ΚΕΦ. 4ο ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΡΙΣΕΩΣ 1. Ποιες είναι οι προϋποθέσεις που πρέπει να πληρεί ένα πλασμίδιο για να χρησιμοποιηθεί ως φορέας κλωνοποίησης; Απάντηση. Οι προϋποθέσεις που πρέπει να πληρεί ένα πλασμίδιο είναι οι εξής:  Να έχει την αλληλουχία που αναγνωρίζει η περιοριστική ενδονουκλεάση μόνο μια φορά.  Να έχει τουλάχιστον ένα γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά.  Να έχει την ικανότητα εισόδου σε κύτταρο-ξενιστή.  Να έχει μικρό μέγεθος. 2. Ποια ένζυμα είναι απαραίτητα για τη δημιουργία μιας cDNA βιβλιοθήκης; Απάντηση. Τα ένζυμα που είναι απαραίτητα είναι τα εξής:  DNA πολυμεράση.  DNA δεσμάση.  Αντίστροφη μεταγραφάση.  Περιοριστική ενδονουκλεάση. 3. Ποια είναι τα γονίδια που περιέχονται στα πλασμίδια; Απάντηση. Στα πλασμίδια περιέχονται:  Γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά.  Γονίδια που σχετίζονται με τη μεταφορά γενετικού υλικού από το ένα βακτήριο στο άλλο  Γονίδια που σχετίζονται με όγκους στα φυτά.  Γονίδια που αποτελούν το 1-2% του βακτηριακού DNA. 4. Για τη μελέτη της ινσουλίνης και του υποκινητή της θα δημιουργήσετε γονιδιωματική ή cDNA βιβλιοθήκη και γιατί; Απάντηση. Για τη μελέτη της ινσουλίνης θα κατασκευάσουμε cDNA βιβλιοθήκη γιατί με τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη υπάρχει περίπτωση η περιοριστική ενδονουκλεάση να κόψει μέσα στο γονίδιο με συνέπεια να μην είναι δυνατή η παραγωγή της πρωτεΐνης σε βακτήριο. Αντίθετα στη cDNA βιβλιοθήκη χρησιμοποιείται μόνο το ώριμο mRNA του γονιδίου με συνέπεια να είναι δυνατή η έκφρασή του σε βακτηριακό κύτταρο. Επειδή ο υποκινητής δε μεταγράφεται θα κατασκευαστεί γονιδιωματική βιβλιοθήκη. 5. Ποιες περιπτώσεις γνωρίζετε στις οποίες γίνεται ανασυνδυασμός του DNA; Απάντηση. Πειράματα Griffith, Avery Mac-Leod και McCarty, Hershey και Chase, ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ πλασμιδίων, ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ πλασμιδίων και κύριου μορίου DNA, μετατοπίσεις, αμοιβαίες μετατοπίσεις, διπλασιασμούς, μετατροπή του πρωτοογκογονιδίου σε ογκογονίδιο (οφείλεται σε μετατόπιση), παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών από βακτήρια (ινσουλίνη, αυξητική ορμόνη, ιντερφερόνες), υβριδώματα, γονιδιακή θεραπεία, διαγονιδιακά φυτά (πλασμίδιο Ti), παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών από διαγονιδιακά ζώα (α1-αντιθρυψίνη, παράγοντας IX). 6. Είναι δυνατή η εφαρμογή της μεθόδου PCR στη μελέτη του γονιδιώματος ενός ρετροιού; Απάντηση. Ο ρετροϊός έχει ως γενετικό υλικό το RNA ενώ η μέθοδος PCR επιτρέπει τον επιλεκτικό πολλαπλασιασμό αλληλουχιών DNA. Γιαυτό και θα πρέπει με μέθοδο ανάλογη της κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης να δημιουργηθεί δίκλωνο DNA στο οποίο στη συνέχεια θα εφαρμοστεί η μέθοδος PCR. 7. Σε ποιες περιπτώσεις στην τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA βρίσκει εφαρμογή ο κανόνας της συμπληρωματικότητας των βάσεων; Απάντηση.  Στη δημιουργία του ανασυνδυασμένου φορέα τα άκρα του οποίου ήταν μονόκλωνα και συμπληρωματικά με άλλα τμήματα DNA που έχουν κοπεί με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση.  Στην δημιουργία cDNA με καλούπι το mRNA στην κατασκευή της cDNA βιβλιοθήκης.  Στην δημιουργία δίκλωνου DNA κατά την κατασκευή μιας cDNA βιβλιοθήκης.  Στην υβριδοποίηση, δηλαδή στη σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών αλυσίδων DNA ή συμπληρωματικών DNA- RNA.  Στη μέθοδο PCR. 8. Ποια είναι τα απαραίτητα συστατικά για την δημιουργία μιας cDNA βιβλιοθήκης; Απάντηση. Ώριμο mRNA, DNA πολυμεράση, DNA δεσμάση, αντίστροφη μεταγραφάση, περιοριστική ενδονουκλεάση, φορέας κλωνοποίησης, δεοξυριβονουκλεοτίδια, χημικές ουσίες για αποδιάταξη του mRNA στα υβριδικά μόρια cDNA-mRNA, βακτήρια-ξενιστές, ουσίες για να γίνουν διαπερατά τα τοιχώματα των κυττάρων-ξενιστών, αντιβιοτικό, θρεπτικό υλικό, μόριαανιχνευτές. 9. Με ποιους τρόπους είναι δυνατή η κλωνοποίηση ενός τμήματος DNA; Απάντηση. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη, cDNA βιβλιοθήκη και μέθοδος PCR. 10. Ποια τμήματα του ανθρώπινου γονιδιώματος δεν κλωνοποιούνται σε μια cDNA βιβλιοθήκη; Απάντηση. Τμήματα του ανθρώπινου γονιδιώματος που δεν κλωνοποιούνται σε μια cDNA βιβλιοθήκη είναι τα εξής:  Τμήματα του DNA που δεν εκφράζονται (μη κωδικοποιούσα περιοχή).  Εσώνια.  Γονίδια για tRNA, rRNA, snRNA.  Υποκινητής.  Αλληλουχίες λήξης της μεταγραφής. 11. Ποιες προϋποθέσεις θα πρέπει να πληρούν τα βακτήρια ξενιστές; Απάντηση.  Να μην έχουν πλασμίδια.  Να έχουν ανενεργά τα γονίδια των περιοριστικών ενδονουκλεασών.  Τα τοιχώματά τους να γίνονται διαπερατά μετά από κατάλληλη διαδικασία. 12. Ένα γονίδιο ενσωματώθηκε σε ένα πλασμίδιο και στο μετασχηματισμένο βακτηριακό κύτταρο δεν εκφραζόταν το γονίδιο. Εάν δεν έχει συμβεί κάποια μετάλλαξη μπορείς να σκεφτείς μερικούς λόγους γι' αυτό το γεγονός; Απάντηση.  Έλειπε ο κατάλληλος υποκινητής.  Δεν υπήρχαν οι κατάλληλοι μεταγραφικοί παράγοντες.  Μια πρωτεΐνη-καταστολέας συνδέεται με χειριστή και εμποδίζει την έναρξη της μεταγραφής.  Το βακτήριο δε διαθέτει μηχανισμούς τροποποίησης (ωρίμανση και μεταμεταφραστικοί μηχανισμοί) με συνέπεια το τελικό πρωτεϊνικό προϊόν να μην είναι λειτουργικό.  Πιθανόν να μην είχαν απενεργοποιηθεί τα γονίδια των περιοριστικών ενδονουκλεασών του βακτηρίου με συνέπεια να κόβουν το πλασμίδιο.  Αλλαγές των περιβαλλοντικών συνθηκών μπορεί να επηρέασαν τη λειτουργία του βακτηρίου. 13. Σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο ένα γονίδιο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μιας πρωτεΐνης 148 αμινοξέων. Αν το ίδιο γονίδιο κλωνοποιηθεί σ' ένα βακτηριακό πληθυσμό, θα παραχθεί η ίδια ακριβώς πρωτεΐνη; Να αιτιολογηθεί η απάντησή σας. Απάντηση. Τα βακτήρια δε διαθέτουν μηχανισμούς ωρίμανσης και μηχανισμούς μετα-μεταφραστικής τροποποίησης (απομάκρυνση αμινοξέων από το αμινικό άκρο). Το γονίδιο ενός ευκαρυωτικού κυττάρου περιέχει συνήθως εσώνια, ενώ το πρωτεϊνικό προϊόν που παράγεται υφίσταται συχνά μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Γι’ αυτό και το πιθανότερο είναι η πρωτεΐνη που θα παραχθεί από το βακτηριακό κύτταρο να διαφέρει από αυτή του ευκαρυωτικού κυττάρου. 14. Ποιες είναι οι διαφορές μεταξύ της γονιδωματικής και cDNA βιβλιοθήκης; Απάντηση. Γονιδιωματική βιβλιοθήκη cDNA βιβλιοθήκη 1. Περιλαμβάνει όλο το DNA του 1. Περιλαμβάνει μόνο τα γονίδια του οργανισμού-δότη οργανισμού-δότη που εκφράζονται 2. Από τον οργανισμό-δότη 2. Από τον οργανισμό-δότη απομονώνεται DNA απομονώνεται mRNA 3. Ο αριθμός των κλώνων είναι πολύ 3. Ο αριθμός των κλώνων δεν είναι μεγάλος πολύ μεγάλος 4. Τα κλωνοποιημένα γονίδια φέρουν 4. Τα κλωνοποιημένα γονίδια δεν εσώνια φέρουν εσώνια 5. Χρησιμοποιούνται 2 ένζυμα: 5. Χρησιμοποιούνται 4 ένζυμα: περιοριστική ενδονουκλεάση, DNA περιοριστική ενδονουκλεάση, DNA δεσμάση πολυμεράση, DNA δεσμάση, αντίστροφη μεταγραφάση 6. Η αποδιάταξη χρησιμοποιείται για 6. Η αποδιάταξη χρησιμοποιείται στα την επιλογή του κλώνου προς μελέτη υβριδικά μόρια mRNA-cDNA καθώς επίσης και για την επιλογή του κλώνου προς μελέτη 7. Στοχεύει στη συνολική μελέτη του 7. Στοχεύει στην παραγωγή επιθυμητής γονιδιώματος ενός οργανισμού. πρωτεΐνης 15. Δύο cDNA βιβλιοθήκες δημιουργήθηκαν για ανθρώπινο ηπατικό και παγκρεατικό κύτταρο αντίστοιχα. α. Ποια συστατικά χρησιμοποιήθηκαν για το σχηματισμό των δύο βιβλιοθηκών; β. Μεταξύ των κλώνων που προέκυψαν υπήρχαν αρκετοί όμοιοι στις δύο βιβλιοθήκες. Πώς δικαιολογείται η παρουσία όμοιων κλώνων στις δύο βιβλιοθήκες; Απάντηση. α. Για τη δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης απαιτούνται τα ακόλουθα συστατικά:  Ώριμο mRNA από το επιλεγμένο κύτταρο.  Αντίστροφη μεταγραφάση.  Δεοξυριβονουκλεοτίδια.  Χημικές ουσίες για αποδιάταξη.  DNA πολυμεράσες.  Πλασμίδια.  Περιοριστική ενδονουκλεάση.  DNA δεσμάση.  Αντιβιοτικό.  Θρεπτικό υλικό.  Μόρια- ανιχνευτές. β. Η cDNA βιβλιοθήκη περιέχει αντίγραφα των γονιδίων που εκφράζονται σε ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρου. Μεταξύ των γονιδίων αυτών υπάρχουν αρκετά γονίδια που εκφράζονται σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού και ανεξάρτητα από τη γονιδιακή ρύθμιση, διότι κωδικοποιούν πρωτεΐνες απαραίτητες για τις βασικές μεταβολικές διεργασίες των κυττάρων, όπως είναι η αντιγραφή του DNA και η μεταγραφή. 16. Κατά τη διάρκεια της ζωής του κυττάρου ή σε διάφορες εργαστηριακές τεχνικές είναι πολλές φορές απαραίτητο να συμβεί αποχωρισμός των αλυσίδων του δίκλωνου μορίου DNA. Σε ποιες περιπτώσεις γνωρίζετε να συμβαίνει αποχωρισμός αλυσίδων δίκλωνου DNA και ποιοι παράγοντες είναι υπεύθυνοι σε κάθε περίπτωση για τον αποχωρισμό αυτό; Απάντηση. Οι συμπληρωματικές αλυσίδες του DNA αποχωρίζονται:  Κατά την αντιγραφή του DNA. Ο αποχωρισμός πραγματοποιείται από τις DNA ελικάσες.  Κατά τη μεταγραφή του DNA σε RNA. Ο αποχωρισμός στην περίπτωση αυτή αφορά ένα μικρό κομμάτι του μορίου και επιτυγχάνεται μέσω της RNA πολυμεράσης.  Κατά την αποδιάταξη που πραγματοποιείται εργαστηριακά με σκοπό την υβριδοποίηση. Η αποδιάταξη επιτυγχάνεται με την επίδραση κατάλληλων ουσιών ή αύξηση της θερμοκρασίας στα μόρια του DNA που απομονώνονται.  Κατά τη μέθοδο PCR, όπου οι διαδοχικές αποδιατάξεις επιτρέπουν τη δημιουργία εκατομμυρίων αντιγράφων ειδικών αλληλουχιών DNA. 17. Κατά την κατασκευή μιας cDNA βιβλιοθήκης και την απομόνωση ενός κλώνου από αυτήν πραγματοποιείται δύο φορές η διαδικασία της αποδιάταξης μορίων νουκλεϊκών οξέων. Σε ποια στάδια της τεχνικής συμβαίνουν αποδιατάξεις και από ποια διαφορά χαρακτηρίζονται; Απάντηση. Αποδιάταξη αλυσίδων DNA / RNA πραγματοποιείται μετά τη δημιουργία υβριδικών μορίων cDNA – mRNA, οπότε τα δύο μόρια αποχωρίζονται. Αποδιάταξη συμβαίνει επίσης κατά την επιλογή του κατάλληλου κλώνου, οπότε αποδιατάσσεται το ανασυνδυασμένο DNA της βιβλιοθήκης με σκοπό την υβριδοποίηση. Συγκρίνοντας αυτές τις δύο αποδιατάξεις παρατηρούμε ότι στην αποδιάταξη για τον αποχωρισμό του mRNA από το cDNA, το μόριο του mRNA μπορεί να διασπάται και άρα να καταστρέφεται, κάτι που δεν συμβαίνει στην αποδιάταξη με σκοπό την υβριδοποίηση.