ORİJİNAL ARAŞTIRMA Hematolojik Kanserlerde Moleküler Hedeﬂere Yönelik İlaç Tespiti Murat İŞBİLEN,a Ali Osmay GÜREa a Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Bilkent Üniversitesi, Ankara Yazışma Adresi/Correspondence: Ali Osmay GÜRE Bilkent Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Ankara, TÜRKİYE [email protected] ÖZET Amaç: Yakın gelecekte, kanser kemoterapisinin kişiye özel planlanmasında belki en önemli kıstası moleküler tümör biyobelirteçleri oluşturacaktır. Böyle biyobelirteçler ile tümörün hangi kemoterapötik ajana cevap vereceğinin öngörülmesiyle, hem morbidite ve mortalitede, hemde maliyette kayda değer azalma olması beklenebilir. Gereç ve Yöntemler: Yakın zamanda tamamlanan ve sonuçları veri tabanlarına yüklü iki büyük çalışmada, içlerinde hematolojik kanserlerin de bulunduğu, çok sayıda kanser türünden geliştirilmiş hücre hatlarının birçok ilaç için hassasiyet değerleri tespit edilmiş, aynı zamanda bu hücrelerin mutasyon profilleri ve transkriptomları da tanımlanmıştır. Dolayısıyla bu veriler, her hangi bir kanser türü için ilaç hassasiyet bilgisi ile genom ilişkisini tespit edilebilir kılmaktadır. Bu çalışmamızda, bu iki tür bilgiyi bulunduran veritabanından yararlanarak hematolojik kanserlerin alt gruplarının hangi ilaçlara en hassas olduğunu saptamayı hedefledik. Alt grupları hem klinikte kullanılan tanımlara göre, hemde transkriptomik profilleme ile kendi oluşturduğumuz gruplamalar temelinde yaptık. Bulgular-Sonuç: Sonuçlarımız her iki analizle de hemen her tür hematolojik kanser için tedavide kullanılabilecek potansiyel bir çok yeni ilacın varlığını göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Hematolojik kanserler; moleküler hedefe yönelik tedavi; biyobelirteçler, farmakolojik ABSTRACT Objective: Molecular biomarkers of chemosensitivity will possibly be the primary contributing factor in the planning of personalized cancer chemotherapy in the near future. It is highly likely that the foresight these biomarkers will provide will decrease mortality and morbidity rates, as well as treatment costs. Material and Methods: Two large studies, completed quite recently, have made cytotoxicity data from a large number of drugs for cell lines derived from various cancers including hematological malignancies as well as their genomic and transcriptomic profiles publicly available enabling the determination of genomic correlates of drug sensitivity. In this study, we aimed the identification of drugs with selective action for subgroups of hematological malignancies. We defined subgroups according to the classical clinical descriptions of these cancers as well as those we defined by transcriptomic profiling. Results-Conclusion: Our results suggest the presence of many drugs which potentially could be used for subgroups of hematological cancers as defined by either method. Key Words: Hematological neoplasms; molecular targeted chemotherapy; biomarkers, pharmacological Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1):1-7 Copyright © 2014 by Türkiye Klinikleri ematolojik kanserler (lösemi, lenfoma ve multipl miyelom) birarada değerlendirildiklerinde binde 2’lik insidans ile Türkiye’de erkeklerde akciğer kanserinden sonra ikinci, kandınlarda meme kanseriyle birlikte en sık görülen kanser grubunu oluşturmaktadırlar. Mortalite/insidans oranları Hodgkin lenfoma (HL) için 0,33 olmakla birlikte diğer gruplarda bunun çok üstünde olup, non-Hodgkin lenfoma (NHL), multipl myelom (MM) ve lösemiler için sırasıyla 0,69, 0,83 ve 0,86’dır.1 Günümüzde bu kanserler için farklı tedavi protokolleri bulunmaktadır. Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) 1 Murat İŞBİLEN ve ark. HEMATOLOJİK KANSERLERDE MOLEKÜLER HEDEFLERE YÖNELİK İLAÇ TESPİTİ HL’da tedavi standart kemoterapi [adriamisin, bleomisin, vinblastin, dakarbazin (ABVD)] ve radyoterapi iken, başkalarında hastalığın moleküler patolojisi ile yakından ilgilidir. Örneğin, kronik myeloid lösemide (KML) tedavi BCR-ABL’i hedefleyen kinaz inhibitörleri (örneğin Imatinib) ile yapılmaktadır.2 Yakın zamana kadar bu ve dier kanserler için tedavi yaklaşımları ya ampirik ya da moleküler mekanizmanın anlaşılması temelinde geliştirilen ilaçların denenmesi ile geliştirilebilmekteydi. Ancak klinik ve patolojik sınıflandırmanın, diğer kanserlerde olduğu gibi hematolojik kanserlerde de var olduğu bilinen heterojeniteyi belirlemekte yetersiz kaldığı bilinmektedir. Hematolojik kanserlerin moleküler yöntemlerle alt gruplara ayrılabileceğini gösteren ilk çalışmalardan biri, diffüz büyük B hücreli lenfomaların (DBL) farklı klinik seyir gösteren türlerinin tümörlerdeki gen ifade farklılıkları temelinde tespit edilebileceği ile ilgili bir çalışma idi.3 2000 yılında yayınlanan ve 4500’den fazla atıf alan bu çalışmadan sonra benzeri transkriptomik analizler ile ilgili lösemide 35,000, lenfomada 17,000, multipl myelomda 9,000’den fazla çalışma yapılmıştır (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gds). Bu derece çok verinin kapsamlı bir sentezini yapmak bu makale kapsamında mümkün değildir. Ancak, daha önceki çalışmalarda, o tarihlerde verileri bulunmadığından istifade edilemeyen iki büyük çalışma 2012 yılında tamamlanmış olup sonuçları bilim dünyası paylaşımına açılmıştır. Broad Institute ve Sanger Institute/Welcome Trust kaynaklı bu iki büyük çalışma ile, içlerinde hematolojik kanserlerin de bulunduğu bir çok kanserden kaynaklı 200’den fazla hücre hattı için hem transkriptomik ve genomik, hem de ilaç hassasiyet bilgileri elde edilmiştir.4,5 Dolaysıyla, daha önce cevaplanması zor iki soru (hangi kanser türleri hangi kemoterapötik ajanlara hassastır? (1) ve hangi genlerin ifade miktarları veya polimorfizmleri hangi ilaçlar için bir hassasiyet belirtecidir? (2), artık cevaplanabilmektedir. Bu çalışmamızda bu iki soruyu hematolojik kanserler için cevaplamaya çalıştık. Sonuçlarımız hematolojik kanserlerin bilinen alt gruplarının ve ayrıca transkriptomik analizlerimiz ile saptadığımız alt gruplarının, günümüzde bu kanserler için kullanılmayan birçok ilaca hassas olduklarını göstermektedir. Sonuçlarımızın geniş doğrulama çalışmalarına öncü olmasını ümit ediyoruz. SONUÇLAR HEMATOLOJİK KANSERLERİN TEDAVİSİNDE ETKİN İLAÇLARIN TESPİTİ İlaç/genom ilişkisinin incelenmiş olduğu iki büyük çalışmadan ilki olan, kanser hücre hattı ansiklopedisi (Can- 2 cer Cell Line Encyclopedia, CCLE) kapsamında içlerinde KML, AML, ALL (T ve B), lenfoma [DBL, HL, NHL ve Burkitt (BL)], MM ve alt grubu bilinmeyen hematolojik kanserden kaynaklı toplam 172 hücre hattı ve 24 ilaç çalışılmıştır.4 Kanser genom projesi (Cancer Genome Project, CGP) kapsamındaysa, 103 hematolojik kanser kökenli hücre hattı için 130 ilaca hassasiyet bilgisi elde edilmiştir.5 Çalışmamız dahilinde ilk olarak özellikle hematolojik kanser türlere etkili ilaçların tespit etmek istedik. CCLE’de ilaç sitotoksisite ölçümleri 4 (IC50, EC50, Amax ve Activity Area), CGP’de iki değişik parametre (IC50, ROC) olarak bulunmaktadır. Bunlardan CCLE için Activity Area (AA), CGP için IC50 değerlerini kullandık. Bu değerlerin, her kanser türüne karşılık gelen hücre hatları için elde edilmiş ortalama (median) değerleri kıyaslandığında, şaşıtrıcı bir biçimde, bir çok ilacın en etkili olduğu tümörün bir hematolojik kanser olduğunu tespit ettik. Tablo 1a’da CCLE’de çalışılmış 24 ilaçtan 17 tanesinin (%68) tüm kanserler arasında en çok etkili oldukları kanserin bir hematolojik kanser olduğu görülmektedir. Benzer şekilde CGP için de, 103 ilaçtan 38’i (%37) yine bir hematolojik kanser için en etkili görünmektedir (Tablo 1b). Bu en etkili ilaçlar incelendiğinde, bazı tümörlerde bir temel yolağının, diğer TABLO 1a: CCLE veritabanındaki ilaçların en etkili olduğu kanser türleri. Kanser Türü KML İlaçlar İlaç Hedefi AZD6244 MEK AZD0530 Nilotinib PD-0325901 PF-2341066 Sorafenib ZD-6474 AML MM DBL T-ALL B-ALL Panobinostat RAF265 TKI258 AEW541 PD-0332991 TAE684 L-685458 Paclitaxel Irinotecan LBW242 Src, Abl/Bcr-Abl, EGFR Abl/Bcr-Abl MEK c-MET, ALK Flt3, C-KIT, PDGFRbeta, RET, Raf kinaz B, Raf kinaz C, VEGFR-1, KDR, FLT4 Abl, EGFR, Flt3, C-KIT, RT, VEGFR-1, KDR, FLT4 HDAC Raf kinaz B, KDR EGFR, FGFR1, PDGFRbeta, VEGFR-1, KDR IGF-1R CDK4/6 ALK Gama Sekretaz Beta-tübülin Topoizomeraz 1 IAP Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) HEMATOLOJİK KANSERLERDE MOLEKÜLER HEDEFLERE YÖNELİK İLAÇ TESPİTİ TABLO 1b: CGP veritabanındaki ilaçların en etkili olduğu kanser türleri. Kanser Türü KML İlaçlar İlaç Hedefi PF-02341066 MET, ALK Imatinib AZD-0530 SRC, ABL1 GNF-2 BCR-ABL Dasatinib A-770041 WH-4-023 ABL AMPK agonisti SRC, ABL, TEC PDGFR, KIT, VEGFR SB 216763 GSK3A/B GSK269962A ROCK Vinblastine Mikrotübüller AZD8055 PAC-1 Cytarabine Methotrexate AZD7762 CEP-701 MK-2206 Cyclopamine LFM-A13 Metformin BX-795 ZM-447439 IPA-3 KU-55933 SL 0101-1 MM SRC family, ABL Nilotinib Axitinib DBL SRC family ABL Bosutinib ALL ABL, SRC, KIT, PDGFR AP-24534 AICAR T-ALL ABL, KIT, PDGFR 681640 Temsirolimus mTORC1/2 CASP3 aktivatörü DNA sentezi Dihidrofolat redüktaz (DHFR) CHK1/2 FLT3, JAK2, NTRK1, RET AKT1/2 SMO BTK AMPK agonisti TBK1, PDK1, IKK, AURKB/C AURKB PAK ATM RSK, AURKB, PIM3 VEE1, CHK1 MTOR ATRA Retinoik asit ve retinoik asit X reseptör agonisti VX-702 p38 BI-D1870 RSK1/2/3/5, PLK1, AURKB Lenalidomide AML ABT-263 BL Roscovitine TNF alfa BCL2, BCL-XL, BCL-W CDKs bazılarında ise farklı yol ağlarının tümörleşmeyle ilgili oldukları anlaşılabilmektedir. Örneğin, KML’de en etkili ilaçların BCR-ABL yolağındaki proteinleri (BCR-ABL, RAF, SRC gibi), PI3K yol ağı elemanı mTOR ve GSK’yi Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) Murat İŞBİLEN ve ark. inhibe ediyor oldukları, keza mTOR inhibitörü AMPK agonisti bir ilacın bu listede olması şaşırtıcı olmayıp KML’nin daha ziyade homojen ve aynı yol ağındaki bozulmalar ile ilişkili olduğu teyit edilmiş görünmektedir. Ancak bu listede etki mekanizmaları örtüşen ilaçlar olmakla birlikte, bazılarının diğerlerine göre özellikle etkin olduğu görünmektedir. Örneğin, Nilotinib KML icin, hematolojk kanserler dahil, diğer tüm kanserlerden daha etkin görünmektedir (Şekil 1A). Bir ilacın bir tümör cinsi için bu derece belirgin farkla etkin olduğu kayda değer sayıda sonuç elde ettik. Başka bazı ilaçların ise hemen her hematolojik kanser için etkili olabileceğini tespit ettik. Örneğin, metotreksat, en çok T-ALL’ye etkili görünmekle birlikte, diğer hematolojik kanserler için de etkili görünmektedir (Şekil 1B). Diğer yandan, MM için en etkili ilaçların hedefleri KML’de olduğu gibi tirozin kinaz yol ağı elemanları IGF-1R, MAPK (p38) ve mTOR olmakla birlikte, TNF ve Retinoik asit inhibitörlerinin de bu kanserde en etkin ilaçlar listesinde olması, tümörün KML’ye göre daha heterojen olduğunu göstermektedir. Ayrıca myelomların bir kısmında görülen ve siklin genlerini etkileyen translokasyonlar ışığında, CDK4/6 inhibitörü PD-0332991’in de bu listede bulunuşu literatür ile uyumludur.2 HEMATOLOJİK KANSERLERİN TRANSKRİPTOMİK SINIFLANDIRMAYLA TESPİT EDİLEN ALT GRUPLARININ İLAÇ HASSASİYET PROFİLLERİ Hematolojik kanserlerde varlığı bilinen heterojeniteyi transkriptomik bir analiz ile tespit edebilmemiz halinde klinikopatolojik sınıflamaya göre daha homojen hücrelerden oluşan ayrımlar ve buna bağlı olarak da, daha net ilaç hassasiyet profilleri oluşturabileceğimizi öngördük. Bu amaç doğrultusunda CCLE veritabanındaki tüm hematolojik kanser kökenli hücre hatlarını ifade değeri bakımından standart sapması en yüksek 319 gen’e karşılık gelen 400 probset’i kullanarak bir kümeleme analizine tabii tuttuk. Sonuçlarımız CCLE veritabanındaki 10 değişik hematolojik kanserin, bu genler bakımından sadece 8 gruba ayrıldıklarını gösterdi (Şekil 2). Aynı probsetleri kullanarak CGP’de de bir kümeleme analizi yaptık. CCLE ve CGP’deki hücrelerin ancak %29’u ortak olmakla birlikte, her iki veritabanında bu kümeleme analizi ile tanımladığımız gruplar arasında çok yüksek benzerlik olduğunu tespit ettik (Şekil 2). Bu şekilde, belirlediğimiz hücre alt gruplarının güvenilebilir bir ayrım yapabildiği kanaatini edindik. Sekiz alt grup incelendiğinde ilginç gözlemler yapılabilmektedir. Örneğin birinci gruba (G1) hem CCLE hem CGP’de AML hücre hatlarının çoğu girmekle birlikte, KML ve 3 Murat İŞBİLEN ve ark. HEMATOLOJİK KANSERLERDE MOLEKÜLER HEDEFLERE YÖNELİK İLAÇ TESPİTİ ŞEKİL 1: Hematolojik kanserlere etkin ilaçlara iki örnek. KML’ye en etkili olduğunu saptadığımız ilaçlar arasından Nilotinib’in CCLE’de elde edilmiş sitotoksisite bilgisi etkinlik alanı (activity area) cinsinden tüm kanserler için gösterilmektedir (A). Artan değerler hassasiyet artışına karşılık gelmektedir. Birçok hematolojik kansere etkili ilaçlara bir örnek Metotrexat, CPG’de elde edilmiş IC50 değerleri cinsinden tüm kanserler için gösterilmektedir (B). Küçük değerler hassasiyet ifade etmektedir. Grafikler, her tümöre ait bütün hücre hatlarından elde edilen ortalama, %75 içi (kutu), %95 içi (kesik çizgiler) ve dışındaki (açık halkalar) değerleri göstermektedir. Hematolojik kanserler alt gruplarına göre renklendirilmiştir. (Renkli hali için Bkz. http://www.turkiyeklinikleri.com/journal/hematoloji-ozel-dergisi/1308-1160/) ŞEKİL 2: CCLE verisetindeki hematolojik kanser hücre hatlarının transkriptomik hiyerarşik kümeleme analizi ve grupların tutarlılığı. CCLE’deki tüm hematolojik kanser hücre hatlarının varyasyonu en yüksek 400 probset ile kümeleme analizi (A) ve hücre hatları için elde edilen dendogram (B). Dendogramdan, bu genler ile tüm hücrelerin 8 gruba ayrildiklari görülmektedir. Aynı 400 probset ile CGP hematolojik kanser hücre hatları da 8 gruba ayrılmakta ve her iki veritabanındaki hematolojik kanser transkriptomik alt grupları karşılaştırıldıklarında çok yüksek oranda konkordans görülmektedir (C). Renkler Pearson’un korrelasyon katsayısının 1’e ne kadar yakın (kırmızı) veya uzak (siyah) olduğunu göstermektedir. (Renkli hali için Bkz. http://www.turkiyeklinikleri.com/journal/hematoloji-ozel-dergisi/1308-1160/) hatta DBL hücre hatlarının da bir kısmı dahil olmaktadır (Şekil 3). B-ALL hücre hatlarının önemli bir kısmı G5 grubundayken, KML hücrelerinin de bir kısmı bu gruptadır. Bu gruplar temelinde yaptığımız ilaç hassasiyet analizleri sonucunda önceki analizimizden farklı birçok ilacın hematolojik kanser transkriptomik alt gruplarına (HKTAG), klinikopatolojik gruplamaya göre 4 daha etkin olduğunu tespit ettik (Tablo 2). Örneğin, bir ALK inhibitörü olan TAE684 ancak CCLE’de MM için en etkili bir ilaç iken, çoğunu MM hücre hatlarının teşkil ettiği G7 grubuna daha etkin görünmektedir. Aynı ilaç, içinde HL’ların bulunduğu G6 grubuna da en etkin ilaçlardan biridir. Benzer şekilde bir PKC inhibitörü olan Bryostatin’in, G2 grubundaki AML ve KML hücre Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) HEMATOLOJİK KANSERLERDE MOLEKÜLER HEDEFLERE YÖNELİK İLAÇ TESPİTİ Murat İŞBİLEN ve ark. ŞEKİL 3: Hematolojik kanser transkriptomik alt grupları-nın içerikleri Belirlenen 8 grubun CCLE ve CGP veritabanların-daki hematolojik kanser alt tipleri içerisindeki yüzdelik dağılımları. Her bir renk grafiğin altında gösterilen gruplara karşılık gelmektedir. (Renkli hali için Bkz. http://www.turkiyeklinikleri.com/journal/hematoloji-ozel-dergisi/1308-1160/) hatlarına en etkin ilaçlardan biri olduğu tespit edilmiştir (Tablo 2). GEREÇ VE YÖNTEMLER Tüm analizler CCLE (http://www.broadinstitute.org/ ccle) ve CGP (http://www.cancerrxgene.org) veritabanlarındaki, sırasıyla 916 ve 727 hücre hattı için, gen ifade ve ilaç hassasiyet bilgileri kullanılarak yapılmıştır. GEN SEÇİMİ VE HİYERARŞİK KÜMELEME ANALİZİ CCLE (GSE36133) ve CGP (E-MTAB-783) mikrodizi verisetindeki tüm degerleri BRB Array Tools programı kullanılarak RMA yöntemi ile normalize ettik. CCLE verisetindeki hematolojik kanser hücre hatlarında standart sapması en yüksek 1000 probseti ile Öklit uzaklığı (Euclidean distance) tabanlı tam bağlamalı (complete linkage) hiyerarşik kümeleme analizi yaptık. “Within Cluster Sum of Square” küme içi hata hesaplama yöntemiyle doğru küme sayısını 9 olarak belirledik. 1000 probsetten bu kümeleri iyi ayıramayanları elemek amacıyla, her bir kümeyi tek başına ayıran genler hariç diğerleri analizlerden çıkardık. Bu seçimi yapmak için her Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) hücre hattına, belirlenen kümenin içerisindeyse 1, değilse 0 değerleri atayıp, her bir probsetin bu değerler ile Pearson r katsayı değerini hesapladık. Pearson r katsayı değeri herhangi bir küme için 0.5 ve üzerinde olan 400 adet probseti ileriki analizler için seçtik. Bu probsetleri kullanılarak tekrar Öklit uzaklığı tabanlı tam bağlamalı hiyerarşik kümeleme analizi yapılarak, küme içi hata hesaplaması sonucunda 8 adet küme belirledik. Çalışmamızdaki tüm analizler bu 8 küme temelinde yapılmıştır. KUTU GRAFİKLERİ CCLE ve CGP veritabanlarındaki bütün kanser türlerine ait hücre hatları için ilaç hassasiyet değerlerinin dağılımları her bir ilaç için R programlama dili kullanılarak kutu grafikleri ile ifade edilmiştir. Her bir kanser türü, hematolojik kanser alt tipi ve hematolojik kanser grupları için bir kutu grafiği çizilmiş, hematolojik kanser alt tipleri ve grupları için kutu grafikleri renklendirilmiştir. CCLE VE CGP VERİTABANLARINDA KÜMELERİN UYUMU CCLE ve CGP veritabanlarındaki kümelerin uyumunu tespit edebilmek için daha önce yayınlanmış bir algoritmayi temel aldık.6 Her iki veritabanına ortak hücre hat- 5 Murat İŞBİLEN ve ark. HEMATOLOJİK KANSERLERDE MOLEKÜLER HEDEFLERE YÖNELİK İLAÇ TESPİTİ TABLO 2a: CCLE alt tiplerinde standart medyan AA* ilaç hassasiyet değerleri. Alt Tip Sorafenib RAF265 B-ALL -0,494 -1,715 BL -1,841 HL 1,243 2,420 AML KML 2,572 MM Grup TAE684 0,865 -0,068 -0,282 -1,117 -2,015 -0,700 -1,571 -1,404 -2,029 1,810 -0,073 0,045 -0,681 0,984 2,345 -0,662 0,734 3,247 -1,236 Nutlin-3 AZD6244 AEW541 TAE684 -1,721 1,998 -0,204 2,355 -0,636 1,405 -0,717 1,312 -1,053 G4 1,516 0,766 0,686 -0,936 -0,428 G6 1,550 -1,192 0,199 -0,201 G8 -0,401 -0,958 0,086 -1,128 Alt Tip ALL - - 0,807 0,732 AZD6244 TAE684 AZD8055 -1,663 -2,005 -0,750 -0,806 0,102 -1,041 0,014 -1,614 -0,132 -1,690 DBL -0,008 -1,393 0,972 -1,566 -0,207 -2,124 BL KML 0,194 0,189 HL -0,703 T-ALL 0,950 MM Grup G1 G2 G3 G4 0,696 0,259 0,800 0,036 0,295 - 2,036 1,056 0,369 -2,131 -0,286 -0,488 1,307 -1,107 -0,437 Bryostatin-1 CGP-082996 0,267 -0,800 0,290 -0,440 0,896 0,712 0,756 -0,571 1,021 -0,427 -0,832 -0,955 - 2,864 -0,731 -0,328 -2,799 - -0,278 - -0,957 - Bryostatin-1 CGP-082996 0,291 - 0,727 - CI-1040 -3,458 -0,884 - -0,426 -0,211 1,192 -0,759 1,390 -0,763 -0,212 0,708 -2,000 -0,642 -1,637 1,014 -0,982 -0,545 0,159 0,822 -1,385 - 1,292 1,480 0,821 0,170 0,637 - 1,042 0,867 0,028 -0,490 0,807 0,199 -1,357 -2,067 0,405 -1,141 1,217 0,834 1,312 -1,751 0,002 -0,858 -0,964 2,094 0,035 KU-55933 PHA-665752 0,761 0,384 - - 1,020 1,010 -0,087 -1,019 1,515 0,729 -1,699 -0,880 -1,826 - 1,894 0,205 0,317 - 0,849 -1,371 1,567 -1,911 GDC0941 RDEA119 ZM-447439 2,756 -1,728 -0,660 -0,994 - 1,243 0,612 -2,013 0,896 0,366 0,910 1,960 0,478 TABLO 2d: CGP gruplarında standart medyan log(IC50) ilaç hassasiyet değerleri. -0,598 0,375 -1,454 -1,239 -1,363 -0,303 -0,770 -0,227 0,960 0,025 0,282 0,384 -1,947 1,261 0,003 -0,582 0,829 ZM-447439 1,450 1,393 0,000 0,760 RDEA119 -0,365 -1,723 -1,507 G7 -1,550 GDC0941 -0,959 0,778 -2,139 -0,464 -0,659 0,363 1,454 -0,243 1,646 1,505 -1,415 KU-55933 PHA-665752 -0,358 0,484 -0,523 -0,420 -0,278 0,505 -2,119 1,029 -0,928 -1,290 AZD8055 - 1,531 2,572 -0,639 -1,146 TAE684 - -1,142 -0,837 1,741 AZD6244 -0,848 -0,404 -2,532 - 0,444 CI-1040 0,595 -0,171 0,756 Nutlin-3a -1,316 -0,733 G8 - 0,601 0,088 - 3,328 -0,842 Sorafenib G5 G6 -0,125 0,456 0,270 1,223 - TABLO 2c: CGP alt tiplerinde standart medyan log(IC50) ilaç hassasiyet değerleri. Nutlin-3a -0,978 - 3,363 -1,248 AML B-ALL - 2,467 0,043 Sorafenib -0,110 RAF265 -1,043 G7 2,767 -0,496 G2 G5 -0,054 TABLO 2b: CCLE gruplarında standart medyan AA* ilaç hassasiyet değerleri. 3,261 G3 0,583 -0,092 -0,278 0,403 2,133 -1,084 -1,007 0,248 0,733 Sorafenib 2,177 -0,489 -0,556 1,521 G1 AEW541 -0,644 1,229 T-ALL AZD6244 0,069 1,319 0,377 DBL Nutlin-3 1,864 -0,416 -0,853 -2,077 - -1,855 - 1,515 -2,423 0,368 -1,485 0,961 2,012 1,784 -1,742 0,662 -0,242 CCLE ve CGP alt tiplerinde ilaç hassasiyet değerlerinin klinikopatolojik alt tiplerde ve bu çalışmada oluşturduğumuz gruplarda karşılaştırılması. Her bir alt tipin ve belirlenen grupların ilaçlar için hassasiyet değerleri standardize medyan cinsinden verilmiştir (gereçler ve yöntem kısmına bakınız). Kırmızı kutular, transkriptomik gruplar için, klinikopatolojik sınıflandırmadan daha iyi sonuçlar elde ettiğimiz durumları ya da tersi durumları göstermektedir. Siyah kutular ise, kırmızı kutuların içerdiği orenkleri en fazla içeren ve dolaysıyla karşılaştırma yapılan grup ya da alt tipleri göstermektedir. Kesik çizgili kutular ise, kırmızı veya siyah kutuların belirlemediği ancak o ilaç için en iyi hassasiyet değerini veren grubu ya da alt tipi göstermektedir. * AA: Etkinlik Alanı (Activity Area) (Renkli hali için Bkz. http://www.turkiyeklinikleri.com/journal/hematoloji-ozel-dergisi/1308-1160/) 6 Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) HEMATOLOJİK KANSERLERDE MOLEKÜLER HEDEFLERE YÖNELİK İLAÇ TESPİTİ ları için seçtğimiz 400 probsetin ifade değerlerinin her bir küme için medyan değerlerini Pearson r katsayısı kullanılarak karşılaştırdık. CCLE veritabanındaki her bir küme için bütün probsetlerin medyan değerlerini belirledik ve bu sayede 400 probsetin her biri için 8 adet medyan değeri hesapladık. CGP için de aynı işlemi tekrarlayıp 400 probsetten bu veritabanında bulunanlar (274 adet) için 8 adet medyan değeri hesapladık. Daha sonra bu medyan değerlerini her bir küme için Pearson r katsayı değerlerini hesaplayarak karşılaştırdık. İLAÇ HASSASİYET KARŞILAŞTIRMASI VE STANDART MEDYAN HESAPLANMASI CCLE ve CGP veritabanlarındaki her bir ilaç için her bir kanser çeşidinin ilaç hassasiyet değerlerinin medyan değerlerini hesapladık. Bu değeri, tüm kanserler için elde edilen değerlerin medyanına göre kullanarak standardize ettik. Her ilaç için kanserlerin standardize medyan değerlerini, kansere özgü ilaç hassasiyet medyan değerinden tüm kanserlerin ilaç hassasiyet medyanlarının ortalamasını çıkartıp tüm kanserlerin ilaç hassasiyet medyanlarının standart sapmasına bölerek elde ettik. Bu standart medyan değerlerini her kanser türünün diğer kanser türlerine göre ilaç hassasiyet ölçüsü olarak kullandık. TARTIŞMA Bu çalışmada çok yeni iki veri tabanının belli bir tür kanser için uygun kemoterapötik ajan tespiti için nasıl kullanılabileceğine örnek bir yaklaşım tanimladık. Yaklaşımımızın, klinik kullanımda olmayan ancak olması halinde yarar elde edilebilecek ilaçların tespiti için çok önemli olduğuna inaniyoruz. Ancak bu veya benzeri yöntemlerle buluncak ilaçlar için bir sonraki aşama doğrulama deneyleri olmalıdır. Bu çalışmadan da görüleceği üzere, iki veritabanında birden çalışılmış bazı ilaçlar için ayrı sonuçlar elde edilebilmektedir. Örneğin Nutlin-3a, 1. 2. 3. Tuncer AM. Türkiye'de Kanser Kontrolü. TC Sağlık Bakanlığı. Ankara: Onur Yayınevi; 2007. Tao J, Sotomayor E. Hematologic Cancers from Molecular Pathobiology to Targeted Therapeutics Cancer Growth and Progression. Volume 14. Dordrecht: Springer; 2012. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by Murat İŞBİLEN ve ark. CGP’deki sonuçlar ışığında AML için çok uygun bir ilaç gibi görünürken, CCLE veritabanındaki AML hücrelerine çok az etkili görünmektedir (Tablo 2). Bu tür tutarsızlıkların bir kısmı bu çalışmada yaptığımız gruplama temelli yaklaşım ile kısmen çözülmektedir. Örneğin Nutlin-3a, her iki veritabanında da tespit ettiğimiz beşinci gruba (G5) son derece etkili görünmekte, dolaysıyla ilacın etki ettiği gruplarda tutarlılık oluşturulabilmektedir. Ancak, gruplama yöntemimizin da yetersiz kaldıgı durumlar tespit edebildik. Örneğin, TAE684, CCLE’ye göre 6. gruba, CGP’ye göre 7. gruba bilhassa etkili görünmektedir. Böyle tutarsız sonuçların sebepleri literatürde derinlemesine tartışılmış ve tutarlılık için en önemli kıstasın sitotoksisite ölçüm yöntemi olduğu tespit edilmiştir.7 Ancak, bu ikinci ve daha önemli bir soruyu, hangi sitotoksisite yönteminin in vivo sitotoksik yanıtı en iyi yansıttığı, sorusunu oluşturmaktadır. Bu sorunun da cevabı doğal olarak ancak in vivo doğrulama deneyleri ile verilebilir. Çalışmamızda oluşturduğumuz hematolojik kanser alt gruplarını transkriptomik bir yöntemle elde ettik. Bu yöntemin avantaji, klinikte de kullanılabilecek biyogöstergelerin tespit edilmiş olmasıdır. Böyle biyogostergeler, klinikte tümör siniflandirilmasinda yardımcı olabilecekleri gibi, tümör biyolojisinin aydınlanmasını da mümkün kılabilir. Örneğin 6. grubu belirleyen temel genler kanser-testis antijen genleri, 1. grubu ise ifadesi artmış mezenkimal genler tanimlamaktadir. Dolaysıyla 6. grup tümörler kanser-testis antijenlerine yönelik immunoterapi adayları olabilecek iken, 1. grup tümörler in vivo farklilasmaya cevap sonucu kontrol altına alınabilecek tümörler olabilir. Teşekkür Seçil Demirkol ve Kerem Mert Şenses’e çalışmamızı eleştirsel bir yaklaşımla gözden geçirdikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma TÜBİTAK BİDEB tarafından M.İ.’ye verilen bir burs ile desteklenmiştir. KAYNAKLAR 4. 5. Turkiye Klinikleri J Hematol-Special Topics 2014;7(1) gene expression profiling. Nature 2000;403 (6769):503-11. Barretina J, Caponigro G, Stransky N, Venkatesan K, Margolin AA, Kim S, et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature 2012;483(7391):603-7. Garnett MJ, Edelman EJ, Heidorn SJ, Greenman CD, Dastur A, Lau KW, et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature 2012;483(7391): 6. 7. 570-5. Widmer DS, Cheng PF, Eichhoff OM, Belloni BC, Zipser MC, Schlegel NC, Javelaud D, Mauviel A, Dummer R, Hoek KS. Systematic classification of melanoma cells by phenotypespecific gene expression mapping. Pigment cell & melanoma research 2012;25:343-53. Haibe-Kains B, El-Hachem N, Birkbak NJ, Jin AC, Beck AH, Aerts HJ, et al. Inconsistency in large pharmacogenomic studies. Nature 2013;504(7480):389-93. 7