İnvazif Mantar Enfeksiyonlarında Diğer Tanı Yaklaşımları Dr Beyza Ener Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi 12.02.2014 Enfeksiyon Hastalıklarında (Mantar Enfeksiyonu) Etiyolojik Tanı • • • • • • Mikroskobik inceleme ile etkeni gösterme Besiyerlerinde etkeni üreterek çoğaltma ve gösterme Antijen-antikor reaksiyonları ile gösterme Metabolit-substrat ilişkisi ile gösterme Yeni yöntemlerle proteinleri gösterilmesi (proteomiks) Nükleik asitleri kullanarak etkeni gösterme (DNA’nın anlaşılması ve gen dizilerinin öğrenilmesi) Proteom analizi • Gaz-likit kromotografi klasik 2D-PAGE ve MS • MALDI-TOF gibi yeni yöntemler • Daha çok identifikasyonda kullanılmakta • Ancak direkt kullanımı ile ilgili yayınlar Tanıda Nükleik Asitler • Hibridizasyon • Amplifikasyon Hibridizasyon Filter (Yüzey) Hibridizasyon (DNA Micro Array) Amplifikasyon Yöntemleri • «Polimarase chain reaction» (PCR=PZR) • Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) – İzotermal RNA amplifikasyon yöntemi – Viral hastalıkların tanısı – Mantarlarla ilgi az veri var PCR • • • • Klasik PCR PCR-ELISA Nested PCR Real-time PCR – TaqMan – FRET Yaklaşık 20 yıldır çalışılıyor PCR için Örnek Seçimi • • • • Bronkoalveolar lavaj (BAL) Steril vücut sıvıları (BOS vb.) Doku Kan fraksiyonları (serum, plazma, tam kan) – Tam kan=serum/plazma • Costa C, et al. Real-time PCR coupled with automated DNA extraction and detection of galactomannan antigen in serum by enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of invasive aspergillosis. J Clin Microbiol 2002; 40: 2224–27. – Tam kan>serum/plazma • Loeffler J, et al. Comparison between plasma and whole blood specimens for detection of Aspergillus DNA by PCR. J Clin Microbiol 2000; 38: 3830–33. – Anti-koagulan inhibisyonu – Örnek miktarı – Örneğin nakli DNA ekstraksiyonu • Yeterli konsantrasyonda ve iyi kalitede DNA elde edebilmek • Kandaki miktar az • Kandioz > Aspergilloz • Aspergilloz’da <10 CFU/ml • Kontaminasyon önemli (yaklaşık %3) • Negatif ve pozitif ekstraksiyon kontrollü kullanmak gerekir DNA ekstraksiyonu • Farklı yöntemler – In-house yöntemler – Ticari kitler • Qiagen QIAmp Tissue Kit [Hilden, Germany] • ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (Zymo Research) – Otomatik ticari teknikler • MagNA Pure LC (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) • Eritrosit ve lökositlerin eritilmesi • Hücre duvarının uzaklaştırılması • Hücre zarının uzaklaştırılması • Proteinlerin çöktürülerek uzaklaştırılması ve DNA’nın saflaştırılması • Saflaştırılan DNA’nın toplanması DNA ekstraksiyonu • Hücre duvarının uzaklaştırlması – Kimyasal • Dilue alkalide kaynatma – Enzimatik • Zymolase • Rekombinant lyticase – Mekanik • • • • Cam boncuklar Donma-çözme Sonikasyon Likit nitrojende parçalama – Enzimatik-mekanik DNA ekstraksiyonu • Hücre zarının uzaklaştırılması – sodium dodecyl sulphate, beta-mercaptoethanol, EDTA • Proteinlerin çöktürülerek uzaklaştırılması ve DNA’nın saflaştırılması – Phenol-chloroform • Saflaştırılan DNA’nın tutulması – Alkol, magnetik boncuklar vs Hedef Seçimi • rRNA operonu – Hem korunmuş hem değişken dizileri bulundurur – Gen bankalarında bu bölge dizilerine ulaşmak kolay – Çok tekrarı var (102 kopya/hücre) • tRNA ve sitokrom b kodlayan mitokondri genleri Hedef Seçimi • 18S rRNA bölgesi pan-fungal – İnsan 18S rRNA ile homology – Yalancı pozitif /yalancı negatif reaksiyonlar – Block-based/Sybr Greenbased – Uygun probe gerektirir • 28S rRNA bölgesi cinse özgü primer • ITS bölgeleri daha çok türe özgü – Identifikasyonda Genel yaklaşım pan-fungal primer kullanıp, cins ya da türe özgü probe ile tanımlama yapmak UK-Irish Fungal PCR Consensus Group White PL et al. A Consensus on Fungal Polymerase Chain Reaction Diagnosis? JMD 2006; 8: 376-384 • 2001 yılında 7 merkez ile kuruluyor • IFI tanısında güvenilir ve tekrarlanabilir PCR temelli bir yöntem oluşturmak • Kullanılan moleküler yöntemlerin çok merkezli olarak denenmesi için kontrol panelleri oluşturularak merkezlere dağıtılıyor • Farklı ekstraksiyon yöntemleri • Candida için 3 farklı, Aspergillus için 5 farklı amplifikasyon yöntemleri deneniyor • Tam kanda miktarları belirlenmiş (0-105) Candida blastosporlar • Tam kanda miktarları belirlenmiş (0-105) Aspergillus konidyaları • Aspergillus DNA’sı • • • LightCycler (LC; Roche, Lewes, UK) Corbett Rotor-Gene (CR; Corbett Research LTD, Cambridge, UK) TaqMan (TQ; Applied Biosystems, Warrington, UK) UK-Irish Fungal PCR Consensus Group White PL et al. A Consensus on Fungal Polymerase Chain Reaction Diagnosis? JMD 2006; 8: 376-384 • Ekstraksiyon yöntemlerinden Loeffler ve ark tarafından geliştirilen mekanik veya enzimatik olarak hücre duvar yıkımı yapan yöntem • Tam kan gönderilerek yapılan deneylerde • Candida için denenen bütün ekstraksiyon ve amplifikasyon yöntemleri benzer • 10 CFU/ml belirleyebiliyor • Aspergillus testlerinde farklı sonuçlar alınıyor • Ekstrakte edilmiş DNA yollanıyor • İki yöntem öne çıkıyor • Aspergillus primer + Aspergillus spesifik LC hidroliz probu • Pan-fungal primer + Aspergillus spesifik TQ hidroliz probu UK-Irish Fungal PCR Consensus Group White PL et al. A Consensus on Fungal Polymerase Chain Reaction Diagnosis? JMD 2006; 8: 376-384 LC (7 merkez ) RG (3 merkez) TQ (2 merkez) Pan-fungal primer (18S rRNA) Aspergilus özgül TQ hidroliz probe >500 konidya/ml 25-50 konidya/ml 10-20 konidya/ml Aspergilus özgül primer (28S rRNA) Aspergilus özgül LC hidroliz probe 100 konidya/ml 25 konidya/ml 10 konidya/ml UK-Irish Fungal PCR Consensus Group Önerisi European Aspergillus PCR Initiative (EAPCRI) çalışma grubu [International Society for Human and Animal Mycoses (ISHAM)] • 2006 yılında kuruluyor • Avrupa’dan, orta doğu ve Avustralya’dan katılan merkezler • Standart Aspergillus PCR yöntemi geliştirmek • Bu yöntemin klinik çalışmalarla validasyonunu sağlamak • EORTC/MSG tanı kriterlerine alınmasını sağlamak • 8 çekirdek laboratuvar, 16 yeni laboratuvara kalite kontrol panelleri gönderiliyor • İki kez tam kan kan panelli (2007 ve 2008), bir kez DNA panelli gönderiliyor • 11 farklı PCR protokolü uygulanıyor • DNA panelleri ile çok uyumlu sonuç alınıyor • Ancak tam kan kullanıldığında uyum %50 azalıyor • Ekstarksiyon yöntemi önemli • >3ml EDTA’lı tam kan • Eritrosit ve lökositlerin parçalanması • Seramik ya da asit ile yıkanmış cam boncuklarla (710-1180µm) hücre duvarı uzaklaştırılması • Ticari kitler DNA’nın purifikasyonu için kullanılabilir • Negatif ve pozitif kontrollerin kullanılması • Amplifikasyon yöntemi çok önemli değil Moleküler Tanı • Bütün dünyada tek bir PCR formatının kullanılması gerçekçi değil. • Minimal information for publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE) • Herhangi bir real-time quantitative PCR (qPCR) deneyi tasarlama ve uygulayarak raporlama için gerekli fikir ve öneri oluşturmak. Böylece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak Candida enfeksiyonlarında Ticari PCR Sistemi (Septifast) • Sepsisli hastalarda hızlı tanıya yönelik test • Kandidemileri de saptayabiliyor • Ancak çok az sayıda veri var • ECIL tarafından tanıda kullanılması önerilmiyor Candida PCR meta analiz • Avni T et al. JCM 2011 meta analiz • Toplam duyarlılık %95, toplam özgüllük %92 olarak bulunmuş • Proven/probabale hastalarda %85 pozitiflik • Kan kültürü %29-46 Aspergillus PCR meta analiz • Meta analiz – Mengoli C, et al. Lancet Infect Dis 2009 • Duyarlılık %75, Özgüllük %87 Meta analizler Duyarlılk Özgüllük Galaktomannan %78 %81 BDG (Aspergillus) %77 %85 PCR (Aspergillus) %75 %87 Mannan-Antimannan %83 %86 BDG (Candida) %64 %84 PCR (Candida) %95 %92