DNA Ekstraksiyonu - Adnan Menderes Üniversitesi

Adnan Menderes Üniversitesi
Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü
TBY 118
Muavviz Ayvaz
(Yrd. Doç. Dr.)
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü
Laboratuvar
Tekniği
5. Hafta (14.03.2014)
1
5. Haftanın Ders İçeriği
• DNA ekstraksiyonu
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• DNA ekstraksiyonunun amacı
• DNA ekstraksiyon protokolü basamaklarının ve her
aşamanın kimyasal süreç analizi
2
5. Haftanın Ders İçeriği
DNA ekstraksiyonunun amacı;
DNA İzolasyonu;
Organizmaların hücre yapılarında bulunan hücre
zarı , çeperi gibi yapıların bazı kimyasal maddeler
ve enzimler yoluyla yıkılarak DNA’ nın elde
edilmesine DNA izolasyonu denir.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA; PCR, dizilime vb. araştırmalarda
kullanılmak üzere saflaştırılarak elde edilmesi
gereklidir.
3
DNA Ekstraksiyonu
DNA ekstraksyion protokolü
1) Hücre içeriğinin açığa çıkması (Lizis) ve DNA’nın
çözülmesi
2) Enzimatik yada kimyasal metodlarla
proteinlerin, RNA ve makromoleküllerin
uzaklaştırılması
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Birçok DNA ekstraksiyon protokolü iki aşamadan
oluşur.
4
DNA Ekstraksiyonu
Hücrenin DNA’sının diğer tüm kısımlardan ayırarak
saflaştırmak için 4 basamaklı bir yol izlenir.
1) Hücre içeriğinin açığa çıkması (Lizis)
2) Çöktürme (Presipitasyon)
3) Yıkama
4) Resüspansiyon
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Bitkilerin çekirdek yapısı “çekirdek membranı” ile
çevrilidir. Çekirdek membranından sonra “ hücre
membranı ” ve “ hücre çeperi ” vardır.
5
DNA Ekstraksiyonu
Laboratuvarındaki” DNA ekstraksiyon
yöntemlerinin karşılaştırılması
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
“Araştırma Laboratuvarı” ve “Sınıf İçi Uygulama
6
Araştırma Laboratuvarı DNA Ekstraksiyon
Yöntemi/Protokolü
1) Lizis: Sıvı Azot (N2) da öğütme ve deterjan
kullanma
2) Presipitasyon 1. Kısım: Proteinlerin
uzaklaştırılması için fenol/klorofom ektraksiyonu
 Sıvı faz (Nükleik asitler)
 Fenol faz (proteinler)
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA Ekstraksiyonu
7
DNA Ekstraksiyonu
3) Presipitasyon 2. Kısım: DNA’nın fosfat’larının su
ile hidrojen bağlarının bozunması için tuzların
ilavesi.
4) Presipitasyon 3. Kısım: DNA’nın ortamdaki
çözeltiden ayrılması için etanol ilavesi.
5) Yıkama ve resüspansiyon:
DNA etanol’de yıkanır, kurulanır ve
H2O yada TE tamponunda yeniden
resüspanse hale getirilir.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Araştırma Laboratuvarı DNA Ekstraksiyon
Yöntemi/Protokolü
8
Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarı DNA Ekstraksiyon
Yöntemi/Protokolü
1) Lizis: Havan ve havan eli ile deterjan kullanılır.
2) Presipitasyon 1. Kısım:
Kullanılmaz (Kimyasallar Tehlikelidir.)
3) Presipitasyon 2. Kısım: Su ve DNA’nın fosfat
molekülleri arasındaki hidrojen bağlarının
bozunması için tuz ilave edilir.
4) Presipitasyon 3. Kısım: DNA’nın ortam
çözeltisinden ayrılması için etanol ilave edilir.
5) Yıkama ve resüspansiyon: DNA etanolde yıkanır,
kurutulur ve H2O ve TE tamponu içinde yeniden
resüspanse hale getirilir.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA Ekstraksiyonu
9
DNA Ekstraksiyonu
a) Bitkilerden DNA ekstraksiyonunda hücre
çeperinin yıkılması ve hücresel membranların
yıkılması basamakları aşamasıdır
(plasma ve nükleer membranlar için önemli olan
basamak)
b) Hücre çeperi (selüloz yapılıdır) ve mekanik güç
uygulayarak bozunması sağlanır
(Örneğin yaprakların havan ve havan ile
öğütülmesi)
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
1) LİZİS
10
DNA Ekstraksiyonu
1) LİZİS devam;
• Deterjanlar membranları amphipatic (hem
hidrofobik hemde hidrofilik bölgeler) yapıları (hem
hücre membranlarının hemde deterjanların)
gereği bozabilirler. Deterjan molekülleri membran
tabakasını ayırabilirler.
• Lizis sonucu bitki hücrelerinin içeriği ortam
çözeltisine geçer.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
c) Daha sonra deterjan ilave edilerek hücre
membranları yıkılır.
11
2) Presipitasyon / Çöktürme
(Araştırma Laboratuvarı İçin)
• Araştırma laboratuvarında çöktürmenin ilk
aşaması fenol/kloroform kimyasalları ile
DNA’dan proteinlerin uzaklaştırılmasına yarar.
• Fenol proteinleri denatüre eder ve yapısını
çözer.
• Kloroformda bir protein denatürantıdır.
• Bu aşama öğrenci laboratuvarlarında
uygulanmamaktadır
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA Ekstraksiyonu
12
2) Presipitasyon / Çöktürme devam;
(Araştırma Laboratuvarı İçin)
• DNA çöktürmesindeki ikinci aşama Tuzların
ilavesidir.
• Tuzlar su ve DNA molekülleri arasındaki hidrojen
bağlarının bozar/kırar.
• DNA yeniden/ilave olarak protein yapılardan
isopropanol yada etanol ile uzaklaştırılır ve
çöktürülür.
• Katyonların varlığında etanol DNA moleküllerinin
topaklanması ve çökmesini sağlar.
• DNA santrifüjelenerek çökeltinin üzerindeki kısmı
atılır.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA Ekstraksiyonu
13
DNA Ekstraksiyonu
2) Presipitasyon / Çöktürme devam;
(Öğrenci Laboratuvarı İçin)
• Tuzlar su ve DNA molekülleri arasındaki hidrojen
bağlarının bozar/kırar.
• DNA yeniden/ilave olarak protein yapılardan
isopropanol yada etanol ile uzaklaştırılır ve
çöktürülür.
• Katyonların varlığında etanol DNA’da yapısal değişikler
yaparak, çözeltideki DNA moleküllerinin topaklanarak
çökmesini sağlar.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• Öğrenci laboratuvarında DNA çöktürmesi tuzların
eklenmesiyle başlar.
14
• Not: Bu protokolde Fenol/Kloroform kimyasalları kullanılmaması
nedeniyle öğrenci laboratuvarında izole edilen DNA, araştırma
laboratuvarlarında izole edilen DNA’lar kadar TEMİZ değildir.
3) Yıkama
Çöktürülen DNA asetat tuzları ile yüklüdür.
%70’lik etanol çözeltisi ile yıkanması tuzların ve
suda çözünen diğer safsızlıkların yıkanması/
uzaklaştırılması içindir.
4) Resüspansiyon
Temizlenen DNA tampon çözelti içinde uzun süreli
sabitliğini koruyabilmesi için resüspanse hale
getirilmelidir. Bu aşama için kullanılan tampon
çözelti TE resüspansiyon tamponudur.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
DNA Ekstraksiyonu
15
DNA Ekstraksiyonu
DNA çözeltisi
içindeki katı
maddeleri
santrifüjlenerek
uzaklaştırılır
DNA
çözdürülür.
İsopropanol
ile DNA
çöktürülür.
DNA
topakçıkları
etanol ile yıkanır
ve daha sonra
kurutulur.
DNA’dan
çözünmüş
tuzlar ve
şekerlerin
uzaklaştırması
için
santrifüjlenir.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Hücre
çeperi ve
membran
yapısı
parçalanır.
16
DNA’nın kalitesinin kontrol edilmesi
• Düşük kalitedeki DNA PCR’da iyi sonuç vermez.
• 10 µL DNA yı, 10 µL yükleme tamponu ile
karıştırınız.
• Karışımı %1’lik agaroz jele yükleyiniz.
• Sonuçları analiz ediniz.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• DNA’nın kalitesini aşağıdaki basit protokolü
uygularak bulabilirsiniz.
17
Araştırma Laboratuvarında DNA’nın
Kalitesi ile İlgili Beklenen Olası Sonuçlar
Yanda çeşitli bitkilerden
5 genomik DNA
örneğinin agaroz jeldeki
görüntüsü verilmiştir.
Bu şekilde net DNA
bantları araştırma
laboratuvarında optimal
koşullarda elde edilmiştir.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Yüksek moleküler ağırlıklı
DNA’nın temiz ve kalın
bantları net olarak
görülmektedir.
1 kbp ve
100 bp
kontrolbelirteci
5 farklı tahıl
türürüne ait
DNA örnekleri
18
Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarında DNA’nın
Kalitesi ile İlgili Beklenen Olası Sonuçlar
Belirteç
• Bu beklenen bir sonuç olmasına rağmen ekstrakte
edilen DNA PCR da çoğaltım için kullanılabilir haldedir.
A B C DE
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
• Protokolü uygulayarak
elde ettiğimiz agaroz jel
görüntüsü bir önceki
slaytta verilen optimal
şartlardaki bantlardan
farklı şekilde olur.
(Bantların temiz görüntü
vermeme nedeni
fenol/kloroform
basamağının öğrenci
laboratuvarında atlanmış
olmasıdır.)
A bantı: Arpa
B bantı: Mısır
C bantı: Yulaf
D bantı: Pirinç
E bantı: Buğday
19
Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarında DNA’nın
Kalitesi ile İlgili Beklenen Olası Sonuçlar
•
•
•
•
•
Belirteç
A B C DE
Arpa (A): Örnek sorunsuz
Mısır (B): Örnek sorunsuz
Yulaf (C): Örnek sorunsuz
Pirinç (D): Örnek sorunsuz
Buğday (E): Bu örnekte ciddi
şekilde bozunma vardır
ancak PCR’da çalışabilir.
Bununla beraber yeniden
ekstrakte edilmelidir.
• Özellikle buğday’da temiz bir bant görüntüsünün ortaya çıkmamasını
DNA’nın birçok iplikçiğe bölünmesi ile açıklanabilir (1000-10000 bp
aralığında)
• 100 ile 1000 bp temiz bantlar RNA’nın görüntülenebildiği aralıktır.
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Örneklerin analizi
20
ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji
Bölümü
Never Stop Thinking !
21

Download Report