ΠΡΩΤΕΙΝΟΥΡΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ ΟΥΡΩΝ Νικολάου Χρυσούλα ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΣΤΑ ΟΥΡΑ  Το ποσό του λευκώματος που περνά από το αγγειώδες σπείραμα είναι 36 g/24ώρο.  Επαναρροφάται όλο από τα κύτταρα των εσπειραμένων σωληναρίων και τελικά με τα ούρα χάνονται 150 mg/24ώρο.  Το λεύκωμα των φυσιολογικών ούρων είναι: σφαιρίνες χαμηλού ΜΒ (30000) αλβουμίνη (α2 > β> γ).  Άλλες αζωτούχες ουσίες που δίνουν θετικές τις αντιδράσεις του λευκώματος και βρίσκονται στα φυσιολογικά ούρα, παράγονται στο νεφρό, στα σωληνάρια ή εκκρίνονται από τα κύτταρα του ουροαποχετευτικού ή ακόμη και από τα πυοσφαίρια. Αυτές είναι οι μυκίνες.  Το λεύκωμα Tamm Horsfall παράγεται από τα νεφρικά σωληνάρια και αποτελεί το στρώμα των κυλίνδρων. Πρωτεΐνες στα φυσιολογικά ούρα Οι πρωτεΐνες του πλάσματος με ΜΒ < 50 – 70.000 περνούν την βασική μεμβράνη του αγγειώδους σπειράματος και επαναρροφώνται από τα εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια. Η αλβουμίνη με ΜΒ 69000 διηθείται, αλλά σε μικρές ποσότητες.  η πρωτεΐνη που δεσμεύει την ρετινόλη  η β2 μικροσφαιρίνη  οι ελαφρές αλυσίδες των ανοσοσφαιρινών και  η λυσοζύμη απεκκρίνονται σε μικρές ποσότητες. Πρωτεΐνες στα φυσιολογικά ούρα Πρωτεΐνη % της ολικής πρωτεΐνης Μέγιστη ημερήσια ποσότητα Αλβουμίνη 40% 60 mg Tamm – Horsfall 40% 60 mg Ανοσοσφαιρίνες 12% 24 mg Εκκριτική IgA 3% 6 mg Άλλες 5% 10 mg 100% 150 mg Ολική πρωτεΐνη Πρωτεϊνουρία είναι η αύξηση του λευκώματος στα ούρα σε ποσότητα ≥ 150 mg/ 24ώρο Μηχανισμοί πρωτεϊνουρίας     Σπειραματική Σωληναριακή Πρωτεϊνουρία από υπερφόρτωση Εξωνεφρική λειτουργική πρωτεϊνουρία Σπειραματική Πρωτεϊνουρία (α) Αύξηση της διαβατότητας του τοιχώματος των αγγείων του αγγειακού σπειράματος. Αρχικά μικρή λευκωματουρία ( αλβουμίνη &τρανσφερίνη) αργότερα βαρειά ( νεφρωσικό σύνδρομο > 3 – 3,5 g/ ημέρα) Συνοδεύονται από μείωση των πρωτεϊνών στον ορό του αίματος. Σπειραματική Πρωτεϊνουρία (β) Μεγάλες πρωτεΐνες ( α2 μακροσφαιρίνη, β λιποπρωτεΐνη ) εμφανίζονται στα ούρα σε βαριές βλάβες στο σπείραμα (μη εκλεκτική πρωτεϊνουρία). Όσο η σωληναριακή επαναρροφητική λειτουργία διατηρείται οι μικρές πρωτεΐνες (α1 & β2 μικροσφαιρίνες ) επαναρροφώνται. Παρατηρείται σε: οξεία στρεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα  χρόνια σπειραματονεφρίτιδα και  νεφρωσικό σύνδρομο Σπειραματική Πρωτεϊνουρία (γ) Ο βαθμός διήθησης της πρωτεΐνης από την βασική μεμβράνη του σπειράματος εξαρτάται από:  Μοριακό βάρος  Καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης  Συγκέντρωση πρωτεινών στο πλάσμα  Επαναρρόφηση της πρωτείνης από τα νεφρικά σωληνάρια ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΠΕΙΡΑΜΑΤΟΝΕΦΡΙΤΙΔΑΣ  Δημιουργία αντισωμάτων(Ab) έναντι αντιγονικών στοιχείων της βασικής μεμβράνης με εναπόθεση αντιγόνου (Ag) και συμπληρώματος ( μοριακή μίμηση)  Σχηματισμός κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλεγμάτων (ΑΣ) , το Ag των οποίων δεν είναι απαραίτητα σπειραματικής προέλευσης ( βακτηριακά Ag, αυτό Ag ) Η ιστική βλάβη προκαλείται από :  ενεργοποίηση του συμπληρώματος  ανοσοσυμπλέγματα  προσέλκυση ουδετεροφίλων  φλεγμονή  ενεργοποίηση της πήξης και  σχηματισμό ινώδους Λευκωματουρία σωληναριακή Οφείλεται σε ελάττωση της απορροφητικότητας του λευκώματος από τα νεφρικά σωληνάρια. Τα μικρού ΜΒ διερχόμενα από το σπείραμα λευκώματα του πλάσματος (α1 μικροσφαιρίνη, β2 μικροσφαιρίνη, ελαφρές αλυσίδες ανοσοσφαιρινών και λυσοζύμη) χάνονται στα ούρα. Παρατηρείται σε : νεφρικές παθήσεις σύνδρομο Fanconi νόσο του Wilson οξεία σωληναριακή νέκρωση και πυελονεφρίτιδα. Βαθμός πρωτεϊνουρίας 1‐2 g/ημ. Πρωτεϊνουρία από υπερφόρτωση Χαρακτηρίζεται από αυξημένες συγκεντρώσεις στον ορό πρωτεϊνών, όπως μονοκλωνικών ανοσοσφαιρίνων και παραγωγή ελεύθερων ελαφρών αλύσεων στις δυσγαμμασφαιριναιμίες. Οι ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες λόγω του χαμηλού τους ΜΒ διηθούνται από το σπείραμα, εξαντλούν την επαναρροφητική δυνατότητα των σωληναρίων και αποβάλλονται μαζικά στα ούρα, όπως η Bence Jones πρωτεΐνη. Το λεύκωμα Bence‐Jones εμφανίζεται στα ούρα γρήγορα, γιατί η διήθηση των ελαφρών αλύσεων γίνεται χωρίς ουδό. Εξωνεφρική λειτουργική πρωτεϊνουρία ελαφρού βαθμού μέχρι 1 g/ημ. Σε νόσους που επηρεάζουν την ομαλή αγγειακή λειτουργία του νεφρού:  δ/χές κυκλοφορικού στις καρδιοπάθειες  πιέσεις νεφρικών αγγείων  εμπύρετες καταστάσεις  μετά από έντονη μυϊκή δραστηριότητα  ορθοστατική λευκωματουρία ΝΕΦΡΩΣΙΚΟ ΣΥΝΔΡΟΜΟ (ΝΣ): Πρωτεΐνη ούρων > 3,5 g/ 24ώρο  Πρωτοπαθές Ν.Σ.: λιποειδής νέφρωση (σοβαρή) μεμβρανώδης σπειραματονεφρίτιδα μεμβρανοϋπερπλαστική σπειραματονεφρίτιδα  Δευτεροπαθές Ν.Σ. : σακχαρώδης διαβήτης συστηματικός ερυθηματώδης λύκος αμυλοείδωση και άλλες διηθητικές νόσοι θρόμβωση νεφρικής φλέβας Συνήθη αίτια της καλοήθους πρωτεϊνουρίας        Αφυδάτωση Stress μετά από συγκίνηση Πυρετός Εγκαύματα Έντονη μυϊκή άσκηση Υποθερμία Ορθοστατική πρωτεϊνουρία (σταθερή στην όρθια θέση, ελάχιστη ή απούσα με την κατάκλιση) ΑΙΤΙΑ ΠΡΩΤΕΙΝΟΥΡΙΑΣ Λειτουργική εντατική μυϊκή άσκηση εγκυμοσύνη ορθοστατική πρωτεϊνουρία Νεφρική σπειραματονεφρίτιδα νεφρωσικό σύνδρομο νεφρικός όγκος λοίμωξη νεφρών Προνεφρική πυρετός νεφρική ισχαιμία (υποξία) υπέρταση Μετανεφρική κυστίτιδα ουρηθρίτιδα, προστατίτιδα επιμόλυνση με κολπικές εκκρίσεις Προνεφρική πρωτεϊνουρία από υπερφόρτωση Αυξημένες συγκεντρώσεις στο πλάσμα χαμηλού ΜΒ πρωτεϊνών και αυξημένη έκκρισή τους στα ούρα. Οι πρωτεΐνες είναι: μυοσφαιρίνη αιμοσφαιρίνη πρωτεΐνες οξείας φάσης ή Bence jones πρωτεΐνη Διαταραχές : Μυική βλάβη ενδιαγγειακή αιμόλυση λοίμωξη φλεγμονή πολλαπλούν μυέλωμα Νεφρική σπειραματική πρωτεϊνουρία (α) Βλάβη σπειράματος: • εκλεκτική: αύξηση αλβουμίνης και μεσαίου ΜΒ πρωτεϊνών από το πλάσμα ή • μη εκλεκτική παρουσία στα ούρα και πρωτεϊνών υψηλού ΜΒ, οι οποίες προέρχονται από το πλάσμα. Διαταραχές: Πρωτοπαθείς : σπειραματονεφρίτιδα, σπειραματοσκλήρυνση σπειραματοπάθεια των ελαχίστων αλλοιώσεων Προεκλαμψία λευχαιμία λέμφωμα, φάρμακα (πενικιλλαμίνη, λίθιο) και τοξίνες (βαρειά μέταλλα) Νεφρική σπειραματική πρωτεϊνουρία (β) Διαταραχές Δευτεροπαθείς: μεταστρεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα,  σακχαρώδη διαβήτη,  ΣΕΛ,  αμυλοείδωση,  δρεπανοκυτταρική αναιμία,  απόρριψη μοσχεύματος,  λοιμώξεις (μαλάρια, ηπατίτις Β, μικροβιακή ενδοκαρδίτις) Παροδική αλλαγή στην λειτουργία του σπειράματος: έντονη άσκηση, πυρετός, αφυδάτωση, υπέρταση, ορθοστατική πρωτεϊνουρία, stress, παρατεταμένη έκθεση στο ψύχος Σωληναριακή πρωτεϊνουρία Μειωμένη σωληναριακή επαναρρόφηση πρωτεϊνών. Αύξηση του χαμηλού ΜΒ πρωτεϊνών και αλβουμίνης Διαταραχές : οξείας και χρόνια πυελονεφρίτιδα, διάμεση νεφρίτιδα, νεφρική σωληναριακή οξέωση, φυματίωση νεφρού, σύνδρομο Fanconi, ΣΕΛ, κυστίνωση, γαλακτοζαιμία, Ν. Wilson, αιμοσφαιρινουρία‐μυϊκή βλάβη, φάρμακα (αμινογλυκοσίδες, σουλφοναμίδες, πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες), τοξίνες και δηλητήρια (βαρέα μέταλλα) απόρριψη μοσχεύματος, έντονη μυϊκή άσκηση Μετανεφρική πρωτεϊνουρία Επιμόλυνση των ούρων από πρωτείνες εκκρίσεων γειτονικών οργάνων. (Πύον, αίμα, εμμήνου ρύσεως, αίμα, αιμορροΐδες, κολπικές εκκρίσεις, προστατικές εκκρίσεις) Διαταραχές  φλεγμονή κακοήθεια  βλάβη  τραυματισμός  επιμόλυνση κατά την ούρηση ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ ΤΩΝ ΟΥΡΩΝ ΓΙΑ ΠΡΩΤΕΙΝΗ • Μέθοδος των αντιδραστηρίων ταινιών ( ΗΜΙΠΟΣΟΤΙΚΉ) • Μέθοδος του θειοσαλικυλικού οξέος ( ΠΟΣΟΤΙΚΗ ) • Μέθοδος βρασμού και οξεικού οξέος (ΠΟΙΟΤΙΚΗ) • Μέθοδοι ανιχνεύσεως των ειδικών πρωτεϊνών (λεύκωμα Bence Jones, λεύκωμα της μικρολευκωματουρία, λεύκωμα της ορθοστατικής λευκωματουρίας, μυκίνης) (ΠΟΙΟΤΙΚΗ) • Ηλεκτροφόρηση των λευκωμάτων των ούρων ανοσοκαθήλωση ( ΠΟΙΟΤΙΚΗ) και η Μέθοδος των αντιδραστηρίων ταινιών (α) Η μέτρηση του λευκώματος γίνεται με την αντιδραστήρια ταινία σε πρωινά ούρα μετά από καλή ανάδευση, ενώ η ποσοτική μέτρηση γίνεται στο υπερκείμενο φυγοκεντρημένων ούρων 24ώρου, γιατί τα κύτταρα που υπάρχουν μπορούν να προκαλέσουν ψευδώς υψηλές τιμές πρωτεΐνης. Η ανίχνευση της πρωτεΐνης στα ούρα με την ταινία (στικ) βασίζεται στην αρχή του πρωτεϊνικού σφάλματος των δεικτών PH ,η πρωτεΐνη δέχεται ιόντα υδρογόνου από τον δείκτη ( κυανό της τετραβρωμοφαινόλης και όξινο ρυθμιστικό διάλυμα ) Η ταινία έχει σταθερό PH = 3 , κίτρινο χρώμα ( απουσία πρωτεΐνης ) Ύπαρξη πρωτεΐνης : αλλαγή χρώματος (από κίτρινο σε διάφορες αποχρώσεις του πράσινου που αντιστοιχούν σε ίχνη, 1+, 2+, 3+, 4+) Η ταινία είναι πιο ευαίσθητη για την ανίχνευση αλβουμίνης απ΄ ότι για τις σφαιρίνες, την πρωτεΐνη Bence Jones ή τις βλεννοπρωτεΐνες. Μέθοδος των αντιδραστηρίων ταινιών (β) ΨΕΥΔΩΣ (+): συμπυκνωμένα ούρα  ε.β., πολύ αλκαλικά ούρα > 8.5, μικροβιουρία Δεν επηρεάζονται από φάρμακα, ακτινοσκιερές ουσίες Κατά την παραμονή των ούρων το PH αυξάνει προς το αλκαλικό, γιατί χάνεται μέρος CO2 και γιατί η μικροβιακή δραστηριότητα παράγει αμμωνία από την ουρία. ΨΕΥΔΩΣ (‐): αραιωμένα ούρα, ύπαρξη ελαφρών αλυσίδων κ ή λ πρωτεΐνης Bence Jones Επίσης η δοκιμή για λεύκωμα με τις ταινίες δεν είναι κατάλληλη για ούρα εξ αρχής χρωματισμένα, όπως αυτά με χολοχρωστικές, με φάρμακα της ομάδας της πυριδίνης με ζωηρό πορτοκαλί χρώμα. THE URINE DIPSTICK Protein Chemical Principle Μέθοδος του θειοσαλικυλικού οξέος ή τριχλωροξεικού οξέος ( ΠΟΣΟΤΙΚΗ ) Βασίζονται στην καθίζηση του λευκώματος που προκαλεί η προσθήκη εν ψυχρώ σουλφοσαλικυλικά ή τριχλωροξεικού οξέος στα ούρα. Η θολερότητα που προκύπτει μετριέται φωτομετρικά ή νεφελομετρικά. Αξιολογείται ο βαθμός της ελαττώσεως της έντασης του φωτός (θολοσιμετρία). Ανιχνεύουν λευκωματίνη και σφαιρίνες και ελαφρές αλυσίδες ανοσοσφαιρίνων. Όριο ανίχνευσης 5 ‐ 10 mg/dl. Μέθοδος του θειοσαλικυλικού οξέος ή τριχλωροξεικού οξέος (β) ΨΕΥΔΩΣ (+): συμπυκνωμένα ούρα υψηλού ε.β., μεταβολίτες φαρμάκων, ακτινοσκιερές ουσίες ΨΕΥΔΩΣ (‐): αραιά ούρα, αλκαλικά ούρα. Δεν επηρεάζονται από αντισηπτικά  Ο ποσοτικός προσδιορισμός του λευκώματος με αυτοναλυτές στηρίζεται στη σύνδεση του λευκώματος με χρωμογόνο ουσία σε ορισμένο PH.  Η ένταση του εμφανιζόμενου χρώματος που είναι ανάλογη με το ποσό του λευκώματος στο δείγμα των ούρων μετριέται σπεκτοφωτομετρικά. Ανίχνευση των ειδικών πρωτεϊνών Λεύκωμα Bence‐Jones : Αποτελείται από τις μονοκλωνικές κ και λ ελαφρές αλυσίδες των ανοσοσφαιρίνων ΜΒ = 20 – 25.000.  Περνούν άνετα χωρίς ουδό από το αγγειακό σπείραμα, αλλά επαναρροφούνται από τα νεφρικά σωληνάρια.  Όταν το ποσό τους στο πλάσμα είναι μεγάλο, δεν απορροφάται όλο από τα νεφρικά σωληνάρια και έτσι εμφανίζεται στα ούρα.  Στην εξέταση των ούρων με ταινία δεν ανιχνεύονται Χαρακτηριστική ιδιότητα :πήζει και προκαλεί θολερότητα στους 40o C – 60o C, η οποία εξαφανίζεται με το βρασμό (επανεμφανίζεται, καθώς η θερμοκρασία κατεβαίνει στους 60oC – 40oC). Διαγνωστικό στοιχείο στο πολλαπλό μυέλωμα. Ανίχνευση των ειδικών πρωτεϊνών Λεύκωμα μικρολευκωματινουρίας Μικρολευκωματινουρία είναι η δια των ούρων απώλεια λευκωμάτων (αλβουμίνης) του αίματος σε ποσότητες που δεν ανιχνεύονται με τις συνήθεις μεθόδους που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια στα πλαίσια της γενικής εξέτασης των ούρων. Φυσιολογικά απεκκρίνονται < 20 mg αλβουμίνης/ 24ωρο,  έκκριση 30 – 300 mg/ημ μικροαλβουμινουρία έκκριση αλβουμίνης >300 mg/ημ) μακροαλβουμινουρία (+ ταινία) Η παρουσία μικροαλβουμίνης στα ούρα ανιχνεύει την πρώιμη διαβητική νεφροπάθεια. Μέτρηση πρωτεΐνης με στικ (αντιδραστήρια ταινία) Συγκέντρωση κατά προσέγγιση (ημιποσοτική) Διαβάθμιση Συγκέντρωση mg/dl Συγκέντρωση/ 24ώρου Ίχνη 5‐20 mg/dl 1+ 30 mg/dl < 500 mg/ ημέρα 2+ 100 mg/dl < 0.5 – 1 g/ ημέρα 3+ 300 mg/dl 1 – 2 g/ ημέρα 4+ > 2.000 mg/dl > 2 g/ ημέρα Στους διαβητικούς ανίχνευση λευκώματος ιχνη έως 1+ δικαιολογεί την μέτρηση μικροαλβουμίνης στα ούρα 24ώρου Ποιοτική ανίχνευση λευκώματος ούρων Ηλεκτροφόρηση ούρων: χρησιμεύει στην εντόπιση της προέλευσης της λευκωματουρίας και στην ανίχνευση της πρωτεΐνης Bence Jones. Σπειραματική λευκωματουρία: α) Εκλεκτική παρατηρείται αλβουμίνη άνω του 80% και τρανσφερίνη.  β) Μη εκλεκτική: η εικόνα είναι ανάλογη με του ορού. Εμφανίζεται σε πρωτοπαθείς και δευτεροπαθείς σπειραματονεφρίτιδες. Αίτια είναι : ο διαβήτης η αμυλοείδωση οι δυσγαμμασφαιριναιμίες τα νοσήματα του κολλαγόνου. Ποιοτική ανίχνευση λευκώματος ούρων (α) Σωληναριακή λευκωματουρία :η αλβουμίνη δεν είναι εκσεσημασμένη. Κυριαρχούν οι : α1, α2 και γ‐σφαιρίνες. Παρατηρείται σε: συγγενείς σωληναριακές νεφροπάθειες, διάμεσες σωληναριακές νεφρίτιδες, χρόνια πυελονεφρίτιδα και πολυκυστικούς νεφρούς. Ποιοτική ανίχνευση λευκώματος ούρων (β) Ανίχνευση λευκωματουρίας σε δυσγαμμασφαιριναιμίες: παρατηρούνται ζώνες στην περιοχή των γ‐σφαιρινών που οφείλονται σε ακέραια μόρια ανοσοσφαιρινών και ελεύθερες μονοκλωνικές αλύσεις κ ή λ τύπου, πρωτεΐνη B‐J.  Στις IgG και IgA μονοκλωνικές ή λευκωματουρία χαρακτηρίζεται από μια κορυφή αλβουμίνης και μια ανοσοσφαιρίνης.  Στην μακροσφαιριναιμία Waldenstrom, η λευκωματουρία μπορεί να είναι φυσιολογική και να συνίσταται από ελαφρές αλύσεις – πρωτεΐνη Bence – Jones. Η ηλ/ση ούρων γίνεται συγκριτικά με την ηλ/ση του ορού. Ποιοτική ανίχνευση λευκώματος ούρων Ανοσοκαθήλωση ούρων: συνδυάζει την ηλεκτροφόρηση και την ανοσοκαθίζηση των πρωτεϊνών με ειδικούς αντιορούς έναντι της αλβουμίνης και ανοσοσφαιρινών (βαρειών και ελαφρών αλύσεων ανοσοσφαιρινών και των ελεύθερων αλύσεων κ ή λ.)  Χρησιμεύει για την ταυτοποίηση της πρωτεΐνης Bence – Jones.  Εκτιμάται συγκριτικά και με την ανοσοκαθήλωση του ορού. Ηλεκτροφόρηση Μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών. Βασίζεται στην μετακίνηση φορτισμένων μορίων (πρωτεινών) από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου .  Η κινητικότητα είναι ανάλογη του φορτίου και του μεγέθους του μορίου.  Μετά την ηλ/ρηση η ταινία βάφεται και πυκνομετρείται. Ανοσοκαθήλωση  Ηλ/φόρηση + ιζηματινοαντίδραση  Ένωση [Ag‐Ab ] και σχηματισμού μη διαλυτού ανοσοσυμπλέγματος πάνω στο gel.  ΄1η φάση : διαχωρισμός των πρωτεινών με απλή ηλ/ρηση  2η προσθήκη μονοδύναμου αντιορού(Αβ) έναντι αλβουμίνης, GAM, k,l,Fu, Fλ ( και της ελεύθερης και δεσμευμένης ελαφριάς κ και λ αλυσίδας) καθηλώνει την ανοσοσφαιρίνη (Αγ‐) στο σημείο του διαχωρισμού.  Η ζώνη που αντιστοιχεί στο καθηλωμένο ανοσοσύμπλεγμα [Ag‐Ab ] μετά από χρώση γίνεται ορατή ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΟΥΡΩΝ 1.Σπειραματική πρωτεϊνουρία 2.Σωληναριακή πρωτεϊνουρία 3.Πρωτεϊνουρία από υπερφόρτωση 1 2 3 Πρωτεΐνες ούρων στην σπειραματική πρωτεΐνουρία •Αλβουμίνη •Τρανσφερρίνη •α1‐αντιθρυψίνη •α1‐όξινη γλυκοπρωτεΐνη Πρωτεΐνες ούρων στην σωληναριακή πρωτεΐνουρία •Αλβουμίνη •β2‐μικροσφαιρίνη •Πρωτεΐνη συνδέουσα ρετινόλη •α2‐μικροσφαιρίνη •α1‐μικροσφαιρίνη •Λυσοζύμη IFE of serum ELECTROPHORESIS OF URINE Ευχαριστώ