Zirve Üniversitesi Tıp Fakültesi I. Dönem 4. Ders Kurulu Tıbbi Biyokimya Laboratuvar Uygulaması -‐ Deney 6 Deneyin İsmi: Serum Lipid (kolesterol ve trigliserit) Analizi Deneyin amacı: Serumdaki trigliserit (triaçilgliserol) ve kolesterol miktarlarının spektrofotometrik yöntemle tayini Deneyin açıklaması: Kolesterol Tayini: Serum kolesterol düzeyinin saptanması klinik açıdan önem taşıyan bir teşhis metodudur. Kandaki yüksek kolesterol miktarı kalp hastalıkları için en önemli risklerden birini oluşturmaktadır. Bu deneyde serum içerisindeki kolesterol miktarı spektrofotometrik yöntemle tayin edilecektir. Bu analiz için kolesterol esteraz (CHE), kolesterol oksidaz (CHOD) ve peroksidaz (POD) enzimlerinden oluşan “kolorimetrik enzimatik” analiz kiti kullanılacaktır. Bu analizde öncelikle serum içerisinde bulunan esterleşmiş kolesterol molekülleri CHE enzimi tarafından serbest kolesterole çevrilir (hidroliz reaksiyonu). Serumda halihazırda mevcut olan serbest kolesterol, CHE enzimi tarafından oluşturulan serbest kolesterol ile beraber CHOD tarafından 4-‐kolestenon’a çevrilir (oksidasyon reaksiyonu). Bu reaksiyon esnasında aynı zamanda hidrojen peroksit (H2O2) açığa çıkar. Oluşan bu hidrojen peroksit, peroksidaz (POD) enzimi tarafından fenol ve 4-‐aminofenazon substratlarının kinonimin molekülüne dönüştürülmesinde kullanılır. Kinonimin 505 nm’de absorbansı olan ve bu nedenle pembemsi-‐kırmızı renk veren kromofor bir maddedir. Oluşan kinonimin miktarı absorbans değeriyle orantılıdır. Kinonimin oluşma miktarı ise direk olarak H2O2 miktarıyla orantılı olduğu için dolaylı olarak serumdaki kolesterol miktarını hesaplamamıza imkan verir. Trigliserit Tayini: Serum trigliserit düzeylerindeki artış spesifik olmamakla beraber yağ ve karbonhidrat oranı yüksek yiyeceklerle beslenme, hepatit sonucu karaciğerdeki fonksiyon bozukluğu, siroz ve diyabet gibi hastalıklar serumdaki trigliserit seviyesinin artmasıyla ilişkilidir. Bu deneyde serum içerisindeki trigliserit miktarı spektrofotometrik yöntemle tayin edilecektir. Bu analiz için lipoprotein lipaz (LPL), gliserol kinaz (GK) ve gliserol-‐3-‐fosfat oksidaz (GPO) ve peroksidaz (POD) enzimlerinden oluşan “kolorimetrik enzimatik” analiz kiti kullanılacaktır. Bu analizde öncelikle serum içerisinde bulunan trigliserit molekülleri LPL enzimi tarafından gliserol ve serbest yağ asitlerine çevrilir. Daha sonra oluşan gliserol ise GK enzimi tarafından ATP kullanılarak gliserol-‐3-‐fosfat’a dönüştürülür. Oluşan gliserol-‐3-‐fosfat ise GPO enzimi tarafından oksitlenerek dihidroksiaseton fosfat’a çevrilir. Bu reaksiyon esnasında aynı zamanda hidrojen peroksit (H2O2) açığa çıkar. Oluşan bu hidrojen peroksit, peroksidaz (POD) enzimi tarafından p-‐ klorofenol ve 4-‐aminofenazon substratlarının kinon molekülüne dönüştürülmesinde kullanılır. Kinon, 505 nm’de absorbansı olan ve bu nedenle pembemsi-‐kırmızı renk veren kromofor bir maddedir. Oluşan kinon miktarı absorbans değeriyle orantılıdır. Kinon oluşma miktarı ise direk olarak H2O2 miktarıyla orantılı olduğu için dolaylı olarak serumdaki trigliserit miktarını hesaplamamıza imkan verir. Deney için gerekli malzemeler: Deney için gerekli malzemeler: -‐Kolesterol kiti reaktif çözeltisi (90 mM Pipes pH 6.9 tampon çözeltisi içerisinde 26 mM fenol, 0.4 mM 4-‐aminofenazon, 300 U/L kolesterol esteraz, 600 U/L kolesterol oksidaz ve 1250 U/L peroksidaz mevcuttur) -‐Trigliserit kiti reaktif çözeltisi (50 mM GOOD pH 7.5 tampon çözeltisi içerisinde 2 mM p-‐klorofenol, 0.1 mM 4-‐aminofenazon, 0.1 mM ATP, 150000 U/L lipoprotein lipaz, 500 U/L gliserolkinaz, 2500 U/L gliserol-‐3-‐oksidaz ve 440 U/L peroksidaz mevcuttur) -‐Trigliserit ve kolesterol standart çözeltileri (her iki çözelti de 200 mg/dL), insan serumu, Tris tampon çözeltisi (pH 7.5) ve spektrofotometre küvetleri (plastik) Deneyin yapılışı: Dikkat: Aşağıdaki prosedüre başlamadan önce spektrofotometreyi 505 nm’de kör (blank) çözelti (Kolesterol veya Trigliserit kiti reaktif çözeltisi) ile sıfırlamayı unutmayın! 1) Kolesterol kiti reaktif çözeltisinden pipet yardımıyla 1000 mikrolitre (ul) alarak plastik spektrofotometre küveti içerisine transfer ediniz. 2) Bu çözelti üzerine 10 mikrolitre (ul) kolesterol standart çözeltisi ekleyip pipet ucu yardımıyla hafifçe karıştırınız ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletiniz (çözeltinin renginin zamanla pembeleştiğini göreceksiniz). 3) Daha sonrak küveti spektrofotometre içerisine adaptör vasıtasıyla yerleştirerek 505 nm’deki absorbans değerini ölçünüz ve bu değeri not ediniz. Bu absorbans değeri standart absorbans değeridir. 4) Daha sonra küveti yıkayıp içerisine taze olarak kolesterol kiti reaktif çözeltisinden 1000 ul ekleyiniz. Bunun üzerine 10 ul serum koyarak pipet ucu yardımıyla karıştırınız. 10 dakika bekledikten sonra 505 nm’deki absorbans değerini okuyarak not ediniz. Bu absorbans değeri numune absorbansıdır. 5) Aşağıda yer alan denklemi kullanarak serumda bulunan kolesterol miktarını hesaplayıp ilgili tablo içerisine not ediniz. 6) Trigliserit tayini için yukarıdaki aynı basamakları bu kez trigliserit reaktif çözeltisi ve trigliserit standardı kullanarak tekrar ediniz. Miktar Hesaplamaları: Aşağıdaki denklemleri kullanarak kullandığınız serumdaki kolesterol ve trigliserit düzeylerini mg/dL cinsinden hesaplayınız. Bu değerleri aşağıdaki tabloya not ediniz. (numune absorbansı/standart absorbansı) x standart konsantrasyonu (200 mg/dL) = serum kolesterol veya trigliserit konsantrasyonu (mg/dL) Kolesterol 1000 ul reaktif çözelti + 10 ul kolesterol stand. 1000 ul reaktif çözelti + 10 ul serum Abs 505 nm Kolesterol (mg/dL) Trigliserit 1000 ul reaktif çözelti + 10 ul trigliserit stand. 1000 ul reaktif çözelti + 10 ul serum Abs 505 nm Trigliserit (mg/dL) Serum için Referans Değerler: Kolesterol miktarı 200 mg/dL’den az 200-239 mg/dL 240 mg/dL ve üzeri Durum Normal Sınırda Yüksek Trigliserit Erkek Kadın (normal değer aralığı) 40-160 mg/dL 35-135 mg/dL Deney Sonrası Soruları: 1) Kolesterol ve trigliserit tayininde 505 nm’de absorbans değerini ölçtüğümüz maddeler hangileridir? 2) Kolesterol oksidaz (CHOD) enzimi tarafından kolesterolün yükseltgenme reaksiyonunda hangi moleküller oluşur. Bu oluşan moleküllerden hangisi peroksidaz (POD) enzimi tarafından substrat olarak kullanılır? 3) Trigliserit tayininde 4-‐aminofenazon ve p-‐klorofenol, kolesterol tayininde ise 4-‐ aminofenazon ve fenol miktarları önceki reaksiyonlar esansında oluşan H2O2 miktarlarından her zaman fazla olmak durumundadır. Bunun sebebi nedir?
© Copyright 2024 Paperzz
