Πολυμορφισμοί Ανρώπινου DNA Νικόλαος Δάβανος, MSc PhD Πολυμορφισμοί ανθρώπινου DNA • Το ανθρώπινο DNA διαφέρει σε συγκεκριμένες θέσεις μεταξύ των ατόμων ενός πληθυσμού (εξαίρεση αποτελούν οι μονοωογενείς διδύμοι) • Σε πολλές, μη κωδικοποιές συνήθως περιοχές του γονιδιώματος (γενετικοί τόποι) είναι δυνατόν να υπάρχουν πολλαπλά φυσιολογικά αλληλόμορφα • Οι διαφορετικοί γονότυποι εξαιτίας της ύπαρξης πολλών αλληλομόρφων ονομάζονται πολυμορφισμοί του DNA • Οι κυριότεροι πολυμορφισμοί του ανθρώπινου γονιδιώματος είναι: • Πολυμορφισμοί στο επίπεδο του ενός νουκλεοτιδίου (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) • Μικρο-δορυφόροι ή αλληλουχίες με σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις (Microsatellites ή Short Tandem Repeats, STRs) • Μινι-δορυφόροι ή αλληλουχίες με ποικίλο αριθμό διαδοχικών επαναλήψεων (Minisatellites ή Variable Number of Tandem Repeats, VNTRs) SNPs • Σε μια συγκεκριμένη θέση ενός ομόλογου ζεύγους χρωμοσωμάτων (γενετικός τόπος) μπορεί να υπάρχει διαφορά ενός μόνο νουκλεοτιδίου (π.χ. σε ορισμένα άτομα να υπάρχει αδενίνη ενώ σε άλλα γουανίνη) • Αυτή η διαφορά οδηγεί στην παρουσία 2 αλληλομόρφων στον πληθυσμό (Α και G) από τα οποία προκύπτουν 3 γονότυποι (π.χ. ομoζυγωτία ΑΑ, ετεροζυγωτία ΑG, ομοζυγωτία GG) • Υπολογίζεται ότι το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει ~1 SNP σε κάθε 1000 βάσεις SNPs • Ανάλυση SNPs • Ενίσχυση με PCR του τμήματος DNA στο οποίο υπάρχει η πολυμορφική θέση, αλληλούχιση (μέθοδος Sanger) του προϊόντος της PCR και εντοπισμός της πολυμορφικής θέσης • Ειδική για αλληλόμορφα PCR • Ένας από τους 2 εκκινητές σχεδιάζεται έτσι ώστε να προσδένεται επάνω στο ένα αλληλόμορφο με αποτέλεσμα να μην μπορεί να προσδεθεί επιτυχώς στο άλλο αλληλόμορφο. Η παρουσία/απουσία προϊόντων ενίσχυσης καθορίζει το γονότυπο Χρωματίδα 1 Χρωματίδα 2 5’-TGGATCATGTCTA-3’ 5’-TGGATCGTGTCTA-3’ • Διάκριση SNPs από μεταλλάξεις: Ως μετάλλαξη ορίζεται μία αλλαγή στην αλληλουχία με συχνότητα στον πληθυσμό <1%, ο δε πολυμορφισμός με συχνότητα >1% STRs • Οι STRs είναι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που αποτελούνται από 2 – 6 νουκλεοτιδικές βάσεις Δι-νουκλεοτιδικές επαναλήψεις 5’-atgctagagtcccacacacacacacacacacacactgatggttaactg-3’ Τετρα-νουκλεοτιδικές επαναλήψεις 5’-atgctagagtccattcattcattcattcattcattcattcattcctgatggttaactg-3’ • Είναι διάσπαρτες στο ανθρώπινο γονιδίωμα με συχνότητα εμφάνισης ~1 STR • • • • κάθε 10.000 βάσεις Παρουσιάζουν υψηλό δείκτη ετεροζυγωτίας Η πολυμορφικότητα ενός STR καθορίζεται από το μέγεθος και τον αριθμό των αλληλομόρφων του Ο συνήθης αριθμός των επαναλήψεων είναι 15 – 30 Το συνολικό μήκος των αλληλομόρφων του κυμαίνεται μεταξύ 100-400 νουκλεοτιδικών βάσεων Παράδειγμα ανάλυσης περιοχών STR με PCR (ετεροζυγωτία – ομοζυγωτία) STRs • Πολλαπλή ενίσχυση γονιδιωματικού DNA με φθορίζουσα PCR σε γενετικό αναλυτή DNA για 5 πολυμορφικές θέσεις STR • Παρατηρούμε πως το συγκεκριμένο άτομο είναι ετερόζυγο (2 αλληλόμορφα) και στους 5 αυτούς γενετικούς τόπους D3S1358 TH01 D21S11 D18S51 Penta E VNTRs • Ότι ισχύει για τους STRs ισχύει και για τους VNTRs • Διαφορές: • Οι VNTRs είναι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που αποτελούνται από >15 (έως και 1000) νουκλεοτιδικές βάσεις • Ο τρόπος που είναι διάσπαρτοι στο γονιδίωμα δεν είναι συγκεκριμένος • Είναι λιγότερο πολυμορφικοί • Η διαφορά στο μέγεθος των αλληλομόρφων λόγω του αριθμού των επαναλήψεων μπορεί να καθοριστεί με απλή PCR και ανάλυση με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (Δεν χρειάζεται γενετικός αναλυτής DNA) VNTRs • Ανίχνευση του πολυμορφισμού στον γενετικό τόπο D1S80, στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1 • Φέρει ποικίλο αριθμό επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών VNTRs, από 15-41 επαναλήψεις (Budowle et al. 1995) Γενικά • Οι πολυμορφισμοί αξιοποιούνται στη γενετική ανάλυση (σύνδεση με • • • • • νοσήματα όπως διάφορες μορφές καρκίνου, κατασκευή γενετικών χαρτών κ.α.) Γενετικό αποτύπωμα (genetic fingerprinting, DNA typing, DNA profiling) είναι η τεχνική που χρησιμοποιείται για την διάκριση ατόμων με βάση την ανάλυση του DNA τους Παρόλο που η αλληλουχία DNA δύο διαφορετικών ατόμων είναι περίπου ίδια, είναι εξαιρετικά σπάνιο δύο άνθρωποι που δεν έχουν εξ’ αίματος συγγένεια να έχουν τα ίδια ακριβώς αλληλόμορφα σε πολλαπλούς πολυμορφικούς γενετικούς τόπους Όσο περισσότερες πολυμορφικές θέσεις χρησιμοποιηθούν στην γενετική ανάλυση τόσο μεγαλύτερη και η πιθανότητα ο ανιχνευόμενος συνδυασμός να διακρίνει ένα συγκεκριμένο και μοναδικό άτομο Οι συνδυασμοί πολυμορφισμών ακολουθούν τον μενδελικό τρόπο κληρονομικότητας Κάθε άτομο διαθέτει σχεδόν μοναδικό συνδυασμό, άρα έχει και ένα μοναδικό γενετικό αποτύπωμα Πρωτόκολλο άσκησης • Μέρος 1. • Χρησιμοποίηση του ανθρώπινου DNA γονιδιώματος που έχουμε απομονώσει από τα επιθηλιακά κύτταρα της στοματικής κοιλότητας Μέρος 2. • Αντίδραση PCR για την παραγωγή αντίγραφων της πολυμορφικής περιοχής (VNTR) D1S80 του χρωμοσώματος 1 Μέρος 3. • Ανάλυση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Μέρος 4. • Παρατήρηση του πηκτώματος σε υπεριώδες φως, φωτογράφηση και αξιολόγηση αποτελεσμάτων ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ Polymerase Chain Reaction (PCR) • Διατυπώθηκε το 1983 από τον Kary Mullis (Cetus Corporation) – Nobel Χημείας (1993) • Με επιλεκτική ενίσχυση οδηγεί στην in vitro παραγωγή εκατομμυρίων αντιγράφων συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA • Μιμείται τη φυσική κυτταρική διαδικασία της ενζυμικής αντιγραφής του DNA ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΗΣ PCR Μήτρα DNA • DNA το οποίο περιέχει την αλληλουχία που θέλουμε να ενισχύσουμε • Xρωμοσωμικό(γονιδιωματικό), πλασμιδιακό, ιικό, κ.α. • Απομόνωση και καθαρισμός από κυτταρικά συστατικά και πρωτεΐνες • Έλεγχος ποιότητας • Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης • Μέτρηση οπτικής πυκνότητας στα 260nm • Η αρχική ποσότητα που χρησιμοποιείται στην PCR είναι ελάχιστη (θεωρητικά από το DNA που απομονώνεται από ένα μόνο κύτταρο) Ζεύγος εκκινητών • Μικρού μήκους μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια • Ειδικά σχεδιασμένοι να υβριδοποιούνται στη μήτρα DNA • Προσδένονται στα άκρα της αλληλουχίας στόχου – οριοθετούν το τμήμα του DNA που θα ενισχυθεί – ορίζουν το σημείο έναρξης της αντιγραφής • Η υβριδοποίηση γίνεται μέσω δεσμών υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων • A-T (2 δεσμοί) / G-C (3 δεσμοί) • Πρόσθιος: συμπληρωματικός με την περιοχή που βρίσκεται στην 3΄ κατεύθυνση της αλληλουχίας στόχου στη μια αλυσίδα του DNA • Ανάστροφος: συμπληρωματικός με την περιοχή που βρίσκεται στην 5΄ κατεύθυνση της αλληλουχίας στόχου στη άλλη αλυσίδα του DNA Ιδανικό ζεύγος εκκινητών • Οι 2 εκκινητές πρέπει: • Να είναι ειδικοί • συμπληρωματικοί μόνο με συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA που πλαισιώνουν την αλληλουχία στόχο • χωρίς ομολογία με άλλες περιοχές του γονιδιώματος • Να έχουν θερμοκρασία τήξης (Tm) κατάλληλη για υβριδοποίηση σε θερμοκρασίες 50-65οC • Υπολογισμός Tm: 4οC x (G+C) + 2οC x (A+T) • Να έχουν μήκος >15 και <30 βάσεις και σύσταση σε G/C περίπου 50% • Να μην έχουν εσωτερική δευτεροταγή δομή • Να μην είναι συμπληρωματικοί μεταξύ τους • Χρήση διαδικτυακών λογισμικών προγραμμάτων για τον σχεδιασμό σωστών εκκινητών (π.χ. primer-blast, www.ncbi.nlm.nih.gov) DNA Πολυμεράση DNA Πολυμεράση T½ 95oC Επιμήκυνση (βάσεις/sec) Οργανισμός προέλευσης Taq 40 min 75 Thermus aquaticus Amplitaq (τμήμα Stoffel) 80 min >50 Thermus aquaticus Vent 400 min >80 Thermococcus litoralis Pfu >120 min 60 Pyrococcus furiosus Η πιο διαδεδομένη Τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια • deoxyriboNucleotide Triphosphates (dNTPs) • Τριφωσφορική δεοξυ-αδενοσίνη (dATP) • Τριφωσφορική δεοξυ-κυτιδίνη (dCTP) • Τριφωσφορική δεοξυ-γουανοσίνη (dGTP) • Τριφωσφορική δεοξυ-θυμιδίνη (dTTP) Άλας 2+ • MgCl2 – παρέχει ιόντα μαγνησίου (Mg ) τα οποία σταθεροποιούν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ εκκινητών, DNA και DNA πολυμεράσης Ρυθμιστικό διάλυμα • Παρέχει σταθερό pH (~8.5) για βέλτιστη απόδοση της DNA πολυμεράσης ΔΙΑΔΙΚΑΣΙA ΤΗΣ PCR Διαδικασία της PCR • Η αντίδραση πραγματοποιείται σε 25-40 κύκλους • Κάθε κύκλος αποτελείται από 3 βήματα εναλλαγής θερμοκρασιών 1ος κύκλος PCR Βήμα 1: Θέρμανση στους 95°C • Τα μόρια δίκλωνου DNA αποδιατάσσονται • Η Taq DNA πολυμεράση δεν καταστρέφεται 1ος κύκλος PCR Βήμα 2: Ψύξη στους 50-65°C Οι εκκινητές (πρόσθιος και ανάστροφος) προσδένονται στις συμπληρωματικές με αυτούς περιοχές των μορίων μονόκλωνου DNA δημιουργώντας δίκλωνες περιοχές. Η DNA πολυμεράση συνδέεται σε αυτές τις περιοχές 1ος κύκλος PCR Βήμα 3: Θέρμανση στους 72°C Η DNA πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές προσθέτοντας σταδιακά dNTPs, συνθέτοντας συμπληρωματικές αλυσίδες Στο τέλος του κύκλου έχουν παραχθεί τα διπλάσια μόρια δίκλωνου DNA από αυτά που υπήρχαν στην αρχή 2ος κύκλος PCR • Επανάληψη 1ου και 2ου βήματος • Αποδιάταξη του DNA – πρόσδεση των εκκινητών – σύνδεση της DNA πολυμεράσης στις περιοχές πρόσδεσης 2ος κύκλος PCR Επανάληψη 3ου βήματος • Η DNA πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές συνθέτοντας συμπληρωματικές αλυσίδες Διπλασιασμός μορίων δίκλωνου DNA στο τέλος του κύκλου 3ος κύκλος PCR Επανάληψη 1ου, 2ου και 3ου βήματος • Αποδιάταξη – πρόσδεση – επιμήκυνση • Παραγωγή των πρώτων αμπλικονίων • Αντίγραφα με μέγεθος που καθορίζεται από τα σημεία πρόσδεσης και των δύο εκκινητών Θεωρητική απόδοση της PCR • Στο τέλος κάθε κύκλου παράγονται τα διπλάσια μόρια αλληλουχίας στόχου από αυτά που υπήρχαν στην αρχή του κύκλου • Αυτό οδηγεί στην εκθετική αύξηση των προϊόντων • Ποσότητα της αλληλουχίας στόχου που παράγεται: • N = 2t (N0) • N είναι ο αριθμός των αντιγράφων στο τέλος της PCR • t είναι ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης • Ν0 είναι ο αριθμός των μορίων μήτρας DNA στην αρχή της PCR Αν t=35 και N0=102 τότε N = 235(102) = 6.9x1012 Πραγματική απόδοση της PCR • Αρχική φάση: Τα συστατικά βρίσκονται σε περίσσεια. Η παραγωγή περιορίζεται από τη χαμηλή αρχική συγκέντρωση του DNA • Γραμμική φάση: Τα αντίγραφα της αλληλουχίας στόχου αυξάνονται εκθετικά • Τελική φάση (πλατό): Εξάντληση των συστατικών / μείωση της δραστικότητας του ενζύμου Αντίδραση Συστατικά πριν τον 1ο κύκλο Πρόσδεση (60°C) Συστατικά μετά τον 35ο κύκλο Αποδιάταξη (95°C) Κύκλος PCR Επιμήκυνση (72°C) Προϊόντα Ποσότητα συστατικών / Αντίδραση • Τελικός όγκος αντίδρασης: 25-100μl • Μήτρα DNA: 1ng-1μg • Πρόσθιος εκκινητής: 0,05-2.0μΜ • Ανάστροφος εκκινητής: 0,05-2,0μΜ • dNTPs: 200μM το κάθε ένα • Taq DNA πολυμεράση: 0,01-0,05 μονάδες/μl • MgCl2: 1,5-2,5 mM • Buffer: 1X • Μεγαλύτερες ποσότητες οδηγούν σε μη-ειδική ενίσχυση • Μικρότερες ποσότητες οδηγούν σε μειωμένη παραγωγή Προγραμματισμός PCR • 95οC για 5 λεπτά (Αρχική αποδιάταξη) • 95οC για 30 δευτερόλεπτα (Αποδιάταξη) • 60οC για 30 δευτερόλεπτα (Πρόσδεση) • 72οC για 40 δευτερόλεπτα (Επιμήκυνση) 25-40 φορές Θερμοκυκλοποιητής • 72οC για 10 λεπτά (Τελική επιμήκυνση) Ανάλυση του προϊόντος της PCR Μ 1 2 3 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Μ: Τμήματα DNA γνωστού μεγέθους 1: Θετικός μάρτυρας (περιέχει την αλληλουχία στόχο –έλεγχος απόδοσης της αντίδρασης) 2: Αρνητικός μάρτυρας (δεν περιέχει DNA – έλεγχος επιμόλυνσης) 3: Προϊόν PCR (<3kb με την Taq DNAπολυμεράση) Πλεονεκτήματα / Μειονεκτήματα • Πλεονεκτήματα • Ειδικότητα • Ευαισθησία • Απαιτεί ελάχιστη αρχική ποσότητα DNA • Αποτελεσματική σε τεμαχισμένο DNA • Μειονεκτήματα • Ψευδώς θετικά/αρνητικά αποτελέσματα • Απαιτεί τυποποίηση • Κίνδυνος επιμόλυνσης
© Copyright 2024 Paperzz
