Εργαστηριακή Διάγνωση της HIV λοίμωξης Δρ. Μαρία Κοτσιανοπούλου Βιολόγος Υπεύθυνη Εργαστηριού Κέντρου Αναφοράς AIDS, ΕΣΔΥ Διάγνωση της HIV λοίμωξης Από το 1985 και μέχρι σήμερα η διαγνωστική διαδικασία που ακολουθείται προκειμένου να καθοριστεί η HIV λοίμωξη είναι: η αναζήτηση αντισωμάτων έναντι του ιού με ανοσοενζυμική μέθοδο (EIA) και ακολουθεί σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος η επιβεβαίωση με τη μέθοδο Western Blot (W.Bl.). Ο έλεγχος ξεκινάει πάντα με την ανοσοενζυμική δοκιμασία διαλογής που ανιχνεύει την παρουσία αντισωμάτων έναντι του ιού HIV και έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύσει όσο το δυνατόν περισσότερες HIV περιπτώσεις . Χρησιμοποιούνται ευρέως, λόγω της υψηλής ευαισθησίας και καταλληλότητάς τους για τον έλεγχο μεγάλου αριθμού δειγμάτων, ιδιαίτερα στις αιμοδοσίες. Η δοκιμασία W.Blot ( ή ανοσοαποτύπωση) στην πραγματικότητα είναι παρόμοια με τη δοκιμασία ΕΙΑ με την έννοια ότι ανιχνεύουν στο δείγμα αντισώματα έναντι των ειδικών πρωτεϊνών του ιού. Ο πρωταρχικός ρόλος της επιβεβαιωτικής δοκιμασίας είναι η εξασφάλιση ότι τα δείγματα που βρίσκονται anti-HIV θετικά με τις δοκιμασίες διαλογής είναι πραγματικά θετικά ή αρνητικά για τη HIV λοίμωξη. • Η δοκιμασία Western Blot είναι η πιο διαδεδομένη επιβεβαιωτική μέθοδος που εφαρμόζεται στα Κέντρα Αναφοράς AIDS μέχρι και σήμερα στη χώρα μας και στην Ευρώπη. Επιβεβαιωτική δοκιμασία (Western Blot). Οι ιικές πρωτεΐνες (αντιγόνα) χωρίζονται ανάλογα με το μοριακό βάρος τους μέσω ηλεκτροφόρησης και μεταφέρονται σε μια μεμβράνη, η οποία στη συνέχεια χρησιμοποιείται ως μία ταινία για κάθε δείγμα και επωάζεται με τον ορό ή πλάσμα του αντίστοιχου δείγματος. New Lav Blot I / II protocol 5 min 2H 1H 6 to 15 min CHROMOGEN CONJUGATE PATIENT SAMPLE Western blot strip Ανάλογα με τα αντισώματα που υπάρχουν στο δείγμα αντίστοιχες μπάντες εμφανίζονται στην ταινία. Οι διάφορες πρωτεΐνες του HIV ταξινομούνται σε δύο λειτουργικές ομάδες, που παράγονται από τρείς γονιδιακές περιοχές του HIV (gag, env, pol): "p" - πρωτεΐνες, "gp" – γλυκοπρωτεΐνες Western blot p17 p66/51 HIV Confirmation : New Lav Blot I / II • Με τη δοκιμασία W. Bl. συνήθως αναζητούμε τα αντισώματα έναντι των ακόλουθων πρωτεινών του ιού HIV: • πρωτεινες του περιβλήματος: gp41, gp120/160 • πρωτεινες του πυρήνα: p18, p24, p55 • ένζυμα του ιού: p31, p51, p66. HIV1 HIV2 Για να θεωρηθεί ένα δείγμα θετικό με Western Blot σύμφωνα με τα προτεινόμενα κριτήρια κατά CDC για την HIV-1 και HIV-2 λοιμώξεις απαιτείται η παρουσία αντίστοιχων αντισωμάτων έναντι δύο τουλάχιστον πρωτεϊνών από τις παρακάτω: p24 p26 gp41 gp31 gp120/160 gp125/140 Οι επιβεβαιωτικές δοκιμασίες αυξάνουν σημαντικά την εξειδίκευση της ανίχνευσης, όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τις δοκιμασίες διαλογής. Στις περισσότερες περιπτώσεις, είναι τουλάχιστον τόσο ευαίσθητες όσο και οι συγκεκριμένες δοκιμασίες διαλογής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, τα αποτελέσματα είναι είτε σαφώς θετικά ή αρνητικά. Διάγνωση της HIV λοίμωξης Είναι δυνατόν η επιβεβαιωτική δοκιμασία ενός θετικού με EIA δείγματος να δώσει αρνητικό ή ακαθόριστο αποτέλεσμα. • Στην εικόνα παρουσιάζονται δυο δείγματα με τη δοκιμασία W. Blot, που ελέγχθηκαν μετά από 15-30 ημέρες. Σε κανένα δείγμα δεν είχε αλλάξει το προφίλ κλασμάτων που παρατηρήθηκε σε αρχικές λήψεις. Η σωστή και γρήγορη αντιμετώπιση των ακαθόριστων αποτελεσμάτων, όπως φαίνεται, δεν μπορεί να γίνει με συμβατικές στρατηγικές (επιβεβαίωση θετικού anti-HIV αποτελέσματος με τη δοκιμασία Western Blot). Θα μπορούσε να εφαρμοσθεί η αναζήτηση του p24 Ag HIV στον ορό, που επιτυγχάνεται σε 2-4 εβδομάδες πριν από την εμφάνιση των αντισωμάτων, περίπου τη 14 η -15 η ημέρα μετά την μόλυνση με τον HIV. Η ανίχνευση του p24 AgHIV στον ορό αποτελεί μάλλον ένα ασταθές εύρημα, δεδομένου ότι η δοκιμασία στερείται ευαισθησίας για τη διάγνωση της HIV πρωτολοίμωξης, αφού ανιχνεύεται μόνο στο 75% των περιπτώσεων οξείας HIV λοίμωξης και η περίοδος αντιγοναιμίας είναι σύντομη και μετά την ανάπτυξη αντισωμάτων συνήθως δεν ανιχνεύεται. Αν η δοκιμασία ανίχνευσης του p24 Ag HIV έχει περιορισμένες δυνατότητες, οι δοκιμασίες ανίχνευσης του HIVRNΑ έχουν πολύ υψηλή ευαισθησία και όλο πιο συχνά εφαρμόζονται στις μέρες μας. Για την επίλυση των περιπτώσεων με ακαθόριστα αποτελέσματα οι καταλληλότερες μέθοδοι είναι η ανίχνευση του HIV RNA και του p24 AgHIV Πιστεύουμε ότι η προσθήκη της δοκιμασίας ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων (HIVRNA) και AgHIV είναι πλέον επαρκής για να μας επιτρέπουν να συμπεράνουμε ότι αυτή η μορφή των δοκιμών θα πρέπει να είναι ένα πρότυπο εργαλείο για την πρόληψη και την επιτήρηση της HIV λοίμωξης και για τη φροντίδα των οροθετικών ατόμων. Ανάλογα με την κλινική εικόνα του ασθενούς και τους παράγοντες κινδύνου προτείνεται η εξής πορεία δράσης: 1) για ασθενείς με χαμηλούς παράγοντες κινδύνου συνιστάται η επανάληψη της δοκιμασίας ανίχνευσης anti-HIV εντός 15-30 ημερών 2) για ασθενείς με παράγοντες υψηλού κινδύνου συνιστάται έλεγχος για p24 Ag και HIV RNA για το ενδεχόμενο μιας οξείας HIV λοίμωξης Εντούτοις, επειδή δεν είναι δυνατή η διερεύνηση του παράγοντα κινδύνου σε κάθε περίπτωση, σε όλα τα ακαθόριστα δείγματα συνιστάται να γίνεται έλεγχος για την ανίχνευση του p24 Ag και HIV RNA. Οι μεγάλες δυσκολίες με την εργαστηριακή διάγνωση της HIV λοίμωξης περιλαμβάνουν: 1) ψευδώς θετικά αποτελέσματα με ανοσοενζυμικές δοκιμασίες ανίχνευσης αντισωμάτων έναντι του ιού, 2) ακαθόριστα αποτελέσματα με τη δοκιμασία Western blot, 3) εργαστηριακή διάγνωση της HIV πρωτολοίμωξης, 4) εργαστηριακή διάγνωση της HIV λοίμωξης στα νεογέννητα οροθετικής μητέρας και 5) ύπαρξη των τεχνικών λαθών. Το σημαντικότερο πρόβλημα είναι η διάγνωση της οξείας HIV λοίμωξης. Παρά τη μεγάλη πρόοδο στην κλινική θεραπεία της λοίμωξης, τα HIV οροθετικά άτομα εξακολουθούν να αναγνωρίζονται πολύ αργά στη πορεία της λοίμωξης. Περίπου το ήμισυ των ασθενών που έχουν ταυτοποιηθεί με τον ιό HIV γνωρίζουν τη κατάσταση τους μόνο όταν έχουν προχωρημένη νόσο. Πρόσφατες εκτιμήσεις του CDC δείχνουν ότι το 38,3% ασθενών αναπτύσσουν AIDS σε 1-3 χρόνια μετά τη διάγνωση της HIV λοίμωξης. Συμφώνα με τις εκτιμήσεις, στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης οι καθυστερημένες διαγνώσεις κυμαίνονται από 26% έως 53%. Τα στοιχεία αυτά υποδεικνύουν ότι οι προσπάθειες για τον εντοπισμό των ατόμων νωρίς στην πορεία της HIV λοίμωξης είχαν περιορισμένη επιτυχία. Υπάρχουν τρείς κύριοι λόγοι για τους οποίους η ανίχνευση όλων των περιπτώσεων HIV λοίμωξης είναι ιδιαίτερα σημαντική. Πρώτον, η αναγνώριση της οξείας HIV λοίμωξης επιτρέπει την κατάλληλη κλινική διαχείριση. Όταν ενδείκνυται, η αντιρετροϊκή θεραπεία μπορεί να παρέχεται και να καθυστερήσει την εξέλιξη της νόσου. Δεύτερον, η αναγνώριση των ατόμων με οξεία HIV λοίμωξη μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη περαιτέρω μετάδοσης του ιού. Τρίτον, η αναγνώριση της οξείας λοίμωξης μπορεί να επιφέρει τη βελτίωση της εποπτείας της HIV/AIDS επιδημίας. Αλγόριθμος ορολογικού screening ELISA HIV1/2 &O + - HIV-1 WB + HIV-1 ΛΟΙΜΩΞΗ - AMΦΙΒΟΛΟ HIV-2 WB ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ AΡΝΗΤΙΚΟ Οι τρέχουσες κατευθυντήριες οδηγίες που προτείνει το CDC υποστηρίζουν των αποκλεισμό της δοκιμασίας Western Blot από τον αλγόριθμο ανίχνευσης της HIV λοίμωξης. anti-HIV1/2 – Ag HIV ( EIA 4 ης γενιάς) Θετικό (+) Αρνητικό (-) Western blot Θετικό (+) Αρνητικό (-) ή ακαθόριστο p24 AgHIV θετικό Θετικό (+) Αρνητικό (-) HIVRNA αρνητικό 3073 anti-HIV1/2 – Ag HIV ( EIA 4 ης γενιάς) 1927 (+) 1146 (-) Western blot 1741(+) 184 (-) ή ακαθόριστα p24 AgHIV 2 θετικά 91 (+) 93 Αρνητικά (-) HIVRNA 91 αρνητικα Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι με τη συμβατή διαδικασία εντοπίσαμε το 94,83% των HIV λοιμώξεων (1743 από τα 1836 δείγματα) σε σύγκριση με έναν αλγόριθμο που περιλαμβάνει τη δοκιμασία ανίχνευσης του p24 Ag και HIV RNA για τον καθορισμό της οξείας HIVλοίμωξης. Με τον αλγόριθμο αυτό ο αριθμός HIV οροθετικών δειγμάτων ήταν κατά 93 κρούσματα παραπάνω, αυξάνοντας έτσι την ακρίβεια και την αποτελεσματική εκτίμηση της HIV λοίμωξης. Εργαστηριακή διάγνωση κάθετης μετάδοσης γέννηση 4η-7η εβδομάδα 8η-16η εβδομάδα King SM, Pediatrics 2004 εφαρμογή ποσοτικής μέτρησης του HIV-RNA Αποκλεισμός κάθετης μετάδοσης HIV ≥ 2 αρνητικές ιολογικές εξετάσεις ηλικία ≥ 1 μήνα ηλικία ≥ 4 μήνες ≥ 2 αρνητικές εξετάσεις προσδιορισμού Abs σε ηλικία ≥ 6 μήνες Έλεγχος HIV λοίμωξης στην εγκυμοσύνη: WHO συστάσεις εγκυμοσύνη εξέταση στο 1ο τρίμηνο επαναληπτικός έλεγχος στο δεύτερο τρίμηνο σε άτομα υψηλού κινδύνου Έλεγχος HIV λοίμωξης: WHO συστάσεις Σήμερα τα περισσότερα προγράμματα επαγρύπνησης και πρόληψης, στοχεύουν στη μείωση της εξάπλωσης της νόσου μέσω της έγκαιρης διάγνωσης. εργαστηριακός έλεγχος ρουτίνας σε όλα τα άτομα (13-64 ετών) επανάληψη κάθε χρόνο σε άτομα με συμπεριφορά υψηλού κινδύνου Κλινική χρήση ποσοτικού προσδιορισμού ιϊκού φορτίου Ο ποσοτικός προσδιορισμός του HIV RNA αποτελεί μία πολύ σημαντική εξέταση για την μέτρηση των επιπέδων ιϊκού φορτίου (συγκέντρωση του HIVRNA) στο αίμα του ασθενούς. ΓΟΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (ΑΝΤΟΧΗ) ΓΙΑ ΤΟΝ ΙΟ HIV • Ο ιός HIV μεταλλάσεται πολύ γρήγορα. Αυτό μπορεί να συμβεί τυχαία, αλλά συνήθως προκαλείται απο τα φάρμακα που χορηγούνται στον ασθενή. • Η μελέτη ανάπτυξης αντοχής (resistance testing) είναι ένα απαραίτητο εργαλείο για την ανίχνευση αποτέλεσματηκότητας φαρμάκων στον ασθενή. Ποιοτικός έλεγχος. Ο ποιοτικός έλεγχος για την επιβεβαιωτικές δοκιμασίες είναι πιο δύσκολή διαδικασία από αυτή της ΕΙΑ. Ο κύριος λόγος είναι ότι οι συστάσεις για τον ποιοτικό έλεγχο πρέπει να συμβιβάζεται με το τι είναι επιστημονικά αναγκαίο και τι είναι οικονομικά εφικτό. ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΠΟΛΥ!