izolatlarda seftazidim direnci yalnız
TEM-1 içerenlere göre daha yüksekti. Normalde sefepim direncini etkileyen OXA-30’un
GSBL’lerle bir arada olduğunda seftazidimi de etkilediği söylenebilir.
Bu sonuçlara göre tespit edilemeyen GSBL’lerin araştırılmayan CTX-M gruplarına ait
enzimler olabileceği ancak kesin sonuç için ileriki çalışmalarda her bir CTX-M grubuna ait
ayrı primerlerle dizileme yapılması gerektiği düşünüldü. Bu konudaki dizileme çalışmalarının
ülkemizde rahat yapılabilmesi için teknik imkanların geliştirilmesi ve yaygınlaştırılması,
çalışmaların ülke çapında arttırılarak yeterli veriye ulaşılması gerekir.
56
ÖZET
Hastane infeksiyonlarının önemli etkenlerinden Escherichia coli’de direnç problemi
giderek artmaktadır. Geniş spektrumlu beta-laktamların yaygın kullanımı sonucu ortaya çıkan
genişlemiş spektrumlu beta-laktamazların sıklığı ülkeler ve hastaneler arasında değişmektedir.
Bu çalışmanın amacı genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz üreten 39 hastane kökenli
Escherichia coli izolatındaki enzim tiplerini ve bunların antibiyotik duyarlılıklarıyla olan
ilişkisini araştırmaktır.
Bakteriler VİTEK 2 yöntemiyle tanımlandı. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz
varlığı zon çapına göre disk difüzyon yöntemiyle tarandı ve VİTEK 2, agar dilüsyon ve çift
disk sinerji testi kullanılarak doğrulandı. Beta-laktamazların izoelektrik noktaları ‘Isoelectric
focusing’ metoduyla tespit edildi. TEM, OXA-1, SHV ve CTX-M-9 genleri polimeraz zincir
reaksiyonuyla çoğaltıldı, ardından nükleotid dizileme analizi uygulandı. Polimeraz zincir
reaksiyonuyla aynı enzimleri araştırmak için rastgele seçilen altı izolatın plazmidi izole edildi.
Çift disk sinerji testi izolatların %49’unda pozitifti. Diğerlerinin zon çapı ya çok küçük
ya da hiç yoktu. İki izolatta bulunan 6,9 ve 8,1 bantları hariç beta-laktamazların izoelektrik
noktaları çoğunlukla TEM ya da SHV tipi beta-laktamazlara uygundu. İzolatların 27’sinde
TEM, 20’sinde OXA, üçünde SHV ve birinde CTX-M tipi enzim bulundu. Enzimler
nükleotid dizileme analiziyle TEM-1, OXA-30, SHV-1, SHV-2, SHV-12 ve CTX-M-14
olarak adlandırıldı. Ondört izolatta TEM-1 ve OXA-30’un birlikte olduğu tepit edildi. İzole
edilen plazmidlerde polimeraz zincir reaksiyonu ürünleri saptanamadı.
İzolatlara
en
duyarlı
antibiyotikler
karbapenemler,
sefotetan,
amikasin
ve
piperasilin/tazbaktamdı. Piperasilin/tazobaktam duyarlılığı amoksisilin/klavulanata göre daha
yüksekti.
57
Bu çalışma Türkiye’den Escherichia coli izolatlarında OXA-30 ve CTX-M-14
enzimlerini bildiren ilk bildiridir. Sefotaksim duyarlılığının düşük bulunması, TEM-1 ve
OXA-30’un CTX-M tipi enzimlerle birlikte sıkça bulunabilmesi ve piperasilin/tazobaktama
amoksisilin/klavulanattan daha yüksek duyarlılığın olması nedeniyle izolatların saptanamayan
genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlarının diğer CTX-M gruplarına ait olabileceğini
düşünmekteyiz. Bu sonuçlar Türkiye’deki farklı beta-laktamaz tiplerini ve bunların
yaygınlığını gösterecek başka çalışmalarla doğrulanmalıdır.
Anahtar kelimeler: Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz, Escherichia coli, TEM,
OXA, CTX-M.
58
EXTENDED-SPECTRUM BETA-LACTAMASES IN NOSOCOMIAL
ESCHERICHIA COLI ISOLATES
SUMMARY
The resistance problem of Escherichia coli that is an important agent of nosocomial
infections, is gradually increasing. The frequency of extended spectrum beta-lactamases
varies between countries and hospitals because of widely consumption of extended spectrum
beta-lactams.
This study aims to investigate the enzyme types of extended-spectrum beta-lactamaseproducing 39 nosocomial isolates of Escherichia coli and their relationship with antibiotic
susceptibilities.
Bacteria were identified by VITEK 2 method. The presence of extended spectrum
beta-lactamase was screened by disk diffusion method according to zone diameters, and was
verified by VITEK 2, agar dilution and double disk synergy methods. Isoelectric points of
beta-lactamases were determined by isoelectic focusing method. TEM, OXA-1, SHV and
CTX-M-9 genes were amplified by polymerase chain reaction, followed by nucleotide
sequencing analysis. Plasmids of randomly selected six isolates were isolated to screen the
same enzymes by polymerase chain reaction.
Double disk synergy tests were positive at 49% of isolates. Zone diameters of the
others were too small or no zone. The isoelectric points of beta-lactamases were in
concordance mostly TEM or SHV-types beta-lactamases, except 6.9 and 8.1 bands found in
two isolates. TEM, OXA, SHV and CTX-M type enzymes were found at 27, 20, three and
one isolates, respectively. These enzymes were called as TEM-1, OXA-30, SHV-1, SHV-2,
SHV-12 and CTX-M-14 by nucleotide sequencing analysis. Coexistence of TEM-1 and
59
OXA-30 were detected at 14 isolates. No polymerase chain reaction products could be
detected by plasmid extracts.
Most efficient antibiotics of isolates were carbapenemes, cefotetan, amikacin and
piperacillin/tazobactam.
The
piperacillin/tazobactam
susceptibility
was
higher
than
amoxicillin/clavulanat.
This study is the first report about OXA-30 and CTX-M-14 enzymes at Escherichia
coli isolates from Turkey. We concluded that undetected extended spectrum beta-lactamases
of the isolates could be other CTX-M type enzymes, due to low susceptibility to cefotaxime,
high probability of coexistence of CTX-M, TEM-1 and OXA-30, and higher susceptibility to
piperacillin/tazobactam than amoxicillin/clavulanat. This conclusion should be verified by
other studies that would show different extended spectrum beta-lactamase types and their
frequency in Turkey.
Key words: Extended-spectrum beta-lactamase, Escherichia coli, TEM, OXA, CTX-M.
60
KAYNAKLAR
1.
Yalçın AN. Nozokomiyal gram negatif çomak infeksiyonları. Klimik Derg
2000;13(özel sayı):23-5.
2.
Peşken Y. Hastane infeksiyonlarının emidemiyolojisi. Günaydın M, Esen Ş, Saniç A,
Leblebicioğlu H (Editörler). Sterilizasyon, dezenfeksiyon ve hastane
infeksiyonları’nda. Samsun: Deomed Medikal Yayıncılık; 2002. s.203-13.
3.
Korten V. Hastane infeksiyonları. Topçu AW, Söyletir G, Doğanay M (Editörler).
İnfeksiyon hastalıkları ve mikrobiyolojisi’nde. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi; 2002.
s.401-9.
4.
Akçam FZ, Gönen İ, Kaya O, Yaylı G. Hastane infeksiyonu etkeni enterobakterilerde
beta-laktam antibiyotiklere duyarlılık ve ESBL sıklığının araştırılması. SDÜ Tıp Fak
Derg 2004;11:6-9.
5.
Akalın H. Çoğul dirençli gram negatif bakteriler. Doğanay M, Ünal S (Editörler).
Hastane infeksiyonları’nda. Ankara: Bilimsel Tıp Yayınevi; 2003. s.269-87.
6.
Livermore DM. Beta-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol
Rev 1995;8:557-84.
7.
Akova M. Dikkat: Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz var. ANKEM Derg 2004;18
Ek 1:98-103.
8.
Gür D. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar. Ulusoy S (Editör). Beta-laktamazlar
ve klinik önemi’nde. Ankara: Bilimsel Tıp Yayınevi; 2005. s.70-88.
9.
Rahal JJ. Extended-spectrum β-lactamases: how big is the problem? Clin Microbiol
Infect 2000;6 Suppl 2:2-6.
61
10.
Taşlı H, Bahar H. Molecular characterization of TEM- and SHV-derived extendedspectrum beta-lactamases in hospital-based enterobacteriaceae in Turkey. Jpn J Infect
Dis 2005;58:162-7.
11.
Jeong SH, Bae IK, Lee JH, Sohn SG, Kang GH, Jeon GJ et al. Molecular
characterization of extended-spectrum beta-lactamases produced by clinical isolates of
Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli from a Korean nationwide survey. J Clin
Microbiol 2004;47:2902-6.
12.
Gülay Z. Beta-laktamlara direnç mekanizmaları. antibiyotiklere karşı oluşan direnç
mekanizmaları. Ulusoy S (Editör). Beta-laktamazlar ve klinik önemi’nde. Ankara:
Bilimsel Tıp Yayınevi; 2005. s.9-34.
13.
Yu WL, Chuang YC, Rasmussen JW. Extended-spectrum beta-lactamases in Taiwan:
epidemiyology, detection, treatment and infection control. J Microbiol Immunol Infect
2006;39:264-77.
14.
Livermore DM. β-Lactamase-mediated resistance and opportunities for its control. J
Antimicrob Chemother 1998;41 Suppl D:25-41.
15.
Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for βlactamases and its correlation with molecular structure [mini review]. Antimicrob
Agents Chemother 1995;39:1211-33.
16.
Gür G. β-laktamazlar. Flora 1997;2(3 Ek):3-18.
17.
Vahaboğlu H. Beta-laktamaz tanı testlerinin rutin kullanımı ve klinik önemi. Flora
1998;3:73-9.
18.
Rice LB, Sahm D, Bonomo RA. Mechanism of resistance to antibacterial agents. In:
Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (Eds.). Manual of
clinical microbiyology. 8th ed. Washington: ASM Press; 2003. p.1074-1104.
19.
Bush K, Jacoby G. Nomenclature of TEM beta-lactamases [leading article]. J
Antimicrob Chemother 1997;39:1-3.
20.
Heritage J, M’Zali FH, Binzi DG, Hawkey PM. Evolution and spread of SHV
extended-spectrum β-lactamases in gram-negatif bacteria [review]. J Anitimicrob
Chemother 1999;44:309-18.
21.
Tanır G, Göl N. Antibiyotik direnci. Klimik Derg 1999;12:47-54.
22.
Livermore DM, Brown DFJ. Detection of β-lactamase-mediated resistance. J
Antimicrob Chemother 2001;48 Suppl 1:59-64.
62
23.
Neu HC. Antibiotic inactivating enzymes and bacterial resistance. In: Lorien V (Ed.).
Antibiotics in laboratory medicine, 2nd ed. Baltimore: Williams&Wilkins; 1986. p.75789.
24.
Akata F. Gram negatif bakterilerde beta-laktamaz tipleri ve antibiyogramdan betalaktamaz tipini tahmin etmede kullanılabilecek yöntemler. İnfeks Derg 1997;11:303-9.
25.
Öngen B. Hastanede sorunlu mikroorganizmalar: Gram negatif
http://www.das.org.tr/tr/dosya/kongre/kong2003/41.htm.
26.
Dolapçı İ. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar: Klinik mikrobiyoloji laboratuvarı,
tedavi ve enfeksiyon kontrolündeki rolleri. Mikrobiyol Bült 2005;39:229-40.
27.
Stürenburg E, Mack D. Extended-spectrum β-lactamases: implications for the clinical
microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect 2003;47:273-95.
28.
Bradford PA. Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization,
epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev
2001;14:933-51.
29.
Pfaller MA, Segreti J. Overview of the epidemiological profile and laboratory
detection of extended-spectrum β-lactamases [supplement article]. Clin Infect Dis
2006;42 Suppl 4:1153-63.
30.
Gniadkowski M. Evolution and epidemiology of extended-spectrum β-lactamases
(ESBLs) and ESBL producing microorganisms [review]. Clin Microbiol Infect Dis
2001;7:597-608.
31.
Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum β-lactamases: a clinical update. Clin
Microbiol Rev 2005;18:657-86.
32.
Bonnet R. Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the CTX-M enzymes
[minireview]. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:1-14.
33.
Cantón R, Coque TM. The CTX-M β-lactamase pandemic. Curr Opin Microbiol
2006;9:466-75.
34.
Tzouvelekis LS, Tzelepi E, Tassios PT, Legakis NJ. CTX-M-type β-lactamases: an
emerging group of extended-spectrum enzymes. Int J Antimicrob Agents
2000;14:137-42.
35.
Danel F, Hall LMC, Gur D, Livermore DM. OXA-15, an extended-spectrum variant of
OXA-2 β-lactamase, isolated from a Pseudomonas aeruginosa strain. Antimicrob
Agents Chemother 1997;41:785-90.
63
bakteriler.
36.
Hall LMC, Livermore DM, Gur D, Akova M, Akalın HE. OXA-11, an extendedspectrum variant of OXA-10 (PSE-2) β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa.
Antimicrob Agents Chemother 1993;37:1637-44.
37.
Danel F, Hall LMC, Gur D, Livermore DM. OXA-14, another extended-spectrum
variant of OXA-10 (PSE-2) β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob
Agents Chemother 1995;39:1881-84.
38.
Danel F, Hall LMC, Gur D, Livermore DM. OXA-16, a further extended-spectrum
variant of OXA-10 β-lactamase, from two Pseudomonas aeruginosa isolates.
Antimicrob Agents Chemother 1998;42:3117-22.
39.
Danel F, Hall LMC, Duke B, Gur D, Livermore DM. OXA-17, a further extendedspectrum variant of OXA-10 β-lactamase, isolated from Pseudomonas aeruginosa.
Antimicrob Agents Chemother 1999;43:1362-66.
40.
Toleman MA, Roltson K, Jones RN, Walsh TR. Molecular and biochemical
characterization of OXA-45, an extended-spectrum class 2d´ β-lactamase in
Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2003;47:2859-63.
41.
Nordmann P, Ronco E, Naas T, Duport C, Michel-Briand Y, Labia R. Characterization
of a novel extended-spectrum β-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob
Agents Chemother 1993;37:962-9.
42.
Akata F, Tatman-Otkun M, Özkan E, Tansel Ö, Otkun M, Tuğrul M. Prevalence of
extended-spectrum beta-lactamases produced by nosocomial isolates of
Enterobacteriaceae in Trakya University Hospital, Turkey. Microbiologica
2003;26:257-62.
43.
Gür D. Temel tıptan kliniğe β-laktamazlar. Hacettepe Tıp Derg 2002;33:102-9.
44.
Kim J, Lim YM, Rheem I, Lee Y, Lee JC, Seol SY et al. CTX-M and SHV-12 βlactamases are the most common extended-spectrum enzymes in clinical isolates of
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae collected from 3 university hospitals
within Korea. FEMS Microbiol Lett 2005;245:93-8.
45.
Vahaboğlu H, Öztürk R, Aygün G, Coşkunhan F, Yaman A, Kaygusuz A et al.
Widespread detection of PER-1 type extended-spectrum β-lactamases among
nosocomial Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa isolates in Turkey: a
nationwide multicenter study. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2265-9.
46.
Aktaş Z, Poirel L, Şalcıoğlu M, Özcan PE, Midilli K, Bal Ç et al. PER-1 and OXA-10like β-lactamases in ceftazidime-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from
intensive care unit patients in İstanbul, Turkey. Clin Microbiol Infect Dis
2005;11:193-8.
64
47.
Aktaş Z, Gönüllü N, Schneider I, Bal Ç, Bauernfeind A. Hastanede yatan bir hastanın
idrar örneğinden izole edilen Escherichia coli suşunda CTX-M-15 tipi genişlemiş
spektrumlu beta-laktamazın tanımlanması. Mikrobiyol Bült 2005;39:421-9.
48.
Lartigue MF, Poirel L, Héritier C, Tolün V, Nordmann P. First description of CTX-M15-producing Klebsiella pneumoniae in Turkey [correspondence]. J Antimicrob
Chemother 2003;52:315-6.
49.
Acikgoz ZC, Gulay Z, Bicmen M, Gocer S, Gamberzade S. CTX-M-3 extendedspectrum β-lactamase in a Shigella sonnei clinical isolate: first report from Turkey
[short communication]. Scand J Infect Dis 2003;35:503-5.
50.
Paterson DL, Hujer KM, Hujer AM, Yeiser B, Bonomo MD, Rice LB et al. Extendedspectrum β-lactamases in Klebsiella pneumoniae bloodstream isolates from seven
countries: dominance and widespread prevalence of SHV- and CTX-M-type βlactamases. Antimicrob Agents Chemother 2003;47:3554-60.
51.
Paterson DL. Resistance in gram-negative bacteria: Enterobactericeae. Am J Med
2006;119:520-8.
52.
Nathisuwan S, Burgess DS, Lewis II JS. Extended-spectrum β-lactamases:
epidemiology, detection, and treatment. Pharmacotherapy 2001;21:920-8.
53.
Al-Jasser AM. Extended-spectrum β-lactamases (ESBLs): a global problem [review
article]. J Kuwait Med Assoc 2006;38:171-85.
54.
Paterson DL, Ko WC, Gottberg AV, Mohapatra S, Casellas JM, Goossens H et al.
Antibiotic therapy for Klebsiella pneumoniae bacteremia: implications of production
of extended-spectrum β-lactamases. Clin Infect Dis 2004;39:31-7.
55.
Samaha-Kfoury JN, Araj GF. Recent development in β lactamases and extendedspectrum β lactamases [clinical review]. Br Med J 2003;327(7425):1209-13.
56.
Clinical and Laboratory Standarts Institute. Performance standarts for antimicrobial
susceptibility testing; sixteenth informational supplement. CLSI document M100-S16,
Wayne, Pennsylvania 2006.
57.
Thomson KS, Sanders CC. Detection of extended-spectrum β-lactamases in members
of the family Enterobacteriaceae: comparison of the double-disk and three
dimensional tests. Antimicrob Agents Chemother 1992;36:1877-82.
58.
Thomson KS, Sanders CC. A simple and reliable method to screen isolates of
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae for the production of TEM- and SHVderived extended-spectrum β-lactamases. Clin Microbiol Infect 1997;3:49-54.
65
59.
Vercauteren E, Descheemaeker P, Ieven M, Sanders CC, Goossens H. Comparison of
screening methods for detection of extended-spectrum β-lactamases and their
prevalence among blood isolates of Escherichia coli and Klebsiella spp. in a Belgian
Teaching Hospital. J Clin Microbiol 1997;35:2191-7.
60.
Ho PL, Chow KH, Yuen KY, Ng WS, Chau PY. Comparison of a novel, inhibitorpotentiated disk-diffusion test with other methods for the detection of extendedspectrum β-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. J Antimicrob
Chemother 1998;42:49-54.
61.
Cormican MG, Marshall SA, Jones RN. Detection of extended-spectrum β-lactamase
(ESBL)-producing strains by the Etest ESBL screen. J Clin Microbiol 1996;34:18804.
62.
Brown DFJ, Andrews J, King A, MacGowan AP. Detection of extended-spectrum βlactamases with Etest and double-disc potentiation methods [correspondence]. J
Antimicrob Chemother 2000;46:323-42.
63.
Sanders CC, Barry AL, Washington JA, Shubert C, Moland ES, Traczewski MM et al.
Detection of extended-spectrum β-lactamase-producing members of the family
Enterobacteriaceae with the Vitek ESBL test. J Clin Microbiol 1996;34:2997-3001.
64.
Tzouvelekis LS, Vatopoulos AC, Katsanis G, Tzelepi E. Rare case of failure by an
automated system to detect extended-spectrum β-lactamase in a cephalosporinresistant Klebsiella pneumoiae isolate. J Clin Microbiol 1999;37:2388.
65.
Sanguinetti M, Posteraro B, Spanu T, Ciccaglione D, Romano L, Fiori B et al.
Characterization of clinical isolates of Enterobacteriaceae from Italy by the BD
Phoenix extended-spectrum β-lactamase detection method. J Clin Microbiol
2003;41:1463-8.
66.
Sturenburg E, Lang M, Horstkotte MA, Laufs R, Dietrich M. Evaluation of the
MicroScan ESBL plus confirmation panel for detection of extended-spectrum βlactamases in clinical isolates of oxyimino-cephalosporin-resistant gram-negative
bacteria. J Antimicrob Chemother 2004;54:870-5.
67.
Fluid AC, Visser MR, Schmitz FJ. Molecular detection of antimicrobial resistance.
Clin Microbiol Rev 2001;14:836-71.
68.
Kim J, Lee HJ. Rapid discriminatory detection of genes coding for SHV β-lactamases
by ligase chain reaction. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:1860-4.
69.
Alcorn TM, Anderson SM. Otomatize DNA dizi analizi (Çeviri: C. Karahan). In:
Persing DH, Tenver FC, Versalovic J, Tang YW, Unger ER, Relman DA, White TJ
66
(Eds). Moleküler mikrobiyoloji: tanı prensipleri ve uygulamalar (Çeviri editörleri:
Tekeli A, Ustaçelebi Ş). Ankara: Palme Yayıncılık; 2006. s.153-9.
70.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Biochemistry 1977;74:5463-7.
71.
National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution
antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, approved standard,
6th edition M7-A6. NCCLS, Wayne, Pennsylvania 2003.
72.
Kuloğlu-Coşkunhan F. Seftazidime Dirençli Nozokomiyal Klebsiella pneumoniae
İzolatlarının Beta-laktamaz Direnç Mekanizması (tez). Kocaeli: Kocaeli Üniversitesi
Tıp Fakültesi; 1999.
73.
Bio-Rad Laboratories (USA). Model 111 mini IEF cell instruction manual. Catalog
number: 170-2975 and 170-2976; California.
74.
Esen Ş. Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae Suşlarında TEM ve SHV Türü βlaktamaz Direncinin Araştırılması (tez). Samsun: Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp
Fakültesi; 1997.
75.
Kado CI, Liu ST. Rapid procedure of detection and isolation of large and small
plasmids. J Bacteriol 1981;145:1365-73.
76.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
77.
Babini GS, Livermore DM. Antimicrobial resistance amongst Klebsiella spp. collected
from intensive care units in Southern and Western Europe in 1997-1998. J Antimicrob
Chemother 2000;45:183-9.
78.
Tonkic M, Goic-Barisic I, Punda-Polic V. Prevalence and antimicrobial resistance of
extended-spectrum β-lactamases-producing Escherichia coli and Klebsiella
pneumoniae strains isolated in a university hospital in Split, Croatia [research article].
Int Microbiol 2005;8:119-24.
79.
Gangoué-Piéboji J, Benedic B, Koula-Shiro S, Randegger C, Adiogo D, Ngassam P et
al. Extended-spectrum β-lactamases-producing Enterobacteriaceae in Yaunde,
Cameroon. J Clin Microb 2005;43:3273-7.
80.
Jeong SH, Bae IK, Kwon SB, Lee JH, Jung HI, Song JS et al. Investigation of
extended-spectrum β-lactamases produced by clinical isolates of Klebsiella
pneumoniae and Escherichia coli in Korea. Lett Appl Microbiol 2004;39:41-7.
67
81.
Tzelepi E, Magana C, Platsouka E, Sofianou D, Paniara O, Legakis NJ et al.
Extended-spectrum β-lactamases types in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli
in two Greek hospitals. Int J Antimicrob Agents 2003;21:285-8.
82.
Gültekin M, Ödünç D, Günseren F, Çolak D, Kırbaş I, Mamıkoğlu L. Hastane
infeksiyonu etkeni Klebsiella pneumoniae ve Escherichia coli suşlarının genişlemiş
spektrumlu beta-laktamaz ve antibiyotik duyarlılık özelliklerinin araştırılması. İnfeks
Derg 1999;13:515-20.
83.
Tünger A, Hilmioğlu S, Dibek MA, Çavuşoğlu C, Aktaş L, Özkan F ve ark. Hastane
infeksiyonu etkeni olarak soyutlanan Klebsiella pneumoniae ve Escherichia coli
kökenlerinde genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sıklığı. İnfeks Derg 1998;12:165-8.
84.
Özbilge H, Yıldız-Zeyrek F, İnanç Y. Gram negatif çomaklarda genişlemiş spektrumlu
beta-laktamaz varlığı ve çeşitli antibiyotiklere direnç durumu. ANKEM Derg
2003;17:13-5.
85.
Delialioğlu N, Öcal ND, Emekdaş G. Çeşitli klinik örneklerden izole Escherichia coli
ve Klebsiella türlerinde genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz oranları. ANKEM Derg
2005;19:84-7.
86.
Köroğlu M, Tekerekoğlu MS, Durmaz B, Durmaz R. Gram negatif çomaklarda
genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz varlığını saptamada farklı yöntemlerin
karşılaştırılması. ANKEM Derg 2001;15:46-52.
87.
Ülkar ÜGB, Tülek N, Mert A. Gram olumsuz basillerde genişlemiş spektrumlu βlaktamaz saptanmasında çift disk sinerji ve E-test yöntemleri. İnfeks Derg
1999;13:385-90.
88.
Fincancı M, Ulutürk R, Eren G, Konuksal C, Soysal F, Sander S ve ark. Klebsiella
pneumoniae, Klebsiella oxytoca ve Escherichia coli kökenlerinde genişletilmiş
spektrumlu beta-laktamazların araştırılmasında kullanılan çeşitli yöntemlerin
karşılaştırılması. İnfeks Derg 2003;17:55-60.
89.
Gülay Z, Abacıoğlu YH, Yuluğ N. Çift disk sinerji yönteminde diskler arası uzaklığın
sonuca etkisi. İnfeks Derg 1995;9:89-92.
90.
Amino acid sequences for TEM, SHV and OXA extended-spectrum and inhibitor
resistant β-lactamases. http://www.lahey.org/studies/webt.htm.
91.
Galani I, Souli M, Chryssouli Z, Katsala D, Gamarellou H. First identification of an
Escherichia coli clinical isolate producing both metallo-β-lactamase VIM-2 and
extended-spectrum β-lactamase IBC-1. Clin Midrobiol Infect 2004;10:757-60.
68
92.
Gülay Z, Thomson CJ, Abacıoğlu YK, Amyes SGB, Yuluğ N. Pediatrik hastalardan
soyutlanan hastane kökenli Klebsiella pneumoniae suşlarının beta-laktamaz tipleri.
İnfeks Derg 1996;10:221-4.
93.
Ayhan Y, Gülay Z, Biçmen M, Gülfidan G, Meşe T, İnan S. Outbreak due to
Salmonella enterica serovar typhimurium producing SHV-12 and CTX-M-3 extendedspectrum beta-lactamases (ESBLs) at a children’s hospital. In: Uzun M, Erturan Z,
Özdem A (Eds). 3rd Balkan Conference of Microbiology Proceedings and Abstract
Book: 2003 Sep 4-6; İstanbul, Turkey. 2003, p.522.
94.
Ambler RP, Coulson AFW, Frère JM, Ghuysen JM, Boris B, Forsman M. A standart
numbering scheme for the class A β-lactamases [letters]. Biochem J 1991;276(Pt
1):269-70.
95.
Nüesch-Inderbinen MT, Kayser FH, Hächler H. Survey and molecular genetics of
SHV β-lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: two novel enzymes, SHV-11
and SHV-12. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:943-49.
96.
Yagi T, Kurokawa H, Shibata N, Shibayama K, Arakawa Y. A prilaminary survey of
extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae
and Escherichia coli in Japan. FEMS Microbiol Lett 2000;184:53-6.
97.
Kim J, Kwon Y, Pal H, Kım JW, Cho DT. Survey of Klebsiella pneumoniae strains
producing extended-spectrum β-lactamases: prevalenece of SHV-12 and SHV-2a in
Korea. J Clin Microbiol 1998;36:1446-9.
98.
Benedić B, Randegger CC, Stobberinh E, Hächler H. Molecular epidemiology of
extended-spectrum β-lactamases from Klebsiella pneumoniae strains isolated in
Zagrep, Croatia [concise article]. Eur J Infect Dis 2001;20:505-8.
99.
Gulay Z. High prevalence of CTX-M type extended-spectrum beta-lactamases in
members of Enterobacteriaceae in Turkey. 14th European Congress of Clinical
Microbiology and Infectious Diseases; 2004 May 1-4; Prague, Czech Republic.
Blackwell Synergy; 2004.
100.
Hernández JR, Martinez-Martinez L, Cantón R, Cogue TM, Pascual A et al.
Nationwide study of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extendedspectrum β-lactamases in Spain. Antimicrob Agents Chemother 2005;49:2122-5.
101.
Brigante G, Luzzaro F, Perili M, Lombardi G, Coli A, Rossolini GM et al. Evolution
of CTX-M-type β-lactamases in isolates of Escherichia coli infecting hospital and
community patients. Int J Antimicrob Agents 2005;25:157-62.
69
102.
Lavollay M, Mamlouk K, Frank T, Akpabie A, Burghoffer B, Ben Redjeb S et al.
Clonal dissemination of a CTX-M-15 β-lactamase-producing Escherichia coli strain in
the Paris area, Tunis, and Bangui. Antimicrob Agents Chemother 2006;50:2433-8.
103.
Lartigue MF, Fortineau N, Nordmann P. Spread of novel extended-spectrum βlactamases in Enterobacteriaceae in a university hospital in the Paris area, France
[research note]. Clin Microbiol Infect 2005;11:588-91.
104.
Mohamed Al-Agamy MH, El-Din Ashour MS, Wiegand I. First description of CTXM β-lactamase-producing clinical Escherichia coli isolates from Egypt. Int J
Antimicrob Agents 2006;27:545-8.
105.
Munday CJ, Whitehead GM, Todd NJ, Campbell M, Hawkey PM. Predominance and
genetic diversity of community-and hospital-acquired CTX-M extended-spectrum βlactamases in York, UK. J Antimicrob Chemother 2004;54:628-33.
106.
Ma L, Ishii Y, Chang FY, Yamaguchi K, Ho M, Siu LK. CTX-M-14, a plasmidmediated CTX-M type extended-spectrum β-lactamase isolated from Escherichia coli.
Antimicrob Agents Chemother 2002;46:1985-8.
107.
Yu WL, Wu LT, Pfaller MA, Winokur PL, Jones RN. Cefepime MIC as a predictor of
the extended-spectrum beta-lactamase type in Klebsiella pneumoniae, Taiwan
[dispatches]. Emerg Infect Dis 2002;8:522-4.
108.
Pagani L, Dell’ Amico E, Migliavacca R, D’ Andrea MM, Giacobone E, Amicosante
G et al. Multiple CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases in nosocomial isolates
of Enterobacteriaceae from a hospital in northern Italy. J Clin Microbiol
2003;41:4264-9.
109.
Eckert C, Gautier V, Saladin-Allard M, Hidri N, Verdet C, Ould-Hocine Z et al.
Dissemination of CTX-M- type β-lactamases among clinical isolates of
Enterobacteriaceae in Paris, France. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:1249-55.
110.
Pitout JD, Hossain A, Hanson ND. Phenotypic and molecular detection of CTX-M-βlactamases produced by Escherichia coli and Klebsiella spp. J Clin Microbiol
2004;42:5715-21.
111.
Ryoo NH, Kim EC, Hong SG, Park YJ, Lee K, Bae IK et al. Dissemination of SHV12 and CTX-M-type extended-spectrum β-lactamases among clinical isolates of
Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and emergence of GES-3 in Korea. J
Antimicrobiol Chemother 2005;56:698-702.
112.
Aubert D, Poirel L, Chevalier J, Leotard S, Pages JM, Nordmann P. Oxacillinasemediated resistance to cefepime and susceptibility to ceftazidime in Pseudomonas
aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2001;45:1615-20.
70
113.
Dubois V, Arpin C, Quentin C, Texier-Maugein J, Poriel L, Nordmann P. Decreased
susceptibility to cefepime in a clinical strain of Escherichia coli related to plasmid and
integron-encoded OXA-30 β-lactamase [letters to editor]. Antimicrob Agents
Chemother 2003;47:2380-1.
114.
Sanschagrin F, Couture F, Levesque RC. Primary structure of OXA-3 and phylogeny
of oxacillin-hydrolyzing class D β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother
1995;39:887-93.
115.
Siu LK, Lo JYC, Yuen KY, Chau PY, NG MH, Ho PL. β-lactamases in Shigella
flexneri isolates from Hong Kong and Shangai and a novel OXA-1-like β-lactamase,
OXA-30. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:2034-8.
116.
Pai H, Kim MR, Seo MR, Choi TY, Oh SH. A nosocomial outbreak of Escherichia
coli producing CTX-M-15 and OXA-30 β-lactamase [concise communication]. Infect
Control Hosp Epidemiol 2006;27:312-4.
117.
Galani I, Souli M, Chryssouli Z, Giamarellou H. Detection of CTX-M-15 and CTXM-33, a novel variant of CTX-M-15, in clinical Escherichia coli isolates in Greece
[letter to editor]. Int J Antimicrob Agents 2007;29:598-602.
118.
Mendonça N, Louro D, Castro AP, Diogo J, Caniça M. CTX-M-15, OXA-30 and
TEM-1 producing Escherichia coli in two Portuguese regions [correspondence]. J
Antimicrob Chemother 2006;57:1014-6.
119.
Lavigne JP, Bouziges N, Chanal C, Mahamat A, Michaux-Charachon S, Sotto A.
Molecular emidemiology of Enterobacteriaceae isolates producing extended-spectrum
β-lactamases in a French hospital. J Clin Microbiol 2004;42:3805-8.
120.
Machado E, Coque TM, Canton R, Baquero F, Sousa JC, Peixe L. Dissemination in
Portugal of CTX-M-15-, OXA-1-, and TEM-1-producing Enterobacteriaceae strains
containing the aac (6´)-Ib-cr gene, which encodes an aminogylcoside- and
fluoroquinolone-modifying enzyme [letters to editor]. Antimicrob Agents Chemother
2006;50:3220-1.
121.
Schlesinger J, Navon-Venezia S, Chmelnitsky I, Hammer-Münz O, Leavitt A, Gold
HS et al. Extended-spectrum beta-lactamases among Enterobacter isolates obtained in
Tel Aviv, Israel. Antimicrob Agents Chemother 2005;49:1150-6.
122.
Gupta E, Srujana M, Sood S, Dhawan B, Das BK, Kapil A. Emerging resistance to
carbapenems in a tertiary care hospital in north India. Indian J Med Res 2006;124:958.
71
123.
Mulvey MR, Bryce E, Boyd D, Ofner-Agostini M, Christianson S, Simor AE et al.
Ambler class A extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and
Klebsiella spp. in Canadian hospital. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:1204-14.
124.
Şahin İ, Kaya D, Öksüz Ş, Okay A, Şencan İ, Öztürk E. Klinik örneklerden izole
edilen gram-negatif çomaklarda genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sıklığı ve
antibiyotik duyarlılığı. İnfeks Derg 2003;17:45-8.
125.
Yavuzdemir Ş, Aysev AD, Güriz H. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz yapan
E.coli suşlarının antibiyotiklere duyarlılıkları. Türk Mikrobiyol Cem Derg
2003;33:126-9.
126.
Jain A, Mondal R. Prevalence & antimicrobial resistance pattern of extended-spectrum
β-lactamase producing Klebsiella spp isolated from cases of neonatal septicaemia.
Indian J Med Res 2007;125:89-94.
127.
Liao CH, Sheng WH, Wang JT, Sun HY, Wang HK, Hsueh PR et al. In vitro activities
of 16 antimicrobial agents against clinical isolates of extended-spectrum betalactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in two regional
hospitals in Taiwan. J Antimicrobiol Immunol Infect 2006;39:59-66.
128.
Löker K, Beşirbellioğlu B, Kısa Ö, Aydoğan H, Dizer U, Pahsa A. Hastane
infeksiyonlarından izole edilen Klebsiella pneumoniae ve Escherichia coli
izolatlarında genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz sıklığının saptanması ve izoelektrik
fokuslama yöntemi ile tiplendirilmesi. İnfeks Derg 2001;15:319-24.
129.
Kizirgil A, Yakupoğulları Y, Şenol FF, Toraman ZA. Kan kültürü örneklerinde
genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz üreten enterik basillerin prevalansı ve antibiyotik
duyarlılıklarının araştırılması. İnfeks Derg 2005;19:111-4.
130.
Gülay Z. Genişletilmiş spektrumlu beta-laktamaz tanımlanmasında çift disk sinerji
testi ve izoelektrik odaklama yöntemi ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması.
İnfeks Derg 1999;13:381-4.
131.
Aydemir H, Yalçı A, Pişkin N, Gürbüz Y, Türkyılmaz R. Escherichia coli ve
Klebsiella pneumoniae suşlarının genişlemiş spektrumlu β-laktamaz üretme ve
antibiyotik direnç oranları. Klimik Derg 2006;19:63-8.
132.
Gülay Z, Biçmen M, Amyes SGB, Yuluğ N. Escherichia coli suşlarında
amoksisilin/klavulanik asit direnci ve bununla ilişkili beta-laktamaz ve plazmid
profilleri. ANKEM Derg 2001;15:1-10.
72
EKLER
73
EK 1
74

Direnç Mekanizmalarının Saptanmasında EUCAST Önerileri, Onur

Salmonella enterica Serotip Paratyphi B Klinik İzolatlarının

ISSN 1300–9745 EGE PEDİATRİ BÜLTENİ EDİTÖR VE SORUMLU

Haemophilus influenzae invaziv enfeksiyonları

Bakteriyel

Sistem belleğinde sorun giderme

YÜKSEKÖĞRETİM KURULU - İstanbul Bilim Üniversitesi

Kafa travması 3 - acil tıp sitesi