H Mοριακή Γενετική της Kυστικής ίνωσης Αγγελική Μπαλασοπούλου Βιολόγος Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής Κέντρο Θαλασσαιµίας (WHO Collaborating Centre) Λαϊκό Γενικό Νοσοκοµείο Αθηνών Κυστική Ίνωση   Χρόνια ασθένεια που επηρεάζει το αναπνευστικό αλλά και άλλα συστηµατα.   Εµφανίζεται µε διάφορα συµπτώµατα στην παιδική ηλικία.   Προσδόκιµο ζωής 25-35 χρόνια.   Α ν τ ι µ ε τ ώ π ι σ η : δ ι ά φ ο ρ α φ ά ρ µ α κ α π ο υ υποστηρίζουν τη λειτουργία των πνευµόνων, ένζυµα του πεπτικού. Επιδηµιολογία Η Κυστική ίνωση αποτελεί την πιο κοινή αυτοσωµική υπολειπόµενη νόσο στους Καυκάσιους (για τους Μεσογειακούς λαούς είναι δεύτερη σε συχνότητα).   1 στις 2500-3000 γεννήσεις   Στην Ελλάδα 800 ασθενείς   Στην Ελλάδα 500.000 φορείς wt allelle mutated allelle Το γονίδιο CFTR   Το γονίδιο CFTR εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 7   Καταλαµβάνει µια περιοχή µήκους 250 Kb : 27 εξόνια, mRNA 6129 bp. Η πρωτεΐνη ανήκει στην οικογένεια των µεταφορέων ABC (µεταφορείς που προσδένουν - ATP binding cassette family of transporters) . Είναι ένας δίαυλος ιόντων που απαντά στις µεµβράνες των κυττάρων που επενδύουν τους αγωγούς στους πνεύµονες, το ήπαρ, το πάγκρεας, το έντερο, το δέρµα και την αναπαραγωγική οδό. 4 Μοριακή Γενετική   Γενετικός τόπος : Περιοχή 7q31.2: q31.2 στον µακρύ βραχίονα (q) του χρωµοσώµατος 7.   Γονιδιακή Δοµή : Μήκος γονιδίου περίπου 250 kb περιλαµβάνει 27 εξόνια.   mRNA: mRNA µήκους 6129 bp long.   Ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF): 4443 bp.   Π ρ ω τ ε ΐ ν η : Η π ρ ω τ ε ΐ ν η C F T R αποτελείται από 1480 αµινοξικά κατάλοιπα και έχει µέγεθος 168,173 Da. Μεταλλαγές του γονιδίου CFTR  Έχουν χαρακτηριστεί πάνω από 2.000 µεταλλαγές.  Τα περισσοτερα εργαστήρια κάνουν έλεγχο για 25-87 µεταλλαγές.  13 από τις χαρακτηρισµένες µεταλλαγές απαντούν µε συχνότητα µεγαλύτερη από 1%.  Οι µεταλλαγές οµαδοποιούνται σε 5 κατηγορίες. Στατιστική ανάλυση βάσει του τύπου της µεταλλαγής Τύπος Παρερµηνεύσιµη Αριθµός Συχνότητα % 751 41.15 Μετατόπιση αναγνωστικού πλαισίου 297 16.27 Σε θέση µατίσµατος Ανερµηνεύσιµη Ένθεση/Έλλειψη στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης Μεγάλη έλλειψη/ένθεση Στον υποκινητή 221 158 12.11 8.66 37 2.03 48 12 2.63 0.66 Παραλλαγή στην αλληλουχία 251 13.75 Άγνωστες 50 2.74 Μεταλλαγές του γονιδίου CFTR (www.genet.sickkids.on.ca)   Οι µεταλλαγές επηρεάζουν τη λειτουργία του κυττάρου µέσω διαφόρων µηχανισµών καθώς σε κάποιες περιπτώσεις παράγεται µικρότερη ποσότητα ή και καθόλου πρωτεΐνη, ενώ σε άλλες παράγεται πρωτεΐνη µε αλλαγές στη δοµή. Οι µεταλλαγές προκαλούν… I Πρόβληµα στη σύνθεση (απουσία πρωτεΐνης) II III IV V Πρόβληµα Πρόβληµα στη Δοµικό Μικρή στην ρύθµιση πρόβληµα παραγωγή επεξεργασία (προβληµατική (προβληµατική (υπολειτουργία) (απουσία αγωγή) αγωγή) πρωτεΐνης) Μεταλλαγές CFTR– Η F508del   Η πιο κοινή µεταλλαγή, απαντά σε συχότητες 70-75% στην Β. Ευρώπη και στην Αµερική και 30-50 % στη ΝΑ Ευρώπη.   Έλλειψη του κωδικονίου 508  Απώλεια ενός αµινοξεως από την πρωτεΐνη.   Η πρωτεΐνη λειτουργεί ως δίαυλος Cl- αλλά κατακρετείται στο ενδοπλασµετικό δίκτυο.   Ο κλασικός φαινότυπος περιγράφει την κατάσταση των ασθενών µε οµοζυγωτία για την έλλειψη F508del. Μεταλλαγές CFTR– Η F508del   Όταν η πρωτεΐνη που παράγεται από το αλληλόµορφο F508del φτάνει στο ενδοπλασµατικό δίκτυο αναγνωρίζεται η µη φυσιολογική αναδίπλωσή της µε αποτέλεσµα να κατακρατείται και δεν προωθείται στην κυτταρική µεµβράνη.   Ασθενέις οµόζυγοι για την έλλειψη F508 εµφανίζουν παντελή έλλειψη αγωγής των ιόντων χλωρίου και την πιο βαριά µορφή της νόσου.   Η ανισορροπία στη συγκέντρωση ιόντων νατρίου χλωρίου οδηγεί στο σχηµατισµό ενός παχέος στρώµατος βλέννας που καθώς δεν είναι δυνατόν να αποµακρυνθεί από τις βλεφαρίδες του επιθηλίου παγιδεύει βακτήρια µε αποτέλεσµα την αυξηµένη συχνότητα µολύνσεων. Συσχέτιση γονοτύπου φαινοτύπου   Η κλασική CF χαρακτηρίζεται από χρόνιες βακτηριακές µολύνσεις του αναπνευστικού και των βλεννογόνων, δυσκολία πάψης των λιπών λόγω ανεπάρκειας παγκρεατικών ενζύµων, ανδρική στειρότητα λόγω αποφρακτικής αζωοσπερµίας και αυξηµένα επίπεδα ιόντων χλωρίου στον ιδρώτα.   Μιά σειρά άλλων πιο ήπιων διαταραχών που καλούνται µονοσυπτωµατικές CF (µη κλασικές CF, π . χ . Α πο φ ρ α κ τ ι κ ή α ζω ο σ π ε ρ µ ί α , ι δ ι οπα θ ή ς παγκρεατίτιδα) εµφανίζονται σε άτοµα που φέρουν τουλάχιστον ένα µεταλλαγµένο αλληλόµορφο. Συσχέτιση γονοτύπου φαινοτύπου Γονότυπος & Φαινότυπος   Ο τ ρ όπο ς µ ε το ν οπο ί ο τα δ ι α φ ο ρ ε τ ι κά αλληλόµορφα του CFTR συνεισφέρουν στην ποικιλία που παρατηρείται στην κλινική εικόνα αναλύεται µε µελέτες γονοτύπου-φαινοτύπου.   Υπάρχει µικρή συσχέτιση µεταξύ του φαινότυπου και της βαρύτητας της νόσου στους πνεύµονες γεγονός που υποδεικνύει ότι σηµαντικό ρόλο έχουν και άλλοι παράγοντες γενετικοί (άλλα γονίδια τροποποιητές) ή περιβαλλοντικοί. Συσχέτιση γονοτύπου φαινοτύπου Γονότυπος CFTR Αλληλόµορφο 1 Αλληλόµορφο 2 Εύρος φαινότυπου Κλασικό (π.χ. F508) Κλασικό Κλασικό>> µή κλασικό Ήπιο (π.χ., A455E) Κλασικό ή ήπιο Μή κλασικό> κλασικό R117H/5T Κλασικό ή ήπιο Μή κλασικό> κλασικό R117H/7T Κλασικό ή ήπιο Ασυµπτωµατικό θηλυκό ή CBAVD > µη κλασικό 5T/TG13 or TG12 Κλασικό ή ήπιο CBAVD η µη κλασικόCF >> ασυµπτωµατικός φορέας 5T/TG11 Κλασικό ή ήπιο Ασυµπτωµατικός> CBAVD 7T ή 9T Κλασικό ή ήπιο Ασυµπτωµατικός 7T ή 9T 7T ή9T Ασυµπτωµατικός (From www.genetests.org) Η µελέτη των προτύπων αντανακλά φαινόµεα κυριαρχίας των πιο «ήπιων» αλληλοµόρφων στα διπλά ετερόζυγα άτοµα. Ως κλασικά αναφέρονται τα αλληλόµορφα των οµάδων Ι-ΙΙΙ και ως ήπια αυτά των οµάδων IV και V µε εξαίρεση τα R117H και 5T. Συσχέτιση γονοτύπου φαινοτύπου   Αρκετά γονίδια που ενέχονται στην ανοσολογική απόκριση έχουν αναφερθεί ως πιθανοί τροποποιητές της CF.   Στο χρωµόσωµα 19q13.2 έχει χαρακτηριστεί ένας τροποποιητής που ενέχεται στον ιλεό εκ µηκωνίου που παρατηρείται σε νεογέννητα µε CF. Συγγενής αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων   Ο ι σ π ε ρ µ α τ ι κ ο ί π ό ρ ο ι µ ε τ α φ έ ρ ο υ ν τ α σπερµατοζωάρια από την επιδιδυµίδα στον εκσπερµατιστικό πόρο.   Στο 95% των ανδρών µε CF παρατηρείται συγγενής αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων.   Η συγγενής αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων αποτελεί διακριτή γενετική ανωµαλία που όµως επικαλύπτεται µε τη CF και προκαλεί στειρότητα. Συγγενής αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων   Το ιντρόνιο 8 του γονιδίου CFTR ενέχεται στην συγγενή αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων συσχέτιση µε επαναλήψεις θυµιδίνης (5T/7T/ 9T).   60-70% των ανδρών µε συγγενή αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων φέρουν µεταλλαγή τουλάχιστον στο ένα αλληλόµορφο του CFTR.   H µεταλλαγή 5T µειώνει τον αριθµό των λειτουργικών µορίων της πρωτεΐνης στη µεµβράνη. Συγγενής αµφίπλευρη απουσία των σπερµατικών πόρων Στρατηγικές πρόληψης   Πληροφόρηση – Εκπαίδευση – Αφύπνιση.   κοινό   Επαγγελµατίες υγείας   Έλεγχος νεογνών   Έλεγχος πληθυσµού (ταυτοποίηση φορέων).   Προγεννητικός έλεγχος   Προεµφυτευτική διάγνωση   Γενετική Συµβουλευτική Έλεγχος νεογνών   Διάγνωση µε απλές εξετάσεις αίµατος   Υψηλά επίπεδα τρυψινογόνου παραπέµπουν σε CF   Tα προγράµµατα ελέγχου νεογνών ταυτοποιούν το 10% των περιπτώσεων.   Ανάλυση τις πρώτες µέρες µετά τη γέννηση για τον εντοπισµό νεογνών µε αυξηµένο κίνδυνο για συγκεκριµένες γενετικές νόσους.   Η πρώιµη διάγνωση βοηθά:   Στην έγκαιρη αντιµετώπιση των προβληµάτων στους πνεύµονες   Βοηθά στο σχεδιασµό του κατάλληλου διαιτολογίου.   Πραγµατοποιείται σε αρκετές χώρες. ΄Ελεγχος πληθυσµού Πρέπει να παρέχεται:   Σε άτοµα µε οικογενειακό ιστορικό CF Στους συντρόφους ατόµων που είναι ετερόζυγα για κάποια µεταλλαγή του CFTR   Σε ζευγάρια που βρίσκονται στην αναπαραγωγική ηλικία και ανήκουν και τα δύο στην Καυκάσια φυλή.   Έλεγχος φορέων CF   Ταυτοποίηση της πλειοψηφίας αλλά όχι όλων των φορέων.   Τα ποσοστά ποικίλουν ανάλογα µε την εθνική προέλευση.   Αρνητικό αποτέλεσµα δεν σηµαίνει απουσία µεταλλαγής (δεν ανιχνεύονται όλες οι µεταλλαγές) Συχνότητες φορέων στην κυστική ίνωση Εθνική Οµάδα Συχνότητα φορέων Ποσοστό ανίχνευσης Πιθανότητα να είναι ένα άτοµο φορέας µετά από αρνητικό αποτέλεσµα ελέγχου Καυκάσιοι Βόρεια Ευρώπη 1/25 – 1/29 85-90% ~1 /250 Εβραίοι Ashkenazi 1/26 – 1/29 97% ~1 / 930 Καυκάσιοι Νότια Ευρώπη 1/29 70-80% ~1 / 97 έως 1 /140 Ισπανόφωνοι (ΗΠΑ) 1/46 57% ~1 / 105 Αφροαµερικανοί 1/65 72% ~1 / 232 ~1/90 (;) ~30% (;) Μη διαθέσιµα Ασιάτες (ΗΠΑ) Έλεγχος φορέων CF   Ταυτοποίηση της πλειοψηφίας αλλά όχι όλων των φορέων •  Τα ποσοστά ποικίλουν ανάλογα µε την εθνική προέλευση. •  Αρνητικό αποτέλεσµα δεν σηµαίνει απουσία µεταλλαγής (δεν ανιχνεύονται όλες οι µεταλλαγές)   Διαφορετικές µεταλλαγές µπορεί να οδηγούν σε διαφορετική κλινική εικόνα.   Γενετική συµβουλευτική απαραίτητη για τους φορείς και για τα ζευγάρια στα οποία και οι δυο είναι φορείς. Άλλες περιπτώσεις που θα πρέπει να ελεγχθεί το γονίδιο CFTR  Ανίχνευση Hχογενούς εντέρου στο έµβρυο κατά το υπερηχογράφηµα β-επιπέδου  Ανδρική υπογονιµότητα - στειρότητα. Διαγνωστικός προγεννητικός έλεγχος Παρέχεται όταν :   Οι υποψήφιοι γονείς είναι φορείς, οπότε υπάρχει 25% πιθανότητα το έµβρυο να είναι οµόζυγο.   Ο ένας γονέας είναι φορέας και ο άλλος δεν µπορεί να ελεγχθεί. Επιλογές:   Δείγµα από χοριονικές λάχνες (Chorionic villus sampling – CVS) - Κατά τις εβδοµάδες 9-11.   Αµνιοκέντηση - Μετά τη 14η εβδοµάδα. Διαγνωστικός προγεννητικός έλεγχος Παρέχεται επίσης σε περιπτώσεις:   Εξωσωµατικής γονιµοποίησης   Ένα κύτταρο αποµακρύνεται από το νεαρο έµβρυο και ελέγχεται για την παρουσία µεταλλαγών που φέρουν οι γονείς (προεµφυτευτική διάγνωση)   Στη µητέρα εµφυτεύονται µόνο έµβρυα που δεν είναι οµόζυγα για µεταλλαγές που προκαλούν CF. Περιορισµοί στον προγεννητικό έλεγχο  Δεν είναι δυνατή η ταυτοποίηση όλων των φορέων, το γεγονός αυτό επηρεάζει και τα αποτελέσµατα του προγεννητικού ελέγχου.  Ακόµα και όταν δεν υπάρχει οικογενειακό ιστορικό και τα αποτελέσµατα είναι αρνητικά µια µικρή πιθανότητα παραµένει και πρέπει να εκτιµάται (δεν είναι δυνατός ο έλεγχος όλων των µεταλλαγών). Γενετική Συµβουλευτική Πληροφορίες σχετικά :   Κλινική εικόνα ενός ατόµου που πάσχει   Πιθανότητα να αποκτήσει ένα ζευγάρι παιδί µε τη νόσο.   Μεθόδους προγεννητικού ελέγχου και πληροφορίες για θεραπευτική άµβλωση .   Προγεννητικός έλεγχος κατά την κύηση   Προεµφυτευτική διάγνωση.   Θεραπευτικές προσεγγίσεις   Ψυχολογική υποστήριξη Γενετική συµβουλευτική Η γενετική συµβουλευτική απαιτείται:   Σε παιδιά που διαγιγνώσκονται µε CF.   Σε άνδρες που φέρουν µεταλλαγές που προκαλούν στειρότητα.   Σε ζευγάρια όπου ό ένας ταυτοποιείται ως φορέας οπότε αναζητούν περαιτέρω ανάλυση ή επιθυµούν να µάθουν ποιες είναι οι πιθανότητες εναποµείναντος κινδύνου να αποκτήσουν παιδί µε CF.   Στα ζευγάρια φορέων. Άλλα θέµατα που αφορούν τον έλεγχο  Ποικιλότητα στα συµπτώµατα και στη βαρύτητα της νόσου. Ήπιες - κλασικές µεταλαγές.   Πριν από τη συζήτηση µε τους ενδιαφερόµενους θα πρέπει να είναι γνωστές οι µεταλλαγές που εµπλέκονται στη συγκεκριµένη περίπτωση.  Μέσω του ελέγχου είναι δυνατόν να ταυτοποιηθεί ένας“ασθενής” που όµως δεν έχει σοβαρά συµπτώµατα (π.χ. φέρει δυο ήπιες µεταλλαγές) Άλλα θέµατα που αφορούν τον έλεγχο   Η συγγενής αµφίπλευρη απουσία σπερµατικών πόρων είναι δυνατόν να αποτελεί ήπια εκδήλωση της CF   Θα πρέπει να συζητείται?   Να πραγµατοποιείται έλεγχος?   Προγεννητικός έλεγχος εγκύων φορέων όταν ο πατέρας δεν είναι διαθέσιµος .   Σε περιπτώσεις ελέγχου – µικρή πιθανότητα εύρεσης µη συµβατής πατροτητας. “Πρέπει να δούµε ότι ο τοµέας αυτός εξελίσσεται συνεχώς. Θα πρέπει πλέον οι γυναικολόγοι να εξοικειωθούν περισσότερο µε τη γενετική.” -Francis Collins Κύριος ερευνητής της οµάδας που κλωνοποίησε το γονίδιο CFTR, συντονιστής του προγράµµατος χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώµατος, Διευθυντής του NIH.