Μεθοδολογία Ασκήσεων ΚΕΦ 4ο Θα πρέπει να γνωρίζετε τα ακόλουθα:  Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα που αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA.  Κατά τον ανασυνδυασμό του DNA χρησιμοποιείται η ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση προκειμένου να κοπεί ο φορέας (π.χ πλασμίδιο) και το DNA του οργανισμού δότη. Με τον τρόπο αυτό τα μονόκλωνα άκρα που δημιουργούνται αποτελούνται από συμπληρωματικές βάσεις, οι οποίες μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου.  Κάθε φορά που η EcoRI αναγνωρίζει και κόβει τη χαρακτηριστική αλληλουχία: 5΄G A A T T C 3΄ 3΄C T T A A G 5΄ σπάνε δύο (2) φωσφοδιεστερικοί δεσμοί και οκτώ (8) δεσμοί υδρογόνου.  Η ένωση DNA ενός οργανισμού δότη και ενός φορέα (π.χ πλασμίδιο) που έχουν προκύψει από τη δράση της EcoRI για μία φορά, έχει σαν συνέπεια τη δημιουργία τεσσάρων (4) φωσφοδιεστερικών δεσμών και δεκαέξι (16) δεσμών υδρογόνου.  Η κάθε περιοριστική ενδονουκλεάση μπορεί να έχει περισσότερες από μία (1) θέσεις αναγνώρισης σε ένα φορέα (π.χ πλασμίδιο). Η ένωση DNA ενός οργανισμού δότη με το φορέα, σε κάθε θέση αναγνώρισης, δημιουργεί διπλάσιους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς και δεσμούς υδρογόνου σε σχέση με αυτούς που σπάνε όταν η περιοριστική ενδονουκλεάση επιδρά στη κάθε θέση αναγνώρισης.  Σε κυκλικό μόριο DNA ο αριθμός των θραυσμάτων που προκαλούνται από τη δράση μιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης είναι ίδιος με τις θέσεις αναγνώρισης της συγκεκριμένης ενδονουκλεάσης στο μόριο. Τα τμήματα που προκύπτουν έχουν όλα μονόκλωνα άκρα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανασυνδυασμό. Κωστανίκος Δημήτρης 1 Βιολόγος  Σε γραμμικό μόριο DNA ο αριθμός των θραυσμάτων που προκαλούνται από τη δράση μιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης είναι κατά μία (1) μονάδα μεγαλύτερος από τις θέσεις αναγνώρισης της συγκεκριμένης ενδονουκλεάσης στο μόριο. Τα ενδιάμεσα τμήματα που προκύπτουν έχουν όλα μονόκλωνα άκρα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ανασυνδυασμό. Τα δύο (2) ακραία τμήματα θα πρέπει, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν για ανασυνδυασμό, να υποστούν ειδική κατεργασία ώστε να αποκτήσουν μονόκλωνα άκρα.  Με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης προκύπτουν αντίγραφα επιλεγμένων μορίων δίκλωνου DNA με ρυθμό γεωμετρικής προόδου, δεδομένου ότι το 1 μόριο στον πρώτο κύκλο αντιγραφής δίνει 2 μόρια, στο δεύτερο κύκλο δίνει 4 κ.ο.κ. Κατά συνέπεια εάν γίνουν κ κύκλοι αντιγραφής θα προκύψουν α ∙ 2κ μόρια DNA, όπου α ο αριθμός των αρχικών μορίων DNA. Κωστανίκος Δημήτρης 2 Βιολόγος