KEMIJSKO-TEHNOLOŠKI FAKULTET U SPLITU Zavod za organsku tehnologiju Skripta za internu upotrebu VJEŽBE IZ BIOTEHNOLOŠKIH PROCESA Dr.sc. Branka Andričić, izv.prof. Split, 2006. SADRŽAJ Vježba 1. PROCES FERMENTACIJE KVASACA SOJA Saccharomyces........... 4 Vježba 2. IMOBILIZACIJA STANICA PEKARSKOG KVASCA NA ALGINATU……………………………………………………………. 8 Vježba 3. PRIPRAVA SIRA……………………………………………………... 12 Vježba 4. EKSTRAKCIJA DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE IZ PLODOVA BILJAKA (kivi, grašak, češnjak)………………………… 15 Vježba 5. SINTEZA BIODIZELA TRANSESTERIFIKACIJOM OTPADNOG JESTIVOG ULJA……………………………………………………… 18 6. METODE ODREðIVANJA FIZIKALNO-KEMIJSKIH KARAKTERISTIKA SIROVINA I GOTOVIH PROIZVODA…………… 22 6.1. ODREðIVANJE GUSTOĆE……………………………………... 22 6.2. ODREðIVANJE KISELINSKOG BROJA……………………….. 22 6.3. ODREðIVANJE PEROKSIDNOG BROJA……………………… 22 6.4. ODREðIVANJE KINEMATIČKE VISKOZNOSTI…………….. 23 6.5. ODREðIVANJE PLAMIŠTA…………………………………….. 25 I. PRIPREMA ZA VJEŽBE U LABORATORIJU • Detaljno pročitati tekst vježbe prije ulaska u laboratorij. • Ukoliko imate neka pitanja uvezi vježbe, zapišite ih i pitajte voditelja vježbi. Jednostavno pitanje može znatno skratiti vrijeme potrebno za izvoñenje vježbi. • Sve podatke zapisujte u bilježnicu. Ne koristite listove papira ili različite blokove jer se papiri lako zagube. • Napravite potrebne tablice i eventualno proračune za potrebne kemikalije kako bi prije započeli vježbe. • Operite laboratorijsko posuñe na kraju vježbi tako da je spremno za druge vježbe. Mnogi studenti nepotrebno troše vrijeme na pranje i sušenje posuña koje će im služiti samo da prokuhaju vodu. RAZMIŠLJAJTE! • Mnogi studenti se toliko žure završiti vježbu da zaborave zabilježiti važna zapažanja kao što su: vrijeme kad se nešto dogodilo, promjenu boje, endotermnu ili egzotermnu promjenu, promjenu agregatnog stanja, vrelište, talište, temperaturu u laboratoriju, itd. • Pogledajte rezultate! Izgledaju li logično za izvedenu vježbu? Ako sumnjate, ponovite dio vježbe. Najbolje se uči na vlastitim greškama. Ako i tada niste sigurni, pitajte voditelja vježbi ili laboranta. • Kad voditelj vježbi razgovara s drugim studentima, slušajte i vi, možda ćete čuti nešto što vam može pomoći. • Važno je znati što se smije, a što ne smije, iz sigurnosnih razloga, raditi u laboratoriju; ne samo zbog vaše osobne sigurnosti, već i zbog sigurnosti vaših kolega. 1 II. SAVJETI I MJERE OPREZA PRI RADU U LABORATORIJU • Koristiti zaštitne naočale. • Obavezno je nositi zaštitnu odjeću (bijeli mantil) radi zaštite ostale odjeće od kemikalija. • Dugu kosu treba zavezati kako ne bi došla u dodir s kemikalijama ili plamenom. • U laboratoriju je zabranjeno jesti, piti i pušiti. • Nikad ne raditi u laboratoriju bez nadzora ili znanja laboranta ili voditelja vježbi. • Doñite u laboratorij pripremljeni. Ako ne znate što treba raditi, pitajte voditelja vježbi ili laboranta. • Otvoreni plamen može se upaliti samo kad nema zapaljivih otapala u blizini (što u laboratoriju organske tehnologije znači skoro nikada). • Treba biti vrlo pažljiv pri rukovanju zapaljivim otapalima poput etera, acetona ili metanola. Nikad ne isparavati ova otapala iznad kuhala i sl. Koristiti zatvoreni sustav za isparavanje. • Nikad ne pipetirajte ustima. Postoji propipeta. Izbjegavajte udisanje kemikalija i ne mirišite kemikalije. • Zapamtite, VRUĆE posuñe izgleda kao i HLADNO. Pazite što uzimate u ruke. • Uvijek označite reagense u tikvicama, čašama i sl. Većina organskih kapljevina, vodene otopine kiselina i lužina prozirne su i bezbojne poput vode. • Organske kapljevine najbolje je mjeriti volumenom. Pomoću laboratorijskih priručnika s podatcima o gustoći lako im je odrediti masu. • Neke sintetičke tkanine mogu se oštetiti djelovanjem npr. acetona ili etilacetata. Čak i razrijeñena sumporna kiselina ošteti pamučne tkanine. Nemojte nositi svoju najbolju odjeću dok radite vježbe. • U hladilu hladna voda ulazi na dnu, a izlazi na vrhu. Ne pretjerujte s otvaranjem vode. Uvijek provjerite teče li voda prije nego uključite grijanje. • Pri destilaciji nikad ne isparavajte do suha. Ostatak može postati nestabilan i eksplodirati (pogotovo ako ste radili s eterom ili alkoholom koji stvaraju organske perokside). 2 • Kad provodite ekstrakciju sačuvajte oba sloja dok niste potpuno sigurni koji treba ostaviti, a koji odbaciti. • Nikad ne ostavljajte reakciju ili proces bez nadzora. Ukoliko morate izići, zamolite kolegu da pripazi. • Mnoge organske kemikalije ne miješaju se s vodom. Ne izlijevajte organske kemikalije u sudoper i druge odvode. Za to postoje posebne boce na kojima piše OTPAD. 3 Vježba 1. PROCES FERMENTACIJE KVASACA SOJA Saccharomyces cerevisiae Svrha vježbe: Prepoznavanje faza u razvoju kvasca. Praćenje kinetike rasta stanica kvasca. Odreñivanje optimalne količine supstrata. UVOD Kvasci soja Saccharomyces (pekarski i pivski kvasac) su jednostanični organizmi (gljivice) koji anaerobnom fermentacijom, tj. metabolizmom uz nedostatak kisika, vrše enzimsku konverziju glukoze u alkohol i ugljični dioksid. Za njihov rast i razmnožavanje neophodan je supstrat bogat glukozom, vlagom i aminokiselinama. U prirodi se uobičajeno nalaze na različitom lišću i plodovima biljaka. Veće količine kvasaca, za industrijsku primjenu, prireñuju se kultiviranjem na odgovarajućim hranljivim podlogama. Kvasci se razmnožavaju pupanjem ili dijeljenjem stanica. Rast kvasaca na nekom supstratu odvija se u nekoliko faza, slika 1.1. Broj stanica kvasca 3 4 5 2 1 Vrijeme, t Slika 1.1. Faze u razvoju kvasaca: 1. faza prilagodbe, 2. eksponencijalna faza, 3. post-log faza, 4. stacionarna faza, 5. faza ugibanja. U eksponencijalnoj fazi, u svakom trenutku od jedne nastaju dvije stanice kvasca, tj. ako se počne s jednom stanicom, u sljedećem trenutku bit će 2, zatim 4, pa 8 itd., što znači da broj stanica (X) raste eksponencijalno s vremenom (t). 4 Matematički, to se može opisati: dX/dt ∝ X (1) Povećanjem broja stanica povećava i njihov ukupan volumen te se tada broj stanica, X, može supstituirati volumenom stanica, V. Ako se znak proporcionalnosti iz prve jednadžbe zamijeni konstantom (µ) dobije se : dV/dt = µV (2) gdje µ označava specifičnu brzinu rasta i predstavlja brzinu kojom se pojedinačne stanice dijele. Pretpostavi li se da je µ konstantna te se integrira izraz (2) u vremenu izmeñu t0 i t1 kada je volumen stanica V0 i V1 dobije se : V1 t 1 1 ∫V V dV = µ t∫ dt 0 0 (3) ln V1 - ln V0 = µ (t1 – t0) (4) odnosno: Crtanjem ovisnosti ln V nasuprot vremenu t u eksponencijalnoj fazi rasta kvasca dobije se pravac čiji nagib, prema jednadžbi (4), odgovara specifičnoj brzini rasta µ, slika 1.2. ln V µ=nagib= [(lnV2-lnV1)/(t2-t1)] t2, lnV2 t1, lnV1 Vrijeme, t Slika 1.2. Grafičko odreñivanje specifične brzine rasta 5 Ako se specifična brzina rasta odreñuje za različite koncentracije supstrata, [S], dobije se u većini slučajeva Langmuirov tip grafa, slika 1.3. (Postoje i slučajevi kada zbog inhibicije rasta supstratom doñe do opadanja specifične brzine rasta s porastom koncentracije supstrata.) Koncentracija supstrata pri kojoj je specifična brzina rasta jednaka polovici svoje maksimalne vrijednosti naziva se konstanta zasićenja, Ks. µmax µmax/2 Ks [S] Slika 1.3. Ovisnosti specifične brzine rasta stanica o koncentraciji supstrata Matematički izraz za ovisnost specifične brzine rasta stanica o koncentraciji supstrata izveo je Jacques Monod i glasi: µ = µmaxS / (Ks+ S) (5) Rast stanica pekarskog kvasca lako je pratiti. Ukupna promjena volumena je rezultat povećanje broja stanica kvasca, ali i nastajanja ugljičnog dioksida. Ipak, praćenjem rasta kvasaca na prethodno opisani način moguće je dobiti uvid u faze razvoja kvasca te odrediti specifičnu brzinu rasta EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni pribor i materijal: - odmjerne tikvice - pekarski kvasac, suhi ili svježi - menzure - šećer (glukoza ili saharoza) - zaporna ura - brašno 6 Postupak U odmjernim tikvicama od 100 cm3 napraviti 2, 4, 5, 6, 8 i 10 %-tne otopine šećera (saharoze ili glukoze) u vodi (w/v). U menzuru od 100 ml uliti 20 cm3 otopine šećera, dodati 3,6 g svježeg kvasca te pažljivo promiješati. Može se dodati i 2g brašna jer je tada promjene lakše pratiti. Zabilježiti početni volumen i temperaturu u prostoriji. Svake 2 minute očitavati volumen. Mjerenje je završeno kada volumen počne opadati. Isti postupak ponoviti za preostale koncentracije supstrata. Prvi korak u obradi podataka je za svaku koncentraciju posebno nacrtati krivulju rasta kvasca, tj. ovisnost V nasuprot vremenu t, gdje je V = Vt - V0. Procijeni se eksponencijalna faza rasta te se za tu fazu nacrta ovisnost lnV nasuprot t (najmanje 5 točaka). Nagib najvjerojatnijeg pravca koji prolazi kroz dobivene točke predstavlja specifičnu brzinu rasta, µ (mi), za zadanu koncentraciju šećera. Kada se na prethodno opisani način odrede specifične brzine rasta za sve koncentracije supstrata [S], nacrta se ovisnost µ nasuprot [S]. Iz tako dobivenog grafa odredi se maksimalna brzina rasta i Ks. Zadatak 1. Nacrtati krivulju rasta kvasca u otopinama šećera mjerenjem promjene volumena s vremenom. 2. Iz eksponencijalne faze rasta, crtanjem ovisnosti log V vs. t, odrediti specifičnu brzinu rasta µ za svaku koncentraciju supstrata. 3. Iz ovisnosti specifične brzine rasta o koncentraciji supstrata odrediti maksimalnu brzinu rasta te konstantu zasićenja. 4. Grafove crtati u Excel-u. LITERATURA 1. W. Marison u: Biotechnology for Engineers; Biological Systems in Technological Processes, Ed. A.H. Scragg, Ellis Horwood Ltd. Chichester, 1988, str. 184-194 2. http://www.np.edu.sg/~deptbio/biochemical_engineering/fermentation_tutorial 3. www.le.ac.uk/by/teach/biochem 7 Vježba br. 2. IMOBILIZACIJA STANICA PEKARSKOG KVASCA NA ALGINATU Svrha vježbe: Imobilizacija stanica kvasca. Usporedba efikasnosti imobiliziranih i neimobiliziranih stanica. Uvod Imobilizacija enzima definira se kao fizikalno ili kemijsko vezivanje ili lokalizacija enzima na odreñenom nosaču uz zadržavanje katalitičkih svojstava enzima i mogućnosti ponovne i kontinuirane uporabe. U nekim slučajevima nije potrebno pročišćavanje enzima. Meñutim, ponekad je povoljnija imobilizacija stanica jer stanice predstavljaju multienzimski sustav. Primjena imobiliziranih biokatalizatora (enzima ili pak čitavih stanica) u biotehnološkim procesima provodi se u svrhu: 1. dobivanja spojeva stereospecifičnim reakcijama 2. proizvodnje energije biološkim reakcijama 3. selektivnog djelovanja na onečišćenja u svrhu rješavanja problema u okolišu 4. analize različitih spojeva s visokom osjetljivošću i specifičnošću 5. proizvodnje novih lijekova, umjetnih organa itd. Enzimi se mogu imobilizirati na više načina, a stanice se imobiliziraju na četiri osnovna načina i to: 1. adsorpcijom na nosač 2. zarobljavanjem u polimernoj matrici, 3. umetanjem (kapsuliranjem), 4. kombinacijom navedenih metoda. Kao polimerna matrica često se koriste različiti polisaharidi: alginati, karagenani, agar, agaroza… Alginska kiselina je polisaharid koji se dobiva ekstrakcijom iz morskih algi u obliku svojih soli - alginata, a kao rezultat postojanja više slobodnih karboksilnih skupina u makromolekulama alginske kiseline (slika 2.1). Soli jednovalentnih metala (npr. Na) su topljive u vodi. Takve soli služe u prehrambenoj industriji za podešavanje viskoznosti različitih proizvoda. Zamjenom Na+ iona s dvovalentnim ionima poput Ca2+ dolazi do stvaranja koordinativnih kompleksa koji su netopljivi u vodi. Upravo ovo svojstvo alginata rabi se za imobilizaciju enzima ili stanica. Kvasci imaju široku primjenu u industriji, pa njihova imobilizacija čini procese u kojima su neophodni ekonomičnijim. 8 Slika 2.1. Kemijska struktura ponavljajuće jedinice u makromolekuli alginata EKSPERIMENTALNI DIO Potreban pribor: Materijal: - Erlenmayerove tikvice od 250 cm3 - Na - alginat (E 401) - magnetska miješalica - pekarski kvasac - bireta - 0,1 M otopina CaCl2 - čaše - supstrat za fermentaciju, pH=4,5: - vrenjače 1. glukoza 80 g/dm3 2. (NH4)2SO4 4 g/dm3 3. MgSO4 x 7H2O 1g/dm3 4. KH2PO4 2g/dm3 - metilensko crvenilo (indikator) Postupak 1. Imobilizacija stanica kvasca U izvaganu čašu uliti 100 cm3 destilirane vode, zagrijane na 60°C i otopiti 1,5 g Naalginata uz stalno miješanje. Kad se alginat sasvim otopi, ohladiti na 30-40°C i dodati 3,75 g suhog pekarskog kvasca i miješati dok se kvasac ne suspendira u otopini alginata. Izvagati čašu sa suspenzijom. Suspenziju kvasca uliti u izvagani lijevak za dokapavanje i s visine od oko 15 cm dokapavati u čašu s 200 cm3 0,1 M otopine CaCl2 uz lagano miješanje pomoću magnetske miješalice, slika 2.2. Dokapavanjem u otopinu kalcijeva klorida nastaju kuglice koje sadrže stanice kvasca «zarobljene« u alginatnom gelu. (Potrebno je izvagati čašu i lijevak za dokapavanje nakon što je iz 9 njih ispražnjen sadržaj da se utvrdi masa udio suspenzije koji je ostao na stijenkama. Izračunati koliko je stvarno kvasca zarobljeno u alginatnom gelu). Nakon 15 minuta kapljevinu dekantirati i kuglice isprati svježom otopinom CaCl2 da se kompletira proces nastajanja kompleksa, a zatim isprati 4 puta s destiliranom vodom da se ukloni višak Ca2+. Kuglice prenijeti na filter papir da se osuše. Nastale kuglice očvrsnu u vremenu 1…2 sata. Slika 2.2. Imobilizacija kvasca u alginatnom gelu 2. Fermentacija glukoze U dvije Erlenmeyerove tikvice uliti po 100 cm3 supstrata za fermentaciju. U jednu tikvicu staviti kuglice imobiliziranih stanica kvasca, a u drugu masu kvasca jednaku prethodno izračunatoj masi kvasca zarobljenog u alginatnom gelu. Obje tikvice sa sadržajem izvagati i zabilježiti masu (m0). Na otvor svake tikvice staviti vrenjaču. Vrenjača je konstruirana tako da omogućava izlaz CO2, a sprječava ulaz O2. U vrenjaču se do oznake ulije voda i stavi par kapi indikatora metilenskog crvenila, kojem se mijenja boja zbog nastajanja CO2, slika 2.3. Promjenu mase bilježiti svakih pola sata (mt) za vrijeme trajanja vježbe, a zatim još nakon 24 i 48 sati. Razlika u masi jednaka je masi nastalog CO2, a količina etanola nastalog fermentacijom ekvivalentna je količini nastalog CO2, prema reakciji: C6H12O6 (glukoza) → 2 C2H5OH (etanol) + 2 CO2 10 Iskorištenje se računa na sljedeći način: Masa glukoze = 8 g ( 100 cm3 otopine koja sadrži 80 g/dm3 glukoze) Stehiometrijska masa etanola: (ms) = (8/Mgl) x 2 mola x MEtOH = (8 /180) x 2 x 48 = 4,09 g Eksperimentalno dobivena masa etanola: me =[(m1 - m0) / MCO2] x MEtOH Iskorištenje: η = (me / ms) x 100 Slika 2.3. Fermentacija s imobiliziranim kvascem Zadatak 1. Imobilizirati stanice kvasca pomoću alginata. Odrediti ukupnu masu i približan broj dobivenih kuglica. 2. Dobivene imobilizirane stanice upotrijebiti za fermentaciju glukoze. 3. Usporediti prinos na etanolu uporabom imobiliziranih i neimobiliziranih stanica kvasca. 4. Navesti neke prednosti i nedostatke koje ste uočili pri radu s imobiliziranim odnosno neimobiliziranim stanicama kvasca. LITERATURA 1. A. H. Scragg, Biotechnology for Engineers; Biological Systems in Technological Processes, Ellis Horwood Ltd. Chichester, 1988, str. 235-252 2. D. L. Vullo, M. B. Wachsman, J. Food Sci. Edu. 4 (2005) 53-55 11 Vježba 3. PRIPRAVA SIRA Svrha vježbe: Razumijevanje procesa koagulacije kazeina i njegova praktična primjena Uvod Mlijeko se sastoji od 66-89 % vode i 11-14 % suhe tvari. Suha tvar sadrži 4,6-4,9% laktoze, 2,6-4,2% proteina (kazeini i albumini), a ostatak čine masti, mineralne tvari, vitamini i elementi u tragovima. U prisustvu bakterija mliječno-kiselog vrenja (Streptoccocus, Lactoccocus, Lactobacillus) odvija se proces kiselo-mliječne fermentacije kojim se mliječni šećer, laktoza, transformira u mliječnu kiselinu. Taj proces može se prikazati: C12H22O11 β-galaktozidaza glukoza + galaktoza laktoza C6H12O6 glikoliza glukoza CH3-CO-COOH pirogrožñana kis. laktat-dehidrogenaza CH3-CHOH-COOH mliječna kis. Kao što se vidi iz gornje sheme, bakterije proizvode mliječnu kiselinu koja snižava pH mlijeka. Snižavanjem pH mijenja se naboj kazeina u mlijeku te pri pH=4,6 (izoelektrična točka) dolazi do njegove koagulacije, dok albumini zaostaju u kapljevini koja se naziva sirutka. Zakiseljavanje mlijeka na ovaj način prvi je korak u proizvodnji jogurta i nekih vrsta sira. Koagulacija se dodatno može pospješiti zagrijavanjem. U nekim procesima proizvodnja sira, odnosno koagulacija kazeina provodi se dodatkom proteolitičkih enzima npr. kimozina (sirište, sirilo, renin). Proteolitički enzimi cijepaju κ-kazein na površini kazeinskih micela i omogućavaju agregaciju micela i koagulaciju kazeina. Koagulirajući enzimi su biljnog ili životinjskog porijekla ili pak iz različitih mikroorganizama. Tradicionalni način dobivanja enzima je iz želuca mlade teladi i janjadi koja se hrane mlijekom. Danas se uglavnom koristi rekombinantni kimozin. 12 Enzimima katalizirana koagulacija odvija se u dvije osnovne faze: 1. Cijepanje κ-kazeina i promjena strukture micela kazeina-zgrušavanje. Za ovu fazu neophodno je prisustvo iona kalcija. 2. Kontrakcija (sinereza) ugrušaka i istiskivanje vode iz zgrušane faze. Proces se ubrzava zagrijavanjem. Nastali sir se soli, formira u različite oblike, a zatim ostavlja da zrije, bez ili uz dodatak plemenitih plijesni. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni pribor i materijal - vodena kupelj - neobrano, pasterizirano mlijeko - čaše različitog volumena - kiselo mlijeko - pipete - sirište - drveni štapići - kapaljka - epruvete - pH papir - tkanina za cijeñenje Postupak Napuniti vodenu kupelj vodom u visini 2-3 cm i zagrijati na temperaturu 37-42°C. Pomiješati obično i kiselo mlijeko u omjeru 3:1 i ostaviti da poprimi sobnu temperaturu. Kiselo mlijeko dodaje se da snizi pH mlijeka i radi boljeg okusa sira. -U čašu od 100 cm3 uliti 40 cm3 smjese kiselog i običnog mlijeka te staviti u vodenu kupelj 1 minutu. -Dodati 4 kapi sirišta, sadržaj čaše promiješati okretanjem čaše u krug oko 5 sekundi. -Vratiti čašu u kupelj, ostaviti 1 minutu, bez miješanja. -Pomaknuti čašu i provjeriti dolazi li do koagulacije. Vratiti čašu u kupelj na još 1 minutu. -Drvenim štapićem promiješati sadržaj i ostaviti u kupelj još 30…60 sekundi. -Procijediti sadržaj čaše preko tkanine, skupiti vrhove i iscijediti tekućinu. 13 Zadatak 1. Provesti proces priprave sira prema opisanom postupku pri oko 40°C. 2. Postupak ponoviti pri sobnoj temperaturi. 3. Isti postupak kao pod 1 ponoviti uz deseterostruko razrjeñenje enzima. 4. Osnovni postupak provesti samo s običnim mlijekom (bez kiselog). 5. Zabilježiti opažanja Literatura 1. Lj. Tratnik, Mlijeko-tehnologija, biokemija i mikrobiologija, Hrvatska mljekarska udruga, Zagreb, 1998. 2. http://www.biosystems.usu.edu/education/high_school/labs/cheese/ 14 Vježba 4. EKSTRAKCIJA DEOKSIRIBONUKLEINSKE KISELINE IZ PLODOVA BILJAKA (kivi, grašak, češnjak) Svrha vježbe: Primjena različitih fizikalno-kemijskih procesa i operacija pri obradi intracelularnog produkta (down-stream processing) Uvod Deoksiribonukleinska kiselina (DNK) je genetski materijal prisutan u svim organizmima, od bakterija do čovjeka. Osnovne grañevne jedinice DNK nazivaju se nukleotidi, a sastoje se od dušične baze, šećera i fosfatne grupe. Stotine tisuća nukleotida tvore lance, a dva takva lanca povezana vodikovim vezama preko dušičnih baza u dvostruku uzvojnicu (heliks) tvore DNK. U organizmima čije stanice imaju jezgru DNK se povezana s proteinima nalazi u kromosomima. Ljudski genom (ukupni set gena u jednoj stanici) sadrži 3⋅109 osnovnih nukleotidnih parova. Kad bi se uzela sva DNK iz stanice i razvukla, bila bi duga 2 m, a sama se nalazi u jezgri stanice promjera 0,005 mm. Kako bi se ekstrahirala DNK iz stanica, voće ili povrće se usitnjava i zagrijava čime se najprije mehanički, a zatim toplinski cijepaju stanične stjenke. Da bi se otopili lipidi u staničnim membranama i ovojnicama jezgri dodaju se površinski aktivne tvari (detergenti). Slobodna DNK topljiva je u vodi jer fosfatne grupe svakog nukleotida imaju negativan naboj. Pozitivno nabijeni ion natrija iz kuhinjske soli neutraliziraju taj negativni naboj. Neutralizacija omogućava agregaciju molekula DNK, a da bi se oslobodila pratećih proteina mogu se koristiti različiti proteoilitički enzimi, npr. subtilisin A (sadržan u tabletama za deproteinizaciju kontaktnih leća), papain (iz papaje) ili bromelain (iz ananasa). Dodatkom etanola u otopinu DNK precipitira na meñupovršini etanol/voda jer nije topljiva u etanolu. Kako dokazati DNK? Svaki tip molekule, zahvaljujući jedinstvenoj strukturi, posjeduje karakterističan apsorpcijski elektromagnetski spektar. Apsorpcijski spektar odreñuje se različitim spektrofotometrima (UV/VIS, IR) pri čemu se bilježi stupanj apsorpcije (apsorbancija) pri svakoj valnoj duljini. DNK ima maksimalnu apsorbanciju pri valnoj 15 duljini od ~260 nm, a tipični proteini pri ~280 nm. Ova razlika u apsorbanciji, točnije njihov omjer, može poslužiti kao mjera uspješnosti ekstrakcije DNK. Ako je A260 nm / A280 nm = 1,8…1,9 - uzorak je praktično čista DNK. Ako je A260 nm / A280 nm = 1,9…2,0 - uzorak je praktično čista RNK. Ako su vrijednosti gornjeg omjera manje od 1,8 znači da je zaostalo dosta proteina koji apsorbiraju UV zračenje pri 280 nm. EKSPERIMENTALNI DIO Potreban pribor i materijal -sjeckalica za povrće - kivi ili grašak -čaša od 500 cm3 ili tikvica od 250 cm3 - etanol -graduirane čaše od 100 i 200 cm3 - led -menzura - kuhinjska sol -lijevak - detergent -termometar - proteolitički enzimi -filter papir Postupak A. Ekstrakcija DNK 1. Pripremiti ledenu vodenu kupelj visine 5…8 cm. U čašu uliti 50 cm3 etanola i staviti u ledenu kupelj. 2. Pripremiti otopinu za ekstrakciju: u čaši ili u tikvici otopiti 2 g kuhinjske soli u 90 cm3 destilirane vode. Dodati 10 cm3 detergenta i lagano promiješati da se ne zapjeni. 3. Kivi ili grašak usitniti u sjeckalici. Od ove mase uzeti 30 g i prenijeti u čašu od 200 cm3. 4. Usitnjeni materijal preliti s otopinom za ekstrakciju tako da je ukupni volumen dvostruko veći od volumena usitnjenog materijala. 5. Pripremiti vodenu kupelj temperature 50… 60°C. 6. Staviti čašu u kupelj. Uz miješanje zagrijavati 10-15 min. 7. Nakon perioda inkubacije prenijeti čašu sa sadržajem u ledenu kupelj. Uz miješanje hladiti 5 minuta. 16 8. Filtrirati sadržaj čaše preko filter papira i filtrat hvatati u tikvicu. 9. Sadržaj u tikvici promiješati. 5 cm3 filtrata prenijeti u 2 epruvete. U jednu epruvetu dodati proteolitičke enzime i povremeno miješati u vremenu od 30 minuta. U drugu ne dodavati proteolitičke enzime. B. Precipitacija DNK 1. Sadržaju u epruveti dodati 10 cm3 što hladnijeg etanola i to pipetom na dno epruvete, staviti u držač za epruvete i pratiti što se dogaña. 2. Ostaviti oko 2-3 minute da se DNK istaloži što se primjećuje po stvaranju bijelog pahuljastog taloga. Radi boljeg taloženja ostaviti preko noći u hladnjaku. 3. Pomoću kapaljke, staklene kuke ili štapića «pokupiti» DNK i prenijeti na satno staklo. Analiza produkta 1. Mikroskopija: malo precipitirane DNK staviti na staklo za mikroskop, dodati kap metilenskog plavila i mikroskopirati. 2. UV spektroskopija: otopiti DNK u 5 cm3 destilirane vode. Po potrebi profiltrirati i razrijediti destiliranom vodom. Slijepa proba je destilirana voda. Odrediti apsorbanciju pri 260 i 280 nm standardnim postupkom. Zadatak 1. Izvršiti ekstrakciju DNK iz dostupnog izvora. 2. Analizirati ekstrahirani produkt mikroskopskom i UV/VIS spektroskopijom te objasniti dobivene rezultate. Literatura 1. www.exploratorium.edu 2. http://www.biosystems.usu.edu/education/high_school/labs/dna/ 3. www.biotech.iastate.edu 17 Vježba 5. SINTEZA BIODIZELA TRANSESTERIFIKACIJOM OTPADNOG JESTIVOG ULJA Svrha vježbe: Dobivanje goriva iz otpadnog biljnog ulja Biodizel je naziv za gorivo koje se proizvodi alkoholizom ili transesterifikacijom biljnog ulja ili životinjskih masti, a služi kao zamjena ili dodatak mineralnom dizelu. Transesterifikacija je naziv za kemijske reakcije u kojima se ester jednog alkohola prevodi u ester drugog alkohola. Osnovna sirovina za proizvodnju biodizela je ulje uljane repice, soje ili druge pogodne uljarice. S obzirom na cijenu ovih ulja kao alternativna sirovina može poslužiti otpadno jestivo ulje. Kvaliteta biodizela izravno je povezana s kvalitetom sirovine. Zagrijavanjem biljnih ulja, npr. tijekom prženja, može doći do toplinskih, oksidacijskih ili hidrolitičkih reakcija, što dovodi do kemijskih promjena ulja. Promjena kemijskog sastava ne ovisi samo o vrsti ulja već i o hrani koja je pržena te temperaturi i vremenu prženja. Stoga se otpadna ulja moraju u odreñenoj mjeri rafinirati prije hidrolize. Najjednostavniji postupak je filtracija zagrijanog ulja, hlañenje te fazna separacija zaostale vode. Sve sirovine moraju biti bezvodne jer se uz prisustvo vode parcijalno odvija i reakcija saponifikacije (nastajanje sapuna). Alkoholiza ili transesterifikacija ulja općenito se odvija prema sljedećoj shemi: H2C OCOR' HC OCOR'' H2C OCOR'' + 3ROH triglicerid alkohol Reakcija teče ROCOR' + ROCOR'' + ROCOR''' katalizator zadovoljavajućom + smjesa alkilnih estera brzinom pri umjerenim H2C OH HC OH H2C OH glicerol temperaturama i atmosferskom tlaku. Prikladni alkoholi su metanol, etanol, propanol, butanol i amilni alkohol. Najčešće se upotrebljava metanol, zbog niske cijene i povoljnih fizikalno- 18 kemijskih karakteristika. Iako je stehiometrijski omjer alkohola i ulja 3:1, zbog povećanja iskorištenja i ubrzanja kemijske reakcije, radi se s alkoholom u suvišku. Katalizatori mogu biti kiseli (sulfatna, fosfatna, kloridna kiselina) i bazni (NaOH, KOH, karbonati, alkoksidi). Najčešće se provodi bazno-katalizirana transesterifikacija jer je oko 4000 puta brža od kiselo-katalizirane. Reakcija transesterifikacije efikasno se može katalizirati ekstracelularnim i intracelularnim lipazama (lipaze iz gljivica Muchor miehei, Candida antartica, Pseudomonas cepacia) bilo u vodenom ili u nevodenom mediju. Meñutim, lipaze su znatno skuplje od nekog alkalnog katalizatora. Prvi standard za biodizel dobiven iz repičinog ulja pojavio se u Austriji 1990 (ON C1190). Slični standardi danas postoje i u Švedskoj, Francuskoj, Njemačkoj, Italiji, Češkoj i SAD-u. Neke značajke biodizela u odnosu na mineralni dizel prikazane su u tablici 5.1. Tablica 5.1. Usporedba biodizela i dizelskog goriva Biodizel iz repičinog Biodizel iz otpadnog ulja repičinog ulja 0,882 (15°C) 0,895 0,830…0,840(15°C) Cetanski broj 51…59,7 53 35,5 Kinematička viskoznost (mm2/s) Plamište (°C) 4,2 (40°C) 9,48 (30°C) 3,5 (40°C) 170 192 80 Sumpor (%) 0,009 0,002 0,36 Svojstvo 3 Gustoća(g/cm ) Dizelsko gorivo EKSPERIMENTALNI DIO Potreban pribor i kemikalije - tikvica okruglog dna od 500 cm3 - metanol - magnetsko miješalo - katalizator, KOH - termometar - otpadno jestivo ulje - lijevak za odjeljivanje, 2 kom 19 Postupak: Predobrada sirovine: oko 300 g ulja zagrijavati uz miješanje oko 5 minuta na 110°C da se ukloni eventualno prisutna voda, ohladiti do 50…60°C te filtrirati. U tikvicu (slika 5.1) uliti 200 g prethodno obrañenog ulja i zagrijati do 60°C. Dodati 57,8 cm3 (43,4 g) metanola s otopljenim katalizatorom (1 % w/w KOH u odnosu na masu ulja, tj. 2 g ). Slika 5.1. Aparatura za provedbu procesa transesterifikacije biljnog ulja Reakcijsku smjesu snažno miješati 2 sata na zadanoj temperaturi, a zatim prebaciti u lijevak za odjeljivanje da bi se odvojio glicerol (najmanje 4 sata ili preko noći). Nakon ispuštanja glicerola dobiveni metilni ester prebaciti u drugi lijevak za odjeljivanje i pažljivo isprati sa 50 cm3 destilirane vode kako bi se uklonili nastali sapuni, višak metanola i katalizator te ostaviti da se slojevi odvoje. Izračunati iskorištenje prema oleinskoj kiselini budući je ona glavna komponenta ulja: 1 mol triglicerida + 3 mol metanola 3 mola metil-estera (biodizela) + 1 mol glicerola 20 Mm triglicerida (oleina) = 885 g/mol, a masa je 200 g, pa je to 200/885 = 0,226 mola. Molni odnos metanola i ulja je 6:1 (dvostruka stehiometrijska količina), a molekulska masa metanola je 32 g/mol, pa je to 0,226 x 6= 1,356 mola x 32 = 43,4 g / 0,75 g/cm3 = 57,8 cm3. Za teorijsko iskorištenje na biodizelu tj. metilnom esteru molekulske mase 296 g/mol (metilni ester oleinske kiseline) vrijedi: 0,226 x 3 = 0,678 mola, a teorijska masa je 0,678 x 296 = 200,69 g Stvarno iskorištenje u postotcima: η = (masa dobivenog biodizela / 200,69) x 100. Zadatak 1. Odrediti karakteristike otpadnog jestivog ulja: gustoću, kiselinski broj, peroksidni broj. 2. Provesti sintezu biodizela iz otpadnog jestivog ulja. 3. Odrediti gustoću, kinematičku viskoznost i plamište dobivenog metilnog estera (biodizela) te izračunati iskorištenje. Literatura 1. H. Fukuda, A. Kondo and H. Noda, J. Biosci. Bioeng. 92, 2001, 405-416 2. C. L. Peterson et al. Appl. Eng. Agriculture, 18, 2002, 5-11 3. B. Supple et al. JAOCS, 79, 2002, 175-178 21 6. METODE ODREðIVANJA FIZIKALNO-KEMIJSKIH KARAKTERISTIKA SIROVINA I GOTOVIH PROIZVODA 6. 1. ODREðIVANJE GUSTOĆE Tariranu (ili izvaganu) odmjernu tikvicu od 10 cm3 nadopuniti do oznake, pri temperaturi 20°C. Izvagati tikvicu i uzorak. Ako je tikvica tarirana očitana masa u gramima (m) je masa kapljevine u tikvici. U drugom slučaju masu prazne tikvice treba oduzeti od mase pune tikvice. Gustoća, ρ = m/10 (g/cm3) 6.2. ODREðIVANJE KISELINSKOG BROJA Kiselinski broj (KB) označava mg KOH potrebne za neutralizaciju 1 g uzorka. 3…5 g uzorka otopiti u 50 cm3 etanola neutraliziranog s alkoholnom KOH i titrirati s 0,1 M KOH uz indikator fenoloftalein do prve pojave ružičaste boje koja se zadržava. Izračunava se prema izrazu: KB = a × 5,61 × f m a – utrošak 0,1 M KOH za titraciju / cm3 f- faktor 0,1 M KOH 5, 61 - masa KOH (u mg) sadržana u 1 mL 0,1 M alkoholne otopine KOH m – masa uzorka / g 6.3. ODREðIVANJE PEROKSIDNOG BROJA Peroksidni broj daje uvid u stanje oksidiranosti ulja, a po definicije predstavlja količinu tvari u uzorku koje oksidiraju KJ, izraženu u milimolovima aktivnog kisika po kg (mmol/kg). 22 U suhoj erlenmeyerovoj tikvici od 250 cm3 s brušenim čepom izvagati uzorak uz točnost 0,001 g (0,3…0,5 g ako je otpadno ulje, a 1,2…2 g ako je novo ulje). Uzorak otopiti u 10 cm3 kloroforma i 15 cm3 ledene octene kiseline, dodati 1 cm3 zasićene otopine KJ, brzo začepiti tikvicu i sadržaj miješati 1 minutu, a zatim ostaviti u tami 5 minuta pri temperaturi 15…20°C. Nakon toga dodati oko 75 cm3 destilirane vode, 2 cm3 otopine škroba i titrirati s 0,01 mol/L (za peroksidni broj ispod 12) ili 0,02 mol/dm3 (za peroksidni broj iznad 12) otopinom natrijeva tiosulfata uz snažno mućkanje. Napraviti i slijepu probu. Za svaki uzorak rade se dva odreñivanja. Peroksidni broj izračunava se prema izrazu: Pbr = (V − V0 ) × C × 1000 2× m V – volumen otopine natrijeva tiosulfata potrošen za titraciju uzorka / cm3 V0 - volumen otopine natrijeva tiosulfata potrošen za titraciju slijepe probe / cm3 C – koncentracija otopine natrijeva tiosulfata 1000 - konstanta, za izražavanje rezultata po kg uzorka 2- molovi tiosulfata koji odgovaraju jednom molu peroksida m – masa uzorka /g Rezultat predstavlja aritmetičku sredinu dvaju odreñivanja. Osim u mmol/kg postoje i druge jedinice za izražavanje peroksidnog broja: - mg/kg ili µg/g: Pbr x 16, - meq aktivnog kisika / kg : Pbr x 2. 6.4. ODREðIVANJE KINEMATIČKE VISKOZNOSTI Viskoznost predstavlja otpor fluida protiv smicanja njegovih čestica. Pojmovno se definira kao mjera žilavosti fluida koja pokazuje kojom će silom slojevi meñusobno djelovati jedan na drugi, po jedinici površine, ukoliko se gibaju jediničnom relativnom brzinom na jediničnoj udaljenosti. Tako definirana viskoznost predstavlja dinamičku viskoznost η (eta). Omjer dinamičke viskoznosti i gustoće fluida naziva se kinematička viskoznost ν (ni). 23 6.4.1. Odreñivanje viskoznosti Ostwaldovim viskozimetrom Ovo odreñivanje sastoji se u mjerenju vremena protjecanja kapljevine kroz kapilaru viskozimetra (slika 6.1). Postupak: Viskozimetar se uroni u vodenu kupku i temperira na 40°C. Zatim se pipetira točno odreñena količina uzorka i ulije u širi dio viskozimetra. Nakon toga uzorak se usiše kroz kapilaru viskozimetra do odreñene oznake i mjeri se vrijeme u kojem tekućina teče do druge oznake. Treba izvršiti 3 mjerenja vremena, a kao rezultat uzima se srednja vrijednost. Umnožak srednje vrijednosti vremena protjecanja i konstante viskozimetra predstavlja kinematičku viskoznost: ν= k·t (mm² s-1) k – konstanta viskozimetra (0,0384) t – vrijeme protjecanja kapljevine Slika 6.1. Ostwaldov viskozimetar 24 6.5. PLAMIŠTE Pod plamištem se podrazumijeva ona temperatura pri tlaku od 760 mm Hg, kod koje se iznad ispitivanog uzorka, zagrijavanog u propisanom aparatu, skupi toliko njegovih para, da se one u smjesi sa zrakom prvi put, na trenutak, zapale kada doñu u dodir s plamenom ili iskrom. Razlikuje se plamište u otvorenom i zatvorenom lončiću. Poklopac na lončiću u ovom drugom slučaju sprječava izlazak pare, te stoga plamište u zatvorenom lončiću predstavlja uvijek nižu vrijednost. Ova je razlika veća, što se plamište nalazi na višoj temperaturi. Postoji nekoliko tipova aparatura za odreñivanje plamišta, a izbor aparature ovisi o temperaturi plamišta tekućine koja se ispituje. Kod tekućina s plamištem ispod 50 °C odreñivanje se vrši u aparatu po Abel-Penskyu, iznad 50 °C upotrebljava se aparat po Pensky-Martensu ili Marcussonu. Aparati po Abel-Penskyu i Pensky-Martensu imaju posudicu sa poklopcem, dok je aparat po Marcussonu otvoren. 6.5. 1. Odreñivanje plamišta po Pensky-Martensu Aparat po Pensky-Martensu upotrebljava se kod kapljevina s plamištem iznad 50 °C. Aparat je strogo normiran i ima dva termometra. Kod tvari s plamištem ispod 100 °C upotrebljava se termometar od 0 - 110 °C, a za tvari s plamištem iznad 100 °C upotrebljava se termometar od 90 - 170 °C. Aparata po Pensky-Martensu prikazan je na slici 5. Brončana posuda za uzorak O uložena je u zračnu kupelj od lijevanog željeza A, koja se grije preko žičane mrežice ili bez nje. Grijanje se vrši Bunsenovim plamenikom. Brončana kupola D smanjuje na minimum gubitak na toplini. Tri otvora na poklopcu posude za uzorak su pokrivena okretnim zaklopcem, koji se pokreće pomoću ručke H. U ispitak kapljevine je uloženo miješalo sa širokim lopaticama za miješanje i s malim lopaticama iznad za miješanje pare i zraka. Miješalo prolazi kroz poklopac i pokreće se rotiranjem ručke K. Temperatura kapljevine kontrolira se termometrom T. 25 Slika 6.2. Aparatura za odreñivanje plamišta po Pensky-Martensu Postupak rada: Svi dijelovi aparata moraju biti potpuno čisti i suhi. Posudica se napuni ispitivanom kapljevinom do oznake i postavi u peć, a poviše nje stavi se poklopac s termometrom. Zatim se upali i regulira plamičak prema standardnoj kuglici na aparatu. Tada se zračna kupelj zagrije plamenikom, tako da temperatura ispitka raste oko 5°C po minuti, te se stavi u pogon miješalo kod približno 60 okr./min. Najmanje 15°C ispod očekivane točke plamišta (u slučaju kada je nepoznato, izvrši se prethodni grubi pokus, ispitujući svake pola minute) pokuša se spuštati plamičak u posudu i to do 100°C kod svakog 1°C, a za temperaturno područje iznad 100°C svako 2°C. Kada se spušta plamičak, prekida se miješanje. Plamičak se mora spustiti u roku od 0,5 sekundi, držati na mjestu 1 sekundu i tada brzo vratiti u početni položaj. Plamište je temperatura pri kojoj se od plamička jasno upali smjesa para i zraka skupljene nad površinom posude. Da je plamište blizu, poznaje se po tome što plamičak postaje veći. Dva odreñivanja smiju se razlikovati najviše za 2 °C. Kod odreñivanja plamišta vrlo viskoznih tvari ploha se stavi već ugrijana u posudicu, koja je takoñer ugrijana na temperaturu blizu plamišta, i provede ispitivanje. Jedina razlika je brzina grijanja, 2 - 3 °C/min., a miješanje 70 - 80 okr./min. 26
© Copyright 2024 Paperzz
