EVDE BİYOTEKNOLOJİ Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 7. DERS Besin ortamının temel içerikleri • • • • İnorganik maddeler Organik maddeler Bitki büyüme düzenleyicileri Doğal kompleksler 2 Besin ortamının temel içerikleri 1. Su: • Hücre doku kültüründe kullanılan besin ortamlarının %95’i sudan oluşur. • Suyun kalitesi çok önemlidir. • Kesinlikle musluk suyu kullanılmamalıdır (Çünkü musluk suyu bir çok organik ve inorganik maddeyi bünyesinde bulundurmaktadır) 3 Musluk suyunun arıtılması için Deiyonizasyon: Su sentetik resinlerden geçirilir. Bu sayede su içerisindeki organik maddeler ve klor uzaklaştırılır. Ancak bu yöntemde erimiş maddeler uzaklaştırılamaz. 4 Destilasyon: Bu yöntemle su birçok iyonlar, partiküller, uçucu olmayan kimyasal maddeler ve mikroorganizmalardan arındırılabilir. Yöntemin esası suyun kaynatılarak buhar haline getirilmesi ve yoğunlaştırılmasından ibarettir. 5 Membran filitrasyonu:: Bu yöntemle suyun içeindeki partiküller ve mikroorganizmalar farklı filitre sisteminden geçirilerek arındırılabilir. Bu yöntemde de su içinde bulunan erimiş maddeler uzaklaştırılamamaktadır. 6 Ters Osmos Yöntemi: Bu yöntemle suyun içindeki bakteriler organik madde ve partiküller %99 oranında ermiş maddeler %90 oranında uzaklaştırılır. Ancak gazlar uzaklaştırılamaz. Bu yöntemde suyun arındırılması için yarı geçirgen bir zar kullanılır. Su bu zardan basınç altında geçerken diğer maddeler geçememektedir. 7 Besin ortamının temel içerikleri 2. Agar: • Besin ortamında katılaştırıcı olarak kullanılan agar deniz yosunlarından elde edilmektedir. Deniz yosunlarından elde edilen agar fabrikasyonla saflaştırılır ve yıkanır. Böylece her türlü toksik maddeden arındırılır. Besi ortamı bileşenleri içerisinde en pahalı olanlarındandır. Besi ortamında %0,6 - 0,8 konsantrasyonları kullanılır. 8 Günümüzde besi ortamlarında agara alternatif birçok maddeden yararlanılabilmektedir. Bunlar • Biogel P200 gibi sentetik polimerler • Alginat • Gelrit • Temiz plastik köpük veya cam elyaf • Filitre kağıtları 9 Besin ortamının temel içerikleri 3. Şeker: • Bütün besi ortamlarında şeker en önemli bileşenlerden biridir. Büyüme ve gelişme için karbon kaynağı olan şeker mutlak gereklidir. • Besi ortamlarında genellikle %1-5 oranında sakkaroz kullanılmaktadır. 10 3. Şeker: • Glikoz, maltoz, fruktoz gibi şekerler de kullanılabilir. • Hangi şekerin kullanılacağı bitki türüne ve kullanılan eksplanta bağlıdır. 11 Besin ortamının temel içerikleri 4. İnorganik Tuzlar: • Bir bitki hücresinin gereksinim duyduğu inorganik besinler normal bir bitkinin ihtiyaç duyduğu besinlere benzer. N, P, K, Ca, S ve Mg gibi elementlere minimol düzeyde ihtiyaç vardır. Bu elementler uygun formda, bitkilere yarayışlı formda ilave edilmeli ve dengeli olmalıdır. 12 • • Besi ortamına ilave edilen P, Mg, Ca, ve S konsantrasyonu 1-3 mM arasında değişir. Nitrat 25-40 mM, Amonyum 2-20 mM arasında değişir. Fe, Mn, Zn, B, Cu, ve Mo gibi mikro elementlere mikromol düzeyde ihtiyaç vardır. 13 Besin ortamının temel içerikleri 5. Vitaminlar: • Doğada bitkiler ihtiyaç duyduğu vitaminleri sentezlerler. İn vitro kültürde bitki hücreleri için bazı vitaminler kısıtlayıcı olabilmektedir. • İn vitro kültürde B1 vitamini olan Thiaminin mutlaka bulnması gerekmektedir. • Ayrıca nikotinik asit, pyrodoksin gibi vitaminlerinde eklenmesinin yarayışlı olduğu tespit edilmiştir.Ayrıca Myo inositolde pek çok besi ortamı için gerekli bir vitamindir. 14 Besin ortamının temel içerikleri 6. Büyüme düzenleyicileri: Hormonlar bitki gelişimini etkileyen ve bitkiler tarafından sentezlenen organik bileşiklerdir. İnvitro kültürde en fazla kullanılan büyüme düzenleyicileri oksinler, sitokininler ve giberallinlerdir. Oksinler hücre uzamasını bölünmesini ve dokuların şişmesini teşvik eder. Sürgün oluşumunu engeller. Düşük oksin konsanrasyonu kök oluşumunu teşvik eder. Yüksek oksin konsantrasyonu kök oluşumunu engeller ve kallus oluşumunu teşvik eder. İndol asetik asit (İAA), 2,4-D (2,4 diklorofenoksiasetik asit), İBA (indol bütrik asit), Dicambe …. sıklıkla kullanılan 15 oksinlerdendir. Sitokininler; hücre bölünmesini teşvik ederler. Yüksek konsantrasyonda kullanıldıklarında sürgün oluşumuna neden olurlar. Genellikle kök oluşumunu engellerler. En fazla kullanılan sitokininler kinetin, BAP (6 benzil aminopurin), IPA (izopentenil adenozin) Giberellinler; Bu grupdaki büyüme düzenleyiciler bitkilerde boğum aralarının uzamasına ve meristem gözlerinin büyümesini teşvik ederler. 16 Besin ortamının temel içerikleri 7. Kompleks maddeler: Protein hidralizatları, maya ekstraktı, malt ekstraktı, hindistan cevizi sütü, mısır endospermi, portakal domates suyu gibi bek çok bileşik denenmiş genellikle yüksek konsantrasyonda kullanıldıklarında hücre büyümesini olumsuz yönde etkilerken düşük konsantrasyonda kullanıldıklarında yararlı oldukları tespit edilmiştir. 17 Besin ortamının temel içerikleri 8. Aktif karbon: Aktif karbon odunun yüksek sıcaklık ve buhar basıncı altında karbonlaştırılması ile elde edilir. Besi ortamında her türlü maddeyi adsorbe edebilir. 18 Besin ortamının temel içerikleri 8. pH: İyi bir invitro büyüme için besi ortamının pH’sı önemlidir. pH’nın 4,5’den düşük yada 7’den büyük olması genellikle invitro büyümeyi durdurur. Genellikle bitkiler in vitro kültürde 5,5 ile 6 arasındaki pH’larda iyi bir büyüme gösterirler. 19 • Bazı besdi ortamlarının içerikleri 20 EV ŞARTLARINDA BESİ YERİ HAZIRLAMA 21 BESİ YERİ HAZIRLIĞI Kullanılacak maddelerin çoğu eczane, market, kimyevi gübre veya medikal malzeme satıcılarından temin edilebilir. Aşağıdakiler yaklaşık 1 litre temel besin ortamını hazırlamada kullanılır: 22 • İki su bardağı yağmur suyu veya saf su (kaynatılmış ve soğutulmuş su da olabilir) • Çeyrek su bardağı toz şeker (yaklaşık 30 g.) • Gübre stok solüsyonu (bir yemek kaşığı 20:20:20 NPK gübresi 2 litre suda eritilir ve buradan bir bardak dolusu solüsyon kullanılır), • Eczanelerden alınabilecek 500 mg’ lık inositol tabletlerinden yarım tablet ve Thiamin’li vitamin tabletlerinden ½ tablet (Multi-vitamin tabletleri de kullanılabilir) 23 • Medikal malzeme satıcıların temin edilebilecek ve besin ortamını yarı-katı (jel) hale getiren agardan dört yemek kaşığı, • Ampisilin içeren antibiyotik tabletleri (250 mg) • Sitrik asit (sirke asidi) ve sodyum bikarbonat (Kabartma tozu) 24 Ağzı kapanabilen bir kaba önce su ve sonra bütün maddeler ilave edilerek karıştırılır. Besin ortamı pH’sı dar alalıkta renk değişimi ile pH’yı tahmin etmeye yarayan indikatör kağıtlarla ölçülür ve 5-6 arasına ayarlanır. Eğer pH fazlaysa sitrik asit, düşükse bikarbonat soda kullanılarak ayarlanmalıdır. Daha sonra agar ilave edilerek eriyinceye kadar ocakta sık sık karıştırarak kaynatılır. Daha sonra eriyik kavanozlara ¼ (çeyrek) oranında veya 2 cm kalınlıkta doldurulur. 25 Basınçlı pişirici içine önce 1/5 oranında su, üzerine ayaklı bir sehpa (metal) konulur, sterilize edilecek malzemeler bu sehpa üzerine konulduktan sonra kavanoz kapakları gevşek olarak kapatılır ve tencerede buhar çıkmaya başlamasından itibaren 15 dakika süreyle tutulur. 26 • Bitkileri çoğaltmak ve köklendirme ortamlarını hazırlamak için yukarıdaki ortama yarım bardak Hindistan cevizi sütü ve malt ilave edilir. Hindistan cevizi sütü yerine yarım bardak yeşil domates püresi veya yarım bardak taze sıkılmış portakal suyu da kullanılırsa ilginç ve farklı sonuçlar ortaya çıkabilir. Ayrıca yarım çay bardağı organik deniz yosunu özü ilave edilebilir (Örnek: Kelpak) 27
© Copyright 2024 Paperzz
