Zirve Üniversitesi Tıp Fakültesi I. Dönem 3. Ders Kurulu Tıbbi

Zirve Üniversitesi Tıp Fakültesi I. Dönem 3. Ders Kurulu Tıbbi Biyokimya Laboratuvar Uygulaması -‐ Deney 3 Deneyin ismi: Serum proteini analizi Deneyin amacı: Bikinkoninik asit (BCA) yöntemi kullanılarak insan serumundaki toplam protein miktarının spektrofotometrik metodla tayini Deney için gerekli malzemeler ve kimyasallar: -‐BCA protein analiz kiti reaktif çözeltisi: NaCl, bikinkoninik asit, Na2CO3 (sodyum karbonat), NaHCO3 (sodyum bikarbonat), CuSO4 (küprik sülfat), Na2C4H4O6 (sodyum tartrat) ve NaOH karışımından oluşur. -‐BSA (bovine-‐sığır-‐ serum albumin) protein standart çözeltisi -‐İnsan kan serumu -‐Spektrofotometre ve plastik küvetler -‐Pipet, pipet uçları ve cam test tüpleri Deneyin açıklaması: Çözünür proteinlerin çözelti içindeki konsantrasyonlarının ölçümü için birçok farklı yöntem geliştirilmiştir. En yaygın kullanılan 3 yöntem; basit absorbans yöntemi, Lowry yöntemi ve Bradford yöntemidir. Bu yöntemlerde bilinen konsantrasyonlardaki protein çözeltileri ile hazırlanan standart kalibrasyon grafikleri kullanılarak bilinmeyen örneğin konsantrasyonu bulunur. Her üç yöntem de proteinlerin analizi için spektrofotometrik ölçümleri (kolorimetrik metod) kullanır. Bikinkoninik Asit Yöntemi: Lowry yöntemi adıyla bilinen protein tayin yönteminin farklı bir uygulaması olan bir tekniktir. Diğer protein tayin yöntemlerine göre daha yenidir ve reaktif olarak bikinkoninik asit (BCA) kullanılır. Bu yöntem alkali çözeltideki proteinlerin, biüret reaktifi (CuSO4, Na2C4H4O6 ve NaOH’in karışımına denir) ile Cu+2’yi Cu+1 indirgemesi ve daha sonra Cu+1’in BCA (bikinkoninik asit) ile verdiği mor renkli kompleksin 562 nm’deki absorbansının spektrofotometrik metodla ölçümüne dayanır. Renk değişimi, BCA kiti reaktif çözeltisinin rengi olan yeşilden koyu mora doğru gerçekleşir. Yöntemin duyarlılığı Lowry metoduna yakındır (20–100 μg protein/ml). Cu+2 iyonlarını indirgeyici maddelerin ve Cu+2 ile kompleks oluşturan EDTA gibi maddelerin bu metodla protein analizi yapılan çözeltilerde bulunması yanlış değerler elde edilmesine sebep olabileceğinden dikkat edilmelidir. Deneyin yapılışı: BCA kiti reaktif çözeltisi: BCA protein analiz kitinde bulunan “A reaktifi” (NaCl, bikinkoninik asit, Na2CO3 (sodyum karbonat), NaHCO3 (sodyum bikarbonat), Na2C4H4O6 (sodyum tartrat) ve NaOH) ve “B reaktifinin” (CuSO4 -‐ küprik sülfat), 50:1 (A:B) oranında karıştırılmasıyla elde edilir. (Not: Yukarıdaki bahsedilen reaktif çözelti önceden karıştırılıp hazırlanmış şekilde size verilecektir). Protein standart çözeltisi kullanılarak kalibrasyon eğrisinin (standart eğri) hazırlanması: Protein tayininde kullanılacak olan standart proteinimiz BSA (bovine-‐sığır-‐ serum albumin) proteinidir. Bu protein, BCA kitinde bulunan 2 mg/mL’lik stok çözeltiden çeşitli konsantrasyonlara seyreltilmiş halde size verilecektir. Aşağıdaki tabloda size verilecek olan 5 farklı standard BSA çözeltisinin konsantrasyonları belirtilmiştir. Standard proteinlerin absorbans ölçümü için cam test tüpleri içerisine pipet yardımıyla 1 ml BCA reaktif çözeltisi ve 50 μl standard BSA çözeltilerini ekleyiniz ve hafifçe karıştırınız. Daha sonra test tüplerini 37 0C’de sabitlenmiş inkübator içerisinde 20 dakika beklettikten (inkübasyon) sonra inkübatörden alarak oda sıcaklığında 5 dakika soğumasını bekleyiniz. Hemen ardından test tüplerinin içerisindeki standartları plastik küvetlere pipet yardımıyla transfer ediniz ve 562 nm’de absorbans değerlerini spektrofotometre yardımıyla ölçünüz. Ölçtüğünüz değerleri aşağıdaki tabloya not ediniz. Spektrofotometre ile ölçüme başlamadan önce spektrofotometreyi kör (blank) çözelti ile sıfırlamayı unutmayınız (Dikkat: Protein standartlarının ölçümünü her grubun bir kere yapması yeterlidir). BSA standardı konsantrasyonu (μg/mL) 50 (μg/mL) 150 μg/mL 250 μg/mL 500 μg/mL 1000 μg/mL Kör (blank) çözelti BSA standardı hacim miktarı (μl) 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl 0 μl BCA reaktif çözeltisi hacim miktarı (ml) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 562 nm absorbans değeri Kalibrasyon Eğrisinin Çizilmesi: Kalibrasyon eğrileri, absorbans değerlerinin konsantrasyona karşı çizildiği lineer (doğrusal) grafiklerdir. Bu eğride konsantrasyon değerleri x-‐ekseninde, absorbans değerleri ise y-‐ekseninde olmalıdır. Kalibrasyon eğrileri grafik kağıdı veya bilgisayar yardımıyla (Excel gibi programlar) çizilebilir. Bu doğrusal grafiğin denklemi y= mx + n şeklindedir. Bu denklemde y değeri absorbansa, x ise konsantrasyon değerlerine tekabül etmektedir. Bilgisayar bu denklemde bize eğim (m) ve intersept (n) sabitlerinin sayısal değerlerini vermektedir. Bu değerler ve absorbans değeri kullanılarak bilinmeyen bir örneğin konsantrasyon değeri hesaplanabilir. Yukarıda BSA protein standartlarından elde ettiğiniz absorbans ölçümü değerleri kullanılarak (bilgisayar yardımıyla) absorbans-‐konsantrasyon grafiğini çiziniz. Bu eğrinin denklemi bilinmeyen örnekteki (serum) protein konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılacaktır. Örnek bir standart eğri grafiği aşağıda verilmiştir. Örneğin (insan serumu) toplam protein konsantrasyonunun hesaplanması: Bir cam test tüpü içerisine insan serumundan 50 μl, standart çalışma reaktifinden ise 1 ml ilave ettikten sonra (standart protein çözeltisine benzer şekilde) test tüplerini 37 0C’de sabitlenmiş inkübatör içerisinde 20 dakika bekletiniz. İnkübatörden aldıktan oda sıcaklığında 5 dakika soğumasını bekleyiniz. Hemen ardından test tüplerinin içerisindeki standartları plastik küvetlere pipet yardımıyla transfer ediniz ve 562 nm’de absorbans değerlerini spektrofotometre yardımıyla ölçünüz. Standart protein ölçümleri sonucu elde ettiğiniz standart eğrinin (kalibrasyon eğrisi) denklemini kullanarak serum içerisindeki toplam protein miktarını hesaplayınız ve aşağıdaki tabloya not ediniz. Aynı deneyi 50 μl yerine 20 μl serum kullanarak tekrarlayınız (Dikkat: Bu kısımda her öğrenci 50 μl ve 20 μl olmak üzere en az iki ölçümü tek başına yapmalıdır). İnsan Serum örneği hacmi (μl) 50 μl 20 μl BCA reaktif çözeltisi hacim miktarı (ml) 562 nm absorbans değeri Konsantrasyon değeri (μg /mL) 1 ml 1 ml Deneyin sonuçları ve öğrenilenler: Bu deneyde örneklerdeki toplam protein miktarlarının tayini için kullanılan değişik metodlar hakkında bilgi edinilmiş ve bunlardan bikinkoninik asit yöntemi kullanılarak insan serumundaki toplam protein miktarı belirlenmiştir. Bu yöntem bakır iyonunun proteinle indirgenmesi ve sonucunda eklenen reaktif çözeltiyle oluşan kompleks miktarının spektrofotometrik olarak tesbitine dayanır.

Download Report