ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR Επανάσταση → βιοιατρική έρευνα, διαγνωστική Dr Mullis et al. 1983 ΗΠΑ 1983-92 5000 επιστημονικά άρθρα 1993 Νοbel χημείας Japan Prize Mark Hughes Υπεύθυνος → National Center for Human Genome Project - ΝΙΗ “ PCR η πλέον ενδιαφέρουσα επιστημονική τεχνολογία των τελευταίων 100 ετών ” PCR molecular photocopying Χημική ενζυμική αντίδραση → Ποσοτική αύξηση → Ειδικού τμήματος DNA in vitro ! 3-4 ώρες >1x106 copies DNA → Taq DNA polymerase ……. Πλεονεκτήματα PCR → 3S Specificity Sensitivity Speed • Ειδική ανίχνευση παθογόνου σε υλικό με χλωρίδα • Ευαίσθητη 1pg DNA η 10-100 μικροοργανισμοί /κλινικό υλικό • Ταχεία 3-4 ώρες •Ποικιλία δειγμάτων Ορός - aliquots, ΕΝΥ, Ούρα, Κύτταρα βιοψίας, επιθηλιακά Ολικό αίμα όχι ηπαρινισμένο/αιμολυμένο Πτύελα, εκκρίσεις αναπνευστικού Κόπρανα παράγοντες που αδρανοποιούν την PCR Μειονεκτήματα PCR • Επιμόλυνση από (+) δείγματα → ↑ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ → FP • Εκχύλιση DNA/RNA - extraction • Ανιχνεύει DNA & μη ζώντων μικροοργανισμών παροδικό αποικισμό • Εξειδικευμένο προσωπικό, χώροι, απόλυτη καθαριότητα ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ Η PCR ? •ΙΑΤΡΙΚΗ • ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ • ANAΓΝΩΡΙΣΗ ΑΤΟΜΩΝ • ΒΙΟΛΟΓΙΑ γονιδιακή ταυτότητα, απόδειξη πατρότητας DNA, γενετική ταξινόμηση ειδών • ΖΩΟΛΟΓΙΑ • ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ • ΑΡΧΑΙΟΛΟΓΙΑ • ΠΑΛΑΙΟΝΤΟΛΟΓΙΑ ΧΡΗΣΕΙΣ PCR ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ • ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ • ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ & ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ • ΙΑΤΡΙΚΗ ΕΡΕΥΝΑ • ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΩΝ - ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ • ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ - ΜΕΤΑΜΟΣΧΕΥΣΕΙΣ • ΠΡΟΓΕΝNHΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΩΝ ΝΟΣΩΝ ινοκυστική νόσος…. • ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ - ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ β-thalassemia, σύνδρομο Duchenne’s, Tay-Sachs... ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ? Όπου εμφανίζουν αδυναμία οι συμβατικές μέθοδοι ΑΜΕΣΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ – ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ / ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ δεν καλλιεργούνται εύκολα βραδεία ανάπτυξη ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΓΡΑ ↓ συγκέντρωση μικροοργανισμού ↓ συγκέντρωση ειδικών αντισωμάτων ΕΙΔΙΚΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ λήψη αντιβιοτικών ↓ τίτλους ειδικών αντισωμάτων ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ IOI HCV, ΗBV, ΗΙV, CMV, HPV / FDA HSV, VZV, EBV, εντεροϊοί … ΒΑΚΤΗΡΙΑ Μycobacterium, Chlamydia, N. gonorrhoeae / FDA Borellia, Treponema, Ricketsia, Ν. meningitidis … MYKHTEΣ ΠΑΡΑΣΙΤΑ Pneumocystis, Cryptococcus, Aspergillus … Plasmodium, Leishmania, Toxoplasmα ……/ in house ποικίλη Ε, Ε FDA → Food and Drug Administration approved ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ • Ιογενείς λοιμώξεις → HBV, HCV, CMV, HPV • Βακτηριακές λοιμώξεις→ Mycobacterium tuberculosis Chlamydia trachomatis Βακτηριακό 16SrRNA ΙΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ - Abs έμμεσοι δείκτες → Ανοσοκατασταλμένοι - Ags άμεσοι δείκτες →Δεν πολλαπλασιάζονται in vitro ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΟΞΕΙΑΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΟΣ Β ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ → ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ Μ. HBsAg anti HBs anti HBc anti HBc IgM HBeAg anti HBe > 20ετία ELISA ΟΞΕΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β Η ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΗ ΧΡΟΝΙΚΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑ ΤΩΝ ΟΡΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΚΑΘΟΡΙΖΕΙ ΤΗ ΦΑΣΗ ΟΞΕΙΑΣ ΛΟΙΜΩΞΗΣ EΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΧΡΟΝΙΑΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΟΣ Β ΕΛΕΓΧΟΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ → ΣΥΜΒΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΗΒV DNA ορού → ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΗΒVDNA Ποσοτικές Μοριακές μέθοδοι - Απλός υβριδισμός - ραδιενεργό σήμανση 1991 -1995 - Απλός υβριδισμός - χημειοφωταύγεια 1996 -2003 Πολλαπλασιαστικές - bDNA μέθοδος → ενίσχυση σήματος 2000 -…. - PCR → ενίσχυση στόχου 2000 -…. μέθοδος Υβριδισμός b-DNA 360 IU /ml χημειοφωταύγεια PCR - EIA / Εbiotin-avidinA 60 IU/ml χρωματομετρική εκκινητές/primers → core gene WHO 2003 → IU /ml b-DNA ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ -ΧΜΦ ΜΕΘΟΔΟΣ ΔΙΑΚΛΑΔΙΖΟΜΕΝΟΥ DNA Amplifier* with hybridized Label Probes* ενίσχυση σήματος Preamplifier* ΗΒV DNA Label Extender* (LE) Capture Extender (CE) Capture Probe Microwell * components containing ΑP → YΠΌΣΤΡΩΜΑ → ΦΩΣ PCR EIA HBV DNA εκχύλιση από ορό HBV extraction HBV DNA PCR Εκκινητές & DNApol Core gene Αντίγραφα(DNA) ενίσχυση στόχου → amplification Ανιχνευτής Ε προσδιορισμός detection → Χρώμα ΣΕ ΠΟΙΕΣ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΕΙΝΑΙ ΧΡΗΣΙΜΟΣ Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΗΒV DNA - ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ? ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β AΤΥΠΑ XΡΟΝΙΑ ΟΡΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΦΙΛ ΕΝΑΡΞΗ , ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β ΗΒeΑg(-) → HBsAg(+) anti HBc(+) anti HBe(+) Προπυρηνικά μεταλλαγμένα στελέχη HBV HBVDNA ≥ 2000 IU/mL ενεργός πολλαπλασιασμός HBVDNA < 2000 IU/mL ΄΄ανενεργός φορεία΄΄ AΤΥΠΑ XΡΟΝΙΑ ΟΡΟΛΟΓΙΚΑ ΠΡΟΦΙΛ πχ anti HBc(+) ↓ HBsAg HBV DNA (+) ≥ 2000 IU/mL φορεία - ενεργός πολλαπλασιασμός < 2000 IU/mL ΄΄ανενεργός φορεία΄΄ ↓ antiHBs HBV DNA (-) ΕΝΑΡΞΗ - ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ → ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟI Αν ΗΒV DNA → < 2000 IU/mL Aναστολή ενεργού πολλαπλασιασμού ΗΒV Aναστολή φλεγμονής ήπατος Επιτυχής θεραπεία → μείωση πιθανότητος ανάπτυξης κίρρωσης, ΗΚΚ Αν ΗΒV DNA → > 2000 IU/mL Παράταση θεραπείας, τροποποίηση δόσης Υποτροπή λοίμωξης → μετάλλαξη HBV, αντοχή → επανάληψη με νέο αντιϊικό παράγοντα Hepatitis C Virus – HCV Μονόκλωνο RNA anti HCV - 1990 Χαμηλή ιαιμία Γενετική ετερογένεια 6 γονοτύπους 1-6 4a(E) 4d 4c 4g 4a(B) 4e 4h 4f 5a 6a 6b 2(I) a f e c b f b d 5 4 a 1 n m l 3 k 1b h 1c(E) 1(I) 1c(0) 1(II) 7b 7d 7a c e 11a d g 6 2 7c/NGII/VII 1a 3c 3e 3d 3(III) 3(VI) 3f 3a TD3 10a 3b NGI * 8a 8b j 9c i 9a 9b 1990 – σήμερα, αναπτύσσονται και τελειοποιούνται οι μέθοδοι… ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΗC ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΕΙ EIA → συμβατική μέθοδος ανίχνευση anti HCV Μοριακές μέθοδοι ανίχνευση HCV RNA μέτρηση HCV RNA τυποποίηση HCV ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ HCV RNA •RT PCR → ενίσχυση στόχου Aνάστροφη μεταγραφή – PCR, εκκινητές 5΄NCR, βιοτίνη αβιδίνη→ χρώμα •ΤΜΑ Trancription mediated amplification – Πολλαπλασιασμός δια μεταγραφής RT,T7RNApol, εκκινητές Τ7promotor, ισοθερμική αντίδραση, χημειοφωταύγεια ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HCV RNA •b-DNA → ενίσχυση σήματος branched DNA, Μ. διακλαδιζόμενου DNA Υβριδισμός, ειδικό ανιχνευτή 5΄NCR → χημειοφωταύγεια ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HCV RNA HCV HCV RNA TMA PCR Εκκινητές & RT,RNApol bDNA Εκκινητές & RT,DNApol Ανιχνευτής με Διακλαδιζόμενο DNA Αντίγραφα (RNA) Ανιχνευτής ΕΑ Χημειοφωταύγεια Αντίγραφα (DNA) Ανιχνευτής Ε Χρώμα Ανιχνευτής ΑΦ Χημειοφωταύγεια HCV RNA ποιοτικές μέθοδοι RT PCR TMA 50 5 IU/ml IU/ml ποσοτικές μέθοδοι bDNA 615 IU/ml WHO 2000 → IU/ml ΓΟΝΟΤΥΠΙΑ HCV • Το HCV προϊόν PCR ή TMA , τμήμα 5΄NCR • Υβριδίζεται με ειδικούς DNA ανιχνευτές 5΄NCR σε ταινία νιτροκυτταρίνης • Ο συνδυασμός των ανιχνευτών που υβριδίζονται καθορίζει το γονότυπο του HCV HCV ΓΟΝΟΤΥΠΟΣ Ανάστροφος υβριδισμός σε ταινία νιτροκυτταρίνης Ειδικός DNA ανιχνευτής 5΄NCR anti HCV → συμβατική μ. HCV RNA → μοριακή μ. ALT ΕΝΑΡΞΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ → ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΘΟΔΟ ΧΡΟΝΙΑΣ HC HCV RNA Επιτυχής πορεία → 1/10 ιϊκό φορτίο ή RT PCR, TMA (-) α΄ τρίμηνο Ίαση → RT PCR, TMA (-) μετά τη θεραπεία και για > 6 μήνες ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ → 24 η 48 εβδ → ΜΟΡΙΑΚΗ Μ. Γονότυπος - LiPA Έλεγχος HCV λοίμωξης σε ασυμπτωματικά άτομα συμβατική μέθοδος - Screening test anti-HCV EIA ↓ anti HCV (-) ↓ STOP → anti HCV (+) → HCV RNA (+/-) Πότε σε άτομο anti HCV(-) συστήνεται έλεγχος HCV RNA ? ΑΔΥΝΑΜΙΑ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ! Yποψία οξείας HC Ανοσοκατασταλμένος HIV+, νεφροπαθής, μεταμοσχευμένος Ασθενής Προσωπικό νοσοκομείου τρύπημα με HCV μολυσμένη ↑ALT - άτομο ομάδος υψηλού κινδύνου με μεικτού τύπου κρυοσφαιριναιμία βελόνα Πότε μπορεί να βρίσκουμε Anti HCV (+) HCVRNA (-) ? παλαιά αυτοιαθείσα ΗC ιαθείσα HC μετά από θεραπεία νεογνό μητέρας με HC CMV CMV Real time PCR ΠΟΣΟΤΙΚΗ Μ. • PMNs → κύρια πηγή CMV στην οξεία λοίμωξη • ολικό αίμα ΕDTA η citrate, όχι ηπαρίνη • anti CMV IgG / IgM ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ • CMV Ag pp65 EIA συμβατικές μέθοδοι καθυστερούν • ανοσοκατασταλμένοι, μεταμοσχευμένοι → RLΤΜ -PCR • ↑ ευαισθησία, 500 cop/ ml … • CMV DNA(+) πρωιμότερα στην CMV λοίμωξη από CMVΑg ΕΓΚΑΙΡΗ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ CMVΑg–IF • παραμένει θετικό Real time PCR-F • 1/10 ιϊκού φορτίου → επιτυχής θεραπεία HPV HPV PCR (13) • Yψηλού κινδύνου γονότυπoι HR-HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 Ογκογόνος ιός CA τράχηλου της μήτρας • 12 HPV primers από 13 ΗR HPV L1 polymorphic region - 165 bp • Τραχηλικό επίχρισμα – screening Test ↑ ευαισθησία 240 cop/ml… • εκχύλιση extraction • ενίσχυση amplification προσδιορισμός detection •Ευαισθησία PCR 95% κυτταρολογικής/PAP 55% •Ειδικότητα PCR 94% ………………… /PAP 97% • Έλεγχος επίμονων λοιμώξεων με High Risk HPV • Αδιευκρίνιστα αποτελέσματα PAP Test → PCR • Κυτταρολογική εξέταση PAP Test / PCR HPV PCR (37) διάγνωση παρακολούθηση HPV λοίμωξης → γονοτυπία → LiPA → HR / LR γονότυποι συνλοιμώξεις BAKTHΡΙΑΚΕΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Μycobacterium tuberculosis Mycobacterium spp. ΣΥΜΒΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΜΕΣΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑ Ziehl Neelsen, Kinyoun, φθορίζουσα auramine O • ειδικότητα 99 % • ευαισθησία 25 – 75 % ↓ > 5000 βακτήρια / ml δείγματος→ (+) αποτέλεσμα ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Loewenstein-Jensen, Middlebrook 7H10, 7H11, Broth 7H9 Χρόνος επώασης → 7- 8 εβδ. Ταυτοποίηση γένος / είδος → 2- 4 εβδ. Αυτόματο σύστημα 9000ΜΒ (Broth 7H9) Ημιαυτόματο σύστημα → μέτρηση χημειοφωταύγειας Myco/F-sputa Myco/F-lytic PCR Δείγματα αναπνευστικού και ούρα μετά από ρευστοποίηση Άλλα υγρά μετά από φυγοκέντρηση Πολλαπλασιασμός τμήματος 584 βάσεων στο 16SrDNA Υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα Αξιολόγηση αποτελέσματος PCR Αποτέλεσμα μετά από 6-8 ώρες ταχέως ! Θετικά αποτελέσματα με > 40 κύτταρα / PCR ή > 1600 cfu/ml ↑ ευαισθησία ! Θετικά αποτελέσματα και με νεκρά βακτήρια ? Δεν έχει εφαρμογή στη παρακολούθηση της θεραπείας ? Αναστολή της PCR Μη καλή ρευστοποίηση Αναστολείς του ενζύμου (αιμοσφαιρίνη) Συγκολλήσεις βακτηρίων Βλέννη (πτύελα) Υψηλότερη ευαισθησία PCR → ΜΤΒ πτύελα Ταυτοποίηση ειδών Mycobacterium με PCR και υβριδισμό LiPA MTB Ταυτοποίηση M. tuberculosis με PCR και υβριδισμό Chlamydia trachomatis PCR • Δείγματα : α΄ρεύμα ούρησης/ ουρηθρικό τραχηλικό επίχρισμα Μ4ΡΤ culture transport medium •Aνίχνευση Αg → συμβατική μέθοδος ΕΙΑ • Πολλαπλασιασμός τμήματος 207 b, cryptic plasmid, primers CP102, CP103 → μοριακή μέθοδος • Ευαισθησία PCR ↑ Ευρέως φάσματος PCR 16 SrRNA • Ανίχνευση κοινού βακτηριακού 16SrDNA σε κλινικά υλικά • Εκκινητές → κοινές περιοχές του DNA όλων των βακτηρίων • Σε 4 h ανιχνεύεται η παρουσία βακτηριακού DNA η όχι ! • Ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σύγκριση με γνωστές αλληλουχίες, ταυτοποίηση→ 48 h GenBank - Blast - National Center for Biotechnology Information • Χρήσιμη σε στείρα υλικά αίμα, ΕΝΥ, αρθρικό, οφθαλμικό • Ταχεία! • Απαιτητικά βακτήρια! • Προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών ! • Ανιχνεύει και DNA μη ζώντων βακτηρίων ??? • Χαμηλή ευαισθησία, 500-1000 βακτήρια/ ml ??? • Επιμόλυνση κλινικών υλικών – υλικά με χλωρίδα ??? ΄΄Νέα αύρα πνέει στα διαγνωστικά εργαστήρια΄΄ Μοριακές Τεχνικές Χρησιμοποιώντας τις με περίσκεψη, σε κάθε ειδική περίπτωση Συνδυάζοντας τις πάντα με τις Συμβατικές Μεθόδους κλινική εικόνα, ιστορικό, ιδιαιτερότητες ασθενούς, βιολογικού υλικού,μικροοργανισμού Έχουμε μια νέα σημαντική βοήθεια στη διάγνωση & θεραπεία των λοιμώξεων ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ Μ.Χριστοφίδου,Επίκουρη Καθηγήτρια Μικροβιολογίας,Ιατρικό Τμήμα Πανεπιστημίου Πατρών