Προσδιορισμός των μεταβολιτών των κατεχολαμινών στα ούρα και αξιολόγησή τους στη διάγνωση και παρακολούθηση του νευροβλαστώματος και φαιοχρωμοκυττώματος Χριστίνα Λαζαροπούλου Χημικός Βιοχημικού Τμήματος ΓΝ Παίδων Αθηνών «Η Αγία Σοφία» Φλοιός: ¾ Σπειροειδής ζώνη: αλδοστερόνη (αλατοκορτικοειδή) ¾ Μέση στηλιδωτή ζώνη: κορτιζόλη (γλυκοκορτικοειδή) ¾ Δικτυωτή ζώνη: ανδρογόνα (DHEA) ¾ Μυελός: χρωμαφινικά κύτταρα (καφέ ή μαύρο χρώμα μετά από οξείδωση με διχρωμικό κάλιο) κατεχολαμίνες: αδρεναλίνη (επινεφρίνη), νοραδρεναλίνη (νορεπινεφρίνη) ¾ Αδρεναλίνη (επινεφρίνη),συντίθεται από τυροσίνη και εκκρίνεται μετά από διέγερση λόγω υπογλυκαιμίας, άγχους, φόβου ή θυμού ¾ Νοραδρεναλίνη (νορεπινεφρίνη), εκκρίνεται από το μυελό των επινεφριδίων ως απάντηση διέγερσης και από ορισμένους νευρώνες στο περιφερικό νευρικό σύστημα. Αυξάνει την πίεση του αίματος, διαστέλλει τις κόρες των ματιών. ¾ Ντοπαμίνη, βρίσκεται στον εγκέφαλο, συμπαθητικά γάγγλια, ήπαρ, πνεύμονες, έντερο. ¾ Είναι πολύ ευαίσθητες στον αέρα και στο φως εξαιτίας της δομής του δακτυλίου της κατεχόλης, που οξειδώνεται εύκολα σε κινόνη ¾ Εγκέφαλος, συμπαθητικά νεύρα, μυελό επινεφριδίων, εξωεπινεφριδιακούς χρωμόφιλους ιστούς ¾ Πρόδρομος των κατεχολαμινών είναι το αρωματικό L‐ αμινοξύ τυροσίνη (δίαιτα, φαινυλαλανίνη στο ήπαρ) (δευτερογενής αμίνη) ¾ Σχηματισμός DOPA (υδροξυλίωση τυροσίνης) και ντοπαμίνης (L‐amino acid decarboxylase) ,(πρωτοταγής αμίνη). Προσλαμβάνεται από κυστίδια και μετατρέπεται σε νορεπινεφρίνη (dopamine β‐hydroxylase),και επινεφρίνη (phenylethanolamine‐N‐methyl transferase) ¾ ¾ Βιοσύνθεση και απελευθέρωση κατεχολαμινών: ενδοκυττάρια διαμερισματοποίηση, παρεμπόδιση από τα προϊόντα ¾ Ένζυμα αδρανοποίησης κατεχολαμινών μυελού: κατεχολ‐ο‐μεθυλτρανσφεράση (COMT), μονοαμινοξειδάση (MAO) ¾ Μεταφέρονται στο αίμα μη συζευγμένες με πρωτείνες και έχουν χρόνο ημίσειας ζωής περίπου 2 min Ann Clin Biochem 2004; 41: 17–38 Απαραίτητη η διέγερση των νεύρων ¾ Η χημική διαμεσολάβηση της απελευθέρωσης των κατεχολαμινών συνδέεται με την παρουσία ακετυλοχολίνης και την εισροή ιόντων Ca ¾ Η διεργασία αυτή εξαρτάται από ενέργεια. Απαιτεί γλυκόλυση ή οξειδωτικό μεταβολισμό για παραγωγή ATP ¾ Μετασυναπτικοί α (επινεφρίνη και νορεπινεφρίνη) και β(επινεφρίνη) αδρενεργικοί υποδοχείς: διαμεμβρανικές πρωτείνες ¾ Οι κατεχολαμίνες απελευθερώνονται με εξωκύττωση ¾ Διάφορα στρεσσογόνα ερεθίσματα, όπως: Άσκηση, στηθάγχη, έμφραγμα, αιμορραγία, χειρουργείο, υπογλυκαιμία, ανοξία, ασφυξία, κ.α. ` ` ` ` ` Επινεφρίνη: ύπτια θέση 0,0‐110 pg/mL όρθια θέση 0,0‐140 pg/mL Νορεπινεφρίνη: ύπτια θέση 70‐750 pg/mL όρθια θέση 200‐1700 pg/mL Ντοπαμίνη: 20‐120 pg/mL Το μεγαλύτερο μέρος κατεχολαμινών κυκλοφορίας μεταβολίζεται και μόνο ελάχιστο ποσοστό απεκκρίνεται αυτούσιο στα ούρα ¾ Κύριοι μεταβολίτες ούρων: Νορμετανεφρίνη, Μετανεφρίνη, Βανιλλομανδελικό οξύ (VMA) ομοβανιλλικό οξύ (HVA) ¾ Νορμετανεφρίνη, μετανεφρίνη ¾ Μεθυλιωμένοι μεταβολίτες της νορεπινεφρίνης και επινεφρίνης ¾ Οι μετανεφρίνες κυκλοφορούν στο αίμα σε ελεύθερες και συζευγμένες μορφές με θειικές και γλυκουρονικές ομάδες ¾ Οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα των συζευγμένων μορφών είναι κατά είκοσι μέχρι τριάντα φορές υψηλότερες από τους ελεύθερους μεταβολίτες ¾ Η κάθαρση των συζευγμένων μορφών είναι πολύ αργότερη από αυτή των ελευθέρων μεταβολιτών ¾ 3‐μεθοξυ‐4 υδροξυμανδελικό οξύ ¾ Κύριος μεταβολίτης κατεχολαμινών ¾ Αντιπροσωπεύει περίπου το 60% του συνόλου των προϊόντων αππέκρισης που προέρχονται από τη νορεπινεφρίνη και την επινεφρίνη ¾ Φωτομετρικές, χρωματογραφικές, ηλεκτροφορητικές και ανοσολογικές μέθοδοι ¾ Απαιτείται μία αρχική εκχύλιση ή ένα βήμα διαδοχικών εκπλύσεων του δείγματος σε μικροστήλες για την απομάκρυνση δυνατών παρεμβολών ¾ Σε αντίθεση με τις μετανεφρίνες, το VMA δεν βρίσκεται σημαντικά συνδεδεμένο και προσδιορίζεται χωρίς να προηγηθεί υδρόλυση ¾ 3‐ μεθοξυ‐4‐υδροξυ φαινυλοξικό οξύ ¾ Κύριος μεταβολίτης στα ούρα DOPA, ντοπαμίνης ¾ Χρωματογραφικές μέθοδοι: αέρια χρωματογραφία, αέρια χρωματογραφία/ φασματομετρία μάζας, HPLC ¾ HPLC: ευαίσθητη, μικρή παρεμβολή από ενδογενή ή εξωγενή οργανικά οξέα, ταυτόχρονος προσδιορισμός VMA και άλλων μεταβολιτών ¾ Spot ή 24ωρη συλλογή ούρων ¾ Ειδική δίαιτα 4 ημέρες πριν τη συλλογή ούρων ¾ Το pH των ούρων πρέπει να είναι όξινο (pH<4) ¾ Το διαιτολόγιο δεν πρέπει να περιλαμβάνει: ¾ εσπεριδοειδή ή χυμούς εσπεριδοειδών ¾ μπανάνες ¾ καφέ ¾ τσάι ¾ κακάο ¾ βανίλια και παράγωγά της ¾ λαχανικά Επίσης ο ασθενής δεν πρέπει να λαμβάνει φάρμακα όπως: ¾ ασπιρίνη ¾ αντιυπερτασικά ¾ ρινικά σπρεϋ ¾ αντιρευματικά Περισταλτική αντλία, έναν αυτόματο δειγματολήπτη, το χώρο υποδοχής της στήλης και τον ηλεκτροχημικό ανιχνευτή ¾ Αμπερομετρία σταθερού δυναμικού. Το παραγόμενο ρεύμα μεταξύ των ηλεκτροδίων ανιχνεύεται από το όργανο, ενισχύεται και απεικονίζεται ως χρωματογραφικό σήμα ¾ Στήλη αντιστρόφου φάσεως ¾ Χρήση εσωτερικού προτύπου κατά την κατεργασία των δειγμάτων ¾ Βαθμονόμηση οργάνου σε κάθε κατεργασία ¾ Δύο μάρτυρες (controls), έναν με φυσιολογικό εύρος συγκεντρώσεων και έναν με παθολογικό εύρος συγκεντρώσεων μαζί με τα δείγματα σε κάθε κατεργασία ¾ Ελέγχουμε τη γραμμή βάσης (baseline) να είναι ευθεία γραμμή και σταθερή, το εσωτερικό πρότυπο να έχει σταθερό παραπλήσιο ύψος κορυφής και τις κορυφές να εκλούονται στους χρόνους που ορίζονται από τον βαθμονομητή ¾ control patient Συγκέντρωση mg/L ¾ Κρεατινίνη ούρων, όγκος των ούρων ¾ Υπολογίζονται οι λόγοι: 9 VMA/κρεατινίνη x 100 και 9 HVA/ κρεατινίνη x 100 ¾ Στις εικοσιτετράωρες συλλογές υπολογίζουμε επιπλέον το VMA και το HVA στο 24ωρο πολλαπλασιάζοντας τις ευρεθείσες τιμές με τον όγκο των ούρων εκφρασμένο σε λίτρα ¾ ` ` ` ` 3‐6 ετών: VMA/κρεατινίνη 4,0‐10,8 VMA 24h 1,0‐2,6 mg/24h. HVA/κρεατινίνη 5,4‐15,5 HVA 24h 1,4‐4,3 mg/24h 6‐10 ετών: VMA/κρεατινίνη 4,0‐7,5 VMA 24h 2,0‐3,2 mg/24h. HVA/κρεατινίνη 4,4‐11,5 HVA 24h 2,4‐4,7 mg/24h 10‐16 ετών: VMA/κρεατινίνη 3,0‐8,8 VMA 24h 2,3‐5,2 mg/24h. HVA/κρεατινίνη 3,3‐10,3 HVA 24h 2,4‐8,7 mg/24h 16 ετών και άνω: VMA 24h 1,4‐6,5 mg/24h HVA 24h 1,4‐8,8 mg/24h. Διάγνωση και παρακολούθηση της θεραπείας σε νεοπλασματικές ασθένειες του συμπαθο‐ επινεφριδιακού συστήματος ¾ Αυτοί οι όγκοι (φαιοχρωμοκύττωμα και όγκοι νευρογενούς προέλευσης) χαρακτηρίζονται από μεγάλη παραγωγή κατεχολαμινών, που έχει ως αποτέλεσμα μεγάλη έκκριση των αντίστοιχων μεταβολιτών στα ούρα ¾ Είναι ένας νευροεκτοδερμικός όγκος που αναπτύσσεται όταν οι εμβρυϊκοί νευροβλάστες αποτυγχάνουν να γίνουν ώριμα νευρικά κύτταρα ή επινεφριδικά μυελικά κύτταρα. Αντίθετα συνεχίζουν να μεγαλώνουν και να διαιρούνται. ¾ Αντιπροσωπεύει την 3η αιτία θανάτου που προέρχεται από καρκίνο στην παιδική ηλικία ¾ Η ετερογενής κλινική συμπεριφορά, που εκτείνεται από αυθόρμητη επαναφορά σε γρήγορη εξέλιξη, αποδίδεται στα βιολογικά και γενετικά χαρακτηριστικά του όγκου ¾ Int J Mol Sci. 2012; 13(12): 16554–16579. Αναπτύσσεται στο νευρικό ιστό των επινεφριδίων (30%), στα συμπαθητικά νευρικά γάγγλια της κοιλιάς (25%) και στα γάγγλια στη σπονδυλική στήλη,στήθος, λαιμό (45%). ¾ Συνθέτει κατεχολαμίνες σε μεγάλες ποσότητες. Βιοσύνθεση: ανώμαλη ¾ Οι παραγόμενες κατεχολαμίνες μεταβολίζονται γρήγορα ¾ Αποβολή στα ούρα μεγάλων ποσών DOPA, ντοπαμίνης και των μεταβολιτών τους (HVA) και ποικίλων ποσών επινεφρίνης, νορεπινεφρίνης, VMA και άλλων μεταβολιτών ¾ Αντιπροσωπεύει περίπου το 7,8% των παιδικών καρκίνων στις ΗΠΑ. Τα περιστατικά είναι περίπου 9,5 ανά 1.000.000 παιδιά ¾ Τα περιστατικά σε άλλες βιομηχανικές χώρες είναι παρόμοια με εκείνα των ΗΠΑ ¾ Οι ρυθμοί περιστατικών νευροβλαστώματος είναι υψηλότεροι ανάμεσα στις χώρες με υψηλό εισόδημα στην Ευρώπη και στη Β. Αμερική και χαμηλότεροι στις χώρες με χαμηλό εισόδημα στην Αφρική, Ασία και Λατινική Αμερική ¾ Ο ρυθμός επιβίωσης 5 έτη από τη διάγνωση είναι περίπου: 83% για βρέφη, 55% για παιδιά ηλικίας 1‐5 ετών και 40% για παιδιά ηλικίας >5 ετών ¾ Οι άρρενες εμφανίζουν ελαφρώς υψηλότερα περιστατικά ΝΒ απ’ότι τα θήλεα, με αναλογία άρρεν/θήλυ: 1,2/1 ¾ 40% των ασθενών είναι ηλικίας <1έτους, 35% ηλικίας 1‐2 ετών, 25% ηλικίας >2 ετών κατά τη διάγνωση. Τα περιστατικά μειώνονται κάθε συνεχή χρονιά για ηλικίες >10 ετών, μετά από την οποία η ασθένεια είναι σπάνια ¾ 40% 35% Στάδιο 1: Όγκος εντοπισμένος στην περιοχή προέλευσης ¾ Στάδιο 2: Όγκος εκτεινόμενος πέρα από το όργανο ή την περιοχή προέλευσης αλλά δεν επεκτείνεται πέρα από τη μέση γραμμή του σώματος ¾ Στάδιο 3: Όγκος που διηθείται.Εμπλέκονται ομόπλευροι ή ετερόπλευροι λεμφαδένες. Ο όγκος επεκτείνεται πέρα από τη μέση γραμμή ¾ Στάδιο 4: Μεταστάσεις του όγκου σε απομακρυσμένους λεμφαδένες, σπλάγχνα, οστά και μαλακό ιστό ¾ Στάδιο 4S (παιδί <18 μηνών): Εντοπισμένος πρωταρχικός όγκος με μεταστάσεις περιοριζόμενες στο ήπαρ, στους υποδόριους ιστούς και στο μυελό των οστών χωρίς συμμετοχή του οστικού φλοιού ¾ Ann Clin Biochem 2004; 41: 17–38 Ποικίλλουν ανάλογα με τη θέση εντόπισης ¾ Γενικά: κοιλιακό άλγος, έμετοι, απώλεια βάρους, ανορεξία, κούραση, οστικά άλγη ¾ >50% των ασθενών βρίσκεται ήδη σε προχωρημένο στάδιο: οστικά άλγη, χωλότητα, ανεξήγητος πυρετός, ευερεθιστότητα ¾ Τα συμπτώματα που δημιουργούνται από την παρουσία της μάζας εξαρτώνται από την εγγύτητα σε ζωτικά όργανα και εξελίσσονται με το χρόνο ¾ Νευρολογικά συμπτώματα ¾ Σύνδρομο Horner ¾ Σε μία μικρή αναλογία νεογνών <6μηνών, το ΝΒ εμφανίζεται με έναν μικρό αρχικό όγκο και η μετάσταση περιορίζεται στο ήπαρ, το δέρμα και το μυελό των οστών (στάδιο 4S) ¾ Περίπου 2% των ασθενών παρουσιάζει οψόκλωνο και μυόκλωνο ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ Προσδιορισμός VMA,HVA στα ούρα MIBG : (meta‐iodobenzylguanidine )Μορφή της μετα‐ ιωδοβενζυλγουανιδίνης που περιέχει ένα μικρό ποσό ραδιενεργού ιωδίου. Η MIBG είναι παρόμοια με τη νορεπινεφρίνη. Εγχέεται στη φλέβα, περνάει στην κυκλοφορία του αίματος και προσκολλάται στα κύτταρα του όγκου οπουδήποτε στο σώμα. Συντελεί στην εκτίμηση της έκτασης της νόσου ,των μεταστάσεων ή των υποτροπών Σημαντικό μειονέκτημα : εμφανίζει 10% ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET‐scan) Μυελόγραμμα και οστεομυελική βιοψία Το στάδιο της νόσου κατά την διάγνωση ¾ Ογκογονίδιο N‐myc : σημαντικό ρόλο στην πρόγνωση της νόσου. Αύξηση των αντιγράφων >1 είναι κακό προγνωστικό στοιχείο ανεξάρτητα από την έκταση της νόσου και την ηλικία του παιδιού. ¾ DNA index >1. Σε ανάλυση του DNA των κυττάρων (κυτταρομετρία ροής ή απεικονιστική κυτταρομετρία) καλύτερη πρόγνωση έχουμε όταν τα κύτταρα είναι ανευπλοϊδικά και όταν έχουμε χαμηλό ποσοστό κυττάρων του όγκου σε φάση S,G2,M του κυτταρικού κύκλου ¾ Ελλείψεις στα χρωμοσώματα 1 ή 11 (1p ή 11q deletions) και περίσσεια στο χρωμόσωμα 17 (17q gain) σημαίνουν χειρότερη πρόγνωση, ενώ η έκφραση του NTRK1 που παράγει την πρωτείνη Trk‐A από καλή. ¾ ` ` ` ` Φερριτίνη Neuron specific enolase (NSE) LDH Αυξημένα επίπεδα σημαίνουν χειρότερη πρόγνωση Χειρουργική εκτομή ¾ ΧΘΠ (cyclophosphamide, cisplatin, vincristine κ.α.) ¾ Ακτινοθεραπεία ¾ Ανοσοθεραπεία (μονοκλωνικά αντισώματα ch 14.18, hu 18‐IL2 που προσκολλώνται στην ganglioside GD2 που υπάρχει στην επιφάνεια πολλών νευρικών κυττάρων και αυξάνει στο νευροβλάστωμα) ¾ Νευροενδοκρινικός όγκος από χρωμαφινικά κύτταρα (προέρχονται από αρχέγονα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας που καλούνται συμπαθογόνα) του μυελού των επινεφριδίων (85‐90%) ή από εξωεπινεφριδιακό συμπαθητικό νευρικό ιστό, παρασπονδυλικά και παρααορτικά (Παραγαγγλίωμα ή εξωεπινεφριδιακό φαιοχρωμοκύττωμα) ¾ Συνθέτει και εκκρίνει κατεχολαμίνες ¾ Lenders JWM et al Lancet 2005;366:665-675 Neumann J et al NEJM 2002; 346:1459-66 25% (1.5‐33%) τυχαία διάγνωση σε απεικονίσεις ¾ 1‐6/1.000.000 γενικού πληθυσμού/έτος ¾ 0.1‐0.6% των υπερτασικών ασθενών ¾ Σποραδικός όγκος ή οικογενής ¾ 10‐13%κακοήθη (δεν υπάρχουν ευρέως αποδεκτά κριτήρια) ¾ Lenders JWM et al Lancet 2005;366:665-675 Neumann J et al NEJM 2002; 346:1459-66 Όγκοι φλοιού:αδένωμα, υπερπλασία, καρκίνωμα ¾ Όγκοι μυελού: φαιοχρωμοκύττωμα,γαγγλιονεύρωμα, νευροβλάστωμα ¾ Άλλοι όγκοι: μυελολίπωμα, μεταστάσεις ¾ Λοιμώξεις, κοκκιώματα, διηθήσεις: απόστημα,αμυλοείδωση, σαρκοείδωση, φυματίωση ¾ Κύστεις, ψευδοκύστεις ¾ Συγγενείς επινεφριδική υπερπλασία ¾ Ψευδοεπινεφριδικές μάζες:παγκρεατικές, νεφρικές, αγγειακές ¾ ` ` ` ` ` ` ` Σποραδικό (συμπαγής καλά περιγεγραμμένος όγκος, σε κάψα, αναπτύσσεται αργά 3‐5cm σπάνια 10‐20cm) NF1 (νευροϊνωμάτωση, χρωμόσωμα 17q11) MEN 2 (Multiple endocrine neoplasia, RET πρωτοογκογονίδιο χρωμόσωμα 10q11) Von Hipper Lindau Disease (tumor suppressor gene, χρωμόσωμα 3p25) PGL1 (SDHD) (Σύνδρομο παραγαγγλίωμα‐ φαιοχρωμοκύττωμα) PGL2 (SDHB) 33% των ασθενών έχουν μετάλλαξη σε ένα από τα υπεύθυνα γονίδια ` ` ` ` Παραγαγγλίωμα Αμφοτερόπλευρο φαιοχρωμοκύττωμα Ετερόπλευρο φαιοχρωμοκύττωμα και θετικό οικογενειακό ιστορικό Ετερόπλευρο φαιοχρωμοκύττωμα σε νέους ασθενείς (<40 ετών) με κλινικά ευρήματα που παραπέμπουν σε κληρονομικά σύνδρομα ` ` ` Αδιάγνωστοι όγκοι είναι δυνητικά θανατηφόροι Ποσοστό 10% είναι κακοήθεις Συνύπαρξη με οικογενή νεοπλασματικά σύνδρομα 10% Εξωεπινεφριδιακά ¾ 10% Εξωκοιλιακά ¾ 10% Κακοήθη ¾ 10% Άμφω ¾ 10% Σε παιδιά ¾ 10% Χωρίς υπέρταση ¾ 10% Οικογενή ¾ Παροξυσμική μορφή: έντονη κεφαλαλγία, ιδρώτες, ωχρότητα ή αγγειοδιαστολή προσώπου και άνω τμήματος κορμού, ταχυκαρδία και έντονους παλμούς, αίσθημα άγχους, πνιγμονής, θωρακικό άλγος, γαστρεντερικές διαταραχές, ναυτία, έμετο, γαστρικά άλγη, αύξηση ΑΠ ¾ Χρόνια μορφή: μόνιμη υπέρταση και επιπλοκές της, απώλεια βάρους, αυξημένο μεταβολισμό και θερμοκρασία σώματος, υπεργλυκαιμία ή διαβήτη ¾ ↑ κατεχολαμινών πλάσματος ¾ ↑ κατεχολαμινών ούρων, ↑ μετανεφρινών, ↑ VMA ¾ Δοκιμασία καταστολής με κλονιδίνη (δεν μειώνεται η νορεπινεφρίνη πλάσματος πάνω από 50%) ¾ Αξονική τομογραφία (CT) κοιλίας (Ανίχνευση όγκου). Εξέταση άλλων περιοχών σώματος, όπως ο τράχηλος, ο θώρακας ή η λεκάνη ¾ Μαγνητική τομογραφία ή σπινθηρογράφημα με MIBG, PET (Ανίχνευση όγκου) ¾ Ευαισθησία Ειδικότητα Plasma‐ free metanephrines 99% 89% Plasma catecholamines 84% 81% Urinary catecholamines 86% 88% Urinary‐ fractionated metanephrines Urinary‐ total metanephrines 97% 69% 77% 93% VMA 64% 95% Lenders JWM et al Lancet 2005;366:665-675 ` ` ` ` Κατεχολαμίνες πλάσματος (ύπτια θέση) >2000 pg/mL Ολικές μετανεφρίνες ούρων >1.8 mg/24h VMA ούρων >11 mg/24h Νορμετανεφρίνες ούρων >156 μg/24h Χειρουργική επέμβαση για να αφαιρεθεί ο όγκος ή χειρουργική αφαίρεση ολόκληρου του επινεφρίδιου που φέρει τον όγκο (προηγείται χορήγηση αποκλειστών των α και β αδρενεργικών υποδοχέων) ¾ Όγκος κακοήθης με μεταστάσεις σε άλλα μέρη του σώματος: ακτινοβολία (εξωτερική ή εσωτερική με τη χορήγηση μεγάλων δόσεων MIBG) ή χημειοθεραπεία >50% των ασθενών με κακόηθες φαιοχρωμοκύτωμα επιβιώνει ¾