Επικ. Καθ. Γ. Βρυώνη Εργαστήριο Μικροβιολογίας Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ [email protected] Διάρροια των ταξιδιωτών  Η πιο συχνή συνδεόμενη με ταξίδι λοίμωξη  30% - 70% των ταξιδιωτών: ανάλογα εποχής και χώρας προορισμού  Αίτια ποικίλα  Βακτήρια: 80%–90% των περιστατικών  Ιοί: 5%–8%, που μπορεί να αλλάξει με την ευκολότερη διάγνωση λοιμώξεων από norovirus  Πρωτόζωα: 10% στους ταξιδιώτες με μακράς διάρκειας ταξίδια.  Τροφική δηλητηρίαση (“food poisoning”): αίτιο τοξίνες, συμπτώματα εμέτων και διάρροιας άμεσα μέσα σε 12 ώρες από την κατανάλωση 1 in 6 About 1 in 6 (or 48 million) people gets sick each year from contaminated food ΕTEC Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Shigella spp., και Salmonella spp. Enteroadherent and other E. coli Aeromonas spp. και Plesiomonas spp. 50% E. coli O157 infections have been about in half since 1997. 365 Million Salmonella infection accounts for $365 million in direct medical costs each year. Μείωση συχνότητας λοιμώξεων από E. coli O157 1996–2010  Λοιμώξεις από Salmonella σταθερές 15 χρόνια ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΚΟΠΡΑΝΩΝ ΓΙΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ Κλασική διάγνωση ΚΟΙΝΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ (Salmonella, Shigella, Yersinia) ΧΡΟΝΟΣ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ 24h 48h 72h (-) Mac Conkey Νο 3 Urea Λακτόζη (-) Άχροες  ΚIΑ (Kligler) MC2   H2S Λακτόζη(-) κεκλιμένη κόκκινη Γλυκόζη (+) βάση κίτρινη ορολ. Salmo, Shiga(+) Προκαταρκτική ταυτοποίηση Τελική ταυτοποίηση ΑΡΙ  Αντιβιόγραμμα Λακτόζη (-) (άχροες) Ταχεία δοκιμή ανίχνευσης VeroToxin / O157 Combi Urea (όπως MC3) SS Agar H S(+)  KIA 2 XLD Agar Selenite broth   ‘’  MC N2 Κόκκινες Κόκκινες με μαύρο κέντρο Urea KIA (ως MC3) N2 MC3 XLD  Urea  KIA N2 ‘’ ‘’ Μοριακή διάγνωση Πολυπλεκτική PCR: ανίχνευση & ταυτοποίηση Ευαισθησία και ειδικότητα ανάλογες κλασικών τεχνικών Ανίχνευση μικρού αριθμού παθογόνων  σημαντικό για Shigella (λοιμ. δόση =10 μικροοργανισμοί) ανίχνευση σε τρόφιμα$1 vs $10 κλασικής μεθοδολογίας (Kim JS J Food Prot 2007;70:1656) Multiplex PCRs for enterovirulent E. coli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1,3,5,7: ST (190bp) PCR1: ETEC (ST); EPEC/AEEC (eae); EAggEC (AA) PCR2: ETEC (LT); EPEC (EAF); DAEC (DA) Yuanhai You et al. J Microbiol Methods 2008;5 2,6: eae (917bp) 4,8: AA (630bp) 2,6: EAF (397bp) 3,7: EIEC (603bp) 4,8: LT (322bp) 1,5: DA (750 bp) Lane 9: molecular size marker Νεότερες μοριακές τεχνικές 20-40% ΟΓ: αιτιολογία άγνωστη Μικροσυστοιχίες – microarrays Microarrays – DNA chips Ανίχνευση και ταυτοποίηση: E. coli, V. Σύνολο μικρών στοιχείων ή κηλίδων cholerae, V. parahaemolyticus, S. σε τακτοποιημένων σε σειρές και στήλες enterica, C. jejuni, Shigellae, Y. στερεή επιφάνεια (διοξείδιο της σιλικόνης) enterocolitica, L. monocytogenes You F etμορίων-στόχων al., J Microbiol Methods 2008;75:566 Υβριδισμός με μόρια σημασμένα Ανίχνευση με καιφθορίζουσα τυποποίηση χρωστική ETEC Wang O et al., JCM 2010;48:2066 Ανάγνωση αποτελέσματος με laser Salmonella genes σχετιζόμενα με παθογόνο scanning συνεστιακό (confocal) δράση, σε αντοχή, ινίδια (Η Ag), LPS (O Ag) μικροσκόπιο φθορισμού και πλασμίδια Huehn S et al., Methods Mol Biol 2009;551:249 Ανάλυση της εικόνας μέσω Η/Υ • Εφαρμογές ▫ Ανίχνευση παθογόνων, ▫ Γονοτυπικές - συγκριτικές αναλύσεις ▫ Ανίχνευση μικροβιακής αντοχής Φασματομετρία μάζας (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight, MALDI-TOF-MS) Αρχή μεθόδου • Ιονισμός μακρομορίων, κυρίως πρωτεϊνών, ενός εύκολα και γρήγορα προετοιμαζόμενου δείγματος • Επιτάχυνση των ιόντων προς την περιοχή του ανιχνευτή κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες και σε περιβάλλον κενού • Ανίχνευση και ανάλυση των προκυπτουσών φασμάτων μάζας που οδηγεί στην ταυτοποίηση των μακρομορίων μέσω του προσδιορισμού του λόγου μάζας προς φορτίο (χρόνος 2 min). Clin Microbiol Infect 2010;16:1604 Ποιες οι εφαρμογές της φασματομετρίας μάζας στο κλινικό μικροβιολογικό εργαστήριο ρουτίνας ; MALDI-TOF MS: ταυτοποίηση από καλλιέργεια Identified species 2 min BioProfiler Data interpretation Generate MALDI-TOF profile spectrum Smear a thin-layer onto a MALDI target plate Select a colony Unknown microrganism ? Ιογενείς γαστρεντερίτιδες  Norovirus: 3%-17% των ταξιδιωτών με διάρροια  εστιατόρια και χώροι μαζικής Κύρια αιτία μη βακτηριακής γαστρεντερίτιδας 21 εκατ. λοιμώξεις: ~ 70,000 νοσηλείες και 800 θάνατοι εστίασης, τόποι διακοπών (κρουαζιερόπλοια: 90% επιδημιών).  Συνλοίμωξη ή ασυμπτωματική λοίμωξη  σωστή αξιολόγηση της συχνότητας  Διάγνωση:  RT-PCR (κυρίως)  Ανίχνευση Ag με EIA / IC RIDASCREEN Norovirus 3rd Generation FDA-approved ○ ΌΧΙ σε σποραδικές περιπτώσεις ○ Σε περιπτώσεις επιδημίας σε κρουαζιερόπλοια (αν αρνητικό επιβεβαίωση με RT-PCR) Αποτέλεσμα Δείγμα Trophozoite stained with trichrome. Πρωτόζωα  Giardia  Entamoeba histolytica  Cryptosporidium  Cyclospora E. histolytica/E. dispar cyst in iodine with two visible nuclei and a chromatoid body (arrow).  Nepal, Peru, Haiti, Guatemala  Εποχική κατανομή  Dientamoeba fragilis Modified acid-fast stain Cyclo Oocysts (8 to10 μm) Modified acid-fast stain Crypto Oocysts (4 to 6 μm) Πρωτόζωα - Διάγνωση Παρασιτολογική κοπράνων Δείγμα υπό κανονική κένωση (τουλάχιστον 3) Διαρροϊκά: τροφοζωίτες Ημίρρευστα: τροφοζωίτες & κύστεις Σχηματισμένα: κύστεις Συντηρητικό (PVA ή 10% φορμαλίνη) Φυγοκέντρηση (π.χ. 10min στα 500 Χ g αν φορμαλίνη) ΌΧΙ αν μετά ΕΙΑ ή RDT για ανίχνευση Ag Επιλογή τεχνικής ανάλογα εμπειρίας, αντιδραστηρίων και κόστους Νωπό παρασκεύασμα Μέσα σε 30min αν διαρροϊκά Μέσα σε 1 ώρα αν ημίρρευστα Έως 24 ώρες (ψυγείο) αν σχηματισμένα Entamoeba histolytica(lamblia) / dispar Giardia intestinalis Τρίχρωμη χρώση Μορφολογία εντερικών πρωτοζώων Giardia intestinalis (lamblia) Τρίχρωμη χρώση Μορφολογία εντερικών πρωτοζώων Entamoeba histolytica / dispar Οξεάντοχη χρώση (τροποποιημένη Kinyoun – χωρίς θέρμανση) Ταυτοποίηση ωοκύστεων διαφόρων κοκκιδίων • κυρίως κρυπτοσπορίδιου • λιγότερο των κυκλόσπορα και ισόσπορα Πρόσφατα ή συντηρημένων με φορμαλίνη Cryptosporidium: oocysts (4 to 6 μm) Cyclospora cayetanensis : oocysts (8 to 10 μm) Άλλοι τρόποι διάγνωσης Direct fluorescent antibody (DFA) assay Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα Συμπύκνωση κοπράνων Giardia intestinalis Cryptosporidium oocysts Enzyme immunoassay (EIA) Κόπρανα αυτούσια Όχι συντηρητικό Όχι συμπύκνωση Πλεονέκτημα: screening (πολλά δείγματα) Οριακά θετικά ή αμφίβολα  έλεγχος με DFA Giardia E. histolytica Cryptosporidium Άλλοι τρόποι διάγνωσης Rapid immunochromatographic cartridge assays Sensitivities, speciﬁcities, PPV, NPV: Κόπρανα αυτούσια G. lamblia, 93.5, 100, 100, and 95.5%,Όχι συντηρητικό C. parvum, 98.8, 100, 100, and 99.7%, Όχι συμπύκνωση False-negative: Πλεονέκτημα: G. lamblia were obtained with απλήwith low parasite numbers specimens (n =7) or specimens Οριακά θετικά ήcontaining αμφίβολα : trophozoites only (n =3) έλεγχος με DFA Giardia E. histolytica/E. dispar Cryptosporidium Sensitivity and specificity : G. lamblia: 95.9%, 97.4%, E. histolytica/E. dispar: 96.0%, 99.1%, C. parvum: 98.3%, 99.7% Χρόνια Διάρροια σε Ταξιδιώτες       CDI among travelers was more commonly acquired in low- and medium-income countries, although 20% of all reported cases occurred in travelers returning from highincome countries. CDI in travelers occurred in relatively young patients and was frequently associated with the empiric use of antibacterial agents, notably fluoroquinolones. A sizable minority of travelers with CDI had no exposure to antibacterial agents at all. The incidence of travel-related CDI is unknown, but may be higher than previously suspected. A prospective study among travelers with unexplained acute or chronic diarrhea is warranted. Ami Neuberger et al. J Travel Med 2013; 20: 37–43 Διάγνωση C. difficile Καλλιέργεια •CCFA (Cycloserine Cefoxitin Fructose Egg Yolk άγαρ, 5% κρόκο αυγού)  Επεξεργασία με καθαρή αιθυλική αλκόολη 96% (alcohol shock method)  Επιβίωση των σπόρων και ελαχιστοποίηση ανάπτυξης μη σπορογόνων βακτηρίων  Επώαση: αναερόβιες συνθήκες,  35-370C, 48-72 ώρες  Μετά την απομόνωση Cd  έλεγχος τοξινών από το καλλιέργημα  •Brazier’s CCEY (Cycloserine, Cefoxitin Egg Yolk άγαρ με 5% κρόκο αυγού, χολικό οξύ και υδροξυφαινυλακετοξικό οξύ) • CCBA (Cycloserine Cefoxitin Blood based άγαρ, 1-7% αίμα ίππου) Αναζήτηση τοξινών Α & Β στα κόπρανα και γλουταμικής δεϋδρογενάσης- GDH ΕΙΑ, ανοσοχρωματογραφία, RT-PCR 2 βήματα για τη διάγνωση CDI 1ο ΒΗΜΑ: Μέθοδος διαλογής (screening test) αναζήτηση GDH στα κόπρανα με ΕΙΑ ή IC 2ο ΒΗΜΑ: Επιβεβαιωτική μέθοδος κυτταροκαλλιέργεια ή τοξινογόνος καλλιέργεια ή PCR ή EIA/IC για έλεγχο τοξινών ΣΤΑ ΘΕΤΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΜΟΝΟ Clinical practice guidelines for Clostridium difficile infection in Adults: 2010 update by the Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA) Cohen SH, et al. Infect Control Epidemiol 2010; 31(5):431-455 ESCMID: Data review and reccomendations for diagnosing Clostridium difficile infection Crobach MJT, et al, Clin Microbiol Infect 2009; 15:1053-66 Cepheid GeneXpert system • Fully integrated and automated sample preparation, RT-PCR and detection • Specimens don’t need to be batched • <2 mins hands-on time • Results in <1hr – 6 targets per sample • Detection of C. difficile toxin B gene http://www.cepheid.com/ Ιογενείς Αιμορραγικοί πυρετοί Ιοί από 4 διαφορετικές οικογένειες Arenaviruses Filoviruses Bunyaviruses Flaviviruses RNA ιοί Λιπιδιακό περίβλημα (φάκελο) Μετάδοση Τρωκτικά Αρθρόποδα Από Α σε Α Ebola virus Ιοί Πηγή μετάδοσης Arenaviridae Junin (Α.Π. Αργεντινής) Τρωκτικά Machupo (Α.Π. Βολιβίας) Τρωκτικά Sabia (Α.Π. Βραζιλίας) Τρωκτικά Guanarito (Α.Π. Βενεζουέλας) Τρωκτικά Lassa (Π. Lassa) Τρωκτικά Bunyaviridae Crimean- Congo H.F. (Κριμαϊκός Α.Π.) Κρότωνες Hantavirus (Α.Π. με νεφρικό σύνδρομο) Τρωκτικά Rift Valley fever (Π. Κοιλάδας του Rift) Κουνούπια Filoviridae Ebola Νυχτερίδες Marburg Νυχτερίδες Flaviviridae Kyasanur Forest Disease (Π. του δάσους Kyasanur) Κρότωνες Omsk H.F. (Α.Π. Omsk) Κρότωνες Yellow Fever (Κίτρινος Πυρετός) Κουνούπια Dengue (Δάγκειος πυρετός) Κουνούπια Δάγκειος πυρετός Countries or areas at risk of dengue transmission worldwide, 2012 Πριν από 1970: επιδημίες σε μόνο 9 χώρες. Σήμερα: > 100 χώρες ενδημικές σε Αμερική, Αφρική, Α. Μεσόγειο, ΝΑ Ασία και Δ. Ειρηνικό. Αμερική, ΝΑ Ασία, Δ. Ειρηνικός: μεγαλύτερη προσβολή (> 2.3 εκατ. περιστατικά το 2010). Επέκταση σε νέες περιοχές και πιο σοβαρές επιδημίες. Απειλή για Ευρώπη: Πρώτη φορά τοπική μετάδοση σε Κροατία και Γαλλία το 2010 Εισαγόμενη επιδημία σε νησιά Madeira της Πορτογαλίας το 2012. Περιστατικά σε Φλόριντα (USA) και επαρχία Yunnan στην Κίνα το 2013. Clinical laboratory course of VHF Μοριακές: τις πρώτες 2 εβδ. Ειδικά IgM / IgG: μετά 7η ημ. Εργαστηριακή διάγνωση Α.Π. από αίμα, ούρα, ΕΝΥ, εκκρίματα, ιστοί σε BSL4 Άμεση ανίχνευση Έμμεση ανίχνευση αντισωμάτων Ιού (Η.Μ.) Αντιγόνου ειδικών IgM 4Χ  ειδικών IgG • Immunocapture ELISA • Reverse passive HA Κυτταροκαλλιέργεια • 2-10 ημέρες Γενετικού υλικού • RT-PCR • Real time RT-PCR • Multiplex RT-PCR • Πιθανά μη ανιχνεύσιμα έως και 2η εβδομάδα της νόσου. • Σε θανατηφόρες περιπτώσεις δεν παράγονται αντισώματα  ανίχνευση αντιγόνου Δυνατόν παραλλαγή του ιού:  ιός μη ανιχνεύσιμος με κοινά αντιδραστήρια και primers 29 Ταχεία διάγνωση Ανίχνευση Ag PCR NS1 Ag Δάγκειου Ταχεία: 15 min Ευαισθησία: 92.3% • IgG (+): 86.7% • IgG (-): 97.3% Ειδικότητα: 100% Ebola Zaire virus (ZEBOV), Ebola Sudan virus (SEBOV), MARV, LASV, RVFV, CCHFV, Hantaan virus (HNTV), Seoul virus (SEOV), YFV, and KFDV Palacios G et al, EID, 2006:12,692 Φυματίωση Μικροβιολογική διάγνωση Άμεση • Μικροσκοπική: Ζ-Ν • Καλλιέργεια: L-J, υγρά θρεπτ. υλικά • DNA: real-time PCR Έμμεση • Ανίχνευση Abs: χωρίς αξία Ανίχνευση κυτταρικής ανοσίας στη ΤΒ Mantoux - tuberculin skin test (TST) IGRAs: QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT)®, and T-Spot.TB® ΔΕΝ ξεχωρίζουν λανθάνουσα (LTBI) από ενεργό νόσο Η διάγνωση στηρίζεται και σε άλλα δεδομένα και όχι μόνο στα αποτελέσματα των TST/IGRA δοκιμασιών o Μείγμα 200 αντιγόνων από μυκοβακτηρίδια o Αντίδραση επιβραδυνόμενης υπερευαισθησίας o Υποκειμενικότητα στην ανάγνωση του αποτελέσματος 48-72h Ανίχνευση κυτταρικής ανοσίας έναντι του MTB • Όχι διάκριση ενεργού ΤΒ vs λανθάνουσα TB • Ψ(+) σε BCG και επαφή ή μόλυνση ΝΤΜ Μέθοδος Αντιγόνο Τι ανιχνεύει • Ψ(-) σε Δερμοαντίδραση Mantoux Purified Proteinανοσοανεπάρκεια προηγούμενη μόλυνση - όχι ΤΒνόσηση (ειδική ανεργία) Derivative-PPD ενεργόμε από ΜΤΒ Tuberculin Skin Test-TST • Φαινόμενο “booster” CFP 10 QuantiFERON-TB Gold In Tube Διάγνωση εν.& λανθ.ΤΒ (Celestis)  Early Secreted Antigenic ESAT-6 Target 6 (ESAT-6) Όχι Ψ(+) αν BCG/ΝΤΜ FDA έγκριση  (2007) Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10) ΤΒ7.7  ΌΧΙ BCG, M. bovis T SPOT-TB (Oxford CFP 10 Διάγνωση εν.& λανθ.ΤΒ Immunotec)  ΕΞΑΙΡΕΣΗ: M. kansasii, M. szulgai, M. marinum ESAT-6 Όχι Ψ(+) αν BCG/ΝΤΜ FDA έγκριση  (2008) Κωδικοποιούνται στο Region of Difference 1 (RD1)  Δράση  Λύση του φαγοσώματος  Κυτταρική λύση στα μακροφάγα Μεθοδολογία αντιγόνα CFP 10 / ESAT-6 + CD4+ Τ- λεμφοκύτταρα από ολικό αίμα QuantiFERON-TB Gold In Tube  ELISA 24 h IFN-γ T SPOT-TB  ELISPOT (Enzyme Linked Immunosorbent Spot): ≤4 κηλ. (-), 5-7:? ≥8(+) Μάρτυρας (-) Δείγμα Μάρτυρας (+) Interferon Gamma Release Assays (IGRAs) Interferon Gamma Release Assays (IGRAs) Πλεονεκτήματα Μία επίσκεψη Αποτελέσματα σε 24h (θεωρητικά) Όχι φαινόμενο booster, αν χρειαστεί να επαναληφθεί. Όχι επηρεασμός αποτελέσματος από BCG (bacille Calmette-Guérin) Μειονεκτήματα Άμεσος χειρισμός δείγματος εντός 8-30 h μετά τη συλλογή του δείγματος (ζωντανά κυτ.) Λάθη στη συλλογή, μεταφορά, μεθοδολογία ή ερμηνεία αποτελεσμάτων Λίγα δεδομένα σε ειδικές ομάδες πληθυσμού Κόστος Ευαισθησία & Ειδικότητα Ενεργός Mantoux Quantiferon TSPOT Ευαισθησία 65 80 81 Ειδικότητα 75 79 59 Λανθάνουσα Mantoux Quantiferon TSPOT Ευαισθησία 71 67 87 Ειδικότητα 88 99 98 Pai et al, 2008; Sester et al, 2010 Εφαρμογή μεθόδων IGRAs Ειδικότητα: QFT-IT 96%, T-SPOT 93% Δεν επηρεάζεται από τον εμβολιασμό με BCG και σταθερή μεταξύ των διαφόρων μελετών Ειδικότητα TST καλύτερη σε μη-εμβολιασμένα άτομα και μη σταθερή μεταξύ των διαφόρων μελετών σε εμβολιασμένα άτομα Ευαισθησία: QFT-IT 70% (92.6%), T-SPOT 90% Μη σταθερή μεταξύ των διαφόρων μελετών, όπως και του TST Σε ανοσοκαταστολή με  κίνδυνο ΤΒ Σε μεγάλα παιδιά: (77%) •IGRA + TST ίδιες ευαισθησία και ειδικότητα με ενήλικες (+) ένδειξη ΤΒ και νόσο ΝΤΜ Λιγότερα (+) σε•Ότι εμβ. με BCG •Όχι το ένα καιμελέτη μετά το •< 5 πρώτα ετών ξεχωριστή (άλλο: κινδυνος ΤΒ) Μη διάκριση ενεργού από λανθάνουσα ΤΒ απώλεια IGRA+/TST•Συγγενής ΤΒ et al.HIV(+) 2009; Curr Opin Infectή Dis ΑπροσδιόρισταNyendak αποτελέσματα (έως ~20%) •Πολύ μικρά ή κακή θρέψη και τα δύο Nyendak al. 2009; Curr Opin με Infect Dis Ανοσοκαταστολή: το etίδιο ευαίσθητες TST Παιδιά Medhukar et al., Ann Int Med; 2008: 177 Ποια η θέση των IGRA στην κλινική πράξη; Σύμφωνα με ECDC  Δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την διάγνωση ενεργού νόσου, αλλά μπορούν να ενισχύσουν τις υποψίες, όταν δεν υπάρχουν σαφείς αποδείξεις  Αρνητική IGRA αποκλείει την πιθανότητα ανάπτυξης ενεργού νόσου, λόγω της μεγάλης αρνητικής διαγνωστικής αξίας τους  Θετική IGRA πρέπει να συνεκτιμηθεί με άλλα δεδομένα για το ενδεχόμενο ανάπτυξης ενεργού νόσου  Για ανοσοκατασταλμένους ασθενείς προτείνεται η ταυτόχρονη χρήση της Mantoux και των IGRAs  Σε χώρες με υψηλή επίπτωση, οι IGRAs δεν προσφέρουν κάτι  Σε χώρες με χαμηλή επίπτωση, προτείνεται διαδικασία 2βημάτων για τις επαφές ασθενών με διαγνωσμένη νόσο  http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/1105_TER_Basics_TB_control.pdf  http://ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/1103_GUI_IGRΑ.pdf 39 Γενικές οδηγίες εφαρμογής IGRAs Αντί της TST, όχι επιπλέον της TST Προτιμώνται σε άτομα που δε θα επιστρέψουν για την ανάγνωση της TST έχουν εμβολιαστεί με BCG Όχι σε παιδιά < 5 ετών, εκτός αν γίνει μαζί TST Αντί της TST, για τη μελέτη πρόσφατων επαφών με ασθενή με ενεργό ΤΒ έχουν μεγαλύτερη ειδικότητα της TST όμως είναι περιορισμένα τα δεδομένα πρόβλεψης μετάπτωσης σε ενεργό νόσο επανάληψη δοκιμασίας σε 8-10 εβδομάδες μετά την έκθεση με το ίδιο test για αντιστοιχία αποτελεσμάτων Γενικές οδηγίες εφαρμογής IGRAs πριν ταξίδι αν υψηλός κίνδυνος ΤΒ Εναλλακτικά της 2-step TST μία IGRA τεχνική FDAεγκεκριμένη QuantiFERON TB test (Gold In-Tube versions) ή T-SPOT.TB Ίδια ειδικότητα με TST σε μη εμβολιασμένα άτομα και πιο ειδική σε άτομα που έχουν εμβολιαστεί με BCG Για ταξιδιώτη που δεν έχει χρόνο πριν την αναχώρηση ΌΧΙ «ανάμειξη» τεχνικών Μη συμφωνία αποτελεσμάτων μεταξύ TST και IGRA : 15% (συνήθως TST –θετικό & ΙGRA-αρνητικό) Πολλοί λόγοι (ποτέ σίγουρη η αιτία) Αν ο κλινικός αποφασίσει να γίνουν και τα δύο tests: προτιμότερο 1ο TST και 2ο IGRA γιατί: μικρότερη πιθανότητα TST-αρνητικό και IGRA-θετικό Ποια POC test μπορούν να χρησιμοποιηθούν ; Παθογόνο / test Τεχνική Δείγμα Ένδειξη Εφαρμογή Σχόλια Rapid malaria test ICT αίμα Πυρετό μετά από ταξίδι Ευαισθ: 87-100% Ειδικ: 52-100% Καλύτερη ευαισθησία για P. falciparum (panmalaria tests) Giardia lamblia EIA κόπρανα Διάρροια μετά από ταξίδι Sensitivity: 58–98% Specificity: 97–98% Σε συνδυασμό με μικροσκοπική εξέταση κοπράνων Ελονοσία Ελονοσία: κύρια αιτία πυρετού σε ταξιδιώτες από ενδημικές περιοχές • 60% of cases are initially misdiagnosed in North America • Malaria leads to death for about 1% of affected travelers  Κόκκινο: όλο το χρόνο Πως γίνεται η διάγνωση; Τρεις κατηγορίες: 1. Μικροσκοπική εξέταση Χρυσός κανόνας Εκτίμηση παρασιταιμίας Πλεονεκτήματα • Μέθοδος φτηνή • Ευαίσθητη (2-5 πλασμ/μl) • Ταυτοποίηση είδους • Διατήρηση παρασκευάσματος • Βαθμός παρασιταιμίας Μειονεκτήματα • Ανάγκη εκπαιδευμένου προσωπικού • Χρονοβόρα Χρώση Giemsa Πως γίνεται η διάγνωση; Τρεις κατηγορίες: 1. Μικροσκοπική εξέταση Χρυσός κανόνας Εκτίμηση παρασιταιμίας Χρώση Giemsa 2. Ανοσολογικές τεχνικές Παχεία σταγόνα ή RDT: όσοι έχουν παρασιταιμία πάνω από το όριο ανίχνευσης (100-1000/μl) 3. Μοριακές τεχνικές 4. Ανίχνευση αντισωμάτων Rapid Diagnostic Test Προηγούμενη έκθεση  Μικρή αξία στη διάγνωση Επιδημιολογικές μελέτες: αποκλεισμός δοτών αίματος / οργάνων σε μη ενδημικές περιοχές RDT για ελονοσία Ανίχνευση Ag Στόχος Είδος HRP2 pLDH Aldolase pLDH-Pf pLDH-pan pLDH-Pvom pLDH-Pv P. falciparum X X X X P. vivax X X X X P. ovale X X X P. malariae X X X HRP2: Histidine rich protein-2, πρωτεΐνη πλούσια σε ιστιδίνη-2 (>40/μL) Τροφοζωίτες & ανώριμα γαμετοκύτταρα P. falciparum Έως και 2 εβδομάδες μετά λήξη επεισοδίου παρασιταιμίας pLDH: Lactate DeHydrogenase, γαλακτική αφυδρογονάση (> 100/μL) ασεξουαλικά στάδια όλων των πλασμωδίων (τροφοζωίτες) Όχι παραμονή θετικών αποτελεσμάτων RDT για ελονοσία Ευαισθησία: ανάλογη παρασιταιμίας >95% για P. falciparum - 80-100% για P. vivax Ψευδώς αρνητικά: αν παρασιταιμία < 100παρ/μL Ψευδώς θετικά: σπάνια σε μη ενδημικές περιοχές αν ρευματοειδής παράγοντας θετικός HRP-2 σε ενδημικές μετά Θ για διάστημα >1 μήνα Προτιμώνται σε μη ενδημικές περιοχές (PCR είναι η μέθοδος εκλογής) RDT για ελονοσία – η εμπειρία από την Ελλάδα The device SD Bioline Malaria Ag P.f./Pan 05FK60: one of the best performing assays in the WHO/TDR/FIND/CDC evaluation programme (WHO summary performance of malaria RDTs Rounds 1-3, 2011) Blood drop well Diluent well Nitrocellulose membrane Control line Non-falciparum infections line P. falciparum/ mixed P. falciparum infections line Αξιολόγηση RDT (MALWEST 2012) RDT vs μικροσκοπική Μικροσκοπική Εξέταση RDT  Sensitivity: 97.44% + - Σύνολο + 38 6 44 - 1 1267 1268 Σύνολο 39 1273 1312 (95% CI: 86.47-99.57)  Specificity: 99.53% (95% CI: 98.98-99.83)  PPV: 86.36% (95% CI: 72.64-94.79) RDT vs PCR PCR Εξέταση RD T  Sensitivity: 95.56% + - Σύνολο + 43 0 43 - 2 910 912 Σύνολο 45 910 955 (95% CI: 84.82-99.33)  Specificity: 100% (95% CI: 99.59-100)  PPV: 100% (95% CI: 91.7-100) PCR 1. Multiplex PCR 2. Real time PCR Πλεονεκτήματα ● Ανίχνευση: 1 πλασμ /μl αίματος ● Χρήσιμη στις περιπτώσεις μικρού φορτίου ή μικτής λοίμωξης Μειονεκτήματα ● Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα ● Ανάγκη εξειδικευμένου προσωπικού, εξοπλισμού, εκπαίδευσης ● Λίγο πιο ευαίσθητη της μικροσκοπικής ● Μη μέτρηση παρασιταιμίας Τρυπανοσωμίαση Αφρικανική Trypanosoma brucei ssp. in a thin blood smear stained with Giemsa. Trypanosoma brucei gambiense (Κ. & Δ. Αφρική) rhodesiense (Α. Αφρική) Μύγα tsetse (Glossina spp.) Διάγνωση Μικροσκοπική εξέταση • • • • • Περιφερικού αίματος Μυελού των οστών Παρακέντηση λεμφαδένα ΕΝΥ (τελευταία φάση ν.) Βιοψία εσχάρας Άλλες: μοριακή, card agglutination, IFA Trypansoma brucei ssp. in a thick blood smear stained with Giemsa. Τρυπανοσωμίαση - Αφρικανική Epidemiologic data mortality of patients from non-endemic countries Diagnostic means of and Human Africanrates Trypanosomiasis among patients from nonwho acquired Human Trypanosomiasis the colonialduring period (1902– endemic countries whoAfrican acquired Human Africanduring Trypanosomiasis the 1966) and during the post-colonial period colonial period (1902–1966) and during the(1967–2012). post-colonial period (1967–2012) Neuberger A et al., PLOS ONE 2014;9:e88647 Τρυπανοσωμίαση – Αμερικανική Global distribution of cases of Chagas disease based on official estimates, 2006–2010 Αμερικανική (ν. Chagas) Trypanosoma cruzi Κοριός Triatomidae Διάγνωση Οξεία φάση Μικροσκοπική εξέταση • Περιφερικού αίματος • Στιβάδας buffy coat Χρόνια φάση Ορολογική: ELISA, IFA 2014 Μυκητιάσεις Histoplasma spp.  Ενδημική λοίμωξη  H. capsulatum: ○ ΗΠΑ: Mississippi, Ohio river valleys ○ Κ. & Ν. Αμερική  H. duboisii: ○ Κ. & Δ. Αφρική (Μαδαγασκάρη)  25οC Ευρώπη: περιπτώσεις εισαγόμενες, αυτόχθονες Buitrago J Travel Med 2011; Antinori et al., J Travel Med 2006 37οC Δίμορφος μύκητας Μέθοδοι διάγνωσης ιστοπλάσμωσης Μικροβιολογικές Μικροσκοπική Βλαστοκύτταρα σφαιρικού – ωοειδούς σχ. τα εκβλαστώματα συνδέονται με στενή βάση με μητρικό κυτ 29/4/2014 Calcofluor white Μη μικροβιολογικές Νεότερες μέθοδοι Ιστολογική εξέταση GMS Καλλιέργεια Αντιγόνο Αντισώματα Μοριακές Μυκητιασικές λοιμώξεις ειδικές Wright χρ.: σε στιβάδα ομάδες ασθενών Δείγματα: Δέρμα Μυελός των οστών Αίμα BAL ENY λευκών περιφ. αίματος 55 (φαγοκυτταρωμένα βλαστοκονίδια) Histoplasma capsulatum Καλλιέργεια: •στους 25οC μορφή υφομύκητα, χνουδωτές, άσπρου-καστανού ή ροζ αποικίες •στους 37οC μορφή βλαστομύκητα Μικροσκοπική: •στους 25οC μακροκονίδια μεγάλα σφαιρικά με ανώμαλο παχύ τοίχωμα και μικροκονίδια στο αρχικό στάδιο ανάπτυξης 56 Μυκητιάσεις Penicillium marneffei  Ενδημική λοίμωξη  Ταϊλάνδη, Βιετνάμ, Μαλαισία, Χόνγκ-Κόνγκ,ΝΑ Ινδία, Ταϊβάν, Α. Κίνα Ευρώπη: περιπτώσεις εισαγόμενες  Ασθενείς   HIV που επισκέφτηκαν Ταϊλάνδη Buitrago J Travel Med 2011; Antinori et al., J Travel Med 2006 Μέθοδοι διάγνωσης πενικιλλίωσης Μικροβιολογικές Μικροσκοπική Καλλιέργεια Βλαστοκύτταρα χωρίς εκβλάστηση Calcuofluor white Μη μικροβιολογικές Ακτινολογικός ελ. Ιστολογική εξέταση Νεότερες μέθοδοι Αντιγόνο BDG PCR Δείγματα: Δέρμα Μυελός των οστών Αίμα BAL Πτύελα Λεμφαδένας 58 Penicillium marneffei Καλλιέργεια: αποικίες άσπρεςγκρίζες, με την παράταση επώασης πράσινες. Στους 25οC παραγωγή κόκκινης χρωστικής Μικροσκοπική: •στους 25οC κονιδιοφόροι κλάδοι ως χρωστήρας (brush) ή θύσανος (penicillus), •στους 37οC ωοειδή ή ελλειψοειδή βλαστοκύτταρα (αναπαράγονται με διχοτόμηση, σχηματισμός διαχωριστικού διαφράγματος)